JPS5836387A - プロリンイミノペプチダ−ゼおよびその製造法 - Google Patents
プロリンイミノペプチダ−ゼおよびその製造法Info
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- JPS5836387A JPS5836387A JP13157681A JP13157681A JPS5836387A JP S5836387 A JPS5836387 A JP S5836387A JP 13157681 A JP13157681 A JP 13157681A JP 13157681 A JP13157681 A JP 13157681A JP S5836387 A JPS5836387 A JP S5836387A
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- Japan
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- proline
- inhibition
- iminopeptidase
- peptides
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、食菌から得られるイミノペプチダ−ゼおよび
その製造法に関し、更に詳しくは、シイタケ（Ｌｅｎｔ
ｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓ ）子実体又は菌体から得られ
るイミノペプチダーゼおよびその製造法に関する。
その製造法に関し、更に詳しくは、シイタケ（Ｌｅｎｔ
ｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓ ）子実体又は菌体から得られ
るイミノペプチダーゼおよびその製造法に関する。
従来、特異的なアミノペプチダーゼとしては、アミノ末
端がアルギニンまたはリジンであるペプチドを特異的に
分解するアミノペプチダーゼＢ、アミノ末端がアシルア
ミノ陵であるペプチドを特異的に分解する哺乳動物臓器
由来のアシルアミノ１遊＋１酵素、アミノ末端がピログ
ルタミン酸であるペプチドを特異的に分解するピロリド
ニルペプチダーゼ、アミ／末端が芳香族アミノ酸である
ペプチドを特異的に分解するフェニルアミノペアブチダ
ーゼ、その他作用に多少の差はある龜ののアミノ末端が
任意のアミノ酸であるペプチドを分解する動物由来ある
いは微生物由来の各種アミノペプチダーゼが知られてい
る。
端がアルギニンまたはリジンであるペプチドを特異的に
分解するアミノペプチダーゼＢ、アミノ末端がアシルア
ミノ陵であるペプチドを特異的に分解する哺乳動物臓器
由来のアシルアミノ１遊＋１酵素、アミノ末端がピログ
ルタミン酸であるペプチドを特異的に分解するピロリド
ニルペプチダーゼ、アミ／末端が芳香族アミノ酸である
ペプチドを特異的に分解するフェニルアミノペアブチダ
ーゼ、その他作用に多少の差はある龜ののアミノ末端が
任意のアミノ酸であるペプチドを分解する動物由来ある
いは微生物由来の各種アミノペプチダーゼが知られてい
る。
本発明者らは、シイタケ子実体に存在するアミノペプチ
ダーゼについて鋭意研究を重ねた結果、アミノ末端が、
プロリン、ヒドロキシプロリンなどのピロリジン環を有
するアミノ酸であルヘフチドを、特異的に分解するプロ
リンイミノペプチダーゼを見出し、本発明を完成するに
至った。
ダーゼについて鋭意研究を重ねた結果、アミノ末端が、
プロリン、ヒドロキシプロリンなどのピロリジン環を有
するアミノ酸であルヘフチドを、特異的に分解するプロ
リンイミノペプチダーゼを見出し、本発明を完成するに
至った。
本発明の目的は、従来みられなかったプロリンをアミノ
末端とするペプチドに、特異的に作用スるアミノペプチ
ダーゼを提供することにあり、本目的は、本発明のプロ
リンイミノペプチダーゼによって達成することができた
。
末端とするペプチドに、特異的に作用スるアミノペプチ
ダーゼを提供することにあり、本目的は、本発明のプロ
リンイミノペプチダーゼによって達成することができた
。
本発明のプロリンイミノペプチダーゼは、次に示す酵素
化学的性質を有するものである。
化学的性質を有するものである。
１ 分 子−量： １９０．０００ （ゲルろ過失、
４量体サブユニツ） ４５，０００ ） ２ 安 定 ｐＨ（４Ｃ＆：２時間保ったときの活性残
存率が１００弧のｐＨ範囲） ８ ６〜１０ 五 作用至適ＰＨ：６〜８ ４ 作用至適温度： ３７Ｃ ４等・電点：４．９ ＆ 賦 活 剤 ： 特に必要としない。
４量体サブユニツ） ４５，０００ ） ２ 安 定 ｐＨ（４Ｃ＆：２時間保ったときの活性残
存率が１００弧のｐＨ範囲） ８ ６〜１０ 五 作用至適ＰＨ：６〜８ ４ 作用至適温度： ３７Ｃ ４等・電点：４．９ ＆ 賦 活 剤 ： 特に必要としない。
２＋
２阻害剤： Ｚｎ （１０ｍＭ） ９４％阻害Ｃｕ”
（１０ｍＭ） ９９１ｇ阻害 Ｈｇ”（０１ｍＭ）９４％阻害 ｐ−クロロメルキュリベンゾエートで も阻害をうける。ＥＤＴＡにより、 Ｚｎ２＋、 Ｃｕ”、 Ｈｇ”Ｇ：よる活性阻害を回復
する。
（１０ｍＭ） ９９１ｇ阻害 Ｈｇ”（０１ｍＭ）９４％阻害 ｐ−クロロメルキュリベンゾエートで も阻害をうける。ＥＤＴＡにより、 Ｚｎ２＋、 Ｃｕ”、 Ｈｇ”Ｇ：よる活性阻害を回復
する。
８゜基質特異性 ： プロリン又はヒドロキシプロリン
をアミノ基末端に持つペプチド及び合成基 質のみをよく加水分解し、これ以外の アミノ酸をアミノ基末端に持つ合成基 質及びペプチドは全く分解しない。又、プロ）ルペプチ
ドとしてはエム・ニス・エッチ・リリーシング・インヒ
ビツシ １１：／ −７７りａ −（ＭＳＨＲｅｌｅａｓｉｎｇ
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ） 、サブスタン
ス・ビー・ペンタペプチド （Ｓｕｂｓｔａｎｃ＠Ｐ Ｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅ）
などの天然オリゴペプチドもよく分解 する。
をアミノ基末端に持つペプチド及び合成基 質のみをよく加水分解し、これ以外の アミノ酸をアミノ基末端に持つ合成基 質及びペプチドは全く分解しない。又、プロ）ルペプチ
ドとしてはエム・ニス・エッチ・リリーシング・インヒ
ビツシ １１：／ −７７りａ −（ＭＳＨＲｅｌｅａｓｉｎｇ
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ） 、サブスタン
ス・ビー・ペンタペプチド （Ｓｕｂｓｔａｎｃ＠Ｐ Ｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅ）
などの天然オリゴペプチドもよく分解 する。
本発明のプロリンイミノペプチダーゼは、賦活剤を特に
必要としない点が、他の類似した特異性を有する酵素と
興なる点の一つである。かかるプロリンイミノペプチダ
ーゼは、細菌及び子嚢菌もしくは高等動物由来の酵素の
如く、２＋ Ｍｇ による賦活はなく、又、透析その他の処理によ
鰺金属イオンを除いても活性の低下はな（、ＥＤＴム添
加によっても活性の低下は認められない。更に、エシェ
リヒア・コリ （Ｅｓｅｈｅ−ｒｉｅｈｔａ Ｃｏ１１
） 、パシｋ Ｘ−ブレビｘ （Ｂａｃｉｌｌｕｓｂ
ｒｅｖｉｇ ）等の酵素の如く、システィ＞ （Ｃｙｓ
ｔｅｉｊｎ）その他の８Ｈ保護剤による賦活化も認めら
れないものである。
必要としない点が、他の類似した特異性を有する酵素と
興なる点の一つである。かかるプロリンイミノペプチダ
ーゼは、細菌及び子嚢菌もしくは高等動物由来の酵素の
如く、２＋ Ｍｇ による賦活はなく、又、透析その他の処理によ
鰺金属イオンを除いても活性の低下はな（、ＥＤＴム添
加によっても活性の低下は認められない。更に、エシェ
リヒア・コリ （Ｅｓｅｈｅ−ｒｉｅｈｔａ Ｃｏ１１
） 、パシｋ Ｘ−ブレビｘ （Ｂａｃｉｌｌｕｓｂ
ｒｅｖｉｇ ）等の酵素の如く、システィ＞ （Ｃｙｓ
ｔｅｉｊｎ）その他の８Ｈ保護剤による賦活化も認めら
れないものである。
次に、本発明のプ四りシイミノペプチダーゼの基質特異
性につ−で、０．ＩＮ）リスマレエート（Ｔｒｉｍ−ｍ
ａｌｅａＬ＠）緩衝液（ｐＨ６，１）に、基質を０．５
ｍＦＭ溶解し、酵素液を加え、３７ｔＺ’で１０分間反
応させ、Ｌ−プロリン−！−す７チルアｔＦ（Ｌ−１’
ｒｅ−β−Ｎム）の分解率を１００％としたと自の各基
質の分解率、至適ｐＨ及び脂１−％ 値を示す。
性につ−で、０．ＩＮ）リスマレエート（Ｔｒｉｍ−ｍ
ａｌｅａＬ＠）緩衝液（ｐＨ６，１）に、基質を０．５
ｍＦＭ溶解し、酵素液を加え、３７ｔＺ’で１０分間反
応させ、Ｌ−プロリン−！−す７チルアｔＦ（Ｌ−１’
ｒｅ−β−Ｎム）の分解率を１００％としたと自の各基
質の分解率、至適ｐＨ及び脂１−％ 値を示す。
基 質 分解率（４） 至適ｐＨＫｍ （
Ｍ）Ｌ−Ｐｒｏ−β−ＮＡ １００ ６
．１ １．９４Ｘ１０Ｌ−Ｈｙｄｒｏ−β−ＮＡ
１２０ ６．７ ２．０Ｘ１０−’Ｌ−Ｐｒ
ｏ−Ｌ−Ａｌａ １５１ ？、５
２．ＯＸｌ ０Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ
１５５ ６．９Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｍｅｔ
１２３ ６．９Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｔｙｒ
１１１ ７．ＩＬ−Ｐｒｏ −Ｌ−Ｌｅ
ｕ ９ｇ ７．１Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ
−Ｉ Ｉｓ ９５ ７．５Ｌ−Ｐｒ
ｏ−ＬＬＴｒｐ ８９
７．８Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｌｙ ２
６ ８．２Ｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
８１ ８．２ １．ＯＸｌ ０″″３Ｌ−Ｐｒｏ
−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２−３５７，１冨 （Ｍ２ＲＲ＠ｌｅａｓｉｎｇ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
Ｆａｃｔｏｒ）Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ
０Ｚ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ ０Ｌ
−Ｐｙｒ−β−ＮＡ ０Ｌ−Ｐｈｅ−
β−ＮＡ ０Ｌ−Ｔｙｒ−β−ＮＡ
０Ｌ−Ｔｒｐ−β−Ｎｋ
。
Ｍ）Ｌ−Ｐｒｏ−β−ＮＡ １００ ６
．１ １．９４Ｘ１０Ｌ−Ｈｙｄｒｏ−β−ＮＡ
１２０ ６．７ ２．０Ｘ１０−’Ｌ−Ｐｒ
ｏ−Ｌ−Ａｌａ １５１ ？、５
２．ＯＸｌ ０Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ
１５５ ６．９Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｍｅｔ
１２３ ６．９Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｔｙｒ
１１１ ７．ＩＬ−Ｐｒｏ −Ｌ−Ｌｅ
ｕ ９ｇ ７．１Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ
−Ｉ Ｉｓ ９５ ７．５Ｌ−Ｐｒ
ｏ−ＬＬＴｒｐ ８９
７．８Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｌｙ ２
６ ８．２Ｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
８１ ８．２ １．ＯＸｌ ０″″３Ｌ−Ｐｒｏ
−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２−３５７，１冨 （Ｍ２ＲＲ＠ｌｅａｓｉｎｇ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
Ｆａｃｔｏｒ）Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ
０Ｚ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ ０Ｌ
−Ｐｙｒ−β−ＮＡ ０Ｌ−Ｐｈｅ−
β−ＮＡ ０Ｌ−Ｔｙｒ−β−ＮＡ
０Ｌ−Ｔｒｐ−β−Ｎｋ
。
Ｌ−Ｌｅｕ−β−限 ０
Ｌ−１１ｅ−β−ぬ ０
Ｌ−Ｖａ、１−β−ＮＡ ＱＬ−Ａｌｍ
−／−ＮＡ ０Ｇ１７″″ｐ −ＮＡ
６Ｌ−Ｍ＠ｔ−β１仏 ０ Ｌ−Ｃｙｓ−ｄｉ−β−ＮＡ ＱＬ−Ｇｌｕ−
β−ＭＡ ＱＬ−８ｓ ｒ−β−ＮＡ
ＱＬ−Ｌｙｓ−β−ＮＡ Ｏ Ｌ−Ａｒｇ−β−ＮＡ ＱＬ−Ｈｌｍ−β
−ＮＡ ６ 〔但し、β−Ｎムはβ−す７チルアミド（β−Ｎａｐｈ
ｔｈｙｌａｍｌｄｅ ） 、 ｐ −ＮＡは一一ニトー
ア掴リド（；磨−Ｎ１ｔｒｏａｎｉ１１ｄｅ ） 、Ｐ
ｙｒ−β−ＮＡはビジリドニル−β−す７ チルアミド（Ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｙｌ−β−Ｎａｐｈ
ｔｈｙト組ａｉｄｅ、）を表わす０〕 本発明のプ四リンイミノペプチダーゼのｌＩ造法は、シ
イタケ子実体又は菌体から、エチレンジアミン四酢＠
（ＥＤＴＡ）を含有する中性附近の塩溶液を用いて抽出
を行ない、得られる抽出液を精製することを特徴とする
ものである。
−／−ＮＡ ０Ｇ１７″″ｐ −ＮＡ
６Ｌ−Ｍ＠ｔ−β１仏 ０ Ｌ−Ｃｙｓ−ｄｉ−β−ＮＡ ＱＬ−Ｇｌｕ−
β−ＭＡ ＱＬ−８ｓ ｒ−β−ＮＡ
ＱＬ−Ｌｙｓ−β−ＮＡ Ｏ Ｌ−Ａｒｇ−β−ＮＡ ＱＬ−Ｈｌｍ−β
−ＮＡ ６ 〔但し、β−Ｎムはβ−す７チルアミド（β−Ｎａｐｈ
ｔｈｙｌａｍｌｄｅ ） 、 ｐ −ＮＡは一一ニトー
ア掴リド（；磨−Ｎ１ｔｒｏａｎｉ１１ｄｅ ） 、Ｐ
ｙｒ−β−ＮＡはビジリドニル−β−す７ チルアミド（Ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｙｌ−β−Ｎａｐｈ
ｔｈｙト組ａｉｄｅ、）を表わす０〕 本発明のプ四リンイミノペプチダーゼのｌＩ造法は、シ
イタケ子実体又は菌体から、エチレンジアミン四酢＠
（ＥＤＴＡ）を含有する中性附近の塩溶液を用いて抽出
を行ない、得られる抽出液を精製することを特徴とする
ものである。
以下において、本発明の製造法を、更に詳し”〈説明す
る。
る。
本発明において使用されるシイタケは、酵母エキス、麦
芽エキス及びブドウ糖を含む通常の培地（ｐＨ５〜６）
を用いて、２０〜２５Ｃで自家培養したシイタケ菌体が
用いられる漬か、重版されている菌体を用−でもよい。
芽エキス及びブドウ糖を含む通常の培地（ｐＨ５〜６）
を用いて、２０〜２５Ｃで自家培養したシイタケ菌体が
用いられる漬か、重版されている菌体を用−でもよい。
・かかるシイタケ菌体又は子実体を細断したものに、先
ずｐＨが中性附近である、埴及びＦＤＴＡの溶液を加え
、ブレンダーで処理した後、直ちに遠心分離して不溶物
を除来し、抽出液を得る。
ずｐＨが中性附近である、埴及びＦＤＴＡの溶液を加え
、ブレンダーで処理した後、直ちに遠心分離して不溶物
を除来し、抽出液を得る。
抽出に使用される塩としては、例えば、トリ□ス塩酸（
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２ ）等が挙げられる。かかる溶液の
塩濃度は、０．０５〜０．５Ｍの範囲のものであること
が好ましい。０．０５Ｍ未満の濃度では、抽出が不充分
となり収量が低下するおそれがあ秒、一方、０．５Ｍを
超える濃度では、抽出効果に有意差がみられな−ので特
に高濃度にする必要はな−。水のみでも抽出可能である
が、収率が悪く、酵素の安定性の面からも好壇しくない
。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２ ）等が挙げられる。かかる溶液の
塩濃度は、０．０５〜０．５Ｍの範囲のものであること
が好ましい。０．０５Ｍ未満の濃度では、抽出が不充分
となり収量が低下するおそれがあ秒、一方、０．５Ｍを
超える濃度では、抽出効果に有意差がみられな−ので特
に高濃度にする必要はな−。水のみでも抽出可能である
が、収率が悪く、酵素の安定性の面からも好壇しくない
。
また、抽出に用−る溶液のＥＤＴＡ濃度は、収率に対す
る効果とコストの関係から５ｍＭを中心とした濃度が適
当である。ＥＤＴＡの添加理由は、これが金属と容易に
錯体を形成するために、重金属によ塾酵素が階化され失
活すること、及びポリフェノールオキシダーゼによ抄抽
出液が着色することが曽げられるからである。これらの
処理及び以後の処理は、４Ｃ以下の低温で行うことが好
ましい。
る効果とコストの関係から５ｍＭを中心とした濃度が適
当である。ＥＤＴＡの添加理由は、これが金属と容易に
錯体を形成するために、重金属によ塾酵素が階化され失
活すること、及びポリフェノールオキシダーゼによ抄抽
出液が着色することが曽げられるからである。これらの
処理及び以後の処理は、４Ｃ以下の低温で行うことが好
ましい。
このようにして得られた抽出液に、硫階アンモニウムを
加え、４０％飽和とし生じた沈殿を除来し、更に、硫酸
アンモニウムを加えて６０悸胞和として生じた沈殿を分
取する。
加え、４０％飽和とし生じた沈殿を除来し、更に、硫酸
アンモニウムを加えて６０悸胞和として生じた沈殿を分
取する。
得られな沈層を溶解し、透析などの通常の手段によって
硫酸アンモニウムを除去し、陰イオン交換セルロース、
例えばジェチルアミノエチルセルロースＣ以下、ＤＥＡ
Ｅセルロースト略記する。）カラムに′負荷し、溶離液
を添加する。
硫酸アンモニウムを除去し、陰イオン交換セルロース、
例えばジェチルアミノエチルセルロースＣ以下、ＤＥＡ
Ｅセルロースト略記する。）カラムに′負荷し、溶離液
を添加する。
溶離液は、ｐＨが中性附近である緩衝液及び中性塩溶液
から成るものであり、かかる溶離液中の中性塩濃度を低
濃廖側から直線的に増加させながら添加する。溶離して
得られたプロリンイミノペプチダーゼ画分につき、中性
塩を除去後、再度同様の操作にてＤＥＡＥセファロース
を用いて処理を施す。
から成るものであり、かかる溶離液中の中性塩濃度を低
濃廖側から直線的に増加させながら添加する。溶離して
得られたプロリンイミノペプチダーゼ画分につき、中性
塩を除去後、再度同様の操作にてＤＥＡＥセファロース
を用いて処理を施す。
上記操１作において使用する緩衝液は、ｐＨが中性附近
で、その濃度は５０ｍＭ以下であるものが好ましい。ま
た添加する中性塩としては、特に制約されないが、例え
ば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙けられ、その
濃度は０から０７Ｍまで直線的に増加されて使用される
。
で、その濃度は５０ｍＭ以下であるものが好ましい。ま
た添加する中性塩としては、特に制約されないが、例え
ば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙けられ、その
濃度は０から０７Ｍまで直線的に増加されて使用される
。
イオン交換り四マドグラフィーによって得られたプロリ
ンイミノペプチダーゼＷ分につき、次−で、へイドロア
オービッククロ！トゲラフイーにて処理を施し、更に精
製する。この際に使用する充填剤としては、フェニルセ
ファロースが好ましい。溶離液は、前記５０ｍＭ中性緩
衝筐緩衝性埴：ＩＩＩ筐から成るものであり、かかる溶
離液中の中性塩濃度を高濃度側から直線的に減少さ豐な
がら添加する。中性塩濃度が高濃度である場合には、疎
水性の低い夾雑蛋白が溶出し、低濃度において、目的と
するプロリンイミノペプチダーゼが溶出する。中性塩の
種類は特に定めるものでないが、硫拳アンモニウムのよ
うな一般的なもので充分であシ、その濃度は、！０囁前
後からＯ囁まで直線的に変化させる。
ンイミノペプチダーゼＷ分につき、次−で、へイドロア
オービッククロ！トゲラフイーにて処理を施し、更に精
製する。この際に使用する充填剤としては、フェニルセ
ファロースが好ましい。溶離液は、前記５０ｍＭ中性緩
衝筐緩衝性埴：ＩＩＩ筐から成るものであり、かかる溶
離液中の中性塩濃度を高濃度側から直線的に減少さ豐な
がら添加する。中性塩濃度が高濃度である場合には、疎
水性の低い夾雑蛋白が溶出し、低濃度において、目的と
するプロリンイミノペプチダーゼが溶出する。中性塩の
種類は特に定めるものでないが、硫拳アンモニウムのよ
うな一般的なもので充分であシ、その濃度は、！０囁前
後からＯ囁まで直線的に変化させる。
ハイドロ７オーピツククロマトグラフイーによって得ら
れた活性画分につき、ゲルー過を行って更に精製する。
れた活性画分につき、ゲルー過を行って更に精製する。
この場合に用いる溶媒は、ｐＨが中性附近にある緩衝液
であれば何れを用いてもよいが、その濃度は、前記５９
ｍＭ１ｉ度の濃度が好まし−。ゲルー過剤としては、＃
除分子量１ｓ万程度のものが適当で、例えば、セファデ
ックスＧ−１５０を用いる仁とギ好ましい。
であれば何れを用いてもよいが、その濃度は、前記５９
ｍＭ１ｉ度の濃度が好まし−。ゲルー過剤としては、＃
除分子量１ｓ万程度のものが適当で、例えば、セファデ
ックスＧ−１５０を用いる仁とギ好ましい。
ゲルー過によって得られた活性−分は、更にヒドロキシ
アパタイトカラムクロマトグラフィーによ抄精製し、当
該活性画分を集めてプレリンイミノペプチダーゼが得ら
れる。この場合の溶媒は、１０ ｍＭを中心とした濃度
の中性附近のｐＨのリン階緩衝液を使用し、緩衝液の濃
度をｌＱｍＭ、＄ら４０ＯｎｘＭ迄直纏的に増加させな
がら添加する。その結果、粗抽出液の２５００倍に精製
された純粋なプロリンペプチダーゼが、活性収率、１Ｂ
−５％の高収率で得られる。
アパタイトカラムクロマトグラフィーによ抄精製し、当
該活性画分を集めてプレリンイミノペプチダーゼが得ら
れる。この場合の溶媒は、１０ ｍＭを中心とした濃度
の中性附近のｐＨのリン階緩衝液を使用し、緩衝液の濃
度をｌＱｍＭ、＄ら４０ＯｎｘＭ迄直纏的に増加させな
がら添加する。その結果、粗抽出液の２５００倍に精製
された純粋なプロリンペプチダーゼが、活性収率、１Ｂ
−５％の高収率で得られる。
本発明のプロリンイミノペプチダーゼは、アミノ末端が
プロリン又はヒドロキシプロリンであるペプチド以外は
全く分解しない。また、プーリル！−す７チルアミド又
はヒドロキシプロリルβ−す７チルアミドのような合成
基（のみならず、プロリルジペプチド又はヒドロキシプ
ロリルジペプチドを何れもよく分解し、更に、エム・ニ
ス・エッチ・リリーシング・インヒビツシ曹ン・ファク
ター（ＭＳＨＲｅｌｅａｓｉｎｇＩｎｈｉｂｉｔｌｏｎ
Ｆａｅｔｏｒ （Ｐｒｏ−Ｌｅａ−Ｇｌｙ−ＮＨ２）
）のようなトリペプチド及びサブスタンス・ビー・ペ
ンタヘプチド（５ｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ Ｐｅｎｔａｐ
ｅｐｔｉｄｅ（Ｐｒｏ −Ｌｙｅ −Ｐｒｏ −Ｇｉｎ
−Ｇｌｕ ） ） などの天然オリゴペプチドにもよ
く作用する。このようにアミノ末端のプロリン及びヒド
ロキシプロリンに高い特異性を示し、しかも、天然オリ
ゴペプチドにもよく作用することが確認されたプロリン
イミノペプチダーゼについては、現在まで２＋ のところ報告がない。更に、Ｍｇ などの金属イオ
ンを必要とせず、ＳＲ保護剤も必要としないプロリンイ
ミノペプチダーゼは全く新規なものである。
プロリン又はヒドロキシプロリンであるペプチド以外は
全く分解しない。また、プーリル！−す７チルアミド又
はヒドロキシプロリルβ−す７チルアミドのような合成
基（のみならず、プロリルジペプチド又はヒドロキシプ
ロリルジペプチドを何れもよく分解し、更に、エム・ニ
ス・エッチ・リリーシング・インヒビツシ曹ン・ファク
ター（ＭＳＨＲｅｌｅａｓｉｎｇＩｎｈｉｂｉｔｌｏｎ
Ｆａｅｔｏｒ （Ｐｒｏ−Ｌｅａ−Ｇｌｙ−ＮＨ２）
）のようなトリペプチド及びサブスタンス・ビー・ペ
ンタヘプチド（５ｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ Ｐｅｎｔａｐ
ｅｐｔｉｄｅ（Ｐｒｏ −Ｌｙｅ −Ｐｒｏ −Ｇｉｎ
−Ｇｌｕ ） ） などの天然オリゴペプチドにもよ
く作用する。このようにアミノ末端のプロリン及びヒド
ロキシプロリンに高い特異性を示し、しかも、天然オリ
ゴペプチドにもよく作用することが確認されたプロリン
イミノペプチダーゼについては、現在まで２＋ のところ報告がない。更に、Ｍｇ などの金属イオ
ンを必要とせず、ＳＲ保護剤も必要としないプロリンイ
ミノペプチダーゼは全く新規なものである。
更に、本発明のプレリンイミノペプチダーゼは、蛋白質
の構造解析に有用であるばかすでなく、蛋白質及びペプ
チドの修飾に１有用であ抄、蛋白性及びペプチド性医薬
品ならびに食品等の安定性を増加させる可能性をも有す
るものである。
の構造解析に有用であるばかすでなく、蛋白質及びペプ
チドの修飾に１有用であ抄、蛋白性及びペプチド性医薬
品ならびに食品等の安定性を増加させる可能性をも有す
るものである。
次に、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、
本発明けその要旨を超克な一限抄、これらによって課電
されるものではな−。
本発明けその要旨を超克な一限抄、これらによって課電
されるものではな−。
実施例
土塊、木片等を除去し、水洗した市販シイタケ子実体５
００りを細断し、３倍量の５−ＥＤＴＡ−２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｍ−Ｈ（Ｊ緩衝液（ｐＨ７，４）、と共に破砕した
。細胞壁等の不溶物は、ｓ 、 ｏｏ。
００りを細断し、３倍量の５−ＥＤＴＡ−２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｍ−Ｈ（Ｊ緩衝液（ｐＨ７，４）、と共に破砕した
。細胞壁等の不溶物は、ｓ 、 ｏｏ。
ｒｐｍで３０分間遠心分離して除去し上滑を採取した。
透明な茶褐色の上清に、固形硫酸アンモニウムを加えて
４０弧飽和とし、生じた沈層を８．００Ｏｒｐｍで３０
分間遠心分離して除去し、更に、上滑に固形硫酸アンモ
ニウムを徐々に加えて６０襲飽和とした。−夜４Ｃに０
放置後、沈殿を遠心分離して集め、少量の２ Ｑ ｍＭ
Ｔｒｉｓ −ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解し、
同じ緩衝液に対して透析し、硫酸アンモニウムを除去し
た。
４０弧飽和とし、生じた沈層を８．００Ｏｒｐｍで３０
分間遠心分離して除去し、更に、上滑に固形硫酸アンモ
ニウムを徐々に加えて６０襲飽和とした。−夜４Ｃに０
放置後、沈殿を遠心分離して集め、少量の２ Ｑ ｍＭ
Ｔｒｉｓ −ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解し、
同じ緩衝液に対して透析し、硫酸アンモニウムを除去し
た。
硫酸アンモニウム分別により濃縮した酵素を、予め’２
０ ｍＭ Ｔｒｉ、５−Ｈ（Ｊ緩衝液（ＰＨ７，４）で
平衡にしたＤＥＡＥセルリースのカラムに吸着させ、先
ず、緩衝液で洗浄して非吸着蛋白質を溶出させた後、該
緩衝液にＫＣｔを加え、その濃度を０．７Ｍｔで直線的
に増加させて溶出させた。プロリンβ−す７チルアミド
に対する活性を有する画分は、約Ｑ、３Ｍ−ＫＣｆｆｉ
で溶出された。活性を示す一分を集め、ディアフロー−
ＤＭ−４０−（Ｄｉａｆｌｏｕ−ＤＭ−１０） ｌ ン
プレンで濃縮し、２０ｍＭ Ｔｒｉｍ−ＨＣＩ緩衝ｆｉ
（ｐＨ７，４）に対して透析を行なった。この酵素液を
、次いで、ＤＥＡＥセファロース−ＣＬ −６−Ｂ （
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液、ｐＨ７，４）のカ
ラムに吸着させ、ＫＣｇの直線濃度勾配（０−０７Ｍ）
で溶離した。
０ ｍＭ Ｔｒｉ、５−Ｈ（Ｊ緩衝液（ＰＨ７，４）で
平衡にしたＤＥＡＥセルリースのカラムに吸着させ、先
ず、緩衝液で洗浄して非吸着蛋白質を溶出させた後、該
緩衝液にＫＣｔを加え、その濃度を０．７Ｍｔで直線的
に増加させて溶出させた。プロリンβ−す７チルアミド
に対する活性を有する画分は、約Ｑ、３Ｍ−ＫＣｆｆｉ
で溶出された。活性を示す一分を集め、ディアフロー−
ＤＭ−４０−（Ｄｉａｆｌｏｕ−ＤＭ−１０） ｌ ン
プレンで濃縮し、２０ｍＭ Ｔｒｉｍ−ＨＣＩ緩衝ｆｉ
（ｐＨ７，４）に対して透析を行なった。この酵素液を
、次いで、ＤＥＡＥセファロース−ＣＬ −６−Ｂ （
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液、ｐＨ７，４）のカ
ラムに吸着させ、ＫＣｇの直線濃度勾配（０−０７Ｍ）
で溶離した。
溶出液から酵素活性画分を集め、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣ慮緩衝液（ｐＨ７，４） −１２≦硫酸アンモニ
ウム溶液に対し透析を行なった。次に、この酵素液を、
前記と同じ組成の溶液で平衡化したフェニルセ７−アロ
ース力ラム（１２Ｘ１Ｂ、５５１＋）にのせ、硫酸アン
モニウムを含まない緩衝液の直線濃度勾配（１２弧〜０
嘱）で溶離を行ない、溶出する活性−分を集めた。この
活性画分を、０．１ＭＫＣ１ｔ含む１０１ｍＭ Ｔｒｌ
ｍ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化したセファデ
ックスＧ−１５０のカラムを使用し、上昇法によりゲル
濾過を行なった。Ｐｒｏ−β−Ｎム活性を有する一分を
集め、１０ ｍＭ Ｎａ−リン１２緩衝液（ｐＨ６，０
）に対して透析し、同じ緩衝液で平衡化し、ハイドロキ
シアパタイトのカラムに吸着させた。Ｎａ−リン瞭緩衝
液の直線濃度勾配（１０ｍＭ −４００ｍＭで溶離した
ところ、プロリンイミノペプチダーゼの活性画分は、鋭
いピークとして溶出された。
−ＨＣ慮緩衝液（ｐＨ７，４） −１２≦硫酸アンモニ
ウム溶液に対し透析を行なった。次に、この酵素液を、
前記と同じ組成の溶液で平衡化したフェニルセ７−アロ
ース力ラム（１２Ｘ１Ｂ、５５１＋）にのせ、硫酸アン
モニウムを含まない緩衝液の直線濃度勾配（１２弧〜０
嘱）で溶離を行ない、溶出する活性−分を集めた。この
活性画分を、０．１ＭＫＣ１ｔ含む１０１ｍＭ Ｔｒｌ
ｍ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化したセファデ
ックスＧ−１５０のカラムを使用し、上昇法によりゲル
濾過を行なった。Ｐｒｏ−β−Ｎム活性を有する一分を
集め、１０ ｍＭ Ｎａ−リン１２緩衝液（ｐＨ６，０
）に対して透析し、同じ緩衝液で平衡化し、ハイドロキ
シアパタイトのカラムに吸着させた。Ｎａ−リン瞭緩衝
液の直線濃度勾配（１０ｍＭ −４００ｍＭで溶離した
ところ、プロリンイミノペプチダーゼの活性画分は、鋭
いピークとして溶出された。
以上の操作によ抄、シイタケ子実体のプロリンイミノペ
プチダーゼは、約２５００倍に純化され、その収率は１
８．５％であった。
プチダーゼは、約２５００倍に純化され、その収率は１
８．５％であった。
精製し、念酵素の純度を、５襲ｌリアクリルアミドゲル
電気泳動を・鴫１各ｐＨで調べたところ、クマシー・ブ
リリアント・ブルーＲ−２５０（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ
Ｂｒｉ １ｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０）による
蛋白染色で図面に示すように単一のバンドを示し、また
、プロリンβ−す７チルアミドを基質とした活性染色の
バンドと蛋白染色バンドは完全に一致した。
電気泳動を・鴫１各ｐＨで調べたところ、クマシー・ブ
リリアント・ブルーＲ−２５０（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ
Ｂｒｉ １ｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０）による
蛋白染色で図面に示すように単一のバンドを示し、また
、プロリンβ−す７チルアミドを基質とした活性染色の
バンドと蛋白染色バンドは完全に一致した。
図面は、シイタケ子実体プロリンイミノペプチターゼの
精製酵素５０μりをクマシーブルーで染色し、５ｓｌリ
アミドゲル電気泳動させたときの各ｐＨにおける電気泳
動パターンを示す。 ｐＨ６，６ ８，０９，３
精製酵素５０μりをクマシーブルーで染色し、５ｓｌリ
アミドゲル電気泳動させたときの各ｐＨにおける電気泳
動パターンを示す。 ｐＨ６，６ ８，０９，３
Claims (1)
- （１） 次の酵素化学的性質を有するプロリンイミノペ
プチダーゼ 分 子 量 ： １９０，０００ （ゲルろ過失、４
置体）安定ｐ）（（４Ｃに２時間保ったときの活性残存
率が１００襲のｐＨ範囲）：６〜１０ 作用至適ｐＨ： ６〜８ 作用至適Ｉ！炭 ； ３７Ｃ 等電点：娠９ 賦 活 剖 ： 特に必要としない。 阻害剤： Ｚｎ、 （１０ｍＭ） ９４ ％阻害Ｃｕ
（１０ｍＭ）９９’４阻害 Ｈｇ （θ、１ ｍＭ） ９４ ％阻害ｐ−クロロメ
ルキュ？ヘンシェードで も阻害をうける。ＥＤＴＡによ呻、 Ｚｎ２＋、Ｃｕ２” 、Ｈｇ２＋による活性阻害を回復
する。 基質特異性 ： プロリン又はヒドロキシプロリンをア
ミノ基末端に持つペプチド及び合成基質のみをよく加水
分解し、これ以外のアミノ酸をアミノ基末端に持つ合成
基質及びペプチドは全く１分解しない。又、プロリルペ
プチドとしてはエム・ニス・エッチ・リリーシング・イ
ンヒビツション・ファクター（ＭＳＨＲｅｌｅａｓｉｎ
ｇ Ｉｎｈｉ−ｂｉｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ） 、サブ
スタンス・ピー・ペンタペプチド（Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ
ＰＰｅｎＬａｐｅｐｔｉｄｅ）などの天然オリゴペプ
チドもよく分解する。 （至） シイタケ子実体又は菌体から、エチレンジアミ
ン西酢酸を含有する中性附近の塩溶液を用いて抽出を行
ない、得られる抽出液を精製することを特徴とするプロ
リンイよノペプチダーゼのＩ［ｉｌｉ法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13157681A JPS5836387A (ja) | 1981-08-24 | 1981-08-24 | プロリンイミノペプチダ−ゼおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13157681A JPS5836387A (ja) | 1981-08-24 | 1981-08-24 | プロリンイミノペプチダ−ゼおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5836387A true JPS5836387A (ja) | 1983-03-03 |
| JPH0215192B2 JPH0215192B2 (ja) | 1990-04-11 |
Family
ID=15061276
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13157681A Granted JPS5836387A (ja) | 1981-08-24 | 1981-08-24 | プロリンイミノペプチダ−ゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5836387A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5168061A (en) * | 1986-05-15 | 1992-12-01 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Human chorionic peptidase-1 |
| EP0522428A1 (en) * | 1991-07-04 | 1993-01-13 | N.V. Vandemoortele International | Prolyl endopeptidase and production thereof |
| US6271201B1 (en) | 1993-07-15 | 2001-08-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for the selective regulation of placental prostanoids and inhibition of labor using IGF-I |
| EP1911839A1 (en) | 2001-07-26 | 2008-04-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene, peptide-forming enzyme, and dipeptide producing method |
| CN104004813A (zh) * | 2014-06-12 | 2014-08-27 | 北京林业大学 | 一种香菇生物活性肽的制备 |
-
1981
- 1981-08-24 JP JP13157681A patent/JPS5836387A/ja active Granted
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5168061A (en) * | 1986-05-15 | 1992-12-01 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Human chorionic peptidase-1 |
| EP0522428A1 (en) * | 1991-07-04 | 1993-01-13 | N.V. Vandemoortele International | Prolyl endopeptidase and production thereof |
| US6271201B1 (en) | 1993-07-15 | 2001-08-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for the selective regulation of placental prostanoids and inhibition of labor using IGF-I |
| EP1911839A1 (en) | 2001-07-26 | 2008-04-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene, peptide-forming enzyme, and dipeptide producing method |
| CN104004813A (zh) * | 2014-06-12 | 2014-08-27 | 北京林业大学 | 一种香菇生物活性肽的制备 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0215192B2 (ja) | 1990-04-11 |
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