NO130344B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av

mukoprotein.

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et nytt, terapeutisk aktivt mukoprotein av pattedyrs for-døyelseskanal. Det inneholder 35-55% protein og 3-15% heksose.

Det er kjent at hormoner som hemmer utskillelsen av mavesaft, avsondres fra pattedyrs fordcyelseskanal. Et slikt hormon, kjent som gastron, inneholdes i mavesaftene. Et annet hormon, kjent som enterogastron, inneholdes i tynntarmen. Den virkelige kjemiske struktur av disse hormoner er imidlertid ukjent.

Fra norsk patent 123.051 er det kjent fremstilling av et glykopeptid (mukoprotein) fra maveslimhinnen eller tolvfinger-tarmen fra svin, og dette patent har således en viss likhet med foreliggende oppfinnelse. Produktet som fremstilles i henhold til foreliggende oppfinnelse, er imidlertid et mukoprotein inneholdende 35-55% protein og 3-15% heksose, mens produktet som fremstilles ifølge patentet, inneholder 3-18% aminosyre og 27-31% heksose. Videre har mukoproteinet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse en lavere molekylvekt enn glykopeptidet fremstilt ifølge.patentet.

Det har nu lykkes oppfinnerne å finne frem til en fremgangsmåte for ekstrahering av et nytt mukoprotein fra pattedyrs fordøyelseskanal, hvilket mukoprotein kjennetegnes ved en slimavsondrende virkning så vel som en anti-sår-virkning-.

Formålet med foreliggende oppfinnelse er således å angi en fremgangsmåte for fremstilling av et mukoprotein fra slimhinnebelegget fra maven eller tynntarmen av et pattedyr, hvilket mukoprotein inneholder 35-55% protein og' 3-15% heksose, og har en slimavsondrende og anti-sår-virkning.

Fremgangsmåten karakteriseres ved at slimhinnen finhakkes, den finhakkede slimhinne ekstraheres med vann,.en vandig oppløsning av fortynnet alkohol eller en vandig oppløsning av fortynnet syre, benzoesyre eller ammoniumsulfat settes til ekstrakten, bunnfallet oppsamles og oppløses i vann, og oppløs-ningen behandles med trypsin i ca. ett døgn ved ca. 3 7°C, de lavmolekylære forurensninger fjernes ved en ekstraksjon med en lavere alkylalkohol, ved dialyse eller ved trykkfiltrering under anvendelse av en fornettet dekstranmembran gjennom hvilken gelaktige forbindelser med molekylvekt over 1000 ikke kan passere, hvorefter den rensede oppløsning lyofiliseres.

Mukoproteinet fremstilt i henhold til oppfinnelsen kan ekstraheres fra en rekke forskjellige pattedyr, innbefattet griser, sauer, geiter eller hvaler. Det foretrekkes å anvende hvaler ved denne fremgangsmåte fordi disse er forholdsvis lett tilgjengelige som industrielle råstoffer. Innholdet av mukoprotein varierer i fordøyelseskanalen. I slimbelegget i maven, og særlig i slimbelegget i slimhinnen i maveport-kjertelområdet og i tarmene,, særlig den øvre del av tynntarmen, er innholdet av mukoprotein høyt, Det er således hensiktsmessig å ekstrahere mukoproteinet fra disse deler.

Den del av fordøyelseskanalen som skal behandles, fin-,hakkes ved hjelp av en hakkemaskin og ekstraheres med kokende vann, en vandig oppløsning av fortynnet alkohol, så som en 30% etanoloppløsning, en 50% metanoloppløsning eller en 0,IN salt-

syre - 50% etanoloppløsning, eller den finhakkede fordøyelses-

kanal behandles med en vandig oppløsning av fortynnet syre, så

som en 0,IN saltsyre-oppløsning, en 5% eddiksyreoppløsning,

eller en 1% svovelsyreoppløsning.

Ekstrakten skilles fra de faste stoffer og et felle-

middel tilsettes. Som fellemiddel anvendes benzoesyre eller ammoniumsulfat. For å øke dispergerbarheten av fellemidlet i ekstrakten, er det hensiktsmessig Å tilsette fellemidlet i form av en oppløsning eller suspensjon i et passende oppløsnings-

middel. Når f.eks. fellemidlet er benzoesyre, kan det oppløses i aceton.

Bunnfallet oppsamles ved slike vanlige metoder som suge-filtrering, sentrifugalseparering e.l., og vaskes med vann og,

hvis nødvendig, med alkohol, aceton, benzen eller et passende organisk oppløsningsmidde1, og tørres.

Det på dette trinn av fremgangsmåten dannede rå-

produkt inneholdende mukoproteinet ble funnet å ha en bioak-

tivitet på ca. 20 mg/kg. Dette råprodukt raffineres deretter for å få et meget aktivt stoff. Den vandige oppløsning av råproduktet reguleres til passende konsentrasjon, f.eks. en 10%

vandig oppløsning, og pH-verdien reguleres til ca. 7. Bunn-

fallet som dannes ved tilsetning av.syre, fjernes, og oppløsningen reguleres til pH 4. Bunnfallet oppsamles og fjernes. Ved denne behandling blir det urene protein som finnes i produktet, utfelt og fjernet. Denne etterbehandling er imidlertid ikke alltid nødvendig, og i mange tilfeller kan <ien vandige oppløsning av det ovennevnte råprodukt anvendes som det er i det neste trinn.

Trypsin settes deretter til den vandige oppløsning av råproduktet

for å frembringe spaltning av proteinet som inneholdes i råproduktet. Oppløsningen oppvarmes deretter for å inaktivere enzymet, og de lavmolekylære forurensninger og uorganiske salter som inneholdes i oppløsningen, fjernes.

For å fjerne de lavmolekylære forurensninger og uor-

ganiske salter kan en hvilken som helst av en rekke forskjellige metoder anvendes. En slik metode består f.eks. i at slike forurensninger som aminosyrer og peptider osv., ekstraheres og fjernes med an lavere alkylalkohol. En annen metode består i

å fjerne lavmolekylære forurensninger og uorganiske salter ved hjelp av dialyse under anvendelse av en semipermeabel membran eller en ionebytterharpiks. Ulempen ved anvendelse av disse metoder er imidlertid at volumet av oppløsningen som inneholder mukoproteinet, er stort, og under behandlingen er det derfor nødvendig med ganske mye arbeid for å oppnå mukoproteinet ved konsehtrering og lyofilisering.

De lavmolekylære forurensninger og uorganiske salter

kan imidlertid elimineres og oppløsningen konsentreres i et enkelt trinn ved å øke filtreringstrykket under anvendelse av en fornettet dekstranmembran som. er fornettet i en slik grad at den er tilstrekkelig til å hindre diffusjon av noen gelaktige stoffer med molekylvekt over 1000. Eksempler på slike fornettede dekstraner er "UM-1" eller "UM-2". Det fornettede dekstran på-

føres på en porøs bæreplate så som et filtrerpapir osv., og festes til dette. Det foretrekkes å anvende en fornettet dekstran-

membran som har en tykkelse på 0,05 til 0,5 mm når et filtrer-

papir anvendes som bæreplate-

Ved utførelse av fremgangsmåten i henhold til opp-

finnelsen filtreres oppløsningen under forhøyet trykk med om-

røring. Trykket bør holdes ved 3,5 til 8 kg/cm 2 og fortrinnsvis ved ca. 7 kg/cm 2. Strømningshastigheten reguleres hensikts-

messig slik at man får en gjennomsnittlig strømningshastighet på 100-200 ml/time når det anvendes en membran med en diameter på 76 mm.

På denne måte vil forurensninger med en molekylvekt på

mindre enn 1000 og uorganiske salter som er tilstede sammen med mukoprotein, bli fullstendig filtrert og fjernet, og samtidig vil mesteparten av fuktigheten fjernes slik at den påfølgende lyofilisering gjøres lettere.

Det er ønskelig å fjerne eventuelt fellemiddel som

kan ha blitt innesluttet i råproduktet under utfellingstrinnet, ettersom tilstedeværelsen av selv små mengder av et slikt fellemiddel har en tendens til å redusere aktiviteten av proteasen som settes til produktet i det påfølgende trinn. Fellemidlet kan fjernes ved en hvilken som helst av de metoder som anvendes for rensning av råproduktet. F.eks. kan fellemidlet fjernes ved dialyse eller trykk-gel-filtrering.

De kjemiske egenskaper for mukoproteinet fremstilt i

henhold til oppfinnelsen, er fremdeles hovedsakelig ukjent i detalj. Sammensetningen synes imidlertid å svare til omtrent den følgende:

Resultatene av en prøve utført for å fastlegge anti-sår-virkningen av mukoproteinet fremstilt i henhold til oppfinnelsen, er som vist i den følgende tabell. Prøven ble utført i henhold til Shay's metode som følger: En laparotomi ble utført på han-rotter under eterbe-døvelse. Rottene som veide 250-350 g etter 48 timers faste, ble underbundet ved maveporten og den oppsnittede del ble umiddelbart sydd. Samtidig ble en prøveoppløsning injisert i nålevenen. Etter 8 timer ble laparotomi utført under eterbedøvelse og spise- røret ombundet på et punkt like over mavemunnen. Maven ble ekstirpert, og mengden såvel som surheten av mavesaftene ble målt under anvendelse av en 0,IN natriumhydroksydoppløsning med fenolftalein som indikator. Samtidig ble tegn på sår på mave-veggen iakttatt ved sammenligning med en kontrollgruppe som var gitt saltoppløsning.

Det fremgår av den ovenstående tabell at hos de grupper som hadde fått henholdsvis 2,5 mg/kg og 5,0 mg/kg av mukoproteinet fremstilt i henhold til oppfinnelsen, ble sår-dannelsen i mave-kjertelen og vommen tydelig stanset, og utskillelsen av mavesaft og mavesyre ble påfallende hemmet. Hos de grupper som var behandlet med henholdsvis 1,0 mg/kg urogastron og 250 /^g/kg sialogastron, ble det iakttatt en begrenset grad av hemming av mavekjertel-sår-dannelse, mens nesten ingen sår-hemmende virkning ble iakttatt hos gruppen som var gitt 1,0 mg/kg atropinsulfat.

EKSEMPEL 1

Maveportkjertel-området fra en frosset tredje mave

fra en hval ble gradvis tint i et lavtemperaturkammer, og slimhinnen ble forsiktig fjernet slik at man fikk 12 kg slimhinne. Slimhinnen ble finhakket med en vanlig hakkemaskin, og ca. 12 kg vann ble tilsatt og kokt i ca. 30 minutter. Oppløsningen fikk stå ved romtemperatur og ble deretter anbragt i et kaldt rom (5°) i 16 timer. Deretter ble de faste stoffer fraskilt under anvendelse av en nylonduk, og man fikk- en ekstrakt. En opp-løsning omfattende 100 g benzoesyre ble oppløst i 1 liter aceton og ble satt gradvis til ekstrakten under omrøring. Den blandede væske ble igjen omrørt i 1 time og påny anbragt i et kaldt rom (ved 5°C) i 16 timer.

Det hvite bunnfall som ble dannet i ekstraktvæsken, ble sugefiltrert under redusert trykk, og de faste stoffer ble omhyggelig vasket med vann. Det faste materiale ble overført til et sentrifugalseparatorrør og vasket 5 ganger med 500 ml aceton og 2 ganger med 300 ml eter inntil ikke mer benzoesyre kunne finnes. De faste stoffer ble deretter tørret, og man fikk 20 g råprodukt. 10 g av dette råprodukt ble oppløst i 1 liter renset vann, og pH-verdien ble regulert til 8,0. En oppløsning inneholdende 100 mg trypsin oppløst i 10 ml vann ble tilsatt, og opp-løsningen ble holdt i 24 timer ved 3 7°C. For å inaktivere trypsinet ble oppløsningen deretter kokt i ca. 15 minutter og deretter avkjølt, og 1 liter n-butanol ble tilsatt, og blandingen ble ristet. Ved sentrifugalseparering av denne blanding ble det oppsamlet en vannfase som først ble konsentrert til 200 ml under redusert trykk og deretter raffinert ved lyofilisering.

På denne måte fikk man 3 g raffinert mukoprpteinpulver.

EKSEMPEL 2

10 g av råproduktpulveret erholdt ved fremgangsmåten ifølge eksempel 1, ble oppløst i 1 liter renset vann. 20 g dietylaminoetylcellulose (DEAE-cellulose) ble satt til oppløs-ningen, og oppløsningen ble omrørt i ca. 3 timer. Umiddelbart deretter ble. oppløsningen sugefiltrert for å gi fast materiale. De faste materialer ble omhyggelig vasket med vann og deretter omrørt 2 ganger, hver gang med 30 minutter, med 50 ml vandig oppløsning av 0,IN natriumhydroksyd for å bevirke at de stoffer som var absorbert i DEAE-cellulosen, skulle komme ut. Den resulterende væske ble regulert til pH 8,0 under anvendelse av eddiksyre, og en oppløsning- laget ved å oppløse 100 mg trypsin i 10 ml vann, ble tilsatt, og det hele fikk stå ved 3 7°C i 24 timer. Oppløsningen ble kokt i ca. 15 minutter for å inaktivere trypsinet. Deretter ble oppløsningen anbragt i et cellofanrør og dialysert i 72 timer ved redusert trykk under anvendelse av vann og det gjenværende væskekonsentrat. Den konsentrerte væske ble oppløst i en blanding av alkohol og saltsyre inneholdende 7 déler etahol og 3 deler 0,IN saltsyre, og den overliggende væske som ble erholdt ved sentrifugering, ble konsentrert og tørret under redusert trykk. Man fikk således et gulaktig, hvitt pulver.

EKSEMPEL 3

Fra en frosset hannspermasetthval, 15 m lang, ble tatt 4,75 kg slimhinne fra den øvre tynntarm. Slimhinnen ble finhakket ved hjelp av en hakkemaskin, og det dobbelte volum vann ble tilsatt.. Oppløsningen ble kokt i ca. 30 minutter, fikk stå ved romtemperatur og ble deretter anbragt i et kaldt rom (5°C)

i 16 timer. De faste stoffer ble deretter fraskilt under anvendelse åv en nylonduk for å gi en ekstraktvæske. Under om-røring av denne ekstraktvæske ble det langsomt tilsatt en opp-løsning inneholdende 950 mg benzoesyre oppløst i 1 liter aceton. Den resulterende væske ble omrørt i ytterligere 1 time og påny anbragt i et kaldt rom (5 C) i 16 txmer.

Det hvite bunnfall som ble dannet i ekstraktvæsken,

ble deretter sugefiltrert under redusert trykk og vasket omhyggelig med vann. Bunnfallet ble deretter overført til et sentrifugalsepareringsrør og vasket 5 ganger med 500 ml aceton

og 2 ganger med 300 ml eter inntil ikke mer benzoesyre kunne finnes. Etter tørring fikk man 26,16 g råprodukt. 10 g av råproduktet ble oppløst i 1 liter renset vann, og pH-verdien ble regulert til 8,0. En oppløsning inneholdende 100 mg trypsin oppløst i 10 ml vann ble tilsatt, og oppløsningen fikk stå i 24 timer ved 37°C. Trypsinet ble deretter inaktivert ved koking i ca. 15 minutter og avkjølt. 1 liter n-butanbl ble tilsatt,

og det hele ble ristet. Ved hj"elp av sentrifugalseparering ble.

en vannfase på buniien oppsamlet og deretter konsentrert til 200

ml under redusert trykk. Et raffinert mukoproteinpulver ble erholdt ved frysetørrihg.

EKSEMPEL 4

25 g råprodukt fremstilt på samme måte som i eksempel

3 ble oppløst i 500 ml vann, og oppløsningen ble regulert til pH 7,0 under anvendelse av ammoniakk. Oppløsningen ble der-

etter kokt i ca. 5 minutter ved 100°C, avkjølt og omrørt i ca.

4 timer.

Etter henstand' natten over ble et bunnfall skilt fra. denne væske ved sentrifugalseparering, og 1 liter vann'med pH-verdi 7,0 ble tilsatt. Etter den samme prosess som i eksempel 3 ble væsken delt i bunnfall og filtrat, og filtratet ble satt til det foregående filtrat. Filtratet ble deretter regulert til pH 4,0 under anvendelse av eddiksyre, kokt i ca. 5 minutter, avkjølt og deretter sentrifugalseparart. Det på denne måte dannede bunnfall ble vasket med 100 ml eddiksyreoppløsning med en pH

på 4,0. Ved å blande den vaskede væske med det foregående filtrat og ved lyofilisering av blandingen fikk man et aktivt stoff.

10 g av dette stoff ble deretter oppløst i 1 liter

renset vann og raffinert ved fremgangsmåten ifølge eksempel 3

for å gi et raffinert mukoprotein.

EKSEMPEL 5

Et råprodukt fremstilt på samme måte som i eksempel 3

ble oppløst i 10 volummengder vann. En mettet oppløsning av ammoniumsulfat-ble tilsatt ved 20°C, og pH-verdien ble regulert til 7,0 slik at man fikk en åmmoniumsulfatkonsentrasjon på 50% ammoniumsulfat-metning. Oppløsningen fikk stå natten over i et 20°C termostatregulert rom og ble sentrifugert for å utvinne et

bunnfall og en væske på toppen. Bunnfallet ble vasket i vann og ble deretter dLalysert ved 4°C under anvendelse av en cellofan-membran i 48 timer. Det indre dialysat ble lyofilisert, og man fikk et aktivt stoff. 10 g av dette stoff ble behandlet som beskrevet i eksempel 3, og man fikk et raffinert mukoprotein.

EKSEMPEL 6

2.500 g mave-slimhinne ble finhakket og tilsatt det dobbelte volum vann. Etter koking i 30 minutter ble ekstrahering foretatt. Etter avkjøling ble væsken filtrert, og residuet ble igjen blandet med det dobbelte volum vann og kokt i 30 minutter. Begge ekstraktvæsker ble kombinert med residuet og fikk stå natten over ved 5°C. Deretter ble den blandede væske filtrert. En oppløsning dannet ved å oppløse 500 mg benzoesyre i 1 liter aceton, ble satt til filtratet under omrøring. Omrøring ble fortsatt i 5 timer, og væsken fikk stå natten over ved 5°C. Bunnfallet ble sentrifugert, vasket med 5 1 vann, 5 1 aceton og 1 1 eter suksessivt og deretter lufttørret. Man fikk således 20 g råprodukt. 2 1 vann ble satt til 20 g av råproduktet, og pH-verdien ble regulert til 7,0. Væskefasen ble fraskilt ved sentrifugering, og 2 1 av en mettet åmmoniumsulfatoppløsning ble tilsatt. Opp-løsningen fikk deretter stå natten over ved 5°C og ble sentrifugert for å gi et annet bunnfall. Dette bunnfall ble igjen vasket med 500 ml mettet ammoniumsulfatoppløsning. Bunnfallet ble deretter oppløst i 500 ml vann og trykkfiltrert. Trykk-filtreringen utføres ved å anbringe 250 ml av oppløsningen i en beholder med en diamter på 76 mm og et indre volum på 400 ml. Oppløsningen omrøres ved hjelp av en magnetisk rører og filtrering utføres ved en gjennomsnittlig strømningshastighet på 50 ml pr. time under anvendelse av en "UM-2" membran-type. Et trykk på o 7 kg/cm 2 ble anvendt under anvendelse av en kompressor. Da residuet var redusert til ca. 50 ml, ble ytterligere 2 50 ml

av den ovennevnte oppløsning tilsatt og filtrert på samme måte. Da residuet var redusert til 50 ml, ble 100 ml renset vann tilsatt for ytterligere konsentrering til 50 ml. Etter fryse-tørring av residuet fikk man 11,8 g mukoprotein-råprodukt. 10 g av mukoprotein-råproduktet ble satt til 1000 ml vann, og opp-løsningen ble regulert til pH 8,0. En oppløsning inneholdende

100 mg trypsin ble oppløst i 10 ml vann og ble holdt i 24 timer ved 3 7°C. Oppløsningen ble kokt i 15 minutter for ~å inaktivere trypsinet og ble deretter trykkfiltrert under anvendelse av en fornettet dek s tran-membran ("UM-2") og med en gjennomsnittlig strømningshastighet på 120 ml/time. Etter påfølgende lyofilisering fikk man 0,3 72 g raffinert mukoprotein. Utbyttet av mukoproteinet fra mave-slimhinnen var 0,18 g/kg.

EKSEMPEL 7

1.650 g tynntarm-slimhinne ble behandlet som beskrevet i eksempel 6. Det ble erholdt 3,45 g mukoprotein som ble behandlet med trypsin. Etter påfølgende trykkfiltrering under anvendelse av en membran av "UM-1" typen og ved en gjennomsnittlig strøm-ningshastighet på 100 ml/time fikk man 0,85 g raffinert mukoprotein .

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et mukoprotein fra slimhinnebelegget fra maven eller tynntarmen av et pattedyr, hvilket mukoprotein inneholder 35-55% protein og 3-15% heksose, og har en slimavsondrende og anti-sår-virkning, karakterisert ved at slimhinnen finhakkes, den finhakkede slimhinne ekstraheres med vann, en vandig oppløsning av fortynnet alkohol eller en vandig oppløsning av fortynnet syre, benzoesyre eller ammoniumsulfat settes til ekstrakten, bunnfallet oppsamles og oppløses i vann, og oppløsningen behandles med trypsin i ca. ett døgn ved ca. 37°C, de lavmolekylære forurensninger fjernes ved en ekstraksjon med en lavere alkylalkohol, ved dialyse eller ved trykkfiltrering under anvendelse av en fornettet dekstranmembran gjennom hvilken gelaktige forbindelser med molekylvekt over 1000 ikke kan passere, hvoretter den rensede oppløsning lyofiliseres.