PL128250B1 - Method of obtaining a new heparin containing raw material - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego typu surowca heparyny z narzadów zwierzecych, dzieki czemu uzyskuje sie powazne udoskonalenie przemyslowego wytwarzania hepa¬ ryny.Heparyna jest waznym lekiem ze wzgledu na swoje wlasnosci przeciwkoagulacyjne. Syntetycz¬ ny sposób jej wytwarzania nie jest opanowany.Surowcem do jej wytwarzania w skali przemyslo¬ wej sa niezmiennie oaainzady zwierzece bogate w heparyne, np. jelito cienkie swin, bydla, owiec, pluca. Narzady te, nawet stosunkowo bogate w heparyne, zawierajac ja w nadzwyczaj malym stezeniu, rzedu 10~2—10-8 % wagowych. Wyodreb¬ nienie tak malej ilosci skladnika aktywnego z ogromnej masy materialu stanowiacego balast sa¬ mo w sobie stanowi powazny problem. Trudnos¬ ci te wzrastaja dodatkowo na skutek zmian wla¬ snosci substancji towarzyszacych heparynie, za¬ chodzacych pod wplywem rozkladu w trakcie ma¬ gazynowania i transportu tego surowca.Aby zapewmic ekonomiczna realizacje wytwa¬ rzania heparyny w skali przemyslowej konieczne jest wiec. nie tylko oczywiste zachowanie calko¬ witej ilosci heparyny w zgromadzonych narza¬ dach zwierzecych do czasu ich przerobu, lecz tak¬ ze wazne jest, aby fizyczne, chemiczne i morfolo¬ giczne wlasnosci substancji towairzyszacych, sta¬ nowiacych glówna czesc tych narzadów, nie ule¬ galy zmianom. ' 10 15 20 Jakiekolwiek zmiany wlasnosci substancji towa¬ rzyszacych moga Sjpowodowac powazne klopoty podczas przerobu a takze stwarzac problemy przy oczyszczaniu w produkcji farmaceutycznej (eks¬ trakcja itd.), stawiajac pod znakiem zapytania o- placalnosc wytwarzania gotowego produktu.Z powyzszych wzgledów wskazane jest aby juz na etapie przygotowywania surowca (gromadzenie i magazynowanie) byly zapewnione odpowiednie warunki.Waznosc zagadnienia gromadzenia i magazyno¬ wania surowców zawierajacych heparyne omówio¬ na zostala w nielicznych tylko opisach patento¬ wych, np. w wegierskich opisach patentowych nr. 148 776 i nr. 149 32i9 oraz w opisie patentowym St. Zjedn. nr 2 587 924, lecz i one poruszaja to za¬ gadnienie mimiochodem. Waznosc odpowiedniego traktowania tego surowica juz w etapie jego gro¬ madzenia i magazynowania widoczna jest z po¬ nizszych ogólnie znanych faktów: Zywe narzady bedace w stanie równowagi fi¬ zjologicznej zawieraja heparyne w róznych posta¬ ciach, glównie w postaci zwiazanej z róznymi bial¬ kami. Po uboju zwierzatx równowaga w ich na¬ rzadach i tkankach zostaje naruszona i natych¬ miast rozpoczyna sie autoliza, przede wszystkim dzialanie enzymów proteolitycznych zywych tka¬ nek, powodujac niekontrolowany rozpad substan¬ cji towarzyszacych (stanowiacych balast), a cza¬ sami i rozpad skladnika aktywnego. 128 250128 250 3 4 Z drugiej strony podczas gromadzenia i maga¬ zynowania narzadów zwierzecych, zwykle w wa¬ runkach niesterylnych, nastepuje zanieczyszczenie drobnoustrojami, w wyniku którego uwolnione zo¬ staja enzymy powodujace rozpad bialka i skladni¬ ka aktywnego. Efekt tego jest taki sam jak w po¬ przednim przypadku.Opis patentowy St. Zjedn. nr 2 884358 (kol. 1, w 51 do 53) wymienia nieprzyjemny zapach po¬ wstajacy w trakcie magazynowania narzadów zwierzecych, zmiane barwy zachodzaca nawet w produkcie koncowym, nastepowanie -rozkladu ter¬ micznego i obnazenie ekstrakcji.Ogólnie przyjely sie trzy sposoby gromadzenia i magazynowania narzadów zawierajacych heparyne: 1). magazynowanie narzadów w stanie natural¬ nym szybko i gleboko zamrozonych, 2) magazynowanie narzadów po denaturacji cieplnej (gdzie denaturacje poprzedza zwykle mie¬ lenie z doprowadzaniem wody), oraz 3) konse cienczonych woda (w przypadku sluzówki bez mie¬ lenia, lecz po czesciowym usunieciu wody z zawie¬ siny otrzymanej w wyniku plukania jelit) za po¬ moca ohemikalii, zwykle róznych soli nieorganicz¬ nych.Wada sposobów wymienionych pod (1) i (2) jest to, ze wymagaja, one duzych nakladów energe¬ tycznych, inwestycyjnych i pracy. AJby szybko u- zyskac temperature —1(8°C i utrzymywac ja pod¬ czas magazynowania i transportu, dopóki nie roz¬ pocznie sie przerób, konieczne jest wlozenie wy¬ sokich nakladów energii i inwestycji (musi byc zapewniony bezpiecznie dzialajacy ciag chlodni¬ czy). Naklady pracy wiaza sie z pperowaniem su¬ rowcem o bardzo duzej zawartosci' wody (77—%$*/<*), pakowaniem, transportem i przygotowaniem do przerobu (mielenie w stanie zamrozonym.).Trzeci sposób, czyli konserwowanie chemikalia¬ mi, jest niewatpliwie mniej energochlonny niz dwa poprzednie, lecz na skutek duzej zawartosci wody w zgromadzonym surowcu (86—90°/o) wzrasta bar¬ dzo powaznie jego objetosc i zwiazane z tym ko¬ szty. Uzycie chemikalii do konserwacji powoduje szybsza korozje przenosnika i urzadzen magazy¬ nowych, a konserwacja tych urzadzen, znajduja¬ cych sie stale w ujemnych temperaturach, jest klopotliwa i kosztowna.Aby obnizyc, koszty transportu i magazynowania duzych objetosci rozcienczonych roztworów (np. o- trzymanych z plukania jelit), tylko czesc tego su¬ rowca zostaje wykorzystana (zawierajaca stosun¬ kowo duzo suchej masy). Aby to zrównowazyc, instaluje sie urzadzenia do gromadzenia tego su¬ rowca w wielu rzezniach.Wada wszystkich .trzech wymienionych sposo¬ bów jest fakt, ze w czasie gromadzenia i maga¬ zynowania surowca mozna uzyskac warunki tylko .zblizone do bakteriostatycznych, w których tylko czesciowo albo w ogóle nie zostaje wylaczane dzia¬ lanie enzymów.Jakikolwiek blad technologiczny (np. okresowa przerwa w ciagu chlodniczym, wyzsza wyjsciowa liczba bakterii, zanieczyszczenie itp) moze spowo¬ dowac utrate warunków prawie bakteriostatycz- nyoh, wzmozone i niekontrolowane dzialanie en¬ zymów, prowadzace do znacznego zmniejszenia skladnika aktywnego i zmiany skladu surowca, a to oznacza klopoty przerobowe i technologiczne.Klopoty zwiazane ze zmiana skladu (w wyniku rozpadu) wzrastaja na skutek duzej zawartosci na¬ turalnego tluszczu w narzadach zwierzecych.Wady dotychczasowych sposobów gromadzenia surowca mozna by usunac stosujac takie rozwia¬ zanie, w którym swieze narzady poddawano by przerobowi w sposób ciagly, w miejscu powsta¬ wania tego surowca, do heparyny lub pólproduktu latwego w magazynowaniu. Równie zadowalajacym rozwiazaniem byloby niezwloczne suszenie swie¬ zych narzadów (odwodnienie rozpuszczalnikiem i suszenie przez wymrazanie luJb rozpylanie), maga¬ zynowanie tak otrzymanego stabilnego pólproduk¬ tu w postaci proszku i poddanie go przerobowi w dogodnym czasie.Jednakze takie rozwiazania mozliwe sa tylko w warunkach laboratoryjnych ze wzgledów ekono¬ micznych (wysoki koszt zwiazany z uzyciem roz¬ puszczalnika lub wysokie koszty inwestycyjne i eksploatacyjne, por. Methods of Biochemiical Anal. 24, 244 (1977), ibid., 7, 269; Methods of Carbon.Chem., 7, 90 (1976).W oparciu o powyzsze mozna stwierdzic, ze pier¬ wszy etap wytwarzania heparyny w sikali pirze- myslowej, obejmujacy gromadzenie narzadów za¬ wierajacych heparyne i magazynowanie ich przed wlasciwym przerobem, nie jest rozwiazany opty¬ malnie, poniewaz sklad tego surowca i zawar¬ tosc w nim skladnika aktywnego zmieniaja sie w szerokim zakresie.Dotychczasowe znane sposoby wytwairzania he¬ paryny w skali przemyslowej polegaja na stoso¬ waniu takich technologii ekstrahowania skladnika aktywnego, które dawaly by mozliwosc efektyw¬ nego przerobu narzadów o najbardziej typowej, siredniej jakosci. Poniewaz jednak jakosc stosowa¬ nych narzadów jest zmienna, nie moze byc mo¬ wy o optymalnym wykorzystaniu tych sposobów.Celem wynalazku jest .umozliwienie wytwarza¬ nia heparyny z nowego typu surowca, w skali przemyslowej i systemem ciaglym, z optymalnymi wykorzystaniem tego surowca, z usunieciem sklad¬ ników zbednych zawartych w organaioh zwierze¬ cych (takich jak tluszcz, sole nieorganiczne, po- ldpeptydy, nukleotydy iltp).Dzieki temu uzyskuje sie surowiec o niespo¬ tykanym dotychczas nagromadzeniu skladnika ak¬ tywnego. Poza tym tak otrzymany surowiec po¬ siada staly sklad pod wzgledem chemicznym, fi¬ zycznym i morfologicznym. Pmzechowywany w wa¬ runkach pokojowych zachowuje staly sklad przez czas nieograniczenie dlugi, bez potrzeby specjal¬ nych warunków, w tym równiez liczbe drobno¬ ustrojów, która jest bardzo mala w stosowanych wairunkach.Z tego nowego surowca mozna wytwarzac pro¬ dukt koncowy — heparyne do celów leczni¬ czych — dowolna znana metoda ekstrakcyjna.Plrzy tym, dzieki temu, ze uzyty do tego suro- 10 u 20 25 30 85 40 45 50 55 60\ 1 5 wiec posiada staly sklad, w tym duza zawartosc heparyny, mala ilosc^ substancji towarzyszacych i niewielka ilosc tluszczu, produkcje mozna zopty¬ malizowac w znacznie wyzszym stopniu. Nowy surowiec heparyny jest w postaci ziarna o okre¬ slonej wielkosci i znacznej powierzchni, jest bez- postaciowy i odporny nawet na wilgoc; wszystko to stwarza nowe dodatkowe korzysci w procesie wytwarzania heparyny na skale przemyslowa, zwlaszcza w etapie ekstrakcji (mozliwosc stoso¬ wania ekstrakcji przeciwpradowej).Wedlug wynalazku, sposób wytwarzania surow¬ ca heparyny, wzbogaconego w ten skladnik akty¬ wny, posiadajacego staly sklad, niska zawartosc tluszczu, mala liczbe drobnoustrojów, nde zmienia¬ jacego morfologii ani zawartosci skladnika aktyw¬ nego podczas magazynowania, poprzez gromadze¬ nie narzadów zwierzecych i ich obróbke, polega na tym, ze narzady zwierzece zawierajace hepary¬ ne, w razie potrzeby po ich rozdrobnieniu, podda¬ je sie obróbce wstepnej polegajacej na ogrzewa¬ niu w srodowisku, wodnym' w teni(peraituirze w za- \ kresie 10—60°C przez 0,15—15 godzin, nastepnie z tak wstepnie obrobionej zawiesiny straca sie w temperaturze 75—100°C nierozpuszczalny w wodzie kompleks heparyny z bialkiem, który poddaje sie agregacji przez dalsze ogrzewanie w tej tempera¬ turze, oddzdela klaczkowaty osad i suszy korzy¬ stnie w temperaturze ponizej 100aC do uzyskania ziamnistego produktu zawierajacego 90—95*/o< su¬ chej ' substancji.Wyjsciowym surowcem w sposobie wedlug wy¬ nalazku jest korzystnie jelito cienkie, sluzówka, blona surowicza swini, pluca bydlece, lecz mozna stosowac i inne dowolne narzady zawierajace he¬ paryne, tafcie jak jelito cienkie bydla lub owiec, sledziona bydleca, inne trzewia takie jak watroba itp.Gdy stosuje sie sluzówke zbedne jest rozdrab¬ nianie i rozcienczanie woda. Inne narzady zwie¬ rzece tnie sie na kawalki 4—6 mm i przygotowu¬ je sie z nich zawiesine wodna, w której bialko i heparyna wystepuja czesciowo w postaci roz¬ puszczonej i czesciowo w postaci koloidalnej. Za¬ wiesine przygotowuje sie o zawartosci 1,5—17*/o suchej masy. Do rozcienczania zawiesiny stosuje sie wode korzystnie o temperaturze 36—42°C, dzie¬ ki czemu nie jest konieczne doprowadzanie ciepla z zewnaittiz lub tylko w niewielkim stopniu, pod¬ czas obróbki tej zawiesiny.Tak otrzymana zawiesine, z typowego surowca zawierajacego heparyne obrabia sie wstepnie ko¬ rzystnie w temperaturze 30—50°C, na ogól przez 4 do 6 godzin. Po tej wstepnej obróbce przepro- wactea sie stracanie kompleksu heparyny z bial¬ kiem przez bezposrednie przepuszczanie pary wod¬ nej lub ogrzewanie w -ciagu dluzszego czasu, gdy . glówna czesc zawartej heparyny jest w postaci zwiazanej z bialkiem dajacym sie odsaczyc.W systemie ciaglym i okresowym wstepnie obro¬ biona zawiesine, ogrzana do temperatury 75— 100°C, utrzymuje w tej temperaturze przez 12— 15 minut. Po straceniu bialka otrzymuje sie wiel¬ kosc ziarna kcczyataa ze wzgledu na oddzielenie 18 250 r. przez saczenie. W tym czasie nastepuje równiez zniszczenie zlosliwych drobnoustrojów. Osad, od¬ dzielony w separatorze mechanicznym opartym na dzialaniu sily ciezkosci, zawiera od okolo 20—25Vt B suchej masy.W separatorze takim w zamknietym ukladzie winno sie regenerowac powierzchnie filtra, w spo¬ sób ciagly. Mozna jednak stosowac i filtry okre¬ sowe plaskie, filtry lukowe, wirówki, lub separa- 10 tory ogrzewane. Oddzielony przesacz odprowadza sie do kanalu. Przesacz ten moze zawierac 5—35M wyjsciowej suchej masy i jesli wstepna obróbka byla wlasciwie przeprowadzona, zawiera niepod- legajace denaturacji cieplnej bdalko, peptydy, po- 15 chodne kwasów nukleinowych, tluszcze, lipidy, so¬ le mineralne. Oddzielony osad stanowiacy kon¬ centrat heparyny suszy sie, korzystnie w tempe¬ raturze ponizej 1(M)0C, do uzyskania zawartosci 90—95% suchej masy. 20 Tak otrzymany koncentrat pozbawiony tluszczu posiada bezpostaciowe czastki o ziarnie, glównie w zakresie 0,2—1,6 mm, o diuzej powierzchni, któ¬ re mozna przechowywac przez dlugi okres czasu.Koncentrat ten nadaje sie zwlaszcza do otrzymy- M wainda heparyny metoda ekstrakcji w przeciw pra¬ dzie, zarówno okresowym jak i ciaglym.Stwierdzono, a takze doswiadczalnie zilustrowa¬ no to w przykladzie I, ze wsród skladników bial¬ kowych w swiezych narzadach zawierajacych he- 30 paryne wystepuja w duzym nadmiarze, w sto¬ sunku do heparyny obecnej w tych narzadach w sposób naturalny, takie bialka, które sa zdolne wiazac rozpuszczona heparyne i kompleksy hepa¬ ryny z bialkiem W taki sposób, ze mozna je wy- 58 odrebnic z tego roztworu po typowej nieodwra¬ calnej denaturacji cieplnej. Ilosc tych bialek zdol¬ nych do wiazania heparyny maleje z postepem autolizy (rozklad), na skutek rozpadu tych bialek na frakcje polipeptydowe, które nie ulegaja de- 40 naturacjd pold wplywem ciepla, a wiec nie nada¬ ja sie do takiego wiazania heparyny.Poza tym stwierdzono, co zostalo równiez zilu¬ strowane -w przykladzie II, ze stosujac kpntrolo- wana krótka autolize, w rJarzadach zwierzecych zmniejsza sie zawartosc zarówno bialek zdolnych wiazac heparyne jak i innych bialek przez ich rozpad na fragmenty nie ulegajace denaturacji pod dzialaniem ciepla. Dzieki temu uzyskuje sie surowiec podstawowy bogatszy w heparyne w po¬ równani/u z naturalnym wyjsciowym surowcem po denaturacji cieplnej.Wyniki przeprowadzonych doswiadczen okazaly sie zadziwiajace i nieoczekiwane, zgodnie z który- 99 mi szybkosc rozpadu bialek zdolnych wiazac hepa¬ ryne jest wyraznie mniejsza niz bialek nie wy¬ kazujacych tej zdolnosci, poza tym, ze podczas autolizy mozliwe jest równiez pozbywanie sie w przesaczu nukleotydów, nukleozydów itd. czyli 60 skladników towarzyszacych, które przeszkadzaja w produkcji.. . - W rezultacie tych stwierdzen i ich wykorzysta¬ nia otrzymuje sie surowiec zawierajacy 20—&$•/• suchej masyf wzbogacony w skladnik aktywny, to ** jest w heparyne, praktycznie bez jej strat Su-128 250 7 8 rowiec tein w porównaniu z surowcem naturalnymi zawiera o 5—35% w przeliczeniu o sucha ma¬ se, mniej skladników' towarzyszacych przeszkadza¬ jacych w . pózniejszej ekstrakcji heparyny.Stwierdzono równiez, ze nowy surowiec hepary¬ ny jest mniej wrazliwy na cieplo niz sama hepa¬ ryna. Pozwala to na wyeliminowanie kosztownych i skomplikowanych metod suszenia, takich jak liofilizacja, suszenie rozpylowe czy odwadnianie przy uzyciu rozpuszczalników, gdyz zwiazanie he¬ paryny z bialkiem w nafizadiaie zwierzecym ma ta¬ kie dzialanie ochronne na heparyne, ze umozliwila utrzymywanie tego narzadu powyzej 100°C nawet przez kilka godzin.Korzysci plynace z zastosowania sposobu wedlug wynalazku mozna przedstawic w nastepujacych punktach: 1. Otrzymuje sie koncentrat heparyny o zawar¬ tosci 90—95% suchej maisy, który mozna przez dlu¬ gi czas magazynowac w temperaturze pokojowej bez obawy zmiany zawartosci skladnika aktywne¬ go czy zmiany skladu. 2. Z produktu tego mozliwa jest ekstrakcja he¬ paryny z optymalna wydajnoscia przy przelicza¬ niu na jeden narzad. 3. Wymagane operacje podczas przerobu prze¬ prowadza sie w urzadzeniach zajmujacych mala przestrzen, o niskich nakladach energetycznych i inwestycyjnych. 4. Koncentrat heparyny posiada mala liczbe dro¬ bnoustrojów, mala ilosc lipidów i tluszczu. 5. Nowy typ surowca posiada najkorzysitniejsza postac i wielkosc ziarna jesli idzie o dalszy jego przerób, heparyna oddzielona w wyniku dzialania ciepla, zwiazana z rodzimym bialkiem jest mo¬ bilna, to znaczy mozna ja ponownie rozpuscic. 6* Staly sklad koncentratu daje mozliwosc upra¬ szczania i optymalizacji technologii wytwarzania heparyny. 7. Transport nowego surowca nawet do odle¬ glych miejsc jest ekonomiczny. 8. Naklady pracy w produkcji ciaglej sa ndskie.Korzystne wykonanie sposobu wedlug wynalazku polega-na rozdrofbnieniu narzadu zwierzecego (je¬ sli takie rozdrobnienie jest wskazane lub koniecz¬ ne) w przemyslowym urzadzeniu do mielenia mie¬ sa na czastki wielkosci 4—6 mm., rozcienczeniu woda Ty temp. 18—50°C do uzyskania stezenia 1,5—17*/». Tak ©trzymana zawiesine wodna prze¬ pompowuje sie do urzadzenia sluzacego do prze¬ prowadzania wstepnej auiolizy, w którym jest u- trzymywany przez Z—6 godzin w temp. 30—50°C.Po tej wstepnej obróbce zawiesine poddaje sie dzialaniu ciepla.Do tego celu stosuje sie wttryskdwacz pary wod- "nej^ Nastepnie zawiesine przepuszcza sie systemem ciaglym przez sekcje izolowanych rur z mala szybkoscia przez 2 do 6 minut, Otrzymujac osad zawierajacy heparyne, który ma postac ziaren la¬ twych do odsaczenia. Srodowisko wodne, zawie¬ rajace wylacznie skladniki zbedne, jest usuwa¬ ne pod dzialaniem sdly ciezkosci, np. przez siffoa 1 otrzymuje surowiec zawierajacy oo najmniej 23^/t suchej masy. Odsaczanie przeiprowadaa sle w urza¬ dzeniu opisanym w wegierskim opisie zgloszenio¬ wym nr RI-705.W urzadzeniu tym zachodzi ciagla regeneracja powierzchni filtra, dzieki czemu uzyskuje sie le¬ psza efektywnosc niz w systemie okresowym.Oddzielony surowiec mozna magazynowac bez chlodzenia i zamrazania, jesli suszy sie go W spo¬ sób ciagly w urzadzeniu o wysokiej efefotywnosci suszenia, opisanym w cytowanym wegierskim opi¬ sie zgloszeniowym, z taka szybkoscia z jaka jest dostanczany. Podczas suszenia temperature powie¬ trza i pary, a takze wilgotnego powietrza opusz¬ czajacego urzadzenie, reguluje sie w taki sposób, aby w ciagu stosunkowo krótkiego czasu otrzy¬ mywac produkt o ziarnie 0,2—ii,6 mm zawierajacy okolo 92°/o suchej masy, przy temperaturze powie- trza na wlocie 80—180°C a na wylocie 50—110°C.Otrzymany koncentrat pozbawiony jest enzymów, posiada staly sklad, mala liczbe drobnoustrojów, nie zawiera tluszczów, zachowuje niezmienny sklad przez dlugi okres czasu, jego mala liczflba drobno¬ ustrojów sprawia, ze nie nastepuje ioh namnaza- nie, jest ekonomiczny pod wzgledem magazynowa¬ nia i transporltu. Zawartosc heparyny w koncen¬ tracie jest rózna w zaleznosci od zawartosci hepa¬ ryny w wyjsciowym narzadzie zwierzecym. Wy¬ chodzac ze sluzówki swin, uzyskuje sie produkt 0,15 kg/KFNE skladnika aktywnego o znacznie mniejszej ilosci materialu balastowego w porów¬ naniu z innymi podstawowymi surowcami hepary¬ ny.Z tego koncentratu heparyne przeprowadza sie w roztwór wodny, dowolna znana metoda ekstrak¬ cyjna, w znacznie konzysffcniejszyoh warunkach niz to ma miejsce z podstawowym surowcem stoso¬ wanym dotychczas. Powyzszy sposób mozna tak¬ ze prowadzic systemem okresowym nie tracac podstawowych koirzysci.Wyna&fcek ilustruja nizej przytoczone przykla¬ dy.Przyklad I. W przykladzie tym wykazano, ze zawartosc bialek zdolnych wiazac heparyne w swiezym narzadzie zwierzecym jest wieksza od za¬ wartosci heparyny. 1 kg swiiezej sluzówki z jelita cienkiego swin, o zawartosci suchej masy 16,Wo wagowych, roz¬ cienczono 1,0 litrem wody. W wodzie tej uprzed¬ nio rozpuszczono sproszkowana czysta heparyne w takiej ilosci, aby jej stezenie wynosilo 82 NEtal (NE — jednostka miedzynajiodowa). Zawiesine o- gnzewano do 8i5°C podczas mieszania a nastepnie, po 5 minutowym odstaniu, produkt zdenaturowa- ny dzialaniem ciepla odsaczono na sicie.Z pobranej próbki z 1380 ml przesaczu wyliczo¬ no, ze stezenie heparyny wynosilo 1,4 NEAml,. to znaczy, ze okolo 80000 NE z 82000 NE heparyny wprowadzonych do zawiesiny zwijalo sie ze zde- naturowanym narzadem zwierzecym.Jesji taka swieza sluzówke z jeljrta cienkiego swin (1 kg) utezymuje sie w warunkach pokojo¬ wych przez póltora dhia, rozcienczy 1 litrem wo¬ dy zawierajacej 41 NE/ml heparyny, a na koniec przeprowadzi denafturacje cieplna w &6°C, steze¬ nie heparyny w .przeftacssu 1440 ft|l wyftosi 2,1 10 u 20 20 30 36 40 45 50 SI 60128 250 NE/ml, co oznacza, ze zdolnosc zdenaturowanego narzadu do zwiazania heparyny na skutek autoli¬ zy w ciagu .1,5 dnda zmalala do 38000 NE.Przyklad II. Wykazano w tym przykladzie, ze przez usuniecie substancji balastowych z na¬ rzadów zwierzecych otrzymuje sie surowiec o nie¬ spotykanym dotad nagromadzeniu heparyny, bez jej strat, pod warunkiem, ze szybkosc rozpadu czesci skladowych obojetnych ze wzgledu na wiazanie heparyny w czasie wstepnej autolizy jest mniejsza niz szybkosc rozpadu bialek zdolnych wiazac heparyne.Trzy próby, kazda po 2 kg swiezego jelita cien¬ kiego swin, zawierajacego 17,3Vi wagowych su¬ chej masy, rozcienczono 3 litrami wody. Tempe¬ ratura obróbki wynosila 29,5°C. Pierwsza próbe poddano obróbce bez autolizy, druga po szesciu godzinach autollizy a trzecia po 18 godzinach ay- tolizy. Obróbka polegala na ogrzewaniu zawiesiny narzadu do 93°C podczas mieszania, odstawieniu na 5 minut i odsaczeniu. Oznaczono wage i za¬ wartosc suchej masy zdenaturowanego nairzadu za¬ trzymanego na sicie, a takze objetosc odrzucone¬ go przesaczu, zawarta w nim sucha mase i ste¬ zenie heparyny.Z 2 kg swiezego jelita cienkiego swin nie pod¬ danego autolizie otrzymano 1,37 kg zdenaturowa¬ nego napadu o zawartosci 22,8e/# suchej masy; objetosc przesaczu wynosila 3670 ml, zawartosc su¬ chej masy 0,82Vt wag., stezenie heparyny ponizej l,25NEtol.Po 6-godzinnej autolizie waga zdenaturowanego narzadu wynosila 1,18 kg przy zawartosci suchej masy 23,2tyo; objetosc przesaczu 3780 ml, zawart. suchej masy 1,72%, stezeni heparyny 1,25 NEtol.Ze sluzówki 2 kg swiezego jelita cienkiego swdn, po 18 godzinach autolizy, otrzymano 0,99 kg zde¬ naturowanego narzadu z zawartoscia suchej masy 24,l*/t; objetosc przesaczu wynosila 3980 ml, za¬ wartosc suchej masy 2,43%, stezenie heparyny po¬ nizej 1,25 NE/ml* Poniewaz podczas obróbki nie bylo strat hepa¬ ryny, jej zawartosc w wyjsctawyim narzadzie wy¬ nosila 118000 NE i po kolejnych obróbkach jej zawartosc od(powiednio wzrastala. Wyniki przed¬ stawia tablica 1.Przyklad III. Wykazano w tym przykladzie, ze po denaturacji sluzówki z jelita cienkiego swin w systemie ciaglym suszy sie ja bez strat.Zgromadzono w stanie zhomogenizowanym 260 kg wilgotnej sluzówki z jelita cienkiego swdn, o zawartosci 6,4% suchej masy, podhodzacej z urza¬ dzenia do plukania jelit. Pobrano z tej ilosci 10 kg do dalszych badan (próba A), a reszte przez krótki czas ogrzewano do 85°C, podczas miesza¬ nia, w urzadzeniu odpowiednim do bezposredniego wprowadzania pary wodnej.Podczas zblizania sie do temp. 85°C mieszanie zwalniano a po osiagnieciu tej temperatury przer¬ wano je i pozostawiono na czas 15 minut, po któ¬ rym proces denaturacji byl zakonczony. Sfcoagulo- wany produkt przeniesiono na metalowe sita o oczkach 1,2 mm i odsaczono zóltawe ziarna za¬ wierajace heparyne. Produkt ten pozostawiono na 10 18 20 41 50 10 Tablica 1 b ctf jelito nie obrabiane jelito de¬ naturowane jelito po 6 godz. auto- Tifcy i dena¬ turowane jelilto po 18 godz. auto¬ lizy- i de¬ naturowane 12000 1370 1180 990 17,3 22,8 23,2 24,1 346 312 274 i238 h 118 000 118 000 118 000 118 000 342 380 434 500 1 godzine i sporadycznie mieszano w celu przy¬ spieszenia suszenia. Otrzymano 62 kg skoaguiowa- nego produktu zawierajacego stosunkowo mniej tluszczu niz w surowcu wyjsciowym, jakkolwiek czesc tego tluszczu zostala zatrzymana na duzej powierzchni ziaren podczas saczenia. Zawartosc suchej masy w tym produkcie wynosila 23,4P/t.W przesaczu stwierdzono zawartosc heparyny po¬ nizej 0,9 NEtol a suchej masy 0,8dVt. Pod wzgle¬ dem skladu przesacz ten zawieral tluszcz, nie¬ rozpuszczalne i rozpuszczalne bialko, troche pep- tydów i polipeptydów, sole nieorganiczne i inne balastowe skladnikli.Pobrano próby B, C, t kazda w ilosci 10 kg, ze zdenaturowanego produBctu.Próbe B sprasowano w prasie filtracyjnej grubosci warstwy 1,5 om. W wyniku otrzymano 7,4 kg produktu zawierajacego 30,3P/o suchej ma¬ sy. Przy wiekszej grubosci warstwy efekt spraso¬ wania jest gorszy.Próbe C podzielono na dwie równe czesci otrzy¬ majac próby Ci i C2. Próbe Ci o grubosci war¬ stwy 0,5 cm wysuszono w eksykatorze w 90°C w ciagu 1,5 dnda. Otrzymano 1,31 kg produktu o za¬ wartosci Qfrh suchej masy, który nastepnie roz¬ drobniono w mlynie i oznaczono jako próbe Cn.Druga czesc próby C pozostawiono bez suszenia oznaczajac ja Jako próba C2.Przeprowadzono równolegle doswiadczenia eks¬ trakcji heparyny z prób A, C2 i Cu. W celu mo¬ zliwosci porównywania wyników uzyto do obrób¬ ki próby "w takich ilosciach, aby zawartosc su¬ chej masy w kazdej próbie wynosila 468 g. Tak wiec ilosci te wynosily odpowiednio: 7,31 kg pró¬ by A, 2,0 kg próby C2 i 5,32 kg próby Cu.By móc porównywac wyniki ekstrakcji, uzyto jednakowe stezenia suchej masy i proporcje re¬ agentów. Objetosc mieszaniny do ekstrakcji roz-u 128 250 12 cienczono woda do 8,0 litrów. Do tego celu na¬ lezalo uzyc wody z kranu: 690 ml w przypadku próby A, 6000 ml w przypadku próby C2 i 7470 ml w przypadku próby Cu.A oto dalsze czynnosci zwiazane z ekstrakcja: Do wodnej mieszammy poddawanej ekstrakcji dodano podczas mieszania 3.85 g siarczanu amo¬ nowego i ogrzewano do 60°C. Po osiagnieciu tej temperatury dodano wodorotlenku sodu do uzy¬ skania pH 10,0 i utrzymywano dalej w tej tempe¬ raturze przez 2,5 godziny do osiagniecia stanu równowagi ekstrakcyjnej. Po tym czasie obnizo¬ no pH, podczas mieszania, do wartosci 8,2 stosu¬ jac do tego staly chlorek anionu, po czym ogrze¬ wano do stanu wrzenia, który utrzymywano przez 5 minut.Nastepnie mieszanine pozostawiono w spokoju na 10 minut po czym pozostalosc odsaczono na sicie metalowym o oczkach 1,0 mim od cieczy. Z pozostalosci tej pobrano próbike i oznaczono za¬ wartosc suchej masy w celu okreslenia ilosci cie¬ czy zaitrzyimaaiej w -tej pozostalosci. Wydajnosci, wyliczone w oparciu o zawartosc heparyny, znale¬ zionej w próbach i wage wyjsciowego surowca, byly nastepujace: Próba A Zawartosc heparyny — 126 000 NE proporcja surowca — 58,2 kg narzadu/MNE (MNE = milion jednostek miedzynarodowych) Próba C2 Zawartosc (heparyny — 148 000 NE . proporcja surowcowa — 13,5 kg narzadu/MNE Próba CX1 Zawartosc heparyny — 162 000 NE proporcja surowcowa — 3,27 kg narzajdu/MNE Analize porównawcza tych wyników przedsta¬ wiono w tablicy 2 (znajdujacej sie na koncu).Przyklad IV. Sluzówke z jel/ita cienkiego swin o sredniej zawartosci suchej masy 6,3%, pochodzaca (podobnie jak w przykladzie III) z urzadzenia do plukania jelit, przepompowywano prze2 sekcje izolowanych rur, gdzie pozostawala przez 1,5 godziny w temperaturze 41°C.Po tej autolizie mieszanine poddano obróbce systemem eiaglym w urzadzeniu w którego pod¬ grzewaczu mieszanina zostaje ogrzana do 90°C przez bezposrednie doprowadzenie pary, a naste¬ pnie lagodnie przeplywa przez 7,5 minuty przez sekcje izolowanych rur nalezaca do tego urzadze¬ nia. Skoagulowane ziarna oddzielone w filtrze beb¬ nowym, zapewniajacym filtracje ciagla. Odsaczo¬ ny produkt jest przesylany do suszarki polaczonej z filtrami, ogrzewanej zewnetrznie para, a we¬ wnatrz goracym powietrzem, zaopatrzonej w mie¬ szadlo i rolki. Gorace powietrze do tej suszarki, w której odbywa sie suszenie ciagle, doprowadza sie z oddzielnego zespolu, w którym powietrze jest zasysane z otoczenia przez wentylator i o- grzewane para do 142°C. Temperatura powietrza wilgotnego opuszczajacego suszarke wynosi 82— 88°C.Wyjsciowy surowiec doprowadzano z szybkoscia 600 Mtrów na godzine i po 6 godzinach prowadze¬ nia procesu w tym urzadzeniu otrzymano 178 kg produktu prawie pozbawionego tluszczu, o zawar¬ tosci 90,4% suchej masy^ i liczhie drobnoustro¬ jów 102—10* pc/g. Rozklad wielkosci ziarna jest taki, ze produkt mozna magazynowac w stanie 5 nienaruszonym w warunkach pokojowych przez czas nieograniczony: 80°/i tego produktu miala ziarno w zakresie 1,6—0,2 mm.W 'czasie procesu pobierano próbki co pól go¬ dziny w celu oznaczenia zawartosci suchej masy, 10 heparyny i innych waznych skladników. Srednia zawartosc suchej masy wynosila l,41*/o, stezenie heparyny ponizej 0,92 NE/iml, przesacz zawieral znaczne ilosci tluszczu," mniej miiz w przykladzie I bialek rozpuszczonych i nierozpuszczonych za to 15 wiecej peptydów i polipeptydów, a takze sole nie¬ organiczne i inne obojetne zanieczyszczenia.Produkt otrzymany w wyniku autolizy umozli¬ wia wytwarzanie podstawowego surowca wzboga¬ conego w heparyne. Suchym produktem w tym 20 przykladzie byla próba E poddana obróbce eks¬ trakcyjnej w ilosciach i proporcjach jak opisano w przykladzie III.Sklad prób z przykladów lii i IV oraz wyniki doswiadczen zestawiono w tablicy 2. 25 Dla celów dokladnego porównania wyliczono dwa typy zawartosci heparyny i trzy typy proporcji surowcowych. Wyliczenie dwódh typów zawartos¬ ci heparyny jest konieczne z tego wzgledu, ze stosowano pojedyncza ekstrakcje okresowa, w któ¬ rej pozostalosci zatrzymane na sicie w róznych ilosciach podczas rozdzielania cieczy ekstrakcyj¬ nych, przy zalozeniu równowagi, zawieraly ciecz ekstrakcyjna o identycznym stezeniu jak ciecz po przesaczeniu. Nalezy zauwazyc, ze te zawar¬ tosc heparyny teoretycznie uzyskuje sie powta¬ rzajac ekstrakcje.Wartosc podana w kolumnie 9 jest wartoscia aktualnie uzyskana przez wyliczenie w oparciu o 40 wartosci przesaczonych cieczy ekstrakcyjnych, podczas gdy tak zwana wartosc teonetyazna poda¬ na w kolumnie 13 oznacza teoretycznie osiagalna zawartosc heparyny wyliczona przy wzieciu pod uwage zawartosci cieczy ekstrakcyjnej w pozosta- 45 losai.Zawartosc cieczy ekstrakcyjnej w pozostalosci podaje kolumna 12. W oparciu o te wartosci mo¬ zna stwierdzic, ze im wieksza zawartosc 6uchej masy surowca poddawanego obróbce, tym mniej- 50 sza pozostalosc po ekstrakcji, to znaczy, ze eks¬ trakcje mozna przeprowadzic efektywniej stosu¬ jac podstawowy surowiec o wiekszej zawartosci suchej masy, nawet w przypadku ekstrakcji wie¬ lokrotnych. Wartosci przedstawiajace proporcje 55 materialowe, podane w kolumnie 10, byly wyli¬ czone w oparciu o aktualna wage podana w ko¬ lumnie 6 i zawartosc heparyny z kolumny 9. War¬ tosci w kolumnie 11 oznaczaja dane w odniesie¬ niu do lOOtyo zawartosci suchej masy (kolumna 6). w Wartosci tak zwanej proporcji surowcowej w ko¬ lumnie 11 odpowiadaja wartosciom odniesionym do 1001% suchej masy z kolumny 6 w oparciu o teoretyczna zawartosc heparyny (kol. 13). W opar¬ ciu o dane kolumny 6 i 13 mozna porównac za¬ li wartosc heparyny w produkcie poddawanym eks-13 128 250 Tablica 2 14 Próba A c2 Cu E Suro¬ wiec suro¬ wa slu¬ zówka sucha dena¬ turo¬ wana sluz. sucha dena- ituro- wana sluz. sucha dena¬ turo¬ wana sluz.Wste¬ pna auto- liza Sucha masa 6,4 23,4 88,00 90,4 Poddano obróbce waga kg 7,31 2,0 0,532 0,518 sucha masa g 468 468 468 468 Ciecz ekstrakcyjna Obj. ml 6120 6000 7030 7120 stez. (hep.NE/ /ml 20,6 22,5 23,1 28,6 zawart. hepa¬ ryny NE 126000 148000 162500 204000 Proporcja surowcowa 'dla wyjs. wagi kg/ /MNE (58,2 13,5 3;27 2,54 dla 100% narz. kg/ /MNE 3,72 3,16 12,88 '2,29 Za¬ wart. cieczy ekstr.Wpo- tzost. ml 1740 1340 860 900 | Teoretyczna zawart. heparyny NE 162000 179500 182000 229000 .prop.ISU- row. •dla 100% kg/ /MNE 2,89 2,62 2,57 2,04 trakcji uzyskana z przeprowadzaniem autolizy i bez.Z danych zawartych w tablicy 2 wynika, ze wantosc proporcja surowcowej produktu po dena¬ turacji i wysuszeniu jest prawie taka sama w produktach obrabianych bez autolizy i w porów¬ namiu ze sluzówka z jelita cienkiego swini jest okolo 10% korzystniejisza. Podczas denaturacji mo¬ zliwe jest usuniecie w przesaczu wielu substan¬ cji balastowych. W przypadku wstepnej autolizy zawartosc heparyny jest znacznie wyzsza, okolo 30%, w porównaniu ze swiezym narzadem.Dane zawarte w obydwu tablicach doprowa¬ dzaja do wniosku, ze zdecydowanie wyzsza za¬ wartosc heparyny uzyskuje sie w produkcie po denaturacji i wysuszeniu, jesli surowiec byl pod¬ dawany autolizie. Doswiadczenia porównawcze po¬ twierdzaja, ze suszenie produktu nie powoduje pogorszenia heparyny.Z nowego typu surowca mozna wytwarzac, np. na drodze typowej ekstrakcji, taki produkt, z którego otrzymuje sie heparyne o jakosci farma¬ kologicznej.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego typu surowca zawierajacego heparyne, poprzez gromadzenie i ob¬ róbke narzadów zwierzecych, znamienny tym, ze narzady zwierzece zawierajace heparyne, ewentu¬ alnie po ich rozdrobnieniu, poddaje sie obróbce 35 40 55 60 65 wstepnej polegajacej na ogrzewaniu ich w srodo¬ wisku wodnym w temperaturze w zakresie 10— 50°C przez czas 0,5—15 godzin, nastepnie z tak wstepnie obrobionej zawiesiny straca sie w tem- peraiturze 75—100°C nierozpuszczalny w wodzie kompleks heparyny z bialkiem, który poddaje sie agregacji przez dalsze ogrzewanie w tej tempera¬ turze, oddziela klaczkowaty osad i suszy, korzyst¬ nie w temperaturze ponizej 100°C, do uzyskania ziarnistego trwalego produktu o zawartosci 90— 95% suchej masy. 2. Siposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie narzady zwierzece rozdrobnione na cza¬ stki 4—6 mm. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie zawiesine wodna narzadów zwierzecych o zawartosci 1,5—17% suchej masy. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze rozdrobnione narzady zwierzece rozciencza sie WiO- da o ternperalturze 36^42°C. 5. Stposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze obróbke wstepna prowadzi sie w temperaturze 30—50°C przez 4—6 godzin. 6. Siposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w systemie ciaglym i okresowym wstepnie obro¬ biona zawiesine ogrzana do ternperalury 75-^100°C utrzymuje ~w tej samej temjperaturze przez 12-- 15 minut. 7. S(posób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wykonywany jest systemem okresowym. PL PL PL

Claims (7)

1.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego typu surowca zawierajacego heparyne, poprzez gromadzenie i ob¬ róbke narzadów zwierzecych, znamienny tym, ze narzady zwierzece zawierajace heparyne, ewentu¬ alnie po ich rozdrobnieniu, poddaje sie obróbce 35 40 55 60 65 wstepnej polegajacej na ogrzewaniu ich w srodo¬ wisku wodnym w temperaturze w zakresie 10— 50°C przez czas 0,5—15 godzin, nastepnie z tak wstepnie obrobionej zawiesiny straca sie w tem- peraiturze 75—100°C nierozpuszczalny w wodzie kompleks heparyny z bialkiem, który poddaje sie agregacji przez dalsze ogrzewanie w tej tempera¬ turze, oddziela klaczkowaty osad i suszy, korzyst¬ nie w temperaturze ponizej 100°C, do uzyskania ziarnistego trwalego produktu o zawartosci 90— 95% suchej masy.

2. Siposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie narzady zwierzece rozdrobnione na cza¬ stki 4—6 mm.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie zawiesine wodna narzadów zwierzecych o zawartosci 1,5—17% suchej masy.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze rozdrobnione narzady zwierzece rozciencza sie WiO- da o ternperalturze 36^42°C.

5. Stposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze obróbke wstepna prowadzi sie w temperaturze 30—50°C przez 4—6 godzin.

6. Siposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w systemie ciaglym i okresowym wstepnie obro¬ biona zawiesine ogrzana do ternperalury 75-^100°C utrzymuje ~w tej samej temjperaturze przez 12-- 15 minut.

7. S(posób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wykonywany jest systemem okresowym. PL PL PL