CS248012B2

CS248012B2 - Production method of the raw material containing heparin with the enriched of active compound

Info

Publication number: CS248012B2
Application number: CS801898A
Authority: CS
Inventors: Istvan Takacs; Gyorgy Kerey; Janos Illes; Peter Rudolf; Pal Gere; Laszlo Czebe; Erzsebet Neszmelyi
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1979-03-21
Filing date: 1980-03-19
Publication date: 1987-01-15
Also published as: GB2045272A; SE8002126L; AT365927B; ES8102580A1; ES490538A0; DE3010972A1; DK166393C; NZ193215A; IT1133074B; JPS55164201A; AU529809B2; CA1152894A; FR2451743A1; IT1133068B; DD149467A5; DE3011062A1; NZ193188A; AU5663780A; CS248011B2; IT8067444A0

Description

Vynález se týká způsobu výroby suroviny obsahující heparin s obohaceným obsahem aktivní složky, stálého složení s nízkým obsahem tuků a nízkým počtem zárodků mikroorganismů, která je skladovatelná beze změny morfologie a obsahu aktivní složky, přičemž se vychází ze živočišných orgánů, případně rozřezaných na velikost v rozmezí od 4 do 6 milimetrů.

Heparin je vzhledem ke svým antikoagulačním vlastnostem důležitým léčivým prostředkem. Syntetická výroba heparinu není dosud vyřešena, a tak jsou surovinou pro výrobu heparinu v provozním měřítku stále živočišné orgány bohaté na heparin, jako jsou například plicní laloky a tenké střevo prasat, hovězího dobytka a ovcí, přičemž obsah aktivní složky (tzn. heparinu) v živočišných orgánech, považovaných za bohaté na heparin, je jen v rozmezí od 10 ~²do 10~³ jejich hmotnosti, což je značně málo. Separace malého množství aktivní složky (což je heparin s obsahem inaktivních látek, jako jsou tuky, anorganické soli, polypeptidy, nukleotidy a nukleosidy) z velkého množství balastní hmoty v dané surovině je sama o sobě problematická, ale je ještě problematičtější, jestliže doprovodné materiály mění své vlastnosti, jako je to při rozkladu během skladování nebo při dopravě suroviny.

Vzhledem к výše uvedenému je pro realizovanou ekonomickou průmyslovou výrobu rovněž velmi důležité, navíc к samozřejmému požadavku konzervace celkového obsahu heparinu v živočišném orgánu až do doby zpracování, aby fyzikální, chemické a morfologické vlastnosti inaktivních látek, představujících hlavní část živočišného orgánu, zůstaly nezměněny. Jakákoliv změna vlastností inaktivních látek může vyvolat problémy při zpracovávání a čištění během farmaceutické výroby surovin obsahujících heparin (jako například při extrakci, atd.), což může způsobit, že produkce vhodného konečného produktu je ekonomickým způsobem nemožná.

Z hlediska ekonomické výroby je třeba, aby se těmto požadavkům vyhovělo již během přípravy základní suroviny bohaté na heparin, tzn. během shromažďování a uskladňování.

Na důležitost shromažďování a uskladňování surovin obsahujících heparin je upozorňováno jen v několika patentech, například v maďarském patentu č. 147 776 a č. 149 329 a v patentu Spojených států amerických č. 2 587 924, ale i dokonce i tyto patenty se zabývají touto problematikou jen okrajově. Význam vhodného· zpracování surovin během shromažďování a uskladňování je zřejmý vzhledem к následujícím obecně známým skutečnostem.

Živé orgány, které jsou ve fyziologické rovnováze, obsahují heparin v různých formách. Zejména je tato látka vázána na různé proteiny. Jestliže se zvířata porazí, zruší se tato fyziologická rovnováha živých orgánů a tkání, přičemž ihned započne autolýza a hydrolýza, nejdříve všech proteolitických enzymů přežívajících v tkáních, což má za následek nekontrolovaný rozklad přidružených balastních materiálů, často spojený s rozkladem aktivní složky.

Na druhé straně při shromažďování a uskladňování živočišných orgánů, což se obvykle uskutečňuje za nesterilních podmínek, nastává mikrobiologická kontaminace, jejímž následkem se uvolňují rozkladné enzymy proteinů a aktivní složky. Jejich účinek je stejný jako v předešlém případě. V patentu Spojených států amerických číslo 2 884 358 (viz sloupec 1, řádky 51 — 53) se upozorňuje na nepěkný zápach vznikající během skladování živočišných orgánů, dále na odbarvování dokonce i konečného produktu, na vznik pyrogenicity a snížení výtěžku konečného produktu.

Dosud se pro shromažďování a uskladňování živočišných orgánů obsahujících heparin uplatnily tři způsoby:

— rychlé zmrazení a uskladnění za hlubokého chladu pro orgány v původním stavu, — rychlé ochlazení živočišných orgánů a uskladňování za hlubokého chladu, prováděné po tepelné denaturaci (což je zpracování, jehož cílem je převedení živočišných orgánů v přírodním stavu na modifikovanou formu, která může být skladována po dlouhou dobu, přičemž uvedená tepelná denaturace se obvykle provádí rozdrcením materiálu a smícháním s vodou), — konzervace vodou zředěného rozemletého produktu z živočišných orgánů (v případě sliznice bez rozdrcení, ale po částečném odvodnění zředěné vodné suspenze vytvořené během čištění střev) chemickými látkami, obvykle různými anorganickými solemi.

Nevýhoda prvních dvou uvedených postupů spočívá v tom, že jsou energeticky, investičně a pracovně velmi náročné. Dosažení teploty —18^QC velkou rychlostí a její udržení během uskladnění živočišných orgánů a potom během dopravy až do okamžiku zpracování vyžaduje vysoké energetické a investiční náklady, jinak řečeno musí být к dispozici spolehlivě fungující chladicí soustava. Při dopravě živočišných orgánů s vysokým obsahem vody (to znamená v rozmezí od 77 do 85 %), při expedici, dopravě a přípravě výroby (to znamená drcení ve zmrzlém stavu) je pracovní náročnost zajišťována velkou kapacitou pracovní síly.

Třetí způsob, to znamená konzervace chemickými látkami, je nepochybně méně energeticky náročný než předešlé postupy, ale vzhledem к vysokému obsahu vody ve shromážděném materiálu (které je v rozmezí od 86 do 90 %) je značně vyšší dopravovaný objem materiálu a tím i dopravní náklady. Koroze speciálních dopravních a skladových zařízení, používaných pouze pro tento účel, je intenzivnějším vlivem použití chemických látek, přičemž ochrana proti mrazu a dopravních zařízení při teplotách stále se pohybujících pod bodem mrazu, je obtížná a nákladná. Za účelem snížení dopravních a skladovacích nákladů se při tomto způsobu konzervování živočišných orgánů pomocí chemických látek používá jen určitá část orgánů ve zředěných vodných roztocích (například vodná kaše ze sliznice, vzniklá během čištění střev), takže se shromáždí podíl obsahující relativně velké množství sušiny a aktivní složky. Ovšem tímto· způsobem se sníží množství shromážditelných živočišných orgánů z každého zvířete a tím i množství heparinu, takže k získání stejného množství obsahu heparinu je zapotřebí zařízení v několika jatkách.

Nevýhoda všech těchto tří způsobů zpracování uvedených výše, spočívá v tom, že při těchto postupech mohou být vytvořeny během shromažďování a uskladňování živočišných orgánů jenom téměř bakteriostatické podmínky (tzn. že je zabráněno šíření bakterií, ale jejich funkce může dále probíhat), ' což znemožňuje funkci enzymů jenom částečně nebo vůbec ne. Jakákoli technologická selhání (například periodické přerušení chladicího systému, vyšší počáteční počet bakterií, znečištění, atd.) může vést k narušení přibližně bakteriostatického stavu, ke ' zvýšení a nekontrolovatelnému působení enzymů, čímž dochází k intenzivnějšímu snížení obsahu aktivní složky a ' změně složení živočišného orgánu, což zase vede ke zpracovatelským a technologickým problémům.

Problémy způsobené změnou složení živočišného orgánu (při rozkladu) jsou větší při vysokém obsahu tuku v půsodním živočišném orgánu.

Vzhledem k nevýhodám, vyskytujícím se v použitých shromažďovacích metodách podle dosavadního stavu techniky, vyvstává potře ba vyvinout postup, který by byl snadno realizovatelný v praxi, při němž by byl čerstvý živočišný orgán zpracován na materiál obohacený heparinem kontinuálním způsobem v původním místě výskytu nebo by byl zpracován na' snadno skladovatelný meziprodukt. Podobně vyvstává požadavek na vyřešení postupu okamžitého · vysušování čerstvých živočišných orgánů (odvodnění rozpouštědlem při sušení během vymrazování a při granulaci) a zpracovávání takto získaného· stabilnějšího granulovaného orgánu po uskladnění.

Ovšem aplikace takovýchto způsobů se zdá být proveditelná jen za laboratorních podmínek, vzhledem k ekonomickým problémům (tzn. vysoké ceně rozpouštědla nebo vysokým provozním a investičním nákladům), viz: Methods · of Biochemical Anal., sv. 24, str. 244, 1977; Methods of Biochemical Anal., sv. 7, str. 269; Methods of Carbon. Chem., sv. 7, str. 90, 1976.

Vzhledem k výše uvedenému je možno shrnout, že první fáze výroby heparinu v · průmyslovém měřítku, tzn. shromažďování živočišných orgánů obsahujících heparin a nutné uskladňování této· suroviny před zpracováním, není optimálně vyřešeno, neboť složení a tím i obsah aktivní složky kolísá v širokých mezích. Patentované postupy, zabývající se výrobou heparinu v průmyslovém měřítku, se tudíž pokoušejí zavést takové technologické stupně do postupu extrakce aktivní složky, které by umožnily účinné zpracování dostupných nejcharakterističtějších živočišných orgánů průměrné kvality. Z předchozího tedy vyplývá, že výrobní technologie nemohou být realizovány v optimálním měřítku vzhledem ke kolísající kvalitě živočišných orgánů.

Podstata způsobu výroby suroviny obsahující heparin s obohaceným obsahem této aktivní složky, která je stálého složení s nízkým obsahem tuků a nízkým počtem zárodků mikroorganismů a skladovatelná beze změny morfologie a obsahu aktivní složky, přičemž se vychází ze živočišných orgánů, případně rozřezaných na velikost v rozmezí od 4 · do· 6 milimetrů, ip^ille uvedeného vynálezu spočívá v tom, že · se z těchto živočišných orgánů připraví vodná suspenze s obsahem sušiny o hmotnostní koncentraci v rozmezí od 1,5 do 17,0 %, tato· suspenze se ponechá při teplotě v rozmezí od 10 do 50° •Celsia po dobu v rozmezí od 0,15 do · 15,0 hodin, ve výhodném provedení podle vynálezu při teplotě v rozmezí od 30 do· 50 °C po dobu v rozmezí od 4 do 6 hodin, komplex obsahující heparin, který je nerozpustný ve vodě, se oddělí · od této předem zpracované suspenze při teplotě v rozmezí od 75 do· 100 °C a tento komplex se tepelně zpracuje kontinuálním nebo· diskontinuálním způsobem při teplotě v rozmezí od 85 do 100· °C po dobu v rozmezí od 2 do 15 minut za vzniku snadno filtrovatelné sraženiny, která se potom oddělí a izolovaný · produkt se usuší při teplotě v rozmezí od 60 do 100 °C, výhodně v rozmezí od 80 do 100 °C, za vzniku produktu s obsahem sušiny a hmotnostní koncentraci v rozmezí od 90· do 95 °/o.

Postup podle uvedeného vynálezu, který je zaměřen na výrobu suroviny nového typu pro výrobu heparinu v průmyslovém měřítku a v kontinuálním systému, umožňuje optimální využití · výchozího materiálu obsahujícího heparin, · se současným odstraněním inaktivních látek · přítomných v živočišných orgánech (tzn. tuky, anorganické soli, polypeptídy, nukleotidy, nukleosidy atd.), čímž se takto dosáhne vysoké koncentrace obsahu aktivní složky v získaném materiálu, který je výchozím materiálem pro zpracování na heparin, v dosud nedosažené míře. Navíc chemické, fyzikální a morfologické složení získaného materiálu je konstantní.

Jestliže je tento materiál, získaný postupem podle uvedeného vynálezu, skladován při teplotě okolí, zachovává si své složení po· neomezenou dobu bez potřeby speciálních podmínek včetně počtů zárodků mikroorganismů, který je velmi nízký za použitých podmínek. Z této· suroviny nového typu je možno vyrobit konečný produkt terapeutické kvality, tzn. heparinu, přičemž je možno· použít jakéhokoliv známého průmyslového postupu pro · získávání heparinu, a vzhledem k nezměněnému složení, vysokému obsahu heparinu ' a malému množství doprovodného· materiálu a nízkému obsahu tuků může být výrobní technologické zařízení ve velké míře optimalizováno. Vzhledem k fyzikálnímu stavu této nové suroviny, která je v konečném stadiu ve formě granulí s velkým povrchem, amorfní, 'zachovávající si svou vnější formu dokonce i v mokrém prostředí, je možno dosáhnout dalších výhod v tak zvané extrakční fázi průmyslové výroby heparinu (možnost protiproudé extrakce).

Výhody postupu podle uvedeného vynálezu je možno shrnout v následujících bodech:

— při postupu podle uvedeného vynálezu je možno vyrobit nový 'typ suroviny bohaté na heparin s hmotnostním obsahem sušiny v rozmezí od 90 do· 95 %, kterou je možno uskladnit beze změny obsahu aktivní složky a si. ožení při normální teplotě po dlouhou dobu, — v případě extrakce obsahu heparinu je možno dosáhnout optimálního výtěžku, jenž je vztažen na jednotku živočišného· or- J gánu, &

— nutné úpravy ve strojním zařízení na zpracování živočišných orgánů jsou snadno proveditelné, což představuje malé prostorové požadavky a malé požadavky na energetické a investiční náklady, — počet zárodků mikroorganismů v surovině obohacené . na heparin je nízký, přičemž tento koncentrát obsahuje malé . množství lipoidů a tuků, — pokud se 'týká dalšího· technologického zpracování nové 'suroviny získané při postupu · podle uvedeného vynálezu je konzistence a rozměr granulí u tohoto materiálu nejvýhodnější, přičemž heparin izolovaný vlivem tepla a vázaný na· přírodní proteiny se snadno mobilizuje, to znamená, že může být snadno znovu rozpuštěn, — stálé · složení suroviny s obohaceným obsahem heparinu umožňuje zjednodušení a optimalizaci úplné technologie zpracování, — transport suroviny dokonce i na dlouhou vzdálenost je ekonomický, — v případě kontinuálního zpracovávání je ' požadavek na pracovní síly malý.

Výchozí surovinou pro postup podle uvedeného vynálezu tenké střevo prasat, sliznice, pohrudnice, pobřišnice, dobytčí plíce, ale je· možno pro tento postup použít každý jiný orgán obsahující heparin, jako tenké střevo hovězího dobytka, ovcí, dobytčí slezina, jiné vnitřnosti, játra atd.

Jestliže se použije sliznice, potom rozře zání a zřeďování vodou není nutné. Jiné živočišné orgány se nařežou na rozměr v rozmezí od 4 do 6 milimetrů a připraví se vodná suspenze, která obsahuje heparin a proteiny v různé míře v roztoku a také ve formě koloidního roztoku. Vodná suspenze se upraví na obsah sušiny v rozmezí od 1,5 do 17 % hmotnostních. Zředění se provede vodou, výhodně o· teplotě v rozmezí od 36 do 42 °C, takže vnější ohřev při předběžném zpracování není nutný, nebo je potřebný jen v malé míře.

Takto získaná suspenze, připravená z obvyklých materiálů obsahujících heparin, se předběžně zpracuje při teplotě pohybující se v rozmezí · od 30· · do 50· °C obvykle v · časovém intervalu v rozmezí od 2 do 6 hodin. Po předběžném zpracování se provede vysrážení komplexu heparinu s proteinem přímým proudem vodní páry nebo· 'tepelným zpracováním, prováděným po delší dobu, přičemž hlavní část přítomného heparinu se váže na filtrovatelné proteiny. Tepelné zpracování se provádí kontinuálním nebo diskontinuálním způsobem při teplotě 85 °C nebo· vyšší, minimálně po dobu 2 minut až maximálně 15 minut.

Při vysrážení proteinů se dosáhne výhodného rozměru granulí vzhledem k následnému oddělování těchto granulí filtrací, a současně se také · ničí virulentní mikroorganismy. Vzniklá sraženina s obsahem sušiny v rozmezí od asi 20 do 25 % hmotnostních se izoluje ve vhodném mechanickém separátoru, pracujícím účinkem gravitační síly. Mechanický separátor by měl mít kontinuálně se obnovující povrch filtru, ale jsou také přípustná kontinuální nebo dískontinuální plochá síta, oblouková síta, odstředivky a šnekové separátory. Vypouštěný filtrát se odvádí do· odpadu a může obsahovat 5 až 35 % původního obsahu sušiny, a ' v závislosti na řízením předběžném zpracování je tvořen teplem nedenaturovatelnýml proteiny, peptidy, deriváty nukleových kyselin, tuky, lipoidy a minerálními solemi.

Oddělená surovina obohacená na heparin se vysuší v 'sušárně při teplotě 100 °C na obsah sušiny v rozmezí od 90 · do 95 % hmotnostních, · čímž se získá koncentrát se sníženým obsahem tuků, v podstatě o rozměru granulí v rozmezí od 0,2 do 1,6 milimetru, ve formě amorfních částic o velkém povrchu, které jsou skladovatelné po dlouhou dobu, což je zvlášť vhodné například pro diskontinuální nebo kontinuální protiproudou extrakci.

Podle uvedeného vynálezu bylo zjištěno a experimentálně ověřeno, jak to bude uvedeno v příkladu 1, že mezi proteinovými látkami v čerstvých živočišných orgánech, obsahujících heparin, je velký nadbytek takových proteinů, vzhledem k původnímu obsahu heparinu, které jsou schopné vázat rozpuštěný heparin a komplexy heparinu s proteinem takovým způsobem, že po' nevratně probíhající tepelné denaturaci se tyto látky z roztoku oddělí. Množství těchto proteinů vhodných к vázání heparinu se snižuje v závislosti na rychlosti a době autolýzy [tzn. rozkladu), neboť přebytek proteinů schopných vazby se rozloží na polypeptidové frakce nedenaturující se vlivem tepla a nevhodné pro vazbu uvedeného druhu.

Dále bylo podle uvedeného vynálezu zjištěno a ověřeno, jak bude ukázáno v příkladu 2, že při použití řízené a kontrolované krátce probíhající autolýzy u čerstvých orgánů je možno množství jak přebytku proteinů, vázajících heparin, tak jiných proteinů, snížit jejich rozštěpením na nižší jednotky, které nejsou denaturovatelné účinkem tepla, a tímto způsobem je možno získat základní materiál bohatší na heparin, ve srovnání s přírodními materiály po denaturaci provedené tepelným zpracováním.

Provedené experimenty vedly к překvapujícím a neočekávaným výsledkům, podle kterých je míra rozkladu proteinů vhodných pro vázání heparinu podstatně nižší než míra rozkladu proteinů neschopných této vazby, a kromě toho je také možné během prováděny autolýzy odstraňovat nukleotidy, nukleosidy atd., to znamená jiných doprovodných pro výrobu rušivých složek, ve filtrátu. Následkem společného využití těchto poznatků je možno při postupu podle uvedeného vynálezu získat surovinu s obsahem sušiny v rozmezí od 20 do 25 °/o hmotnostních, to znamená obohacenou surovinu prakticky beze ztrát, pokud jde o obsah heparinu, která ve srovnání s přírodními surovinami a v přepočtu na sušinu obsahuje o 5 až 35 °/o méně doprovodného materiálu, který znesnadňuje získávání heparinu, v závislosti na parametrech použitých při řízené autolýze, ze které se získá heparin jakýmkoliv obvyklým extrakčním způsobem.

Do těchto získaných poznatků je možno zahrnout i skutečnost, že tepelná citlivost získané suroviny podle vynálezu je nižší než tepelná citlivost heparinu. Z tohoto důvodu je možno eliminovat nákladné a pečlivé sušicí způsoby, jako je například lyofilizace, sušení prášku nebo odvodnění rozpouštědlem, poněvadž vazba heparinu s proteinem vzniklá v živočišném orgánu má takový ochranný účinek na snižování obsahu heparinu, který umožňuje udržovat živočišný orgán při teplotě nad 100 °C dokonce po několik hodin.

Ve výhodném provedení postupu podle uvedeného vynálezu se živočišný orgán obsahující heparin v případě potřeby nařeže na průmyslové řezačce masa na kousky o rozměru v rozmezí od 4 do 6 milimetrů podle rozsahu porážení a podle původu zpracovávané suroviny. Takto zpracovaný živočišný orgán se promíchá s vodou o teplotě v rozmezí od 18 do 5ΟΊ3 na suspenzi o koncentraci v rozmezí od 1,5 do 17 % hmotnostních. Vodná suspenze živočišného orgánu se čerpá čerpadlem do zařízení používaného pro ipředběžnou autolýzu a udržuje se při teplotě v rozmezí od 30 do 50 °C po dobu v rozmezí od 2 do 6 hodin.

Po předběžném zpracování se uvedená suspenze živočišného orgánu podrobí tepelnému zpracování při teplotě v rozmezí od 82 do 100 °C. Pro tepelné zpracování se použije injektor s přímou párou. Tímto způsobem se získá z vodné suspenze živočišného orgánu udržované v kontinuálním systému izolované trubkové sekce při nízké rychlosti proudění po dobu v rozmezí od 2 do 6 minut, sraženina obsahující heparin ve formě snadno filtrovatelných drobivých granulí. Vodné prostředí obsahující jen inaktivní rušivé látky je oddělitelné od drobivé sraženiny účinkem gravitační síly, například průchodem přes síta, přičemž se získá surovina s obsohem sušiny alespoň 23 % hmotnostních.

Filtraci je možno provést ve filtrační jednotce popsané v patentu Velké Británie č. 2 045 272, ve které je zajištěn konstantně se obnovující účinný povrch filtru, čímž je extrakce tuků a dalších látek účinnější než v diskontinuálních systémech a účinnost může být dále zvýšena vestavěným promývacím systémem. Jestliže je zvlhlá surovina kontinuálně vysušována současně s tím, jak je získávána v sušicí jednotce, popsané v uvedeném patentu Velké Británie, potom může být cddělená a zpracovaná surovina shora uvedeným postupem uskladněna bez zchlazování a zmrazování.

Během sušení je teplota jak páry, tak vzduchu, stejně jako teplota vlhkého vzduchu opouštějícího zařízení, regulována tak, aby byla získána surovina obohacená na heparin o velikosti granulí odpovídající 0,2 až

1,6 milimetru s asi 92% obsahem sušiny během krátké doby sušení při teplotě v rozmezí od 80 do 180 °C na vstupu a v rozmezí od 50 do 110 ^CC na výstupu, přičemž se jedná o teplotu vzduchu. Tato surovina obohacená na heparin má snížený obsah enzymů, konstantní složení, nízký počet zárodků mikroorganismů, snížený obsah tuků, zachovává si nezměněné složení při uvažovaných teplotách při průmyslovém zpracování po dlouhý časový interval, přičemž nízký počet mikroorganismů neumožňuje jejich rozmnožování. Takto získaná surovina bohatá na heparin, vyrobená postupem podle uvedeného vynálezu, je rovněž ekonomicky skladovatelná a transportovatelná.

Obsah heparinu v získané surovině podle vynálezu vzhledem к obsahu heparinu v původním živočišném orgánu je možno měnit. Jestliže se vychází ze sliznice prasat, získá se produkt s obsahem 0,15 kg 10⁵ mezinárodních jednotek aktivní složky, který obsahuje podstatně méně balastních látek ve srovnání s jinými základními surovinami pro výrobu heparinu. Ze získané suroviny bohaté na heparin může být heparin převeden do vodného roztoku jakoukoliv běžnou extrakční metodou za mnohem výhodnějších

podmínek, vzhledem к použitému základnímu materiálu, než jaké byly dosud používány. Popsaný postup může být prováděn i diskontinuálním způsobem, přičemž je možno využít všech základních výhod tohoto postupu.

Další detaily postupu podle uvedeného vynálezu budou uvedeny v následujících příkladech provedení.

Příklad 1

Postup podle uvedeného příkladu je srovnávací, přičemž je zde demonstrována skutečnost, že koncentrace proteinů vázajících heparin, přítomných v čerstvých živočišných orgánech, je vyšší než koncentrace heparinu.

Podle tohoto provedení byl jeden kilogram čerstvé sliznice tenkého střeva prasat o hmotnostním obsahu sušiny 16 % rozmíchán s jedním litrem vody. Práškový čistý heparin byl dále rozpuštěn ve zřeďovací vodě, přičemž koncentrace heparinu byla upravena na 82 m. j./mililitr, kde m. j. je mezinárodní jednotka. Tato suspenze se potom zahřála na teplotu 85 °C za míchání a potom se teplem denaturovaný živočišný orgán oddělil na sítě po zklidnění suspenze trvající 5 minut. Analýza vzorku odebraného ze 1 380 mililitrů filtrátu ukázala, že koncentrace heparinu je 1,4 m. j./mililitr, to znamená, že asi 80 000 m. j. z přidaných m. j. heparinu bylo vázáno .na denaturovaný živočišný orgán.

Jestliže se sliznice čerstvého tenkého střeva z prasete udržuje při teplotě místnosti po dobu 1,5 dne a zředí se 1 litrem vody/1 kilogram, kde koncentrace heparinu je 41 m. j./ml, a nakonec se provede tepelná denaturace při 85 ^QC, potom je možno zjistit, že koncentrace heparinu ve 1440 mililitrech filtrátu je 2,1 m. j./ml, to znamená, že vazebná schopnost pro heparin u denaturovaného živočišného orgánu získaného zpracováním jednoho kilogramu sliznice prasečího tenkého střeva se sníží na 38 000 m. j. heparinu ipo autolýze po dobu 1,5 dne.

Příklad 2

V postupu podle tohoto příkladu provedení je demonstrováno, že odstranění balastních materiálů z orgánu vede к získání suroviny s dosud nedosažitelnou koncentra cí aktivní složky, aniž by došlo ke ztrátě obsahu heparinu, za předpokladu, že rychlost rozkladu částí živočišného orgánu, nehledě na vazbu heparinu s proteinem vzniklou během postupu předběžné autolýzy, je vyšší než rychlost rozkladu proteinů vázajících heparin při denaturaci a oddělování s následnou filtrací.

Podle tohoto příkladu provedení se každý ze tří vzorků 2 kilogramů čerstvého tenkého střeva prasete s hmotnostním obsahem sušiny 17,3 % zředí třemi litry vody. Teplota se nastaví na 29,5 43, přičemž první vzorek se zpracuje bez autolýzy, druhý vzorek po 6hodinové autolýze a třetí vzorek po 18hodinové autolýze. Zpracování se provede zahříváním suspenze živočišných orgánů na 93 °C během míchání a pak odfiltrováním po zklidnění v intervalu 5 minut. V tomto provedení byla zjišťována hmotnost a obsah sušiny denaturovaných orgánů zadržených na filtru, stejně jako· objem a obsah sušiny a koncentrace heparinu vypouštěného u vypouštěného filtrátu.

U vzorku bez autolýzy bylo získáno 1,37 kilogramu denaturovaného živočišného orgánu s hmotnostním obsahem sušiny 22,8 procenta ze 2 kilogramů čerstvého prasečího tenkého střeva, přičemž objem filtrátu byl 3 670 mililitrů, obsahu sušiny 0,82 % hmotnostního a aktivita heparinu pod hodnotou 1,25 m. j./ml.

Po autolýze prováděné po dobu 6 hodin byla u vzorku zjištěna hmotnost denaturovaného živočišného orgánu 1,18 kilogramu, obsah sušiny 23,2 % hmotnostního, objem filtrátu 3 780 mililitrů, obsah sušiny 1,72 % hmotnostního, aktivita heparinu 1,25 m. j./ /ml.

Ze dvou kilogramů sliznice prasečího tenkého střeva po autolýze prováděné po dobu 18 hodin bylo získáno 0,99 kilogramu denaturovaného orgánu s hmotnostním obsahem sušiny 24,1 %, objem filtrátu činil 3 980 mililitrů, obsahu sušiny 2,43 % hmotnostního, aktivita heiparinu pod hodnotou 1,25 m. j./ml.

Protože nedošlo к žádné ztrátě heparinu během zpracování, přičemž obsah heparinu v původně použitém živočišném orgánu byl 118 000 m. ]., je zřejmé, že tímto způsobem je možno vyrobit koncentrovanou surovinu se stále vyšší koncentrací heparinu.

Výsledky tohoto postupu jsou uvedeny v v následující tabulce č. 1.

TABULKA 1

Původní materiál a způsob zpracování	Hmotnost zvlhlého orgánu (g)	Obsah sušiny (g)	Celkový obsah sušiny (g)	Celkový obsah heparinu (m. j.)	Obsah heparinu v s^uíšiině (m. j./g)
Neupravené střevo	2 000	17,3	346	118 000	342
Denaturované střevo	1 370	22,8	312	118 000	380
Střevo po 6 hodinách autolýzy,
denaturované	1180	23,2	274	118 000	434
Střevo po 18 hodinách autolýzy,
denaturované	990	24,1	238	118 000	500

Příklad 3

V postupu podle tohoto příkladu provedení je ukázáno, že sliznice prasečího tenkého střeva je vysušitelná v diskontinuálníin systému beze ztráty aktivní složky po denaturaci.

V tomto postupu · se 260 kilogramů zvlhlé sliznice prasečího tenkého střeva s hmotnostním obsahem, sušiny 6,4 %, získané v zařízení na čištění střeva, shromáždí v homogenizovaném stavu. Potom se 10 kilogramů vzorku oddělí pro další srovnávací zkoušky (vzorek A], a potom se směs zahřívá během míchání na teplotu 85 °C v krátkém intervalu v zařízení vhodném pro přímý přívod páry. Když se dosáhne konečné teploty, intenzita míchání se sníží. Po dosažení teploty 85 °C se směs ponechá v klidu po dobu 15 minut, čímž se dokončí denaturační proces.

Materiál, který je zkoagulován ve formě drobivé sraženiny, se převede z tohoto zařízení na kovová síta o velikosti oka 1,2 milimetru a oddělí se nažloutlé koagulované granule obsahující heparin. Po filtraci se odfiltrovaný materiál ponechá stát ' po dobu 1 hodiny, . přičemž se několikrát zamíchá za účelem zintenzívnění odvodnění.

Tímto postupem se získá 62 kilogramů koagulovaného materiálu obsahujícího· heparin s relativně nízkým obsahem tuků, který je menší než v původním materiálu, ačkoliv určitá část tuků se· znovu váže na velký povrch sraženiny během filtračního procesu. Obsah sušiny v koagulovaném produktu je v tomto provedení 23,4 % hmotnostního.

Aktivita heparinu (neboli koncentrace) u vzorku odebraného z filtrátu je pod 0·,9 m. j./ml, obsah sušiny je 0,88 %. Jak bylo zjištěno, obsahuje směs tuky, nerozpustné proteiny, určité množství peptidů a polypetidů, anorganické soli a určité množství jiných inertních složek.

Ze zpracovaného počátečního materiálu bylo odděleno 10· kilogramů denaturovaných vzorků B, C a D.

Vzorek B byl stlačen v kalolisu na tloušťku vrstvy 1,5 centimetru. Následkem tohoto· slisování bylo získáno 7,4 kilogramu produktu s obsahem sušiny 30,3 % hmotnost ního. Jestliže · je vrstva po· slisování tlustší, potom je účinnost lisování nižší.

V dalším postupu · byl vzorek C rozdělen na stejné části (tzn. na vzorky Ci a Cž). Vzorek Ci o tloušť.ce vrstvy 0,5 centimetru byl vysušen ve větraném exsikátoru při teplotě 90 ^CC, přičemž sušení probíhalo po· dobu 1,5 dne. Tímto · způsobem bylo získáno 1,31 kilogramu produktu vs hmotnostním obsahem sušiny 88 %, Takto získaný produkt byl rozřezán na běžné řezačce a označen symbolem Cil. Druhá část vzorku C nebyla vysušena, přičemž tento vzorek byl označen symbolem Cž.

Pro porovnání byly se vzorky A, Cž a Cn provedeny paralelní extrakční zkoušky na extrahovatelnost obsahu heparinu.

Za účelem usnadnění porovnání dosažených výsledků, odpovídalo· množství každého zpracovávaného vzorku obsahu sušiny 468 gramů. Vzhledem k výše uvedenému bylo zpracováno 7,31 kilogramu vzorku A, 2,0 kilogramy vzorku Cž a 5,32 kilogramu vzorku Cu.

Pro· jednotnost srovnávacích extrakčních postupů bylo použito stejných koncentrací sušiny a stejných poměrů reakčních činidel. Objem extrakční směsi byl zředěn vodovodní vodou · na 8,0 litrů a proto bylo nutno· přidat 690· mililitrů vody v případě vzorku A, dále 6 000· mililitrů vody v případě vzorku Cž a 7 470 mililitrů vody v případě vzorku Cn.

Další postup extrakce probíhal v následujících stupních: 385 gramů síranu amonného· bylo přidáno· k vodné směsi během stálého ·· míchání a pak byla směs zahřáta na teplotu 60 °C. Při této teplotě byla upravena hodnota pH na 10, přičemž k této úpravě bylo použito hydroxidu sodného, a pro upravení extrakční rovnováhy byla shora uvedená teplota udržována · po dobu 2,5 hodiny. Po 2,5 hodiny za ssálého míchání byla hodnota pH snížena na 8,2 přídavkem pevného chloridu amonného a pak byla směs zahřáta na bod varu. Po zahřívání na bodu varu trvajícím 5 minu-t byla směs ponechána v · klidu po dobu 10 minut, potom byl zbytek živočišného orgánu · oddělen od extrakční kapaliny na rámovém kovovém sítu o velikosti oka 1,0· milimetr.

Ze zbytků orgánu na sítu byl odebrán vzorek, u kterého· byl zjišťován obsah sušiny, za účelem určení množství extrakční kapaliny přítomné ve zbytku živočišného orgánu. Výtěžky vypočtené na · základě obsahu heparinu nalezeného ve vzorcích a vztažené na počáteční hmotnost suroviny byly následující:

Vzorek A obsah heparinu:

126 000 m. j. podíl materiálu:

58,2 kg orgánu/milión m. j.

Vzorek Cž obsah heparinu:

148 00 m. j. podíl materiálu:

13,5 kg orgánu/milión m. j. _r

Vzorek Cti obsah heparinu:

162 000 m. j. podíl materiálu:

3,27 kg orgánu/milión m. j.

'Sroonávací analýza získaných výsledků je uvedena v tabulce č. 2 za příkladem 4.

Příklad 4

Podle tohoto příkladu provedení byla sliznice tenkého střeva o průměrném obsahu sušiny 6,3 % hmotnostního, upravená na čisticím zařízení střev jako v příkladu 3, ponechána proudit izolovanou potrubní sekcí s napájecím čerpadlem. V zařízení se nastaví doba zdržení 1,5 hodiny při teplotě 41 °C.

Tato autolyzovaná surovina ze živočišného orgánu byla potom zpracována v nepřetržitém systému v zařízení popsaném v uvedeném patentu Velké Británie č. 2 045 272. V rychloohřevné jednotce byla směs orgánu zahřála na . 90 °C přímým přívodem páry, potom byla zpracována při mírném průtoku po dobu 7,5 minuty ve šroubovité tepelně izolované trubkové sekci náležející k zařízení.

Koagulované granule byly potom odděleny ve spirálovém filtračním bubnu na výstupu ze zařízení v uzavřeném parním prostoru. Spirálový filtrační buben na výstupu zajišťuje odvádění suroviny obsahující heparin, která byla odfiltrována na filtrační jednotce, při kontinuálně probíhající filtraci.

Odfiltrovaný produkt se vede dávkovacím systémem do horizontálně uspořádaného válcového sušicího zařízení připojeného k filtrům, které je zahříváno zvnějšku párou, z vnitřku horkým vzduchem a je vybaveno míchacím zařízením se soustavou válců.

Kontinuální sušení produktu v tomto zařízení se provádí takovým způsobem, že horký vzduch se vyrobí v oddělené zahřívací jednotce, ve které se vzduch nasávaný z okolí ventilátorem zahřívá párou na 142 °C. Teplota odváděného vlhkého vzduchu se nastaví na 82 až 88 °C.

Výchozí surovina byla přiváděna rychlostí 600· litrů za hodinu a po 6 hodinách se získá 178 kilogramů produktu téměř zbaveného tuku s obsahem sušiny 90,4 % hmotnostního a s počtem zárodků mikroorganismů 102 až 103/gram. Granule získaného produktu jsou skladovatelné ipři teplotě místnosti v nepoškozeném stavu po neohraničeně dlouhou dobu, přičemž velikost 80 % granulí je v rozmezí od 1,6 do 0,2 milimetru.

Z filtrátu byl odebrán každou půlhodinu vzorek, u něhož byl stanoven obsah sušiny, obsah heparinu a důležitých chemických složek. Průměrný obsah sušiny byl 1,41 % hmotnostního, koncentrace heparinu pod 0,92 m. j./ml, přičemž filtrát obsahoval podstatné množství tuků, méně nerozpustných a rozpustných proteinů než oddělený filtrát v příkladu· 1, ale více polypeptidů a peptidů, stejně jako anorganických solí a inertních nečistot.

Produkt zskaný autolýzou je výchozí surovinou pro výrobu základního materiálu obohaceného heparinem. Vysušená surovina v tomto příkladu je · označena jako vzorek E, který se zpracuje · extrakcí v množstvích a podílech stejných jako bylo· uvedeno v příkladu 3.

Složení vzorků podle příkladů 4 a 3 . a výsledky zkoušek jsou shrnuty v tabulce č. 2. .

Za účelem přesného srovnávání byly zjišťovány dvě hodnoty týkající se obsahu heparinu a 3 hodnoty týkající se podílu množství materiálu v jednotlivých fázích. Výpočet dvou hodnot týkajících se obsahu heparinu je nutný z toho důvodu, poněvadž použitá extrakční metoda byla jednostupňová diskontinuální extrakce, ve které zbytky živočišného orgánu zadržené na sítu v různých množstvích během oddělování extrakční kapaliny obsahovaly, za · předpokladu rovnováhy, extrakční kapalinu stejné koncentrace jako je koncentrace odfiltrované extrakční kapalíny. Je třeba poznamenat, že tento obsah heparinu je teoreticky získatelný opakovanou extrakcí.

Hodnota uvedená ve sloupci 9 uvedené tabulky je skutečně získaná hodnota vypočítaná na základě analýzy odfiltrovaných extrakčních kapalin, zatímco tak zvané teoretické hodnoty uvedené ve sloupci 13 představují teoreticky získatelné obsahy heparinu vypočtené se zahrnutím obsahu extrakční kapaliny ve zbytku orgánu. Obsah extrakční kapaliny v každém zbytku živočišného orgánu · je uveden ve sloupci 12 této tabulky.

Na základě těchto, hodnot je možno uvést, že při zvýšení obsahu sušiny v základním materiálu, který má být extrakčně zpracován, se obsah extrahovaný ze zbytku živočišného orgánu sníží, to znamená, že extrakční postup může · být realizován efektivněji se základním materiálem s vyšším obsahem sušiny, dokonce i v případě vícenásobných extrakcí. Podílové hodnoty materiálu, uvedené ve sloupci 10· této tabulky, byly vypočteny na základě skutečně použité výchozí hmotnosti uvedené ve sloupci 6 a podle získaného obsahu heparinu uvedeného ve sloupci 9. Hodnoty vypočtené ve sloupci 11 představují údaje vztažené na 100 % sušiny (sloupec 6) z předešlých údajů. Takzvané materiálové podílové hodnoty uvedené ve sloupci 11 odpovídají hodnotám vztaženým na 100% obsah sušiny (sloupec 6), vztaženo na · teoretický obsah heparinu (sloupec 13). Na základě údajů ve sloupcích 6 a 13 může být srovnán obsah heparinu v produktech extrahovatelných uvedeným způsobem, který se získá bez autolýzy a · s použitím autolýzy.

Na základě výsledků uvedených v tabulce

č. 2 je možno konstatovat,· že materiálové podílové hodnoty denaturovaných a usušených produktů jsou téměř stejné v produktech zpracovaných bez autolýzy a ve srovnání se surovým· prasečím tenkým střevem jsou asi o 10 % větší. Během denaturačního postupu mohou být některé inertní materiály odstraněny s filtrátem. V případě předběžné autolýzy je obohacení heparinem mnohem větší, asi o· 30 % ve srovnání s čerstvým živočišným orgánem.

Výsledky uvedené v tabulce · č. 2 vedou k závěru, že obsah heparinu v denaturované vysušené surovině získané autolýzou, vztažený na stejný obsah sušiny, je značně vyšší než obsah heparinu v základním materiálu zpracovaném bez autolýzy. Srovnávací zkoušky potvrzují, že sušení nevyvolává rozklad heparinu.

Získaný nový typ suroviny je zpracovatelný vhodným běžným extrakčním postupem na lakový heparinový produkt, ze kterého je vyrobitelný konečný produkt · terapeutické kvality.

TABULKA 2

1 Označení vzorku	2 Typ materiálu	3 Předběžná autolýza	4 Obsah sušiny (%)	5 Zpracovává celkové množství (kg)	6 ný materiál množství sušiny (g)	7 Objem extrakční kapaliny (ml)
A	surová sližnice	—	6,4	7,31	468	6 · · 120'
C2	denaturovaná sližnice	—	23,4	2,0	468	6 000
Cil	denaturovaná vysušená sližnice	—	88,0·	0,532	468	7 · 030
E	denaturovaná	• —	90,4	0,518	468	7 120

vysušená sližnice.

Tabulka 2 — pokračování

1	8	9	10	11
Označení vzorku	Extrakční kapalina	Podíl materiálu,	Podíl materiálu,
	koncentrace	obsah heparinu	původní hmotnost	živočiš. orgán
	obsaženého·	(m. j.)	živočiš. orgánu	se 100 % sušiny
	heparinu (m. j./ml)		(kg/milión m. j.)	(kg/milión m. j.)
A surová sližnice	20,6	126 000	58,2	3,72
Cz
denaturovaná
sližnice	22,5	148 000	13,5	3,16
Cli
denaturovaná vysušená sližnice p	23,1	162 500	3,27	2,88
denaturovaná
vysušená sližnice	28,6	204 000	2,54	2,29

Tabulka 2 — pokračování

Teoretický obsah heparinu (m. j.)

Označení vzorku

Obsah extrakční kapaliny ve zbytku živočiš. orgánu (ml'j>

• 14

Teoretický jodíl materiálu, 100 °/o živočiš. orgánu (kg/milíón m. j.)

A

surová -sliznice	1740	162 000	2,89
Ca
denaturovaná -sliznice	1 340	179 500	2,62
Cn
denaturovaná vysušená sliznice T?	8(30	182 000	2,57
E denaturovaná vysušená sliznice	900	229 000	2,04

PREDMET VYNALEZU

Claims

Způsob výroby suroviny obsahující heparin s . obohaceným- obsahem aktivní složky, stálého složení s nízkým - obsahem tuků a nízkým počtem zárodků mikroorganismů, skladovatelné beze změny morfologie a obsahu aktivní složky, přičemž se vychází ze živočišných orgánů, případně -rozřezaných na velikost v rozmezí -od 4 do 6 milimetrů, vyznačující se tím, že -se z těchto živočišných orgánů připraví vodná suspenze - -s obsahem sušiny o hmotnostní koncentraci v rozmezí od 1,5 do 17,0 %, tato -suspenze se ponechá při teplotě v rozmezí od 10- do 50 °C po dobu v rozmezí od -0,15 do 15,0 hodin, ve výhodném provedení při teplotě v rozmezí -od 30 do 50 C po- dobu v rozmezí od 4 -do- 6 hodin, komplex obsahující heparin, který je nerozpustný ve vodě, se - oddělí od této· předem zpracované suspenze při teplotě v - rozmezí od 75 -do 100 °C a tento komplex se tepelně zpracovává kontinuálním nebo diskontinuálním způsobem při teplotě 85 až 100 °C po dobu v rozmezí -od 2 do 15 minut, za vzniku snadno·, filtrovatelné -sraženiny, která se potom oddělí a izolovaný produkt se usuší při teplotě v rozmezí -od 60- do 100 °C, ve výhodném provedení při -teplotě od 80 do 100 °C, za vzniku produktu -s' obsahem sušiny o hmotnostní -koncentraci v rozmezí -od 90- do 95 %.