DK166393B - Fremgangsmaade til fremstilling af vandige organekstrakter med et heparinindhold paa mindst 120 ie/ml - Google Patents

Description

i

DK 166393 B

Denne opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af vandige organekstrakter med et heparinindhold på mindst 120 IE/mi (internationale enheder/ml), med ensartet sammensætning og med lavt indhold af fedtstoffer og 5 andre urenheder.

Det er velkendt, at oparbejdningen af heparinholdige animalske produkter til ekstraktion af heparinet er dyr og kompliceret og kan udføres ved hjælp af en ekstraktions-10 proces bestående af flere på hinanden følgende trin af forskellig karakter. Organekstraktionsprocessen kan i praksis ikke adskilles fra indsamlingen og konserveringsmetoden for de heparinholdige animalske organer, eftersom disse bearbejdningstrin på afgørende måde influerer på 15 den. industrielle udførelse af ekstraktionsprocessen og ligeledes på størrelsen af de opnåelige udbytter. De kendte heparinekstraktionsprocesser kræver lang bearbejdningstid, deres reproducerbarhed er tvivlsom, og som følge heraf beskæftiger såvel den tekniske litteratur som 20 patentlitteraturen sig intensivt med ekstraktionsprocessen, der bestemmer effektiviteten og det økonomiske udbytte af den samlede heparinproduktion. Det er klart, at det vigtigste formål med ekstraktionen er den mest muligt effektive opløsning af den aktive ingrediens, der faktisk 25 er til stede i de forskellige typer råmaterialer, der skal bearbejdes efter indsamling af organerne og oplagring af disse ved hjælp af sådanne procedurer, som ikke forårsager nogen forringelse eller nedbrydning af det eksisterende indhold af aktiv ingrediens. Et yderligere 30 formål er isolering af et slutprodukt af farmacopé-kvali-tet ud fra den vandige heparinholdige opløsning, der opnås ved ekstraktionsprocessen, samt at opnå dette med tilfredsstillende udbytte og ved få behandlingstrin. Til dette formål er det nødvendigt, at heparinekstraktvæsken 35 skal indeholde den mindst mulige mængde forureninger såsom de heparinoide, pyrogene, farvende polypeptidbestand-dele, der vanskeliggør rensningen. Den mest muligt selek- 2

DK 166393 B

tive opløsning af heparinet er hensigtsmæssig, når man tager i betragtning, at de andre komponenter, som er til stede i organekstrakten (fedtstoffer, lipoider, proteiner, peptider, uorganiske salte) inhiberer isoleringen 5 af heparinet, dvs. formindsker det opnåelige udbytte, hvilket forårsager problemer, der virker negativt på udførelsen i praksis, og slutproduktet vil ikke altid kunne renses fuldstændigt fra alle de ledsagende materialer. De foran omtalte formål har man ikke med held kunnet udføre 10 optimalt og samtidigt med fremstillingen af de kendte typer råmaterialer samt ved udførelsen af ekstraktionsprocesserne.

De tre fundamentale metoder, som er anvendt ved ekstrak-15 tionen af heparinholdige animalske organer, kan skitseres som følger:

Den teoretiske opbygning af den første ekstraktionsmetode er den samme, som foreslået af Charles og Scott, J. Biol.

20 Chem. 102, 425, 1933. Denne metode er karakteriseret ved anvendelsen af de overlevende vævs egne hydrolyserende enzymer til ekstraktion af de heparinholdige, hakkede, i almindelighed dybfrosne organer. Autolysen udføres i et længere tidsrum, hvorpå man anvender svagt alkalisk salt-25 opløsning og kogning for at koagulere ekstrakten. Metoder, der anvender autolyse, er omtalt i US patentskrifterne nr. 2 571 679 og 2 797 184. Autolyse i kombination med yderligere ekstraktion ved en forbedret fremgangsmåde er omtalt i US patentskrifterne nr. 2 884 358 og 30 3 016 331.

Ulemper ved ekstraktionsmetoden under anvendelse af autolyse er omtalt i HU patentskrift nr. 148 776 og US patentskrift nr. 2 587 924. På basis af eksperimentelle da-35 ta kan ulemperne tilskrives forskellige årsager: 3

DK 166393 B

- Selv når man forudsætter ligevægtstilstand mellem ekstraktionsvæsken og det organ, der skal ekstraheres ved ekstraktionsprocessen, må man ikke desto mindre regne med et betydeligt tab af heparin på grund af det høje vand- 5 indhold i det ekstraherede organ. Fjernelse af det ekstraherede organ medfører nødvendigvis fjernelse af vand (og ligeledes opløst heparin) fra systemet. På grund af den forskellige grad af autolyse i mediet har man ikke ved enhver given lejlighed ligevægtstilstand mellem orga-10 net, som skal ekstraheres, og ekstraktionsvæsken, i hvilket tilfælde tabene naturligvis er højere.

- Ved oplagringen af organet forud for autolysen og under selve autolysen udvikler de heparinbeskadigende mikroor- 15 ganismer sig, hvilket resulterer i, at udbyttet formindskes, og bakterieforureningen er ugunstig også i andre henseender (pyrogenicitet, toxicitet).

- Et af hovedproblemerne ved de metoder, der arbejder med 20 autolyse, tilskrives indsamlingen af organer, som forårsager usikker sammensætning af den opnåede ekstrakt. På grund af det udviklede store rumfang er kravet til udstyr, der er nødvendigt til denne fase af bearbejdningen, ligeledes af betydeligt omfang. Gennemførelse af proces- 25 sen i industriel målestok er kun mulig, dersom rumfanget reduceres i en sådan grad, at det fører til et heparin-holdigt produkt med mindst 1-10 % renhed. På grund af svingninger i sammensætningen varierer kvaliteten af det dannede produkt, og en økonomisk produktion er vanskelig 30 at gennemføre.

Ifølge den anden ekstraktionsmetode udnyttes de heparin-holdige organers indhold af aktiv ingrediens ved anvendelse af kemikalier, som opløser heparinet eller heparin-35 protein-komplekset. Disse fremgangsmåder er f.eks. be skrevet i HU patentskrift nr. 948 776 og 149 339, GB patentskrift nr. 992 201 og US patentskrifterne nr.

DK 166393B

4 2 623 001, 3 058 884 og 3 626 854. Ekstraktionen med opløsningsmiddel har imidlertid en ulempe derved, at analogt med autolyse-metoden må organrester med højt vandindhold fjernes fra systemet, hvorved man må regne med 5 betydelige tab af heparin i en mængde på 20-40 %, alt afhængigt af koncentrationen af organisk tørstof i ekstraktionsresterne (sammenlign eksemplet anført i HU patentskrift nr. 148 776 og GB patentskrift nr. 992 201). Den varierende sammensætning af de anvendte organer er også 10 ugunstig i forbindelse med denne metode, idet den ligeledes fremkalder varierende sammensætning af ekstrakten og usikker reproducerbarhed ved den yderligere bearbejdning.

På grund af disse vanskeligheder udfører man ifølge US patentskrift nr. 2 623 001 en langvarig dialyse i stort 15 rumfang efter ekstraktionen. Ved den i US patentskrift nr. 3 262 854 beskrevne fremgangsmåde anvender man som en nødvendighed organisk opløsningsmiddel i de ekstraktionsfaser, der har det største rumfang.

20 Sammenfattende for fremgangsmåderne i den første gruppe, der anvender autolyse, og i den anden gruppe, der udelukkende anvender kemisk ekstraktion, synes det at være en fælles ulempe, at de ved ekstraktionen - sædvanligvis en medstrømsproces udført i kun et eller to trin - opnåede 25 opløsninger på grund af konsistensen af de indtil fornylig almindeligt anvendte råmaterialer indeholder adskillige ledsagende og generende urenheder, og at deres hepa-rinkoncentration er meget fortyndet, idet den er på 10-20 ΙΕ/ml eller i gennemsnit 0,01%. Med andre ord må ekstrak- g 30 tionen for at der skal opløses 10 IE (6,5 kg) heparin, udføres i et rumfang på 50 000-100 000 liter med et minimumstab af heparin på 20 %.

Ved den tredie gruppe af ekstraktionsmetoder underkastes 35 de heparinholdige organer - for at reducere tabet af heparin og for at eliminere den til au toly sen knyttede usikkerhed - uden kemikalier en intensiv og langvarig

DK 166393B

5 proteolyse, der strækker sig til næsten fuldstændig eller fuldstændig opløsning under anvendelse af et enzym, såsom trypsin, pancreas-ekstrakt eller papain, der tilføres systemet udefra. Sådanne fremgangsmåder er f.eks. beskrevet 5 i HU patentskrift nr. 147 323 og yderligere i US patentskrifterne 2 587 924, 2 989 438 og 3 817 831 såvel som i US patentskrifterne nr. 2 884 358 og 3 016 331, hvor der anvendes kombineret autolyse og enzym-proteolyse. Trods fordelagtige virkninger er den økonomiske virkningsgrad 10 af sidstnævnte ekstraktionsproces følsom over for prisen på det proteolytiske enzym, der er nødvendigt for den specifikke mængde organ. F.eks. er det nødvendigt at tilsætte 1,5-3 kg pancreas eller pancreas-rest til 2 kg heparinholdigt organ ved en af de omtalte fremgangsmåder.

15

Hvis den specifikke mængde af enzymerne nedbringes, bliver proteolyse- og filtreringsprocessen ekstremt forlænget. I US patentskrift nr. 3 817 831 beskrives pepsin-au-tolysen som varende 24 timer, autolysen udført med pan-20 creatin som varende 15 timer, hvorefter der anvendes først en grovfiltrering og derpå efter 24 timers forløb en ultrafiltrering. En yderligere ulempe er, at de forlængede procestider forøger risikoen for bakteriel forurening, medens tilstedeværelsen af enzymerne sammen med 25 dem, der tilføres udefra, nedbryder glucosidbindingerne i heparinet, eller andre nedbrydningsenzymer forøger nedbrydningen af heparinet.

Som et resultat af den fuldstændige eller næsten fuld-30 stændige proteolyse opløses de bestanddele, der er til stede i de animalske organer, og som ledsager heparinet, såsom forbindelserne af mucopolysaccharid-typen, nuclein-syrederivater, fedtstoffer og lipoider, hvilket i betydelig grad skader den hurtige og effektive færdigbe-35 arbejdelse. Ifølge eksempel 3 i US patentskrift nr.

3 817 831 er andelen af organisk tørstof efter fuldførelse af proteolysen og grovfiltreringen 10-15 %, dvs. 3 6

DK 166393 B

størrelsesordener højere end heparinindholdet på 0,027 % i opløsning B. Af denne grund er spildevandsudledningen af de forarbejdede opløsninger, som er befriet for aktiv ingrediens, problematisk m.h.t. miljøbeskyttelse. Produk-5 tet af de processer, der arbejder med proteolyse, er en overordentlig fortyndet opløsning indeholdende 6,45 IE/ml (0,004-0,03 %); proteolysen kan ikke udføres i en mere koncentreret opløsning på grund af den derved opståede substrat-inhibering.

10

Ekstraktionen af de animalske organer, dvs. opløsningen af det i dem tilstedeværende heparinindhold, og reduktionen af opløsningernes rumfang på effektiv og ensartet måde, er den mest tidsrøvende og mest komplicerede fase af 15 den samlede proces til fremstilling af dette farmaceutiske produkt. Ekstraktionen tager lang tid grundet proteolysen og/eller en række kemisk-fysiske processer, der udføres i flere trin, fordi den meget lavere koncentration af den aktive ingrediens nødvendiggør opførelsen og drif-20 ten af udstyr med meget stort rumfang. Den økonomiske virkningsgrad af den kemiske ekstraktion påvirkes ugunstigt af de kemikalier, der skal anvendes, samt af udgiften til enzymer ved den proteolytiske ekstraktion. Reproducerbarheden er usikker, fordi indholdet af den aktive 25 bestanddel på grund af de forskellige indsamlings- og opbevaringsmetoder for de animalske organer svinger mellem vide grænser og samtidig vanskeliggøres den yderligere forarbejdning af de urenheder, der er til stede i en flere gange større mængde.

30

De konventionelle organindsamlingsmetoder, der anvendes ved heparinfremstillingen, gør det således ikke muligt at opnå et slutprodukt af farmacopé-kvalitet uden tab eller med kun et lille tab af det heparinindhold, som bliver 35 tilbage under forløbet af den sædvanlige opbevaring af organerne i større rumfang. Ekstraktionsmetoderne måtte tillempes kvaliteten af udgangsmaterialet, og på den an-

DK 166393B

7 den side gjorde dettes uensartethed det nødvendigt at indføre sådanne behandlinger under ekstraktionsprocesserne, som havde en modsatrettet virkning på den selektive ekstraktion af heparin og gjorde den pågældende metode 5 mere kompliceret.

Således er en simplificering af ekstraktionsmetoderne, som nedsætter tidsforbruget i denne produktionsfase, og som forøger den Økonomiske virkningsgrad og forøger se-10 lektiviteten, en vigtig teknisk opgave og udgør grundlaget for udarbejdelsen af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, hvorved ekstrakter med overordentligt høj heparinkoncentration, mindst 120 IE/ml, med konstant sammensætning og indeholdende mindst mulige 15 mængder af skadelige urenheder, fremstilles med mindre energi-, kemikalie- og arbejdskraftforbrug.

Disse formål realiseres optimalt ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, 20

Det særegne ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er, at man underkaster et heparinberiget, amorft, granuleret råmateriale, som har 90-95 % tørstofindhold og en stor specifik overflade, en intermitterende eller kontinuert mod-25 strømsekstraktion under anvendelse af en vandig saltopløsning med en elektrolytkoncentration på 1,5-12,0 vægt-% og en pH-værdi på 8-12,8 ved 20-80 °C. pH-området 8-12,8 svarer til en alkalisk opløsning med koncentrationen 0,5-1,0 normal. Elektrolytkoncentrationen, temperaturen og 30 pH-værdien holdes på konstante værdier under modstrømsekstraktionsprocessen. Den ekstraherende saltopløsning sættes til det tørre organ på en sådan måde, at man vil opnå ekstraktvæsker med en koncentration på 150-300 IE/ml. Til dette formål er det nødvendigt at have et for-35 hold mellem tørstof og væske på 1:5 under hele processen.

Den anvendte monovalente eller polyvalente base er sædvanligvis natriumhydroxid eller en anden alkalisk opløs- 8

DK 166393 B

•<r ning, der normalt anvendes ved heparinekstraktion, medens elektrolytten er en kation med optimalt en eller flere valenser, som er indifferent med hensyn til heparinet, et salt med organiske eller uorganiske anioner, fortrinsvis 5 natriumchlorid. Ved heparinberiget råmateriale skal for stås et sådant udgangsmateriale, hvis heparinindhold er 5-35 % højere end et hvilket som helst naturligt råmateriale, beregnet på organets tørstofindhold. Modstrømsekstraktionen udføres i et apparatur på intermitterende 10 måde med fuldstændig ekstraktion eller kontinuert, hensigtsmæssigt i en vibrerende U-formet ekstraktør. En sådan U-formet ekstraktør er beskrevet i HU patentskrift nr. 159 977, og denne kan efter vore erfaringer - udover til ekstraktion af medicinske urter - på særlig effektiv 15 måde anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af vandige ekstrakter med højt heparinindhold. I dette apparatur underkastes det granulære he-parinholdige råmateriale, som skal ekstraheres, en med-strøms-sprøjteoplukning, efterfulgt af en medstrøms-20 sprøjteforekstraktion, derpå en medstrøms-dryppeforeks-traktion, så en modstrøms-vibrations-ekstraktion med gen-nemvædning og endelig dryppeefterekstraktion.

Apparaturet er opbygget med et cellesystem, hvor mulighe-25 den for tilbageblanding af de vandige ekstrakter mellem cellerne er forhindret, og samtidig letter de vibrerede enheder af udstyret i betydelig grad etableringen af ekstraktionsligevægten svarende til det givne tidspunkt. Fordelen derved er, at både mængden af ekstraktionsvæske 30 beregnet på det materiale, der skal ekstraheres, og ekstraktionstiden såvel som længden af ekstraktionsvejen kan reduceres væsentligt.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen blev anvendt tør-35 ret, amorft, granuleret, heparinberiget organkoncentrat med stor specifik overflade, fremstillet ved den fremgangsmåde, som er beskrevet i dansk patentansøgning nr.

9

DK 166393 B

1197/80.

Ved denne fremgangsmåde lagres heparinholdige animalske organer, eventuelt efter hakning, i et vandigt medium ved 5 10-50 °C i 0,5-15 timer, og derefter adskilles det i vand uopløselige heparin-protein-holdige kompleks fra den au-tolyserede suspension ved 75-100 °C og omdannes til let filtrerbare aggregater ved yderligere varmebehandling, bundfaldet skilles fra, og det isolerede heparinholdige 10 råmateriale tørres, fortrinsvis ved en temperatur under 100 °C, indtil der er opnået et smuldrende holdbart produkt med 90-95 % tørstof.

Fordelene ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan op-15 summeres som følger: 1) Ved den medstrøms-, ettrins- eller totrins-ekstraktion, der sædvanligvis anvendes til fremstilling af hepa-rinekstrakter, er en programmeret variation af tempera- 20 tur, pH-værdier og oplukningskemikalier nødvendig. Mod strømsekstraktionen ifølge opfindelsen kan udføres i det samme apparatur ved simpel opløsning udført i et givet system i optimalt udvalgt vandigt-alkalisk medium uden ændring af driftsbetingelserne og uden behov for at til-25 sætte forskellige kemikalier.

2) Modstrømsekstraktionen ifølge opfindelsen fører til fremstillingen af praktisk taget fedtfrie ekstrakter med konstant sammensætning og med 5-10 gange højere koncen- 30 tration end ved den sædvanlige ekstraktion, og dette udføres inden for en kort behandlingstid og med tilfredsstillende udbytte, idet der samtidig opnås et meget mere gunstigt forhold mellem heparin og ledsagende materialer end ved de konventionelle metoder.

35 3) Gennemførelsen af modstrømsekstraktionen er ikke fast knyttet til de kemiske egenskaber af et bestemt kemika-

DK 166393B

10 lie, og den kan således finde sted med de mest egnede og billigste kemikalier, der er til rådighed, 4) Rumfangskravene ved modstrømsekstraktionen Sammenlig-5 net med de konventionelle metoder kan reduceres til 1/4 til 1/10, idet fremgangsmåden kan gennemføres med jævn hastighed til dannelse af en heparinholdig ekstrakt op-koncentreret til et lille rumfang, således at udstyrets rumindhold kan reduceres og udnyttelsesgraden forbedres.

10 5) Med henblik på at udskille heparinet fuldstændigt fra modstrømsekstraktionssystemet og reducere rumfanget deraf er det tilstrækkeligt at anvende fødepumper og vakuum-tromlefiltre, idet den kontinuerte separation af hepari- 15 net kan udføres ved tilsætning af kvaternære ammoniumforbindelser og en proteinopløsning med kendte egenskaber og sammensætning og efterfølgende syrning af systemet og derpå isolering af det udskilte heparinholdige bundfald.

20 6) Reduktion af rumfanget fører til væsentlig energibe sparelse, reduceret arbejdskraftbehov og anvendelsen af færre kemikalier.

Sammenfattende kan det anføres, at ekstrakterne med 25 yderst højt heparinindhold kan fremstilles med konstant sammensætning ved kontinuert modstrømsekstraktion, i en kort behandlingstid, i et lille rumfang og i et simpelt apparatur. Ud fra disse ekstrakter kan isoleringen af heparinet med farmacopé-kvalitet gennemføres effektivt 30 ved konventionelle fremgangsmåder.

Hvis den U-formede ekstraktør, der er beskrevet i HU patentskrift nr. 159 977, anvendes til udførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og ekstraktionen udføres 35 med en ekstrakt ions væske med temperaturen 50 °C, en koncentration på 0,5-1,0 n og indeholdende mindst 5 % na-triumchlorid i ekstraktøren ved en opholdstid på 30 mi- 11

DK 166393 B

nutter, så kan den aktive ingrediens ekstraheres fuldstændigt fra det heparinholdige organkoncentrat. Forholdet mellem det tørrede organkoncentrat og ekstraktionsvæsken er sat til 1:5. Organkoncentratet med stor speci-5 fik overflade kvælder moderat op ved vandoptagelse, men det bevarer sin granulære karakter og evne til let filtrering selv ved høj alkalikoncentration. En forøgelse af alkalikoncentrationen influerer praktisk taget ikke på mængden af opløst, ikke-heparinagtigt organisk tørstof, 10 og mængden af opløste proteiner og peptider varierer heller ikke. Grunden hertil er sandsynligvis den betydelige og irreversible denaturering af proteinerne, der udgør hovedparten af organet, som skal ekstraheres, under tørringens forløb.

15

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses i detaljer ved de efterfølgende udførelseseksempler. Det skal bemærkes, at der er anført nogle sammenligningseksempler for at påvise fordelene ved ekstraktionsprocessen ifølge opfindel- 20 sen.

SAMMENLIGNINGSEKSEMPEL 1

Det heparinholdige råmateriale, fremstillet ved den frem-25 gangsmåde, som er beskrevet i dansk patentansøgning nr. 1197/80, ekstraheres ved en konventionel fremgangsmåde med autolyse i nærvær af toluen og under anvendelse af elektrolytopløsninger.

30 20 kg heparin-råmateriale af den ovennævnte kvalitet blandes intensivt med 100 kg finthakket svine-tyndtarm indeholdende 18 % tørstof, 450 1 vand og 150 1 10 % ammoniumsul fatopløsning i en dobbeltblander. Efter sammenblandingen opvarmes blandingen til 38 eC. Efter at de 38 35 'C er opnået under konstant omrøring, indstilles pH-vær-dien til 8,8-9,2 med 40 % natriumhydroxidopløsning, og for at forhindre skadelige mikrobiologiske processer sæt- 12

DK 166393 B

tes 3 1 toluen til systemet.

Med tilsætning af enzymer fortsættes autolysen i 36 timer, temperaturen holdes på 38 “C, og systemet omrøres 5 fra tid til anden. pH-værdien kontrolleres hver 6. time, og om nødvendigt opretholdes den angivne pH-værdi ved hjælp af 40 % natriumhydroxidopløsning.

Efter 36 timers autolyse indstilles pH-værdien til mellem 10 7,3 og 7,7 med 18 % saltsyre, og blandingen bringes til kogepunktet. Efter 10 minutters kogning koagulerer de inerte bestanddele på grund af varmens indvirkning, og disse frasepareres på en sigte. Filtratet adskilles fra fedtstoffet ved 60 eC.

15

Den således fremstillede mørkebrune ekstraktvæske består af 638 1, heparinkoncentrationen er 18,1 IE/ml svarende fi til 11,54 x 10 IE heparin. Udbyttet sammenlignet med det efterfølgende eksempel 5 er kun 76 %.

20 SAMMENLIGNINGSEKSEMPEL 2

Den nye type heparinråmateriale af den tidligere angivne kvalitet ekstraheres ifølge eksempel 1 i US patentskrift 25 nr. 3 817 831. 40 kg råmateriale blandes grundigt med 400 1 vand i en dobbeltblander, pH-værdien indstilles til 2,7 med saltsyre, og blandingen opvarmes til 38 °C. Pepsin svarende til 10 kg svinemaveslimhinde tilsættes, og pH-værdien indstilles til den førnævnte værdi. Proteolysen 30 fortsættes i 20 timer under konstant omrøring, mens temperaturen holdes ved 37-39 °C.

Efter proteolyse i 20 timer indstilles pH-værdien til 8,0 med 40 % natriumhydroxid, og temperaturen indstilles til 35 37 °C. Derpå tilsættes 20 1 aktiveret pancreasblanding.

Den anden proteolyse opretholdes i 10 timer, hvorunder pH-værdien kontrolleres hver anden time, og den angivne 13

DK 166393 B

pH-værdi på 8 opretholdes om nødvendigt ved tilsætning af natriumhydroxid. Temperaturen fastholdes på 37 °C. Efter den anden proteolyse bringes blandingen til kogepunktet, hvorpå der filtreres gennem en sigte. Det således opnåede 5 brunlige filtrat er på 417 1, heparinkoncentrationen er 32,0 IE/ml, hvilket svarer til 13,32 x 10^ IE heparin. Sammenlignet med det efterfølgende eksempel 5 er udbyttet 62,7 %.

10 SAMMENLIGNINGSEKSEMPEL 3

Heparinråmaterialet af den i eksempel 1 angivne kvalitet forarbejdes ved en fremgangsmåde, der er beskrevet i ungarsk patentskrift nr. 148 776.

15 11,2 kg råmateriale blandes grundigt med 195 1 vand i en dobbeltblander, der tilsættes 6,5 kg natriumhydroxid, og derpå indstilles pH-værdien til 10 ved hjælp af 40 % natriumhydroxidopløsning. Under jævn omrøring hæves blan-20 dingens temperatur med damp til 65 °C, og der behandles med per oxid ved denne temperatur. 250 ml 40 % hydrogen-peroxid fortyndes med vand til 4 1, derpå blandes 1 liter af den fortyndede opløsning i blandingen. De resterende 3 1 indføres i apparaturet med jævn hastighed i løbet af 30 25 minutter, mens temperaturen holdes på 65 °C. Efter peroxid-behandlingen omrøres blandingen ved 65 °C i 1 time, der tilsættes 600 g ammoniumchlorid, hvorpå blandingen indstiller sig på pH-værdien 8,7. Blandingen opvarmes ved hjælp af dobbeltblanderens kappe til kogepunktet, og 30 efter kogning i 5 minutter stoppes opvarmningen og omrøringen. Blandingen henstår i 15 minutter, og den lysegule fuldstændig transparente væske over de ekstraherede organrester, der har samlet sig på bunden af apparatet, dekanteres ved hjælp af den udtømningsstuds, som er an-35 bragt på siden af apparatet. Efter dekantering hældes blandingen af organrester og vandig ekstrakt, der optager ca. 1/4 af apparaturet, efter sammenblanding på en sigte 14

DK 166393 B

med 0,8 mm maskevidde.

Rumfanget af de forenede ekstrakter er 168 1, heparinkon-centrationen er 32,4 IE/ml, hvilket svarer til et udbytte 5 på 5,44 x 10^ IE heparin. Udbyttet sammenlignet med det efterfølgende eksempel 5 er kun 72,4 %.

EKSEMPEL 4 10 5,0 kg heparinråmateriale af den i eksempel 1 angivne kvalitet opdeles i 10 lige store dele, og 0,5 kg portionerne forarbejdes ifølge specifikationerne for den intermitterende modstrømsekstraktion i 5 ekstraktionstrin. Ekstraktionstrinnene udføres som følger: 15

Den første portion på 0,5 kg tørret organ sættes ved temperaturen 40 °C til 3,2 1 ekstraktionsvæske i form af 6 % natriumchloridopløsning indeholdende 0,25 normal natriumhydroxid. Blandingen sammenblandes ved 40 eC i 20 minut-20 ter. Efter 20 minutter filtreres ekstrakten i vakuum på en Biichner-tragt, hvor filteroverfladen er en metalsigte med 0,6 mm maskevidde. Det første ekstraktionsfiltrat opsamles, dets rumfang måles, og heparinaktiviteten afprøves.

25

Det på sigten tilbageblevne våde organ blandes igen ved 40 °C med 6 % natriumchloridopløsning indeholdende 0,25 normal natriumhydroxid og i et rumfang på 3,2 1 ekstraktionsvæske. Den anden ekstraktion af det allerede en gang 30 ekstraherede organ udføres som ovenfor beskrevet. Det andet ekstraktionsfiltrat af den første portion tørret organ blandes med den anden portion på 500 g tørret organ, og ekstraktionsrumfanget fastlægges på 3,2 1 under anvendelse af de førnævnte opløsninger.

35

De yderligere behandlingstrin er nøjagtig de samme som sekvensen af den intermitterende, 5-trins modstrømseks-

DK 166393 B

I? 15 traktionsproces. Ekstraktionsrumfanget er altid 3,2 1 og temperaturen 40 °C.

Rumfang og heparinaktivitet af de opsamlede ekstrakter er 5 som følger:

Serie- Filtrat- Aktivitet Heparinindhold

nummer rumfang lE/ml lO^IE

10 I. 1770 83 0,147 II. 1810 118 0,214 III. 1790 133 0,238 IV. 1750 140 0,245 V. 1800 143 0,257 15 VI. 1770 153 0,271 VII. 1800 153 0,275 VIII. 1780 152 0,271 IX. 1815 149 0,270 X/I. 1790 153 0,274 20 -

Trin X. /2 1800 52,5 0,095

Trin 25 X. /3 1850 16,4 0,030

Trin X./4 1830 5,2 0,009

Trin X./5 1780 1,8 0,003 30 -

Total: 2,599 g

Ifølge tabellen opnås 2,599 x 10 IE heparin ud fra 5,0 35 kg heparinholdigt råmateriale med 90,4 % tørstofindhold under anvendelse af intermitterende 5-trins modstrømsekstraktion. Ud fra heparinaktiviteten af ekstraktionstrin- 16

DK 166393 B

nene for den 10. portion kan man slutte, at der har fundet tilbundsgående ekstraktion sted. Udbyttet er praktisk taget identisk med det, der opnås i det efterfølgende eksempel 5 (98,3 %).

5 EKSEMPEL 5

Heparinråmaterialet af den i eksempel 1 angivne kvalitet ekstraheres i et modstrøms system i en U-formet ekstraktør 10 som beskrevet i ungarsk patentskrift nr. 159 977.

Det tørrede råmateriale indføres kontinuert i ekstraktøren ved hjælp af en fødesnegl. Gennem de sprøjtedyser, der er anbragt oven over fødesneglen, tilsættes 0,55 n 15 natriumhydroxidopløsning indeholdende 6 % natriumchlorid og med en temperatur på 70 ‘C i et rumfang, der er dobbelt så stort som vægten af det tilførte produkt. Opholdstiden for materialet i fødesneglen er 10 minutter.

20 6 % natriumchloridopløsning indeholdende 0,1 n natrium hydroxid tilsætte i modstrøm med det opkvældede råmateriale, som føres ind i cellerne af den U-formede ekstraktør. Under den kontinuerte modstrømsekstraktion, som finder sted i apparaturet, opretholdes en temperatur på 50 25 °C, og for at lette overførslen af materialet underkastes dette en skubbende bevægelse med den vibrator, der er anbragt i bunden af den U-formede ekstraktør.

Den kontinuert dannede lysegule, næsten transparente eks-30 traktionsvæskes rumfang måles med rotameter, og hepa-rinkoncentrationen bestemmes på prøver taget hver 30. minut.

Heparinindholdet af den i modstrømsekstraktionssystemet 35 kontinuert dannede ekstrakt udskilles på samme måde i et kontinuert system, mens bundfaldet udvindes ved hjælp af et tromlefilter med henblik på yderligere forarbejdning.

17

DK 166393 B

Forarbejdningen udføres i et apparatur med en kapacitet på 10 kg tørret råmateriale pr. time, og i hvilket materialets opholdstid er 35 minutter. Efter 10 timers kørsel er heparinaktiviteten gennemsnitlig 252 IE/ml baseret på 5 en prøve taget fra de 210 1 ekstrakt. Dette repræsenterer £ et udbytte på 52,9 x 10° IE heparin i forhold til de forarbejdede 100 kg råprodukt med 90,4 % tørstofindhold.

Når den våde organrest, som blev udtømt fra den U-formede 10 ekstraktør, blev prøvet for heparinaktivitet, fandt man, at modstrømsekstraktionen kan gennemføres med et tab på mindre end 2 %.

Den ekstraherede organrest kan sælges som udmærket dyre-15 foder med højt proteinindhold.

20 25 30 35

Claims (5)

18 DK 166393 B

1. Fremgangsmåde til fremstilling af vandige organeks-5 trakter med et heparinindhold på mindst 120 IE/ml (internationale enheder/ml) med ensartet sammensætning og med lavt indhold af fedtstoffer og andre urenheder, kendetegnet ved, at man underkaster et amorft, granuleret, heparinberiget råmateriale, som har 90-95 vægt-% 10 tørstofindhold og en stor specifik overflade, en intermitterende eller kontinuert modstrømsekstraktion under anvendelse af en vandig saltopløsning med en elektrolytkoncentration på 1,5-12 vægt-% og en pH-værdi på 8-12,8 ved 20-80 °C. 15

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man under modstrømsekstraktionen afpasser det indbyrdes mængdeforhold mellem det materiale, der skal ekstraheres, og ekstraktionsvæsken til et vægtforhold 20 mellem tørstof og væske på 1:5 under hele processen, hvorved der dannes organekstrakter med en heparinaktivitet på mindst 105 IE/ml.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendete g-25 net ved, at den anvendte modstrømsekstraktion udføres intermitterende til fuldstændig ekstraktion.

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved, at modstrømsekstraktionen udføres 30 kontinuert, særligt i en i celler opdelt, vibreret, U-formet ekstraktør.

5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at ekstraktionen udføres i et en- 35 kelt apparatur.