JPH0650988B2 - デオキシリボ核酸の製造方法 - Google Patents
デオキシリボ核酸の製造方法Info
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- JPH0650988B2 JPH0650988B2 JP62284331A JP28433187A JPH0650988B2 JP H0650988 B2 JPH0650988 B2 JP H0650988B2 JP 62284331 A JP62284331 A JP 62284331A JP 28433187 A JP28433187 A JP 28433187A JP H0650988 B2 JPH0650988 B2 JP H0650988B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は魚類の白子（精巣）からデオキシリボ核酸（以
下、ＤＮＡと称する）を抽出・分離する方法に関し、更
に詳しくは、 （ａ）魚類の白子の磨砕物にｐＨ７．５乃至ｐＨ９．５
においてプロテアーゼを作用させて、該白子の磨砕物を
分解液化せしめ、 （ｂ）得られる液状物のｐＨを４．５乃至ｐＨ６．５の
範囲に調整した後、ＤＮａｓｅを作用させて、１０％冷
過塩素酸可溶部の２６０ｎｍに於ける吸光度が原料の白
子の１．０ｇあたり２００乃至５００の範囲内にある反
応液を得、 （ｃ）ついで、該反応液からＤＮＡを回収する、各工程
からなるＤＮＡの製造方法に関する。
下、ＤＮＡと称する）を抽出・分離する方法に関し、更
に詳しくは、 （ａ）魚類の白子の磨砕物にｐＨ７．５乃至ｐＨ９．５
においてプロテアーゼを作用させて、該白子の磨砕物を
分解液化せしめ、 （ｂ）得られる液状物のｐＨを４．５乃至ｐＨ６．５の
範囲に調整した後、ＤＮａｓｅを作用させて、１０％冷
過塩素酸可溶部の２６０ｎｍに於ける吸光度が原料の白
子の１．０ｇあたり２００乃至５００の範囲内にある反
応液を得、 （ｃ）ついで、該反応液からＤＮＡを回収する、各工程
からなるＤＮＡの製造方法に関する。
（従来の技術） 魚類の精巣、いわゆる白子からＤＮＡを分離採取する従
来方法としては、洗浄磨砕した白子を水または食塩水溶
液（１〜２Ｍ）などで抽出し、濾過、遠心分離などによ
って不溶物を除去して得られる抽出液を以下のごとき様
々な処理を行ってＤＮＡを採取する方法が提案されてい
る。
来方法としては、洗浄磨砕した白子を水または食塩水溶
液（１〜２Ｍ）などで抽出し、濾過、遠心分離などによ
って不溶物を除去して得られる抽出液を以下のごとき様
々な処理を行ってＤＮＡを採取する方法が提案されてい
る。
例えば、飽和食塩水で処理して核蛋白以外の蛋白質を塩
析・除去する方法（C.F.Emanuel et al,J.Biol.Chem.,2
03,167(1953)；川出由己，日本化学会誌78,376(1957)参
照）、あるいは有機溶剤（J.M.Gulland et al,J.Chem.S
oc.,(1947)1129；渡辺格ら、日本化学会誌74,571,(195
2)参照）または界面活性剤（ＳＤＳ）（E.R.M.Key et a
l,J.Am.Cem.Soc.,74,1724,(1952)；A.M.Marko et al,J.
Biol.Chem.,190,165(1951)参照）で処理して蛋白質を変
性除去するなどの報告がある。こうして得られた処理液
から酸沈澱、アルコール沈澱によりＤＮＡを回収するこ
とができる。
析・除去する方法（C.F.Emanuel et al,J.Biol.Chem.,2
03,167(1953)；川出由己，日本化学会誌78,376(1957)参
照）、あるいは有機溶剤（J.M.Gulland et al,J.Chem.S
oc.,(1947)1129；渡辺格ら、日本化学会誌74,571,(195
2)参照）または界面活性剤（ＳＤＳ）（E.R.M.Key et a
l,J.Am.Cem.Soc.,74,1724,(1952)；A.M.Marko et al,J.
Biol.Chem.,190,165(1951)参照）で処理して蛋白質を変
性除去するなどの報告がある。こうして得られた処理液
から酸沈澱、アルコール沈澱によりＤＮＡを回収するこ
とができる。
しかしながら、上記の如き従来方法では、魚類の白子か
ら抽出した抽出液の粘度が非常に高いため、該抽出物か
ら不溶解物を除去して核蛋白を分離するに当たっては大
量の水を加えて粘度を低下させる必要があり、また、濾
過、遠心分離に際しては多量の濾過助剤を必要とし、更
に遠心分離を行う場合にも強大な遠心力を要するなどの
欠点がある。
ら抽出した抽出液の粘度が非常に高いため、該抽出物か
ら不溶解物を除去して核蛋白を分離するに当たっては大
量の水を加えて粘度を低下させる必要があり、また、濾
過、遠心分離に際しては多量の濾過助剤を必要とし、更
に遠心分離を行う場合にも強大な遠心力を要するなどの
欠点がある。
更に、該核蛋白からＤＮＡを分離する工程において、た
とえば有機溶剤による除蛋白処理は効率が悪いために、
一般に１０数回も繰り返す必要がある。加えてアルコー
ル沈澱の際も飽和に近い食塩濃度にしなければＤＮＡの
回収率が悪く、従って沈澱分離したＤＮＡには多量の食
塩が含まれており、この食塩を除去する脱塩操作が不可
欠になるなど工業的製法には程遠い多くの問題点があ
る。
とえば有機溶剤による除蛋白処理は効率が悪いために、
一般に１０数回も繰り返す必要がある。加えてアルコー
ル沈澱の際も飽和に近い食塩濃度にしなければＤＮＡの
回収率が悪く、従って沈澱分離したＤＮＡには多量の食
塩が含まれており、この食塩を除去する脱塩操作が不可
欠になるなど工業的製法には程遠い多くの問題点があ
る。
魚介類の精巣から核蛋白を製造する際、精巣の磨砕物
に、核蛋白中のＤＮＡが少しでも分解されない条件でプ
ロテアーゼを作用させた後、遠心分離して沈澱物を採取
する核蛋白の製造法も提案されている（特開昭６１−１
９５６１号公報）。
に、核蛋白中のＤＮＡが少しでも分解されない条件でプ
ロテアーゼを作用させた後、遠心分離して沈澱物を採取
する核蛋白の製造法も提案されている（特開昭６１−１
９５６１号公報）。
この提案の方法は、核蛋白中のＤＮＡが少しでも分解さ
れて収率が低下しないように、ヌクレアーゼ活性が存在
しないか、あるいはヌクレアーゼ活性が非常に弱いプロ
テアーゼを用いて核蛋白以外の蛋白質を分解し、液状化
した部分を排除して沈澱物を採取するものである。しか
し、上記公開公報には、白子の磨砕物をブロテアーゼで
分解液化せしめた液状部を利用すること及び核蛋白をさ
らに分解してＤＮＡと結合しているプロタミンを開裂さ
せ、高純度のＤＮＡとして分離採取することは何ら言及
も示唆もされていない。
れて収率が低下しないように、ヌクレアーゼ活性が存在
しないか、あるいはヌクレアーゼ活性が非常に弱いプロ
テアーゼを用いて核蛋白以外の蛋白質を分解し、液状化
した部分を排除して沈澱物を採取するものである。しか
し、上記公開公報には、白子の磨砕物をブロテアーゼで
分解液化せしめた液状部を利用すること及び核蛋白をさ
らに分解してＤＮＡと結合しているプロタミンを開裂さ
せ、高純度のＤＮＡとして分離採取することは何ら言及
も示唆もされていない。
また、例えば特開昭６０−１６０８６３号公報には、魚
類の白子に酵素剤を加えて擂潰し、適当な温度で適当な
時間保持して酵素を作用せしめ、白子を消化、液状化せ
しめて、タンパク質及び核酸に富む魚類白子の溶液また
は粉末を製造する方法が開示されている。この提案の方
法は、プロテアーゼを主成分とする酵素剤を用いて、ｐ
Ｈを調整することなく魚類の白子を加水分解するもので
あり、得られる分解物中のＤＮＡの収率は、白子に対し
て高々３．５％（実施例２）〜３．１％（実施例３）程
度に過ぎない。
類の白子に酵素剤を加えて擂潰し、適当な温度で適当な
時間保持して酵素を作用せしめ、白子を消化、液状化せ
しめて、タンパク質及び核酸に富む魚類白子の溶液また
は粉末を製造する方法が開示されている。この提案の方
法は、プロテアーゼを主成分とする酵素剤を用いて、ｐ
Ｈを調整することなく魚類の白子を加水分解するもので
あり、得られる分解物中のＤＮＡの収率は、白子に対し
て高々３．５％（実施例２）〜３．１％（実施例３）程
度に過ぎない。
以上に述べたごとく、魚類の白子を単にプロテアーゼな
どの酵素を用いて１段階で処理した場合は、該白子中の
蛋白質及び核酸などがランダムに、しかも競合的に分解
が進行するため、核蛋白及びＤＮＡの分解が不均一とな
り、その分子量分布は広範囲に亘り、一般に未分解物あ
るいは過度に分解されたものが多く混在する。従って、
目的とするＤＮＡの収率は低く、高純度、高収率でＤＮ
Ａを分離採取する方法として工業的に満足できるもので
はない。
どの酵素を用いて１段階で処理した場合は、該白子中の
蛋白質及び核酸などがランダムに、しかも競合的に分解
が進行するため、核蛋白及びＤＮＡの分解が不均一とな
り、その分子量分布は広範囲に亘り、一般に未分解物あ
るいは過度に分解されたものが多く混在する。従って、
目的とするＤＮＡの収率は低く、高純度、高収率でＤＮ
Ａを分離採取する方法として工業的に満足できるもので
はない。
（発明が解決しようとうる問題点） 本発明は、上記従来の欠点を解決した極めて容易な操作
によって、魚類の白子から高純度、高収率でＤＮＡを抽
出・分離する工業的に極めて有利な方法を提供すること
を目的とする。
によって、魚類の白子から高純度、高収率でＤＮＡを抽
出・分離する工業的に極めて有利な方法を提供すること
を目的とする。
（問題点を解決するための手段） 本発明によれば、 （ａ）魚類の白子の磨砕物、均質化物にｐＨ７．５〜ｐ
Ｈ９．５においてプロテアーゼを作用させ、それによっ
て該白子の磨砕物、殊に、精子核以外の蛋白質をはじめ
としてＤＮＡに結合して存在しているプロタミンなどの
塩基性蛋白質を分解、液化せしめ、 （ｂ）得られる液状物のｐＨを４．５乃至ｐＨ６．５の
範囲内に調整することにより、魚類の白子に本来的に存
在しているデオキシリボヌクレアーゼII（以下、ＤＮａ
ｓｅIIと称する）を活性化させて作用せしめ、ＤＮＡが
過度に低分子化しない程度の比較的重合度の低いポリな
いしはオリゴヌクレオチド類を生成させ、１０％冷過塩
素酸可溶部の２６０ｎｍにおける紫外部吸収値が上記の
白子１．０ｇ当り２００乃至５００の範囲内にある反応
液を得、 （ｃ）ついで、該反応液からデオキシリボ核酸を回収す
る、 各工程から成ることを特徴とする魚類白子からＤＮＡを
抽出・分離する方法が提供される。
Ｈ９．５においてプロテアーゼを作用させ、それによっ
て該白子の磨砕物、殊に、精子核以外の蛋白質をはじめ
としてＤＮＡに結合して存在しているプロタミンなどの
塩基性蛋白質を分解、液化せしめ、 （ｂ）得られる液状物のｐＨを４．５乃至ｐＨ６．５の
範囲内に調整することにより、魚類の白子に本来的に存
在しているデオキシリボヌクレアーゼII（以下、ＤＮａ
ｓｅIIと称する）を活性化させて作用せしめ、ＤＮＡが
過度に低分子化しない程度の比較的重合度の低いポリな
いしはオリゴヌクレオチド類を生成させ、１０％冷過塩
素酸可溶部の２６０ｎｍにおける紫外部吸収値が上記の
白子１．０ｇ当り２００乃至５００の範囲内にある反応
液を得、 （ｃ）ついで、該反応液からデオキシリボ核酸を回収す
る、 各工程から成ることを特徴とする魚類白子からＤＮＡを
抽出・分離する方法が提供される。
本発明の上記目的及び更に多くの他の目的及び利点は以
下の説明から一層明かとなるであろう。
下の説明から一層明かとなるであろう。
本発明において利用することのできる魚類の白子として
は、例えば、さけ、ます、にしん、たら等の魚類の白子
を例示することができる。これら白子は生もしくは冷凍
物の状態であることが好ましい。
は、例えば、さけ、ます、にしん、たら等の魚類の白子
を例示することができる。これら白子は生もしくは冷凍
物の状態であることが好ましい。
また、本発明において利用することのできるプロテアー
ゼとしては、例えば、市販の細菌プロテアーゼ、糸状菌
プロテアーゼ、動植物起源の蛋白分解酵素等の何れも利
用することができるが、ｐＨ７．０〜９．５の範囲でプ
ロテアーゼ活性を有し、殊に、精子核中のＤＮＡと強固
に結合して存在するプロタミンをも分解、解離する能力
のあるプロテアーゼ、例えば、アクチナーゼＡＳ（科研
製薬）、プロテアーゼ（アマノ）Ｐ−３（天野製薬）、
ブロメライン、パパイン、トリプシン等を好ましく例示
することができる。これらの酵素はさらにＤＮａｓｅII
活性を有していてもかまわない。
ゼとしては、例えば、市販の細菌プロテアーゼ、糸状菌
プロテアーゼ、動植物起源の蛋白分解酵素等の何れも利
用することができるが、ｐＨ７．０〜９．５の範囲でプ
ロテアーゼ活性を有し、殊に、精子核中のＤＮＡと強固
に結合して存在するプロタミンをも分解、解離する能力
のあるプロテアーゼ、例えば、アクチナーゼＡＳ（科研
製薬）、プロテアーゼ（アマノ）Ｐ−３（天野製薬）、
ブロメライン、パパイン、トリプシン等を好ましく例示
することができる。これらの酵素はさらにＤＮａｓｅII
活性を有していてもかまわない。
さらに、本発明の方法において白子の磨砕物及び得られ
る液状物のｐＨ調整に利用することのできるアルカリと
しては、例えば、苛性カリ及び苛性ソーダ等の苛性アル
カリを例示することができ、同様に酸としては、例え
ば、酢酸、クエン酸、乳酸等の有機酸；塩酸、硫酸、燐
酸等の無機酸を例示することができる。
る液状物のｐＨ調整に利用することのできるアルカリと
しては、例えば、苛性カリ及び苛性ソーダ等の苛性アル
カリを例示することができ、同様に酸としては、例え
ば、酢酸、クエン酸、乳酸等の有機酸；塩酸、硫酸、燐
酸等の無機酸を例示することができる。
次に、本発明の方法を、好ましい実施態様についてさら
に具体的に説明する。
に具体的に説明する。
前記した如く、魚類の白子には、ＤＮＡを加水分解し、
粘度低下（基質重合度の低下）、低重合ヌクレオチド類
を生成する一種の加水分解酵素であるデオキシリボヌク
レアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）及びII（ＤＮａｓｅII）が
本来的に存在しているが、比較的重合度の高いヌクレオ
チドを生成するＤＮａｓｅIIがアルカリ性域においては
作用しない特性を利用し、先ず第１段階の酵素分解処理
として、常法により、例えばホモジナイザー、ホモミキ
サー、コロイドミル等で磨砕した魚類の白子に、前記し
た如きアルカリを添加してｐＨ７．５〜９．５の範囲内
の弱アルカリ性とし、それによって該白子中に本来存在
しているＤＮａｓｅII活性を抑制しておき、次いで、白
子磨砕物に対して、例えば、約０．０１〜約１０％の前
記例示した如きプロテアーゼを添加し、例えば、約３０
〜約６０℃で約１０分以上酵素分解反応を行い、精子核
蛋白質以外の蛋白質及びＤＮＡに結合しているプロタミ
ンを分解、液化せしめる。
粘度低下（基質重合度の低下）、低重合ヌクレオチド類
を生成する一種の加水分解酵素であるデオキシリボヌク
レアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）及びII（ＤＮａｓｅII）が
本来的に存在しているが、比較的重合度の高いヌクレオ
チドを生成するＤＮａｓｅIIがアルカリ性域においては
作用しない特性を利用し、先ず第１段階の酵素分解処理
として、常法により、例えばホモジナイザー、ホモミキ
サー、コロイドミル等で磨砕した魚類の白子に、前記し
た如きアルカリを添加してｐＨ７．５〜９．５の範囲内
の弱アルカリ性とし、それによって該白子中に本来存在
しているＤＮａｓｅII活性を抑制しておき、次いで、白
子磨砕物に対して、例えば、約０．０１〜約１０％の前
記例示した如きプロテアーゼを添加し、例えば、約３０
〜約６０℃で約１０分以上酵素分解反応を行い、精子核
蛋白質以外の蛋白質及びＤＮＡに結合しているプロタミ
ンを分解、液化せしめる。
精子核蛋白質が分解されＤＮＡが遊離してくるにつれ
て、液の粘度は急激に増加してくる。次いで、第２段階
の酵素分解処理として、この粘稠化した液に上記した如
き酸類を添加し、液のｐＨを約４．５〜約６．５の範囲
内に調整して該白子中に本来存在しているＤＮａｓｅII
を活性化し、例えば約２５〜約６０℃にて約０．５〜約
５時間作用せしめる。
て、液の粘度は急激に増加してくる。次いで、第２段階
の酵素分解処理として、この粘稠化した液に上記した如
き酸類を添加し、液のｐＨを約４．５〜約６．５の範囲
内に調整して該白子中に本来存在しているＤＮａｓｅII
を活性化し、例えば約２５〜約６０℃にて約０．５〜約
５時間作用せしめる。
ＤＮＡの分解が進行し、低分子化するにつれて液の粘度
は低下してくるが、この際、時々サンプリングを行って
１０％冷過塩素酸塩可溶部の２６０ｎｍに於ける紫外部
吸収値をチェックし、この吸収値が原料白子１．０ｇ当
り２００乃至５００になるまで攪拌もしくは静置して分
解反応を行う。
は低下してくるが、この際、時々サンプリングを行って
１０％冷過塩素酸塩可溶部の２６０ｎｍに於ける紫外部
吸収値をチェックし、この吸収値が原料白子１．０ｇ当
り２００乃至５００になるまで攪拌もしくは静置して分
解反応を行う。
紫外部吸収値の測定方法は、酵素分解生成物約１ｇをサ
ンプリングし、これに１０％冷過塩素酸溶液を加えて１
０ｍｌにメスアップし、良く振った後氷水中に５分以上
静置し、東洋濾紙No.６を用いて濾過し、得られた濾液
を分光光度計（日立２２８型）を用いて、２６０ｎｍに
おける吸光度を測定し、白子１．０ｇに換算した値（Ｏ
Ｄ260で表わす、本明細書において同じ）が２００〜５
００の範囲内になった点を終点とする。
ンプリングし、これに１０％冷過塩素酸溶液を加えて１
０ｍｌにメスアップし、良く振った後氷水中に５分以上
静置し、東洋濾紙No.６を用いて濾過し、得られた濾液
を分光光度計（日立２２８型）を用いて、２６０ｎｍに
おける吸光度を測定し、白子１．０ｇに換算した値（Ｏ
Ｄ260で表わす、本明細書において同じ）が２００〜５
００の範囲内になった点を終点とする。
上記１０％冷過塩素酸可溶部のＯＤ260の値が２００以
下では溶液の粘度が高く、以後の遠心分離もしくは濾過
による固−液分離が困難となり、またＯＤ260値が５０
０以上になるとＤＮＡが過度に低分子化し、ＤＮＡの回
収率が悪くなる。従って前記の如く魚類白子１ｇ当りの
ＯＤ260値は２００〜５００の範囲にとどめる必要があ
る。
下では溶液の粘度が高く、以後の遠心分離もしくは濾過
による固−液分離が困難となり、またＯＤ260値が５０
０以上になるとＤＮＡが過度に低分子化し、ＤＮＡの回
収率が悪くなる。従って前記の如く魚類白子１ｇ当りの
ＯＤ260値は２００〜５００の範囲にとどめる必要があ
る。
上記の如く酵素分解処理を終えた処理液は、非常に低粘
度になっているので、引続き通常の遠心分離もしくは濾
過により容易に不溶解物を分離することができる。この
際、所望により例えばセルロース粉末、硅藻土、タルク
等の濾過助剤を使用することができる。
度になっているので、引続き通常の遠心分離もしくは濾
過により容易に不溶解物を分離することができる。この
際、所望により例えばセルロース粉末、硅藻土、タルク
等の濾過助剤を使用することができる。
更に、固−液分離に先立って、所望により上記酵素分解
処理液に、例えば活性炭、シリカゲル、活性白土、多孔
性重合樹脂などの吸着剤を添加し、脱色、脱臭処理を行
うこともできる。かかる吸着剤の添加量は厳密ではな
く、着色の程度や臭気の程度に応じて任意に選択するこ
とができ、例えば酵素分解処理液に対して約０．０５〜
約１０重量％の範囲を例示することができる。
処理液に、例えば活性炭、シリカゲル、活性白土、多孔
性重合樹脂などの吸着剤を添加し、脱色、脱臭処理を行
うこともできる。かかる吸着剤の添加量は厳密ではな
く、着色の程度や臭気の程度に応じて任意に選択するこ
とができ、例えば酵素分解処理液に対して約０．０５〜
約１０重量％の範囲を例示することができる。
固−液分離によって清澄化された酵素分解処理液（以
後、分離液と称することがある）は、所望により濃縮処
理することができ、例えば可溶性固形分として約１０〜
約５０％に濃縮することにより以後の酸沈澱もしくはア
ルコールによる沈澱処理を容易に行うことができる。
後、分離液と称することがある）は、所望により濃縮処
理することができ、例えば可溶性固形分として約１０〜
約５０％に濃縮することにより以後の酸沈澱もしくはア
ルコールによる沈澱処理を容易に行うことができる。
酸沈澱処理によるＤＮＡの回収工程は、上記分離液に、
前記した如き無機酸を攪拌条件下に添加し、ｐＨ約１．
０〜約２．０に調整することによりＤＮＡを不溶化せし
めることによって行うことができる。
前記した如き無機酸を攪拌条件下に添加し、ｐＨ約１．
０〜約２．０に調整することによりＤＮＡを不溶化せし
めることによって行うことができる。
また、アルコールによる沈澱処理は、上記分離液もしく
はその濃縮物に例えば、メタノール、エタノール及びイ
ソプロピルアルコール等のアルコール類を添加し、アル
コール濃度を例えば約３０〜約８０％にすることによっ
てＤＮＡを沈澱回収することができる。
はその濃縮物に例えば、メタノール、エタノール及びイ
ソプロピルアルコール等のアルコール類を添加し、アル
コール濃度を例えば約３０〜約８０％にすることによっ
てＤＮＡを沈澱回収することができる。
本発明の前記２段階酵素分解反応を、段階を踏まずに、
例えば、魚類白子磨砕物にプロテアーゼを添加後、ｐＨ
約４．５〜約６．５の酸性にて酵素分解処理を行った場
合は、該プロテアーゼと魚類白子中に存在していたＤＮ
ａｓｅIIが同時に作用し、プロテアーゼにより可溶化し
たＤＮＡは直ちにＤＮａｓｅIIの作用を受けて更に低分
子化が進行するため、ＤＮＡの分子量分布が非常に広く
なり、その分解程度をコントロールすることは実際上不
可能である。従って、通常の遠心分離もしくは濾過が可
能な粘度まで酵素分解処理を行った場合には、未分解の
核蛋白及び分解の行き過ぎたＤＮＡが混在する結果とな
り、ＤＮＡの回収率は極めて低いものとなる。
例えば、魚類白子磨砕物にプロテアーゼを添加後、ｐＨ
約４．５〜約６．５の酸性にて酵素分解処理を行った場
合は、該プロテアーゼと魚類白子中に存在していたＤＮ
ａｓｅIIが同時に作用し、プロテアーゼにより可溶化し
たＤＮＡは直ちにＤＮａｓｅIIの作用を受けて更に低分
子化が進行するため、ＤＮＡの分子量分布が非常に広く
なり、その分解程度をコントロールすることは実際上不
可能である。従って、通常の遠心分離もしくは濾過が可
能な粘度まで酵素分解処理を行った場合には、未分解の
核蛋白及び分解の行き過ぎたＤＮＡが混在する結果とな
り、ＤＮＡの回収率は極めて低いものとなる。
以下、実施例により本発明の方法を更に詳しく説明す
る。
る。
（実施例） 実施例１ 冷凍鮭白子２００ｇをホモミキサーで磨砕し、水６００
ｇを添加、混合した後、２％ＮａＯＨを用いてｐＨ９に
調整した。この磨砕物にアクチナーゼＡＳ（科研製薬
製）０．２ｇを添加し、攪拌条件下に４０℃で３時間反
応させた。この反応により、最初は比較的低粘性であっ
た白子磨砕物は反応の終わりには極めて粘稠になった。
次いでこの反応物に１０％乳酸溶液を添加して、ｐＨ５
に調整してＤＮａｓｅを活性化させ、同温度にて攪拌反
応を継続した。この間時々サンプリングを行い、２時間
後に白子１ｇあたりの１０％冷過塩素酸可溶部のＯＤ26
0が３２５になったところで反応をやめ、活性炭８ｇを
加え、９５℃にて３０分間攪拌加熱してＤＮａｓｅの失
活と同時に脱臭、脱色処理を行った。ついでセルロース
粉末を濾過助剤として使用し、遠心分離、濾過を行って
清澄の濾液を得た。この濾液を減圧条件下に濃縮し、固
形分約４０％の濃縮液を得、これに９５％エタノールを
加えてＤＮＡを沈澱させた。含水エタノールを濾過して
除き、得られた固形物を乾燥しＤＮＡ１３．４ｇを得
た。このＤＮＡはSchmidt,Thannhauser,Schneider法で
分析した結果、純度９２％であった。（ＤＮＡ収率：対
原料白子６．１６％）。
ｇを添加、混合した後、２％ＮａＯＨを用いてｐＨ９に
調整した。この磨砕物にアクチナーゼＡＳ（科研製薬
製）０．２ｇを添加し、攪拌条件下に４０℃で３時間反
応させた。この反応により、最初は比較的低粘性であっ
た白子磨砕物は反応の終わりには極めて粘稠になった。
次いでこの反応物に１０％乳酸溶液を添加して、ｐＨ５
に調整してＤＮａｓｅを活性化させ、同温度にて攪拌反
応を継続した。この間時々サンプリングを行い、２時間
後に白子１ｇあたりの１０％冷過塩素酸可溶部のＯＤ26
0が３２５になったところで反応をやめ、活性炭８ｇを
加え、９５℃にて３０分間攪拌加熱してＤＮａｓｅの失
活と同時に脱臭、脱色処理を行った。ついでセルロース
粉末を濾過助剤として使用し、遠心分離、濾過を行って
清澄の濾液を得た。この濾液を減圧条件下に濃縮し、固
形分約４０％の濃縮液を得、これに９５％エタノールを
加えてＤＮＡを沈澱させた。含水エタノールを濾過して
除き、得られた固形物を乾燥しＤＮＡ１３．４ｇを得
た。このＤＮＡはSchmidt,Thannhauser,Schneider法で
分析した結果、純度９２％であった。（ＤＮＡ収率：対
原料白子６．１６％）。
実施例２ 冷凍にしん白子３００ｇをホモジナイザーで磨砕し、水
３００ｇを添加、混合した後、２％ＫＯＨを用いてｐＨ
８に調整した。この磨砕物にアクチナーゼＡＳ（科研製
薬製）２ｇおよびトリプシン４ｇを添加し、静置条件下
に５０℃で２時間反応させた。ついでこの反応物を１０
％ＨＣｌを用いてｐＨ５．５に調整してＤＮａｓｅを活
性化させ、同温度において反応を行った。
３００ｇを添加、混合した後、２％ＫＯＨを用いてｐＨ
８に調整した。この磨砕物にアクチナーゼＡＳ（科研製
薬製）２ｇおよびトリプシン４ｇを添加し、静置条件下
に５０℃で２時間反応させた。ついでこの反応物を１０
％ＨＣｌを用いてｐＨ５．５に調整してＤＮａｓｅを活
性化させ、同温度において反応を行った。
この間、時々サンプリングを行ってＤＮＡの分解程度を
チェックし、２．５時間後に白子１ｇあたりの１０％冷
過塩素酸可溶部のＯＤ260が３６０になったところで、
９５℃にて１５分間加熱を行ってＤＮａｓｅを失活さ
せ、１７００×ｇにて１０分間遠心分離を行い清澄な分
離液を得た。
チェックし、２．５時間後に白子１ｇあたりの１０％冷
過塩素酸可溶部のＯＤ260が３６０になったところで、
９５℃にて１５分間加熱を行ってＤＮａｓｅを失活さ
せ、１７００×ｇにて１０分間遠心分離を行い清澄な分
離液を得た。
この分離液を減圧条件下に濃縮し、固形分約２０％の濃
縮液を得、これに３５％ＨＣｌを加えてｐＨ１．５と
し、ＤＮＡを沈澱させた。デカンテーションにより上澄
液を除去し、得られた固形分を乾燥してＤＮＡ２０．２
ｇを得た。このＤＮＡはSchmidt,Thannhauser,Schneide
r法で分析した結果、純度８８％であった。（ＤＮＡ収
率：対原料白子５．９２％）。
縮液を得、これに３５％ＨＣｌを加えてｐＨ１．５と
し、ＤＮＡを沈澱させた。デカンテーションにより上澄
液を除去し、得られた固形分を乾燥してＤＮＡ２０．２
ｇを得た。このＤＮＡはSchmidt,Thannhauser,Schneide
r法で分析した結果、純度８８％であった。（ＤＮＡ収
率：対原料白子５．９２％）。
（発明の効果） 本発明は、従来の欠点を解決した、極めて容易な操作に
よって、魚類白子から高純度、高収率でＤＮＡを抽出・
分離する工業的に極めて有利な方法を提供するものであ
る。
よって、魚類白子から高純度、高収率でＤＮＡを抽出・
分離する工業的に極めて有利な方法を提供するものであ
る。
本発明によって得られるＤＮＡは、高純度であり、医薬
品をはじめ香粧品、健康食品、飲食品など広い分野にお
いて安全に利用することができる。
品をはじめ香粧品、健康食品、飲食品など広い分野にお
いて安全に利用することができる。
Claims (1)
- 【請求項１】（ａ）魚類の白子の磨砕物にｐＨ７．５乃
至ｐＨ９．５においてプロテアーゼを作用させて、該白
子の磨砕物を分解液化せしめ、 （ｂ）得られる液状物のｐＨを４．５乃至ｐＨ６．５の
範囲に調整した後、ＤＮａｓｅを作用させて、１０％冷
過塩素酸可溶部の２６０ｎｍにおける吸光度が上記白子
の１．０ｇあたり２００乃至５００の範囲内にある反応
液を得、 （ｃ）ついで、該反応液からデオキシリボ核酸を回収す
る、 ことを特徴とするデオキシリボ核酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62284331A JPH0650988B2 (ja) | 1987-11-12 | 1987-11-12 | デオキシリボ核酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62284331A JPH0650988B2 (ja) | 1987-11-12 | 1987-11-12 | デオキシリボ核酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01128795A JPH01128795A (ja) | 1989-05-22 |
| JPH0650988B2 true JPH0650988B2 (ja) | 1994-07-06 |
Family
ID=17677178
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62284331A Expired - Fee Related JPH0650988B2 (ja) | 1987-11-12 | 1987-11-12 | デオキシリボ核酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0650988B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3366769B2 (ja) * | 1995-03-03 | 2003-01-14 | 雪印乳業株式会社 | 白子を配合した栄養組成物 |
-
1987
- 1987-11-12 JP JP62284331A patent/JPH0650988B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01128795A (ja) | 1989-05-22 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |