DE2509482C2 - Verfahren zur Herstellung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus Rinderlunge - Google Patents

Verfahren zur Herstellung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus Rinderlunge

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des bekannten biologisch wirksamen KaI-likrein-Trypsin-Inhibitors durch Behandlung des biologischen Ausgangsmaterials mit proteolytischen Enzymen, Adsorption der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor-haltigen Lösung an trägergebundenem Trypsin und anschließende Desorption des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors.
Es ist bereits bekannt geworden, daß der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor nach der deutschen Patentschrift 10 84 433 mit wassermischbaren organischen Lösungsmitteln, vornehmlich Methanol in Gegenwart von Salzen oder Hydroxiden der Erdalkalimetalle aus zerkleinerten tierischen Organen gewonnen werden kann. Diese selektive Extraktionsart liefert bereits relativ reinen Inhibitor, da hochmolekulare Proteine denaturiert werden. Ein Nachteil dieser Methode ist jedoch, daß die organischen Lösungsmittel in explosionssicheren Anlagen zurückgewonnen werden müssen. Außerdem ist bekannt, daß die Ausbeute abhängig vom Grad der Zerkleinerung der Organe ist. Die Ausbeute an Kallikrein-Trypsin-Inhibitor kann durch nochmalige Extraktion des Organs nach dem gleichen Prinzip erhöht werden.
Andererseits ist bekannt geworden, daß der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor mit starken Säuren wie Schwefelsäure (Französische Patentschrift 15 66 777), Trichloressigsäure (Deutsche Patentschrift 10 11 576), Oxalsäure (Deutsche Patentschrift 14 92 114) oder Perchlorsäure (Zeitschrift für Physiologische Chemie (1964), 338, 228—330) aus verschiedenen Organen extrahiert werden kann. Die mit Säuren erhaltenen Rohextrakte sind in der Ausbeute, nicht jedoch in der Reinheit (KIE/mg, KIE = Kallikrein-Inhibitor-Einheiten), (E. K. Frey, H. Kraut und E. Werle, Das Kallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren, S. 11, Ferdinand Enke, Stuttgart, 1968) mit einem mit Hilfe organischer Lösungsmittel erhaltenen Rohextiakt vergleichbar. Außerdem müssen die Säureanionen im Laufe der Aufarbeitung durch Adsorption an Ionenaustauscher wieder entfernt werden.
Die weitere Aufarbeitung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus diesen Rohlösungen erfolgt durch Fällung als schwerlösliches Derivat der Metaphosphorsäure bzw. Polyphosphorsäure gemäß den deutschen Patentschriften 11 93 200, 11 92 368 und 11 81 370. Die Komplexe werden nach bekannten Methoden in die Komponenten dissoziiert und die Lösung anschließend von Salzen befreit.
Nach dem gleichen Prinzip wird in der deutschen Patentschrift 12 51911 vorgegangen, wo durch Zugabe von Elastin bei pH 7 bis 10 ein schwerlöslicher Inhibitor-Elastinkomplex abgetrennt werden kann, der bei pH 1 bis 6 in 4ie Komponenten dissoziiert wird.
Die Abtrennung des Kallikrem-Trypsin-Inhibitors von Verunreinigungen mit Hilfe schwerlöslicher Derivate ist mit geringen Nachteilen behaftet, sie kann z. B. nur mit hochkonzentrierten und salzfreien Lösungen durchgeführt werden. Die Fällungsprodukte sind außerdem in überschüssigem Fällungsmittel wieder löslich. Die Abtrennung des Inhibitors über den Elastinkomplex ist ökonomisch nicht optimal.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolation und Reinigung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus tierischem Material, wobei man einen rohen Gewebesxtrakt an trägergebundenem Trypsin adsorbiert, den entstandenen Trypsin-Inhibitor-Komplex wäscht und dann den Kallikrein-Trypsin-Inhibitor dissoziiert, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Gewebeextrakt durch Behandlung von in Puffer zerkleinerter Rinderlunge mit einem proteolytischen Enzym aus der Reihe Papain, der mikrobiellen Serin Proteinasen oder einer anderen Aspergillus Proteinase bei 40 bis 700C und pH 5 bis 10 und Abtrennen des nichtlöslichen Rückstandes herstellt
Die genannten Proteinasen sind handelsüblich und werden zum Beispiel unter den Bezeichnungen Corolase® (Papain), Alcalase®, Maxatase®, Bakterienproteinase N® (mikrobielle Serinproteinasen) oder Pilzproteinase P® (Aspergillus Proteinase) angeboten.
Ein wesentlicher Fortschritt gegenüber dem in der DE-AS 15 17 753 bzw. von Fritz et al, Angew. Chem. 78, Seite 775 (1966) beschriebenen Verfahren ist der Verzicht auf den Schritt der Enteiweißung, der, wie oben angesprochen, die Entfernung der Säureanionen im Laufe der Aufarbeitung notwendig macht
Es ist als ausgesprochen überraschend zu bezeichnen, daß ein Protein wie der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor derartig extreme Bedingungen für eine Proteinhydrolyse ohne Modifikation der Struktur übersteht Zwar ist bereits in aer Literatur die Stabilität des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors gegenüber proteolytischen Enzymen beschrieben worden (B. Kassell, Methods in Enzymology, 19 (1970) 848 und 850), jedoch wurde der Inhibitor unter vergleichsweise milden Bedingungen mit den Proteasen behandelt. Die aus der Lunge extrahierten Proteine werden beim erfindungsgemäßen Verfahren mit Ausnahme des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors in wäßriger Lösung bei erhöhter Reaktionstemperatur zur Peptiden und Aminosäuren hydrolysiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus Rinderlunge stellt eine Bereicherung der Pharmazie dar.
Der Ablauf des erfindungsgemäßen biochemischen Verfahrens kann durch das folgende Schema verdeutlicht werden:
Rinderlunge
Proteasenaufschluß von Lunge
Extrakt
Reinigung über trägergebundenes Trypsin und anschließende Desorption
Kallikrein-TrypsinInhibitor
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Puffer zerkleinerte Rinderlunge im ersten Verfahrensschritt mit den proteolytischen Enzymen umgesetzt, welche spezifisch wirksam sind.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Enzyme können als käufliche technische Enzyme ohne vorherige Reinigung eingesetzt werden.
Die Eigenschaften von proteolytischen Enzymen, insbesondere die Beschreibung ihrer biochemischen Wirkungen sind in folgenden Literaturstellen beschrieben: G. E. Perlman und L. Lorand, Methods in Enzymology, 19 (1970) 199 bis 215 für Subtilisin, 226 bis 244 für Papain und 581 bis 594 für Proteasen aus Aspergillus.
Die Enzyme werden bei ihrem jeweiligen pH-Optimum mit dem Lungenprotein in Kontakt gebracht Der pH-Wert kann in einem weiten Bereich von pH 5 bis 10 variiert werden, ohne daß Ausbeute und Reinheit des Inhibitors sich ändern.
Denaturierte Proteine sind bessere Substrate für Proteasen als die nativen Proteine. Außerdem steigt die Aktivität der Proteasen bei Erhöhung der Reaktionstemperatur von 25° C auf 60° C auf ca. das Fünffache an.
Während bei 25° C bei einem Aufschluß von Lunge mit Proteasen nur trübe Rohextraktlösungen erhalten werden können, die auch nach Zusatz von Filtrierhilfsstoffen nicht einwandfrei zu klären sind, sind die bei 600C erhaltenen Rohlösungen klar. Die Reaktionstemperatur beträgt daher insbesondere 600C, die Reaktionszeit 90 bis 120 Minuten. Als vorzugsweiser Temperaturbereich kann 40 bis 70° C angegeben werden.
Soll zusätzlich zu dem Kallikrein-Trypsin-Inhibitor noch ein P'roteinhydrolysat in Form eines Peptons aus Rinderlunge gewonnen werden, so kann man auch 2 proteolytische Enzyme sequentiell, bevorzugt Subtilisin zuerst und dann einer Pilzproteinase aus Aspergillus (Protease Ρ®) auf Rinderlunge einwirken lassen.
Subtilisin, Papain und Bakterienproteinase N® (The Enzymes, Academic Press, Second Edition, Seite 194—203 (I960)) können quantitativ durch Zugabe von konzentrierter Schwefelsäure bis zu einem pH-Wert von 1 bis 2 zerstört werden. Bei der Protease Ρ® wird noch eine Restaktivität von 45% des Ausgangswertes gefunden.
Der Extraktionsschritt, mit dem eine hohe Ausbeute relativ reinen Inhibitors erhalten wird, ist kombiniert mit einer selektiven Adsorption des Inhibitors an trägergebundenes Trypsin, welcher hier als zweiter Verfahrensschritt bezeichnet werden soll.
Diese erfolgt nach dem Prinzip des Affinitätschromatographie gemäß der DE-AS 15 17 753. Alle Bestandteile der Lunge ohne Affinität für Trypsin, z. B. das mit dem Aufschluß erhaltene Proteinhydrolysat, enthaltend Trypsin-Kalükrein-Inhibitor und Peptide wird von der Trypsinsäule nicht zurückgehalten. Der Trypsin-Inhibitor-Komplex wird danach bei einem niedrigen pH-Wert in seine Bestandteile Trypsin und Kallikrein-Inhibitor dissoziiert
Beim zweiten Verfahrensschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der im ersten Reaktionsschritt gewonnene hydrolysierte Organextrakt auf eine Säule, enthaltend trägergebundenes Trypsin, aufgetragen und zunächst mit Acetatpuffer pH 4 das Proteinhydrolysat eluiert und schließlich der Trypsin-Inhibitorkomplex mit verdünnter Mineralsäure dissoziiert
Das Trypsin kann an praktisch alle Trägermaterialien gebunden sein, mit denen Trypsin eine kovalente Bindung eingeht Als mögliche Trägermaterialien seien beispielsweise genannt:
Sepharose®; Copolymerisat aus Acrylamid, N,N'-Methylenbis-acrylamid und Maleinsäure; Carboxymethylcellulose; vernetztes Maleinsäureanhydrid.
Diese Aufzählung soll keineswegs Dmitiv wirken, neben den vorgenannten Trägermaterialien sind noch eine ganze Reihe anderer Trägermaterialien geeignet
Der erfindungsgemäß erhaltene Kallikrein-Trypsin-Inhibitor gleicht in seinen elektrophoretischen und immunologischen Eigenschaften sowie in seiner Amino-Säurezusammensetzung völlig einem Inhibitor, der nach anderen Extraktionsverfahren oder anderen Aufarbeitungsmethoden aus demselben Organ erhalten werden kann.
Der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor ist ein basisches Protein mit einem Molekulargewicht von 6513, dessen Aminosäuresequenz bekannt ist (Anderer F. A. und Hörnle S., Z. Naturforsch, 20 b 457 (1965); Anderer F. A, Z. Naturforsch. 20 b, 462 (1965); Anderer F. A. und Hörnle S, J. Biol. Chem. 241, 1568 (1965). Der Inhibitor hemmt die Enzyme Trypsin (EC 3.4.4.4), Chymotrypsin (EC 3.4.4.5), Plasmin (EC 3.4.4.14) und Kallikrein (EC 3.4.4.21). Er wird in besonders hoher Konzentration in Organen von Wiederkäuern gefunden und bevorzugt aus Lunge, Parotis, Leber oder Pankreas gewonnen.
Der erfindungsgemäß erhaltene Kallikrein-Trypsin-Inhibitor kann in gleicher Weise wie aus der Literatur bekannt medizinisch z. B. bei der Therapie der Pancreatitis sowie bei postoperativen Blutungen Verwendung finden.
Beispiel 1
1 kg zerkleinerte Rinderlunge wird mit 21 0,1 M Phosphat- oder Boratpuffer pH 8,0 angerührt und die Suspension auf 60° aufgeheizt Es werden 13,2 Anson-Einheiten (Anson, ]. Gen. Physiol., 22 (1939) 79) einer technischen Serinprotease aus Bacillus (Alcalase® der Fa. Novo Industri AS, Kopenhagen, Dänemark oder Maxatase® der Fa. Gist Brocades N. V., Delft, Niederlande) zugesetzt und die Proteinhydrolyse 90 Minuten lang bei 60°C unter intensivem Rühren durchgeführt Der pH-Wert wird dann mit konzentrierter Schwefelsäure auf 1 —2 eingestellt und der Rückstand hochtourig abzentrifugiert Der Überstand wird über ein Faltenfilter filtriert und anschließend mit Natronlauge auf pH 6 eingestellt Nach Filtration über eine Seitz-AS-Filterschicht wird eine klare gelbe Lösung erhalten. Die Ausbeute beträgt im Durchschnitt 1,6 χ ΙΟ6 KIE/kg Lunge mit einer Hemmaktivität von 150—250 KIE/kg Protein. 138 000 KIE eines solchen Organextraktes werden bei 4—250C auf eine Trypsin-Sepharose-4 B®-Säule aufgetragen, die Begleitproteine mit 0,1 M Acetatpuffer pH 4 ( + 0,3M NaCl + 0,01 M CaCl2) eluiert und der Trypsin-Inhibitorkomplex mit 0,1 HCI (+ 0,5 M NaCl + 0,01 M CaCl2) pH 1,2 dissoziiert Es werden im Eluat 128 000 KIE entsprechend 92,7% der Theorie gefunden. Nach Einstellen des pH-Wertes mit Kalilauge auf 5—6 wird die Inhibitorlösung am Rotationsdampfer eingeengt und über Sephadex G 25® mit 0,1 M Essigsäure oder 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonat als Eluationsmittel entsalzt und anschließend lyophilisiert
Die Entsalzung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors kann mit guter Ausbeute auch mit einer Ultrafiltrationsmembran erfolgen.
Ausbeute:
22,4 mg (121 500 KIE entsprechen 88,1 % d. Th.)
Hemmaktivität:
5450 KIE/mg Einwaage oder 5600 KIE/mg Protein.
Beispiel 2
1 kg zerkleinerte Rinderlunge wird mit 21 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 angerührt und die Suspension auf 60° C aufgeheizt Es werden 19,5 Anson-Einheiten einer Serinproteinase (Bakterienproteinase N®, Röhm GmbH, Darmstadt, BRD) zugesem und die Proteinhydrolyse bei 60° C für 90 Minuten unter intensivem Rühren durchgeführt Die weitere Aufarbeitung geschieht wie im Beispiel 1. Die Ausbeute beträgt im Durchschnitt 1,6 χ l/i1-6 KIE/kg Lunge mit einer Hemmaktivität von 150 KIE/mg Protein.
150 000 KIE eines solchen Organextraktes werden auf eine Trypsin- Sepharose-4 B®-Säule gepumpt und der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor wie im Beispiel 1 isoliert Im Eluat werden 137 000 KIE entsprechend 913% der Theorie gefunden. Nach Entsalzung über Sephadex G 25® werden 26,0 mg Inhibitor einer Hemmaktivität von 4600 KIE/mg erhalten, insgesamt 119 500 KIE, d. h. 79,7% der Theorie.
Beispiel 3
1 kg zerkleinerte Rinderlunge wird mit 21 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 angerührt und die Suspension auf 60° C aufgeheizt Es werden 15,4 Anson-Einheiten Pilzproteinase P® aus Aspergillus (Röhm GmbH, Darmstadt, BRD) zugesetzt und die Proteinhydrolyse bei 60° C für 90 Minuten unter intensivem Rühren durchgeführt Die weitere Aufarbeitung geschieht wie im Beispiel 1. Die Ausbeute beträgt im Durchschnitt 1,7 χ 106 KIE/kg mit einer Hemmaktivität von 150-350 KIE/mg Protein.
151 000 KIE eines solchen Organextraktes werden auf eine Trypsin-Sepharose-4 B®-Säule gepumpt und der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor wie im Beispiel 1 isoliert Im Eluat werden 160 000 KIE entsprechend 106% der Theorie gefunden. Nach Entsalzung über Sephadex G 25® werden 23,3 mg Inhibitor einer Hemmaktivität von 5074 KIE/mg erhalten, insgesamt 118 000 KIE, d. h. 78,2% der Theorie.
Beispiel 4
1 kg zerkleinerte Rinderlunge wird mit 21 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 angerührt und die Suspension auf 6O0C aufgeheizt. Es werden 14,3 Anson-Einheiten Papain (Corolase S 50®, Röhm, Darmstadt, BRD) zugesetzt und die Proteinhydrolyse bei 6O0C für 90 Minuten unter intensivem Rühren durchgeführt Die weitere Aufarbeitung geschieht wie im Beispiel 1. Die Ausbeute beträgt im Durchschnitt 1,5 χ 106 KIE/kg Lunge mit einer Hemmaktivität ve η 150—250 KIE/mg Protein.
150 000 KIE eines solchen Organextaktes werden auf eine Trypsin-Sepharose-4 B®-Säule jepumpt und der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor wie im Beispiel 1 isoliert Im Eluat werden 127 000 KIE entsprechend 84,6% der Theorie gefunden. Nach Entsalzung über SephadexG 25® werden 24,1 mg Inhibitor einer Hemmaktivität von 4980 KIE/mg erhalten, insgesamt 120 000 KIE1 d.h. 80% der Theorie.
Beispiel 5
25 kg zerkleinerte Ririderlünge weiden mit 45 10,1 M Phosphätpuffer pH 8,0 angerührt ühd die Suspension auf 60° G aufgeheizt Es werden 240 AhsomEinheiten Alcalase® zugesetzt und die Proteinhydrolyse 90 Minuten lang bei 60° C unter intensivem Rühren durchgeführt Der pH-Wert wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf pH 1 —2 eingestellt und der Niederschlag abzentrifugiert Der Überstand wird filtriert und anschließend mit Natronlauge auf pH 6 eingestellt Nach Filtration über eine Seitz-AS-Fiiterschicht wird eine klare gelbe bis bräunliche Lösung erhallen. Die Ausbeute beträgt 42 χ 106 KIE/mg Lunge mit einer Hemmaktivität von 240 KIE/mg Protein.
90 000 KIE dieses Organextraktes werden auf eine Säule gepumpt die Trypsin kovalent gebunden an ein Copolymerisat aus Acrylamid, Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und Maleinsäure (Enzygel® der Fa. Boehringer, Mannheim) enthielt Wie im Beispiel 1 wird der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor isoliert Im Eluat werden 83 000 KIE entsprechend 92,4% der Theorie gefunden. Nach Entsalzung über Sephadex G 25® werden 14,5 mg Inhibitor einer Hemm aktivität von 5440 KIE/mg erhalten, insgesamt 78 900 KIE, 873% der Theorie.
Beispiel 6
142 000 KIE eines Organextraktes aus Beispiel 1 werden auf eine Säule gepumpt, die Trypsin polymer gebunden an Carboxymethylcellulose enthielt Wie im Beispiel 1 wird der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor isoliert Im Eluat werden 132 000 KIE entsprechend 93,0% der Theorie gefunden. Nach Entsalzung über Sephadex G 25® werden 24,1 mg Inhibitor einer Hemmaktivität von 5310 KIE/mg erhalten, insgesamt 127 000 KIE, d. h. 89,4% der Theorie.
Beispiel 7
75 000 KIE eines Organextraktes aus Beispiel 5 werden auf eines Säule gepumpt, die Trypsin polymer gebunden an vernetztem Maleinsäureanhydrid enthielt Wie im Beispiel 1 wird der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor isoliert. Im Eluat werden 62 250 KIE entsprechend 82,7% der Theorie gefunden. Nach Entsalzung über Sephadex G 25® werden 27,1 mg Inhibitor einer Hemmaktivität von 2000 KIE/mg Einwaage bzw. 4320 KIE/mg Protein erhalten, insgesamt 54 000 KIE, d. h. 59,3% der Theorie.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Isolierung und Reinigung des KaI-likrein-Trypsin-Inhibitors aus tierischem Material, wobei man einen rohen Gewebeextrakt an trägergebundenem Tiypsin adsorbiert, den entstandenen Trypsin-Inhibitor-Komplex wäscht und dann den Kallikrein-Trypsin-Inhibitor dissoziiert, dadurch gekennzeichnet, daß man den Gewebeextrakt durch Behandlung von in Puffer zerkleinerter Rinderlunge mit einem proteolytischen Enzym aus der Reihe Papain, der mikrobiellen Proteinasen oder einer anderen Aspergillus Proteinase bei 40 bis 7O0C und pH 5 bis 10 und Abtrennen des nichtlöslichen Rückstandes herstellt
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