DE1517753B2 - Verfahren zur Anreicherung von Enzym Inhibitoren - Google Patents

Description

Es ist bekannt, daß man Enzyme oder eiweißartige Verbindungen an polymere Substanzen binden kann. So ist z. B. bereits Trypsin an ein Maleinsäureanhydrid-Äthylen-Copolymer gebunden worden (E. K a ί ο h a 1 s k i et al., Biochem. 3 [1964], S. 1905). In den dabei entstehenden Addukten behalten die Enzyme ihre biologische Aktivität mehr oder weniger bei.

Es ist ferner bekannt, daß man die Aktivität der in dieser Weise an Polymere gebundenen Enzyme durch Inhibitoren hemmen kann (E. K a t c h a 1 s k i et al., s. o.).

Es ist dagegen noch nicht bekannt, daß man den Inhibitor aus seinen rohen Lösungen selektiv an das an Polymere gebundene Enzym binden und aus dem dabei erhaltenen Komplex isolieren kann.

Es wurde nämlich gefunden, und dies ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung, daß man Enzym-Inhibitoren dadurch anreichern kann, daß man ein Enzym, das durch den betreffenden Enzym-Inhibitor gehemmt wird, covalent an einen Träger bindet, die dabei erhaltene Verbindung in Wasser mit einer Lösung des Enzym-Inhibitors in Kontakt bringt, den dabeierhaltenenEnzym/Enzym-Inhibitor/Träger-Komplex durch Auswaschen reinigt, sodann zur Dissoziation bringt und den Enzym-Inhibitor isoliert.

Von den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren anzureichernden, zu reinigenden und zu isolierenden Inhibitoren verweisen wir vor allem auf den bekannten Kallikrein-Inhibitor, den Trypsin-Inhibitor aus Schweinepankreas und Rinderpankreas und den Trypsin-Inhibitor aus Samenblasen.

Bei den erfindungsgemäß anzuwendenden unlöslichen und löslichen Trägern handelt es sich um polymere Substanzen. Diese müssen funktionell Gruppen enthalten, die befähigt sind, nach den Methoden der Peptid-Chemie mit den genannten Enzymen zu reagieren. Hier seien in erster Linie solche Harze genannt, die Anhydrid-Gruppen, Säurechlorid-Gruppen, Isocyanat-Gruppen und Azid-Gruppen enthalten, sowie solche Harze, die aktivierte Fluoratome (Makromolekular-Chemie 39 [1960], S. 13) enthalten. Auch die bekannten im Verkehr befindlichen carboxylhaltigen Ionen-Austauscherharze kommen nach Einführung aktivierter Gruppen in Frage.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der aus den beiden genannten Komponenten bestehende, an den Träger gebundene Komplex

is zur Entfernung von Begleitstoffen und Verunreinigungen gründlich mit Wasser und Pufferlösungen gewaschen und anschließend zur Dissoziation gebracht. Diese Dissoziation kann durch pH-Verschiebung und/ oder Veränderung der Ionenkonzentration und/oder Verdrängung durch kompetive Hemmstoffe oder Substrate, z. B. Tryptamin oder n-Fütylamin für Trypsin und/oder durch Zusatz von solchen Substanzen erreicht werden, die, wie z. B. Harnstoff, in der Lage "sind, molekulare Wechselwirkungen zu lockern bzw. zu lösen, was gegebenenfalls durch eine reversible Denaturierung der beteiligten Proteine erfolgt.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, daß es die Möglichkeit bietet, auch solche Enzym-Inhibitoren, deren Anreicherung aus unreinen Lösungen bisher schwierig und aufwendig war, in einfacher Weise mit guten Ausbeuten und Reinheitsgraden anzureichern, zu reinigen und zu isolieren.

Darüber hinaus bietet das erfindungsgemäße Verfahren die Möglichkeit, neue Inhibitoren für bekannte Enzyme aufzufinden. In diesem Falle bindet man das betreffende Enzym covalent an den Träger und behandelt das dabei erhaltene Addukt so lange mit Lösungen, die möglicherweise Inhibitoren für dieses Enzym enthalten, bis die biologische Aktivität des Enzyms nachläßt.

* Experimenteller Teil

Material: Cellulosepulver; lineares Copolymerisat aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid mit einemmittleren Molekulargewicht von 21000, im folgenden »Copolymerisat« genannt; Trypsin und Chymotrypsin; Kallikrein (etwa 2 μg Protein/Kallikrein-Einheit); Kallikrein-Inhibitor (0,19 μg/Kallikrein-Inhibitor-Einheit) sowie Gewebeextrakte.

Säule aus Copoly merisat mit	3. Kallikrein	Gebunden und abgelöst	Ausbeute nach Ablösung	Elutionsbedingungen pH
		1.1 Kallikrein-Inhibitor	90 bis 100	2,0
		1.2 Trypsininhibitor aus Schweine-	80 bis 100	2,0
1. Trypsin <		pankreas (entsalzter Extrakt)
	1.3 Trypsininhibitor aus Mäusesamen-	75	2,0
	blasen (enteiweißter Extrakt,
f	ohne Entsalzung)
2. Chymotrypsin .... \	2.1 Kallikrein-Inhibitor	etwa 100	2,5 bis 2,0
\	2.2 Extrakt aus Rinderpankreas	etwa 90	2,5 bis 2,0
(Kunitz-Inhibitor)
3.1 Kallikrein-Inhibitor	50 bis 100	2,0
	30	3,5
	50 bis 100	6r0
		(8 M-Harnstoff)

i öl Y

Versuchsbedingungen

(Die Zahlen beziehen sich
auf die Angaben in der Tabelle)

1. Trypsin-Harz: Die Herstellung der Trypsin-Harz-Cellulose-Säulen sowie die Adsorption von Kallikrein-Inhibitor (1.1) aus den Extrakten und ihre anschließende Elution aus der Säule mit sauren Puffern wurde nach folgender Vorschrift durchgeführt:

Herstellung des wasserunlöslichen
Trypsinderivates

Das wasserunlösliche Trypsinderivat wird in Anlehnung an die Vorschrift von K a t c h a 1 s k i et al. (Biochemistry 3, 1905 [1964]), wie folgt hergestellt:

5 g Trypsin, gelöst in 500 ml 0,2 M-Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, wird mit 1 g Copolymerisat in 11 des obigen Puffers suspendiert und 100 ml einer 0,1 %igen wäßrigen Lösung von Hexamethylendiamin zugesetzt. Nach erfolgter Umsetzung wird das Produkt mit dem doppelten Volumen von abgeschlämmtem Cellulosepulver vermischt und in eine Säule gegossen. Man wäscht diese so lange mit 0,1 M-Triäthanolaminpuffer pH 7,8, der außerdem 0,1 M an NaCl und 0,01 M an CaCl₂ ist, bis im Eluat kein aktives Trypsin mehr erscheint. Alle Operationen werden unter Kühlung (4° C) durchgeführt.

Reinigung des Trypsininhibitors

Das Gewebehomogenat wird mit Perchlorsäure oder Äthanol enteiweißt, im Vakuum konzentriert und mit Puffer (s. o.) auf pH = 7,8 eingestellt. Es wird direkt auf die oben beschriebene Säule aufgegeben. Diese kann eine Inhibitormenge adsorbieren, die etwa 1 g Trypsin zu hemmen vermag. Die Säule wird nach dem Durchlaufen der Inhibitorlösung mit Puffer und Wasser proteinfrei gewaschen. Anschließend wird der Inhibitor mit einem HCl/KCl-Puff er (0,2 N-KCl) pH 2 von der Säule wieder eluiert. Die Säule ist nach dem Umstellen des pH-Wertes auf 7,8 (s. o.) für die nächste Reinigungsoperation verwendbar. Sie ist, sofern man unter Kühlung arbeitet (4° C; Wasser), monatelang ohne merklichen Kapazitätsverlust zur Isolierung von Trypsininhibitoren einsetzbar. Der so aus Schweinepankreas isolierte Inhibitor ist völlig frei von Begleitproteinen (spezifische Hemmaktivität 2,8 Einheiten/mg Protein). Die Ausbeute beträgt etwa 80%, sofern die Reinigung bei 4 bis 8°C vorgenommen wird. Nach dem Einmengen wird die saure Inhibitorlösung durch Gelfiltration entsalzt und lyophilisiert.

Die erzielten Ausbeuten an reinen, noch salzhaltigen Inhibitoren sind aus der Tabelle ersichtlich. Die Trypsin-Harz-Säulen sind über einen längeren Zeitraum zur Isolierung von Inhibitoren verwendbar. In analoger Weise wurden die Reaktionen 1.1 und 1.3 (vgl. Tabelle) durchgeführt.

Das unter 1.2 aufgeführte Verfahren (Isolierung des Trypsininhibitors aus Schweinepankreas) kann sowohl bezüglich der angewandten Arbeitsweise, wie im folgenden Abschnitt a) gezeigt werden wird, als auch bezüglich des angewandten Harzes, wie die folgenden Abschnitte b) bzw. c) zeigen, abgewandelt werden.

a) Ein Trypsin-Harz-Komplex wurde nach 1.2 aus 500 mg Maleinsäureanhydrid-Äthylen-Copolymerisat und 250 mg Trypsin (183 E) hergestellt und abzentrifugiert. Der Rückstand des Trypsinharzes wurde auf der Zentrifuge 5mal mit 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,0 und 5mai mit 0,1 M-Natriumchlorid gewaschen. Das Waschwasser war hierauf frei von jeder tryptischen Aktivität. Die gesammelten Überstände hatten eine Trypsinaktivität von 10 E. Damit waren etwa 35 % des eingesetzten Trypsins an das Harz gebunden.
Das Harz wurde hierauf unter Eiskühlung (bei pH 7,0) mit 2,12 ml einer roh enteiweißten Lösung des Inhibitors aus Schweinepankreas versetzt, die 18,7 E Inhibitor enthielten (spezifische Aktivität 0,055 Einheiten/mg Protein; Proteinbestimmung s. W. J.

ίο Waddell, Journ. Lab. Clin. Med. [1956], 48,

S. 311 bis 314). Nach 5minutigem Rühren wurde das Harz abzentrifugiert, mit 0,1 M-Natriumchlorid-LÖ-sung auf der Zentrifuge 5mal gewaschen.

Die vereinigten Überstände zeigten keine Trypsinhemmung mehr. Der Rückstand wurde hierauf im Eisbad in 100 ml 0,1 N-Natriumchloridlösung suspendiert und mit 50 ml 0,1 N-Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt. Es wurde zentrifugiert und der Rückstand nochmals in 150 ml 0,1 M-Natriumchlorid/0,1 N-HCl, pH 2,0, auf der Zentrifuge gewaschen. Die vereinigten Überstände hatten eine Hemmwirkung von 11,9 E, das sind 61% des eingesetzten-Hemmstoffes. Die spezifische Hemmwirkung betrug 0,90 Einheiten/mg Protein. Die Anreicherung war damit 16fach. Das Harz war weiter verwendbar.

b) 0,4 g Maleinsäureanhydrid-Vinylpyrrolidon-Copolymerisat (enthaltend 53 % Vinylpyrrolidon) wurden nach 1.2 mit 2,0 g Trypsin (1168 E) umgesetzt und mit Cellulosepulver in eine Säule gefüllt. Die Säule wurde mit 163 E einer rohen Inhibitorlösung aus Schweinepankreas beladen, gewaschen und mit einer Lösung von 0,1 M-Salzsäure, 0,1 M-Natriumchlorid eluiert. Ausbeute an Inhibitor 99 E, das sind 61 % der eingesetzten Menge.

c) Ein Copolymerisat aus Methacrylsäure und Methacrylsäure-3-fiuor-anilid nach M a η e c k e (Makromolekular-Chemie, 39, S. 13 [I960]) wurde in Suspension in 0,1 M-Bicarbonat-Puffer mit Trypsin bei 4° C umgesetzt. Das erhaltene Harz wurde mit Cellulosepulver gemischt, in eine Säule gefüllt und bei 4° C mit 0,1 M-Trispuffer, pH 7,8, ausgewaschen, bis im Eluat kein* Trypsin mehr nachweisbar war. Dieser Säule wurde hierauf bei pH 7,8 eine unreine Lösung des Schweinepankreas-Inhibitors beigegeben und mit 0,1 M-Trispuffer pH 7,8 nachgewaschen, bis im Eluat kein Inhibitor mehr nachweisbar war. Der an der Säule gebundene Inhibitor wurde hierauf mit einer Lösung von 0,1 M-HCl in 0,1 M-NaCl eluiert.

2. Chymotrypsin-Harz: 200 mg Copolymerisat werden in 200 ml Puffer bei O⁰C kurz homogenisiert und mit 20 ml einer 0,1 %igen Hexamethylendiaminlösung 3 Minuten gerührt. Danach wird 1 g a-Chymotrypsin, gelöst in 100 ml 0,2 M-Phosphatpuffer, pH 7,5, dazugegeben und die Mischung über Nacht bei 0 bis 4° C gerührt, wobei das pH der Lösung durch eventuellen Zusatz von Puffer auf 7,5 gehalten wird.

Der Niederschlag wird mehrmals mit Triäthanolamin-Pufferlösung, pH 7,8 (0,1 M-Triäthanolamin; 0,1 M-NaCl; 0,01 M-CaCl₂), gewaschen (Zentrifugation), dann mit etwa dem 3fachen Volumen Cellulosepulver verrührt und in eine wassergekühlte Säule gegossen. Die Säule wird noch etwa 6 Stunden mit demselben Puffer gewaschen.

Adsorption von Chymotrypsin-Inhibitoren

2.1 50 000 Einheiten Kallikrein-Inhibitor wurden, gelöst in dem obigen Puffer, pH 7,8, an der Säule völlig adsorbiert. Die Elution des Kallikrein-Inbibitors

1 öl/ /bo

erfolgte quantitativ mit 0,25 M-KC1/HC1 Puffer, pH 2,0.

2.2 Ein mit Perchlorsäure enteiweißter und durch Gelfiltration entsalzter Extrakt aus Rinderpankreas enthielt 200 Inhibitoreinheiten für Trypsin, wovon etwa 50 % auf die Anwesenheit des Kunitz-Inhibitors zurückzuführen waren. Der Extrakt wurde nach Zusatz von NaCl (0,2 M) und Puffer, pH 8,0, auf die Chymotrypsin-Harz-Säule aufgetragen. Im Eluat wurden 100 Inhibitoreinheiten für Trypsin getestet, von denen nur noch weniger als 1 % auf die Anwesenheit des Kunitz-Inhibitors zurückzuführen waren.

Der im Eluat der Chymotrypsin-Harz-Säule vorhandene spezifische Trypsininhibitor wurde anschließend über eine Trypsin-Harz-Säule gereinigt (vgl. 1.2 und 1.3). Mit HiKe dieses Verfahrens gelingt somit in einem Arbeitsschritt die beinahe quantitative Trennung und Reinigung von Kunitz-Inhibitor und spezifischem Trypsininhibitor, da das Eluat der Chymotrypsin-Harz-Säule direkt auf die Trypsin-Harz-Säule aufgetragen wird. Nach Elution der Säulen mit saurer Lösung liegen beide Inhibitoren in reiner Form vor.

3. Kallikrein-Harz-Säule: 400 mg Copolymerisat wurden in 200 ml 0,2 M-Phosphatpuffer, pH 7,5, bei 0⁰C kurz homogenisiert, die Mischung mit 2 ml 1 %iger Hexamethylendiaminlösung versetzt und 3 Minuten bei 0⁰C gerührt. Danach wurden 100 000 Einheiten Kallikrein (28 Protein/Kallikrein-Einheit), gelöst in 20 ml 0,2 M-Phosphatpuffer, pH 7,5, zugegeben und die Suspension über Nacht bei 0 bis 4° C gerührt. Das Kallikrein-Harz (an das Copolymerisat wurden 99 500 Kallikreineinheiten gebunden) wurde mit etwa dem vierfachen Volumen Cellulosepulver gemischt und in eine wassergekühlte und mit einer 1 cm hohen Schicht von Dextrangel gefüllte Säule gegossen.

3.1 Nach dem Waschen der Kallikrein-Harz-Säule mit 0,1 M-Triäthanolaminpuffer (+ 0,2 M-NaCl),

ίο pH 7,8, wurden von den aufgegebenen 80 000 Einheiten Kallikrein-Inhibitor 75 000 Einheiten an der Säule adsorbiert. 40 000 Einheiten wurden mit Ammoniumacetatpuffer, pH 2, wieder eluiert. (Bei kleineren Säulen betrug die Ausbeute an eluiertem Kallikrein-Inhibitor 100%.) Die Kallikrein-Harz-Säule konnte bei pH 7,8 erneut mit Kallikrein-Inhibitor beladen werden, das gebundene Kallikrein wurde also durch den EIutionspuffer vom pH 2 nicht geschädigt. Der Kallikrein-Inhibitor kann außerdem mit Hilfe einer 8 M-Harn-

ao stofflösung (+0,1M Triäthanolaminpuffer, pH 7,8) bei neutralem pH von der Kallikrein-Harz-Säule eluiert werden. Die Ausbeute an Kallikrein-Inhibitor beträgt dabei (nach Abtrennung des Harnstoffs mit Hilfe einer Dextrangel-Säule) bis zu 100%. Auf der Säule kommt es dabei wahrscheinlich zu einer reversiblen Denaturierung des Kallikreins bzw. Kallikrein-Inhibitors und damit zu einer Spaltung der spezifischen Kallikrein-Inhibitor-Assoziation.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Anreicherung von Enzym-Inhibitoren, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Enzym, das durch den betreffenden Enzym-Inhibitor gehemmt wird, covalent an einen Träger bindet und die dabei erhaltene Verbindung in Wasser mit einer Lösung des Enzym-Inhibitors in Kontakt bringt, den dabei erhaltenen Enzym/Enzym-Inhibitor/Träger-Komplex durch Auswaschen reinigt, sodann zur Dissoziation bringt und den Enzym-Inhibitor isoliert.