NL8001693A

NL8001693A - Werkwijze voor de bereiding van orgaanextracten met een groot heparinegehalte.

Info

Publication number: NL8001693A
Application number: NL8001693A
Authority: NL
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1979-03-21
Filing date: 1980-03-21
Publication date: 1980-09-23
Also published as: AU5663780A; GB2045272A; DK166504C; IT8067438A0; GB2045272B; AU533021B2; JPH0232282B2; ATA144280A; GB2045271A; AT365927B; GR67681B; CA1137081A; PL222906A1; BE882370A; IN153527B; ES8102581A1; IT1133068B; FR2451743A1; ZA801480B; IT1133074B

Description

1 v 5 N. 0.28.882

Werkwijze voor de bereiding van orgaanextracten met een groot heparinegehalte._

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van orgaanextracten met een heparinegehalte uit heparine bevattende uitgangsmaterialen door tegenstroom-extractie in een water bevattend medium.

5 Het is algemeen bekend dat de verwerking van heparine bevat tende dierlijke organen en de extractie van het heparine duur en gecompliceerd zijn en · een extractieproces bestaande uit verscheidene opeenvolgende trappen voor verschillende doelen vergeriDe processen van de orgaanextractie 10 kunnen niet worden gescheiden van de methode van het verzamelen en conserveren van de heparine bevattende dierlijke organen, daar deze processen de industriële uitvoering van het extractieproces en ook de grootte van de bereikbare opbrengsten beslissend beïnvloeden.

De heparine-extractieprocessen vereisen lange procestijden, de 15 reproduceerbaarheid daarvan is onzeker; op grond daarvan wordt in de technische literatuur en de octrooiliteratuur uitgebreid ingegaan op het extractieproces met het oog op de doelmatigheid en de economische efficiëntie van de totale heparineproduktie. Het is duidelijk dat het meest belangrijke doel van de extractie is de 20 zo effectief mogelijke oplossing van de aanwezige hoeveelheden actieve component van de verschillende typen te verwerken uitgangsmaterialen na de verzameling en de bewaring van de organen volgens methoden die op de aanwezige hoeveelheden actieve component geen nadelige invloeden uitoefenen en geen ontledingen veroorzaken.

25 Een ander doel is de isolering van het eindprodukt met een farmaceutisch geschikte kwaliteit uit de heparine bevattende oplossingen in water verkregen door extractie met een doelmatige opbrengst en in een klein aantal procestrappen. Voor het bereiken van het gewenste doel is het vereist dat het vloeibare heparine-extract zo min moge-50 lijk verontreinigingen zoals heparinoide pyrogene kleurende poly-peptiden bevat die de zuivering bemoeilijken. Het is raadzaam dat het heparine zo selectief mogelijk wordt opgelost, daar de andere in het orgaanextract aanwezige componenten (vetten, lipoiden, proteïnen, peptiden, anorganische zouten) de isolering van het heparine 55 storen, dat wil zeggen dat de bereikbare opbrengst wordt verminderd en dat moeilijkheden. optreden bij de uitvoering van het be treffende proces, terwijl het eindprodukt niet altijd volledig kan 800 1 6 93 worden gezuiverd van de begeleidende stoffen. Het tevoren vermelde doel is in de produktie van de bekende typen uitgangsmaterialen met de uitvoering van de extractieprocessen niet volledig en optimaal gerealiseerd.

De drie fundamentele methoden voor de extractie van de heparine bevattende dierlijke organen zijn de volgende :

De theoretische opbouw van de eerste extractiemethode komt overeen met die volgens Charles en Scott, J. Biol. Chem. 102, 425» 1933· Deze methoden zijn gekarakteriseerd door de toepassing van de eigen hydrolyserende enzymen van de overlevende weefsels voor de extractie van het heparine bevattende, opengesneden, in het algemeen in sterk bevroren toestand gehouden orgaan. De autolyse wordt gedurende een lange periode uitgevoerd, want voor de coagu-latie van het extract wordt een middelmatig basische zoutoplossing gebruikt waarna wordt gekookt. De methoden van de autolyse zijn in de Amerikaanse octrooischriften 2 571 697 en 2 797 184 beschreven. Een werkwijze waarbij de autolyse wordt gecombineerd met een proces dat de extractie verder verbetert is in de Amerikaanse octrooischriften 2 884 358 en 3 016 331 beschreven.

Nadelen van de ex.'ractiemethode door autolyse zijn in het Hongaarse octrooischrift 148 778 en het Amerikaanse octrooischrift 2 587 924 beschreven. De nadelen die zijn gebaseerd op experiment tele resultaten kunnen worden toegeschreven aan een aantal redenen:

Tussen de extractie-oplossing en het orgaan dat in het extrac-tieproces dient te worden geëxtraheerd heerst een evenwichtstoestand; ondanks het grote vochtgehalte van het geëxtraheerde orgaan dient met een aanzienlijk heparineverlies te worden gerekend. Het verwijderen van het geëxtraheerde orgaan gaat onvermijdelijk gepaard met het verwijderen van vocht (ook heparine-oplossing) uit het systeem. Op grond van de verschillende autolysegraad van het medium stelt zich de evenwichtstoestand tussen het te extraheren orgaan en de extractievloeistof niet in alle gevallen in; in sommige gevallen is dus het verlies vanzelfsprekend groter.

Tijdens de bewaring van de organen voor de autolyse en tijdens de autolyse planten de heparine ontledende micro-organismen zich voort, waardoor de opbrengst wordt verminderd terwijl de bacteriële contaminatie ook in andere opzichten (aanwezigheid van pyrogenen en toxiciteit) nadelig is.

Een van de belangrijkste problemen van de methoden door autolyse heeft betrekking op de verzamelingvan de organen, welk de oor- 80 0 1 6 93 3 zaak is dat het verkregen extract geen constante samenstelling heeft. Door het grote volume dat ontstaat is de voor deze fase van het proces vereiste inrichting eveneens zeer groot. Ben uitvoering van het proces op industriële schaal is slechts mogelijk indien het 5 volume zodanig wordt verminderd dat het een heparine bevattend pro-dukt met een zuiverheid van ten minste 1 - 10 % oplevert. Door de schommelingen in de samenstelling varieert de kwaliteit van het verkregen produkt, zodat een economische produktie moeilijk kan worden gerealiseerd.

10 Volgens de tweede extractiemethode wordt de hoeveelheid ac tieve component van de heparine bevattende organen onder toepassing van chemicaliën gewonnen waarbij het heparine of het heparine-protelne-complex wordt opgelost. Deze werkwijzen zijn bijvoorbeeld in de Hongaarse octrooischriften 948 776 en 149 339» het Britse 1 5 octrooischrift 992 201 , de Amerikaanse octrooischriften 2 623 001, 3 058 884 en 3 262 854 beschreven. Echter heeft de extractie met een oplosmiddel een nadeel, namelijk, dat zoals bij de methode door autolyse orgaanresten met een groot vochtgehalte uit het systeem moeten worden verwijderd, waarbij afhankelijk van de concentratie 20 organische droge stof rekening moet worden gehouden met een aanzienlijk verlies aan heparine tot 20 - 40 gev.% (zie ter vergelijking het voorbeeld van het Hongaarse octrooischrift 148 776 en van het Britse octrooischrift 992 201). De variërende samenstelling van de gebruikte organen is ook in deze methode een nadeel, die 25 eveneens variërende samenstellingen van de extracten veroorzaakt en die de reproduceerbaarheid in de verdere verwerking onzeker maakt.

Met het oog op deze moeilijkheden wordt bijvoorbeeld volgens het Amerikaanse octrooischrift 2 623 001v een langdurige dialyse in een groot volume uitgevoerd na onderzoek- Tolgens de werk- 30 wijze van het Amerikaanse octrooischrift 3 262 854 wordt een organisch oplosmiddel gebruikt, dat als noodzaak wordt beschouwd in de fase van het grootste volume van de extractie.

Bij een samenvatting van de eerste groep methoden door autolyse en de tweede groep methoden waarbij slechts wordt gewerkt met een 35 chemische extractie blijkt als gemeenschappelijk nadeel dat tijdens de extractie - gewoonlijk wordt een enkelstromig proces uitgevoerd in slechts een of twee trappen, afhankelijk van de consistentie van de uitgangsmaterialen die tot dusverre in het algemeen werden gebruikt - de verkregen oplossingen verscheidene begeleidende en 40 storende verontreinigingen bevatten en dat de heparineconcentratie 4 daarvan met een waarde van 10-20 ÏÏE/ml of gemiddeld 0,01 gew.% zeer laag is. Met andere woorden dient voor het oplossen van 1000 MHE (6,5 kg) heparine de extractie in een volume van 50 000 - 100 000 liter te worden uitgevoerd met een minimaal verlies 5 aan heparine van 20 %.

Yolgens de derde groep extractiemethoden - ter verlaging van het verlies aan heparine en ter eliminering van de onzekerheid van de autolyse - worden de heparine bevattende organen zonder chemicaliën onderworpen aan een intensieve en langdurige proteolyse die 10 leidt tot een nagenoeg volledige of volledige oplossing onder toepassing van enzymen zoals trypsine, pancreas-extract, papaine, aan het systeem van buiten toegevoegd. Dergelijke werkwijzen zijn bijvoorbeeld in het Hongaarse octrooischrift 147 325, voorts in de Amerikaanse octrooischriften 2 587 924» 2 989 438 en 3 817 924 als-15 mede in de Amerikaanse octrooischriften 2 884 358 en 3 016 331 beschreven, waarbij de methode van een combinatie van de autolyse en de proteolyse onder toepassing van enzymen wordt toegepast.

Haast de bestaande doelmatige effecten wordt de economische efficiëntie van de laatstgenoemde extractiemethode nadelig beïnvloed 20 door de prijs van het proteolytische enzym dat nodig is voor de specifieke hoeveelheid van het orgaan. Bijvoorbeeld is volgens één van de vermelde methoden het toevoegen van 1,5 - 3 kg pancreas of pancreas-residu nodig voor 2 kg heparine bevattend orgaan. Indien de specifieke hoeveelheid van de enzymen wordt verlaagd worden het 25 proces van de proteolyse en het filtratieproces aanzienlijk verlengd. Yolgens het Amerikaanse octrooischrift 3 817 831 duurt de pepsine-autolyse 24 uren, de met pancreatine uitgevoerde autolyse 15 uren, waarna eerst een grove filtratie en daarna na 24 uren een ultrafiltratie wordt uitgevoerd. Een extra nadeel is dat het betrekkelijk 30 lang durende proces het gevaar van een bacteri'êle contaminatie vergroot, terwijl de aanwezigheid van de enzymen in die die van buiten worden toegevoerd de afbraak veroorzaken van de glucosidebindingen van heparine of andere ontledende enzymen versnellen de heparine-ontleding.

35 Als resultaat van de volledige of nagenoeg volledige proteolyse worden de componenten die aanwezig zijn in de dierlijke organen en die het heparine begeleiden opgelost, zoals de verbindingen van het muco-polysaccharide-type,mcleïnezuurderivaten, vetten, lipoiden, die een snelle en efficiënte verdere verwerking aanzienlijk nadelig 40 beïnvloeden. Yolgens voorbeeld 3 van het Amerikaanse octrooischrift 80 0 1 6 93 *· * 5 3 817 831 is na voltooiing van de proteolyse en de grove filtratie het gehalte aan organische droge stof 10-35 gew.^, dat wil zeggen drie keren groter dan het 0,027-gew.procents heparinegehalte in de oplossing B. Derhalve is de afvoer in kanalen en rivieren van de 5 van de processen afkomstige oplossingen vrij vanactieve component met betrekking tot de bescherming van het milieu een probleem.

Het produkt van het proces onder toepassing van proteolyse is een bijzonder verdunde oplossing met een concentratie van 6,45 NB/ml (0,004 - 0,03 %), in een meer geconcentreerde oplossing kan de 10 proteolyse niet worden uitgevoerd op grond van een toename in de inhibering van het substraat.

Het extraheren van dierlijke organen, dat wil zeggen het oplossen van de daarin aanwezige hoeveelheid heparine en de vermindering van het volume van de oplossingen is met betrekking tot de 15 efficiëntie en de reproduceerbaarheid de meest langdurige en de meest gecompliceerde fase van het totale produktieproces van de bereiding van dit farmaceutische produkt. De extractie neemt veel tijd in beslag doordat de proteolyse en/of de reeks chemisch-fysische processen in verscheidene trappen wordt uitgevoerd, want 20 de bijzonder lage concentratie actieve component vereist het installeren en het werken met een inrichting met een zeer groot volume.

De economische effeiciënt ie van de chemische extractie wordt door de chemicaliën die dienen te worden gebruikt en door de prijs van de enzymen b': j de proteolytische extractie nadelig beïnvloed. De 25 reproduceerbaarheid is onzeker, omdat op grond van de verschillende methoden van het verzamelen en de bewaring van de dierlijke organen het gehalte actieve component binnen brede grenzen schommelt, terwijl gelijktijdig de verdere verwerking door de verontreinigingen die in een enige keren grotere hoeveelheid aanwezig zijn nadelig 30 wordt beïnvloed.

Zo maken de bekende methoden van het verzamelen van organen die voor de heparinebereiding worden toegepast het niet mogelijk het eindprodukt in een farmaceutisch geschikte kwaliteit te verkrijgen zonder verlies of slechts met een klein verlies van het 35 heparinegehalte dat is achtergebleven in de loop van de gebruikelijke en onder behoud van een groot volume toegepaste bewaring van de organen. De extractiemethoden dienen aan de kwaliteit van het basismateriaal te worden aan gepast, anderzijds maakt het schommelen van deze kwaliteit het invoeren van bewerkingen in de extractie-40 processen nodig die een nadelige invloed uitoefenen op de selectieve ο ηn 1 * 07 6 heparine-extractie en die de gecompliceerdheid van de betreffende werkwijze vergroten.

Zo was het probleem dat aan de uitvinding ten grondslag lag het vereenvoudigen van de extractiemethoden, het verkorten van de 5 tijd van deze produktiefasen en het vergroten van de economische effeciëntie en het verbeteren van de selectiviteit. Volgens de uitvinding worden op een aanzienlijk eenvoudigere wijze extracten met een bijzonder grote concentratie van ten minste 120 NE/ml, een constante samenstelling en met een minimale hoeveelheid storende 10 verontreinigingen met minder energie en chemicaliën verkregen.

Volgens de werkwijze van de uitvinding wordt hetgeen ten doel is gesteld optimaal gerealiseerd.

De werkwijze volgens de uitvinding voor de bereiding van water bevattende extracten met een constante samenstelling en met 15 een bijzonder groot heparinegehalte van ten minste 120 NE/ml is gekenmerkt doordat men het met heparine verrijkte, amorfe korrelige, uitgangsmateriaal met een gehalte aan droge stof van 90 - 95 gew.$ en een groot specifiek oppervlak onderwerpt aan een intermitterende of continue extractie in tegenstroom in een water bevattend milieu in een 20 optimaal temperatuurgebied en bij de voor het betreffende verwerkingssysteem en uitgangsmateriaal vermelde pH onder toepassing van een zoutoplossing. De extractie in tegenstroom wordt bij een temperatuur tussen 20 en 80°C in een elektrolyt met een zoutconcentratie van 1,5 - 12,0 gew.% en in een pH-gebied van 8 - 12,8 of in een basische 25 oplossing met een concentratie van 0,5 - 1,0 uitgevoerd. De elektro-lytconcentratie, de temperatuur en de pH worden tijdens het proces van de extractie in tegenstroom constant gehouden. De voor de extractie gebruikte zoutoplossing wordt op een zodanige wijze op het droge orgaan toegepast dat vloeibare extracten met een concentratie 30 van 150 - 300 UE/ml worden verkregen. Daarvoor dient de verhouding van de droge stof tot de vloeistof tijdens het totale proces 1 : 5 te zijn. De gebruikte base met een waardigheid van één of meer is in ______ het algemeen natriumhydroxide of een andere basische oplossing die voor de heparine-extractie gebruikelijk is, terwijl de elektrolyt 35 een kation met een waardigheid van doelmatig één of meer is, die indifferent is met betrekking tot het heparinezout met organische of anorganische anionen, bij voorkeur natriumchloride. Met aan heparine verrijkt uitgangsmateriaal wordt zodanig uitgangsmateriaal bedoeld waarvan het heparinegehalte vergeleken met willekeurig natuurlijk 40 uitgangs-materiaal 5-35 gew.% groter is, betrokken op het gehalte 800 1 6 93 7 aan droge stof van het orgaan. De extractie in tegenstroom wordt in een inrichting volgens de intermitterende methode met uitputting of continu uitgevoerd, doelmatig in een vibrerende ïï-extractor. De U-extractor is in het Hongaase octrooischrift 159 977 beschreven, 5 waarvan is gebleken dat de inrichting behalve voor de extractie van geneeskundige kruiden bijzonder doelmatig is voor de werkwijze volgens de uitvinding ter verkrijging van water bevattende extracten met een groot heparinegehalte. In de inrichting wordt het korrelige, heparine bevattende uitgangsmateriaal dat dient te worden geëxtra-10 heerd onderworpen aan een ehkelstromige sproeibehandeling, gevolgd door een ehkelstromige sproeiproces, vervolgens een ehkelstromige uitzijging als voor-extraetie, vervolgens een extractie onder door-weking in tegenstroom onder vibratie en tenslotte een uitzijging na het extraheren. De inrichting is uit een celsysteem opgebouwd 15 dat de mogelijkheid van een terugmenging van de water bevattende extracten tussen de cellen uitsluit, terwijl gelijktijdig de vibratie-eenheden van de inrichting het bereiken van het extractie-evenwicht op het overeenkomstige tijdstip aanzienlijk vergemakkelijken. Het voordeel daarvan is dat zowel de hoeveelheid extractie-20 vloeistof betrokken op het materiaal dat dient te worden geëxtraheerd en de extractietijd alsmede de lengte van de extractieweg aanzienlijk kunnen worden verminderd.

Volgens een uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding die de voorkeur verdient werd uitgegaan van een met heparine 25 verrijkt, gedroogd, amorf korrelig orgaan-concentraat met een groot specifiek oppervlak verkregen volgens de werkwijze van het Hongaars octrooischrift nr. RI-705.

Als voordelen van de werkwijze volgens de uitvinding kunnen de volgende worden genoemds 50 1) In de enkelstromige extractie in een enkele trap of in twee trappen die gewoonlijk ter bereiding van heparine-extracten wordt toegepast is het geprogrammeerde variëren van de temperatuur, de waarden van de pH en de vereiste chemicaliën vereist. De extractie in tegenstroom volgens de uitvinding kan in dezelfde inrichting 35 worden uitgevoerd door een eenvoudig oplosproces uitgevoerd in een bekend systeem in een optimaal gekozen water bevattend basisch milieu zonder verandering van de procesomstandigheden en zonder de noodzaak van de toevoeging van verscheidene chamicaliën.

2) De extractie in tegenstroom levert de produktie van nage-40 noeg volledig vetvrije extracten met een constante samenstelling op 800 1 6 93 ö met een concentratie die met een factor 5 tot 10 groter is dan die bij de gebruikelijke extractie; de extractie in tegenstroom wordt met een korte procestijd uitgevoerd en met een doelmatige opbrengst en kan vergeleken met de gebruikelijke methoden met een aanzienlijk 5 gunstigere verhouding van het heparine begeleidende materiaal worden uitgevoerd.

3) De uitvoering van de extractie in tegenstroom is niet gebonden aan chemische eigenschappen van bepaalde als toevoegsels gebruikte chemicaliën, dat wil zeggen dat de extractie met de meest 10 geschikte en meest goedkope chemicaliën die verkrijgbaar zijn wordt uitgevoerd.

4) Het vereiste volume van de extractie in tegenstroom vergeleken met dat van de bekende methoden kan tot 1/4 - 1/10 worden verminderd, het heparine bevattende extract kan met een constante 15 snelheid worden verkregen, is tot een klein volume geconcentreerd, de volumeeapaciteit van de inrichting kan worden verkleind, de benuttingsgraad wordt verbeterd.

5) Voor het bereiken van een volledige afscheiding van het heparine uit het systeem van de extractie in tegenstroom en voor 20 het verkleinen van het volume is de toepassing van toevoerpompen en vacuum-trommelfilters voldoende, de continue afscheiding van het heparine kan worden bereikt door het toevoeren van quatemaire ammoniumverbindingen en een proteïne-oplossing met bekende eigenschappen en een bekende samenstelling en door het daaropvolgende 25 aanzuren van het systeem, dan door isoleren van het afgescheiden heparine bevattende neergeslagen produkt. — 6) Het verkleinen van het volume levert een aanzienlijke besparing aan energie op, een aanzienlijk kleinere hoeveelheid werk en het gebruik van aanzienlijk minder chemicaliën.

30 De voordelen van de uitvinding samenvattend kan worden gesteld dat de extracten met een bijzonder grote hoeveelheid heparine kunnen worden verkregen met een constante samenstelling door continu extraheren in tegenstroom, met een korte procestijd, in een klein volume en in een eenvoudige inrichting. ïïit deze extracten kan het 35 isoleren van het heparine met een farmaceutisch geschikte kwaliteit efficiënt op gebruikelijke wijze worden uitgevoerd.

Indien ter uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding de U-extractor volgens het Hongaarse octrooischrift 159 977 wordt gebruikt en indien de extractie in de inrichting wordt uitgevoerd 40 met een extraheringsoplossing met een temperatuur van 50°C, een 800 1 6 93 9 concentratie van 0,5 - 1,0 N, die ten minste 5 gew.% natriumchloride "bevat met een verblijftijd van 50 minuten, kan de actieve component volledig worden geëxtraheerd uit het heparine bevattende orgaan-concentraat. De verhouding van het gedroogde orgaan-concentraat 5 tot de extractievloeistof wordt op 1 : 5 ingesteld. Het orgaan- concentraat met een groot specifiek oppervlak zwelt ’ middelmatig op. met de watertoevoer, echter behoudt het concentraat de vocht vasthoudende korrelige aard en de uitstekende filtratie-eigenschap, zelfs bij een grote base-concentratie. Een vergroting van de base-10 concentratie beïnvloedt nauwelijks de hoeveelheid opgeloste niet--heparine organische stof gerekend als droge stof en de hoeveelheid opgeloste proteïnen en peptiden variëren ook niet. Als oorzaak daarvan wordt aangenomen dat de proteïnen die het belangrijkste gedeelte van het te extraheren orgaan uitmaken hoofdzakelijk en ir-15 reversibel worden gedenatureerd, waarbij de denaturering tijdens de droging plaats heeft.

De werkwijze volgens de uitvinding wordt door de volgende voorbeelden geïllustreerd. Enige vergelijkende voorbeelden dienen voor het aantonen van de voordelen van de extractiewerkwijze volgens 20 de uitvinding.

Voorbeeld I (vergelijkend voorbeeld)

Het heparine bevattende uitgangsmateriaal verkregen volgens de werkwijze van het Hongaarse octrooischrifivRI-705 werd op gebruikelijke wij?e geëxtraheerd door autolyse bij aanwezigheid van tolu-25 een en onder toepassing van elektrolyt-oplossingen.

20 kg heparine bevattend uitgangsmateriaal van de bovengenoemde kwaliteit werden in een menginrichting met contra-rotatie intensief gemengd met 100 kg fijn gemalen dunne darm van een big met een gehalte aan droge stof van 18 gew.%, 450 liter water en 150 liter van 50 een 10-gew.procents ammoniumsulfaatoplossing. Na het mengen werd het mengsel op 38°C verwarmd. Na het roeren bij 38°C werd de pH met 40-gew.procents natriumhydroxide op 8,8-9,2 ingesteld en ter voorkoming van storende microbiologische processen werden aan het mengsel 5 liter tolueen toegevoegd.

55 Na de toevoeging van enzymen werd de autolyse J>6 uren uitge voerd, de temperatuur werd op 38°C gehouden en het systeem werd periodiek geroerd. De pH werd iedere zes uren gecontroleerd en indien nodig werd de pH door toevoeging van 40-gew.procents natriumhydroxide op de vereiste waarde gehouden.

40 Na de autolyse van 36 uren werd de pH met 18-gew.procents 10 zoutzuur op 7j3 - 7>7 ingesteld en het mengsel werd aan de kook gebracht. Ha 10 minuten koken coaguleerden de indifferente gedeelten door de warmte; het coagulaat werd afgefiltreerd. De hoeveelheid vet werd bij 60°C uit het filtraat afgescheiden.

5 Het donkerbruin gekleurde vloeibare extract werd in een hoe veelheid van 638 liter verkregen, de heparineconcentratie was 18,1 HE/ml, in overeenstemming met 11,54 MHE heparine. De opbrengst vergeleken met die van voorbeeld Y was slechts 76 %·

Yoorbeeld II (vergelijkend voorbeeld) 10 Het nieuwe type heparine bevattend uitgangsmateriaal van de bovengenoemde kwaliteit werd volgens voorbeeld 1 van het Amerikaanse octrooischrift 3 817 831 geextraheerd. 40 kg uitgangsmateriaal werd in een menginrichting met contra-rotatie met 400 liter water intensief gemengd, de pH werd met chloorwaterstofzuur op 2,7 ingesteld 15 en het mengsel werd op 38°C verwarmd. Pepsine, in overeenstemming met 10 kg maagslijm van een big werd toegevoegd en de pH werd op de bovengenoemde waarde ingesteld. De proteolyse werd 20 uren onder constant roeren uitgevoerd, de temperatuur werd op 37 - 39°C gehouden .

20 Ha de proteolyse van 20 uren werd de pH met 40-gew.procents natriumhydroxide op 8,0 ingesteld en de temperatuur werd op 37°C gebracht, daarna werden 20 liter van een geactiveerd alvleesklier-mengsel toegevoegd. De tweede proteolyse werd 10 uren uitgevoerd, de pH werd iedere 2 uren gecontroleerd en indien nodig werd de ge-25 wenste pH van 8 gehandhaafd door toevoeging van natriumhydroxide.

De temperatuur werd op 37°C gehandhaafd. Ha de tweede proteolyse werd het mengsel aan de kook gebracht, vervolgens door een zeef gefiltreerd. Op deze wijze werd een bruinachtig filtraat in een hoeveelheid van 417 liter verkregen, de heparineconcentratie was 30 32,0 HE/ml, in overeenstemming met 13>32 MHE heparine. Vergeleken met voorbeeld V was de opbrengst 62,7 %·

Yoorbeeld III (vergelijkend voorbeeld)

Heparine bevattend uitgangsmateriaal met een kwaliteit zoals dat van voorbeeld 1 werd volgens een werkwijze beschreven in het 35 Hongaarse octrooischrift 148 776 verwerkt.

11,2 kg uitgangsmateriaal werd in een menginrichting met contra-rotatie met 195 liter water intensief gemengd, 6,5 kg natriumhydroxide werden toegevoegd, daarna werd de pH met 40-gew.procents natriumhydroxide op 10 ingesteld. Onder gelijkmatig roeren werd 40 de temperatuur van het mengsel met stoom op 65°C gebracht, waarna 800 1 6 93 11 het mengsel met peroxide bij de vermelde temperatuur werd behandeld. 25Ο ml 40-gew.procents waterstofperoxide werd met water tot een volumehoeveelheid van 4 liter verdund, daarna werd 1 liter van het verdunde waterstofperoxide aan het mengsel toegevoegd. Be reste-5 rende 3 liter werden met een constante snelheid in 30 minuten onder handhaving van de temperatuur op 63°C in de inrichting gebracht.

Na de behandeling met peroxide werd het mengsel 1 uur bij 65°C geroerd, waarna 600 g ammoniumchloride werden toegevoegd nadat de pH van het mengsel op 8,7 was ingesteld. Het mengsel werd via de om-10 manteling van de roerder met contra-rotatie aan de kook gebracht, na 5 minuten koken werd met het verwarmen en het roeren gestopt.

Het mengsel liet men 15 minuten staan en de lichtgele, volledig transparante vloeistof boven de geëxtraheerde orgaanrest op de bodem van het betreffende vat werd via een afvoer aan de zijkant van 15 de inrichting gedecanteerd. Na het decanteren werd het mengsel van de orgaanrest en het water bevattende extract, dat ongeveer 1/4 deel van de inrichting innam, na geroerd te zijn op een zeef met een maaswijdte van 0,8 mm gegoten.

Het volume van de samengevoegde extracten was 168 liter, de 20 heparineconcentratie was 32,4 NE/ml, in overeenstemming met 5,44 MNE heparine als opbrengst. Be- opbrengst vergeleken met voorbeeld Y was slechts 72,4 %·

Yoorbeeld IY

5,0 kg heparine bevattend uitgangsmateriaal met een kwaliteit 25 zoals dat van voorbeeld I werden in 10 gelijke delen gedeeld en de ----- ---porties van 0-,5 kg werden volgens de werkwijze van de intermitterende extractie in tegenstroom in 5 extractietrappen verwerkt. He extractietrappen werden als volgt uitgevoerd :

He eerste portie van 0,5 kg gedroogd orgaan werd met 0,25 H 30 natronloog die 6 gew.% natriumchloride bevatte gebracht tot een extractievolume van 3>2 liter bij 40°C· Het mengsel werd 20 minuten bij 40°C geroerd. Na 20 minuten werd het extract op een Biichner-filter met een metalen zeef met een maaswijdte van 0,6 mm als filter onder toepassing van vacuum gefiltreerd. Men verkreeg het eerste 35 extractie-filtraat waarvan het volume werd bepaald en de heparine-activiteit werd onderzocht.

Be als rest op de zeef resterende hoeveelheid vochtig orgaan werd opnieuw met 0,25 N natronloog die 6 gew.% natriumchloride bevatte tot een extractievolume van 3>2 liter bij 40°C gemengd.

40 He tweede extractie van de reeds één ..keer geëxtraheerde hoeveel- 800 1 6 93 f heid orgaan werd zoals tevoren is beschreven uitgevoerd. Het tweede extractiefiltraat van de eerste portie van de hoeveelheid gedroogd orgaan werd gemengd met de tweede portie gedroogd orgaan van 0,5 kg en het extractievolume werd onder toepassing van de bovengenoemde 5 oplossingen op 3,2 liter ingesteld.

De daaropvolgende trappen kwamen volledig overeen met die van de intermitterende extractiewerkwij ze in tegenstroom in 5 frappen Het extractievolume was steeds 3,2 liter, de temperatuur 40°C.

De volumina en de heparine-activiteiten van de verkregen ex-10 tracten zijn in de tabel vermeld.

TABEL·

Hummering Volume van Activiteit Heparine-gehalte

van de het fil- NE/ml MHE

porties traat 1 1770 83 0,147 2 1810 118 0,214 3 1790 133 0,238 4 1750 140 0,245 5 1800 143 0,257 6 1770 153 0,271 7 1800 153 0,275 8 1780 152 0,271 9 1815 149 0,270 10/1. 1790 153 0,274 trap 10./2 1800 52,5 0,095 trap 10./3 1850 16,4 0,030 trap 10./4 1830 5,2 0,009 trap 10./5 1780 1,8 0,003

Totaal : 2,599 800 1 6 93

Volgens de tabel werden onder toepassing van de intermitterende extractie in tegenstroom in 5 procestrappen 2,599 MB® hepa-rine verkregen uit 5>0 kg heparine bevattend uitgangsmateriaal met een gehalte aan droge stof van 90»4 gew.%. ïïit de heparine-aetivi-5 teit van de trap van de extrahering van de tiende portie kan worden geconcludeerd dat een uitputtende extractie had plaats gevonden.

De opbrengst was nagenoeg gelijk aan die van voorbeeld V (98,3 %) · Voorbeeld V

Het heparine bevattende uitgangsmateriaal met een kwaliteit 10 volgens voorbeeld I werd in tegenstroom geextraheerd in een U- extractor die is beschreven in het Hongaarse octrooischrift 159 977·

Het gedroogde uitgangsmateriaal werd continu met een toevoer-inrichting met worm in de extractor gebracht. Door sproeikoppen die boven de toevoerplaats waren aangebracht werd 0,55 N natronloog 15 die 6 gev.% natriumehloride bevatte met een temperatuur van 70°C toegevoegd in een volume dat overeenkwam met twee keren van het gewicht van het toegevoerde produkt. De verblijftijd van het materiaal in de toevoerinrichting met worm was 10 minuten.

0,1 N natronloog die 6 gew.% natriumehloride bevatte werd in 20 tegenstroom aan het tot zwelling gebrachte uitgangsmateriaal toegevoegd dat in de cellen van de ïï-extractor was gebracht. Tijdens -de continue extractie in tegenstroom werd in de inrichting een temperatuur van 50°C gehanhaafd en ter bevordering van de stof-overdracht werd het materiaal onderworpen aan stootbewegingen met 25 behulp van een vibrator die was aangebracht bij de bodem van de ïï-extractor.

Het volume van het continu verkregen lichtgele zwak transparante vloeibare extract werd met een rotameter gemeten en de heparine-concentratie werd bepaald aan de hand van een monster dat iedere 50 30 minuten werd genomen.

De hoeveelheid heparine van het continu verkregen extract in het systeem van de extractie in tegenstroom werd op overeenkomstige wijze in een continu systeem afgescheiden, terwijl de precipitatie werd bereikt met behulp van een trommelfilter, bestemd voor de ver-3 5 dere verwerking.

De verwerking werd uitgevoerd in een inrichting met een capaciteit van 10 kg gedroogd uitgangsmateriaal per uur met een verblijftijd van het materiaal van 55 minuten. Na een procestijd van 10 uren was de heparine-activiteit gemiddeld 252 NE/ml, betrokken op het 40 monster dat was genomen van het extract van 210 liter. Dit betekende 80 0 1 6 93 14 een heparine-opbrengst van 52,9 MNE betrokken op de verwerkte 100 kg produkt met een gehalte aan droge stof van 90*4 gew.%.

cLe

Bij de proef op heparine-activiteit van de natte orgaan-rest die uit de U-extractor werd afgevoerd bleek dat de extractie in 5 tegenstroom met een verlies minder dan 2 ge\r.% kon worden uitgevoerd. De aan de extractie onderworpen orgaan-rest kan als uitstekend voedsel voor dieren met een groot proteïnegehalte in de handel worden gebracht.

80 0 1 6 93

Claims

1. Werkwijze voor de bereiding van water bevattende extracten met een constante samenstelling, met een laag vetgehalte en een laag gehalte aan andere verontreinigende bestanddelen, met een 5 bijzonder groot heparinegehalte van ten minste 120 NE/ml, met het kenmerk, dat men het aan heparine verrijkte, amorfe korrelige vocht vasthoudende uitgangsmateriaal met een gehalte aan droge stof van 90 - 95 gew.% en met een groot specifiek oppervlak . onderwerpt aan een intermitterende of continue extractie in 10 tegenstroom onder toepassing van een zoutoplossing bij een temperatuur en een pH die optimaal zijn voor het betreffende processysteem en het uitgangsmateriaal.

2. Werkwijze volgens conclusie 1,met het kenmerk, dat men de extractie in tegenstroom uitvoert bij een tem- 15 peratuur tussen 20 en 80°C.

3. Werkwijze volgens conclusies 1 en 2,met het kenmerk, dat men de extractie in tegenstroom uitvoert onder toepassing van een elektrolyt (zout) concentratie van 1,5 - 12,0 gew.^.

4. Werkwijze volgens conclusies 1 - 3, ui e t het ken-20 m e r k, dat men de extractie in tegenstroom uitvoert bij een pH van 8 - 12,8 of in een basische oplossing met een normaliteit van 0,5 - 1,0.

5. Werkwijze volgens conclusies 1-4, met het kenmerk, dat men de verhouding van het materiaal dat dient te worden 25 geëxtraheerd totde extractievloeistof in de extractie in tegenstroom zodanig regelt dat extracten met een heparine-activiteit van ten minste 150 NE/ml worden verkregen.

6. Werkwijze volgens conclusies 1-5,met het kenmerk, dat men de extractie in tegenstroom uitvoert volgens de 30 intermitterende uitputtende methode.

7. Werkwijze volgens conclusies 1-5,met het kenmerk, dat men de extractie in tegenstroom continu uitvoert in een U-extractor met vibratie en met verdeling in cellen.

8. Werkwijze volgens conclusies 1 - 7, m e t het k e n-35 m e r k, dat men de extractie in een enkele inrichting uitvoert. 800 1 6 93