NO122030B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til konsentrering av inhibitorer for kalli--krein, trypsin, plasmin og chymotrypsin.

Det er kjent at enzymer og stoffer med proteinkarakter kan bindes til høyeremolekylære polymere stoffer (oversikt av I.H. Silman og E.Katchalski i Ann.Rev. Biochemistry, 35_, 873 (1966)). I de derved dannede addisjonsprodukter bibeholder enzymene mer eller mindre deres biologiske aktivitet.

Det er således kjent at trypsin kan bindes til kopolymere av maleinsyreanhydrid og etylen (E. Katchalski et al} Biochemistry, 3, 1905 (1964)). Det er i denne sammenheng kjent at

man kan hemme den enzymatiske aktivitet av de på denne måte bundne enzymer ved hjelp av inhibitorer (E. Katchalsi et al, jfr. ovenfor).

Det er derimot hittil ukjent at enzyminhibitorer fra organekstrakter, vegetabilske ekstrakter og legemsvæsker kan bindes til de polymere fikserte enzymer, og at det derved dannede enzympolymeraddisjonsprodukt-inhibitor-kompleks igjen kan spaltes i dets enkelte bestanddel, nemlig enzympolymeraddisjonsproduktet og den fri inhibitor.

Det har ifølge oppfinnelsen vist seg at inhibitorer

for kallikrein, trypsin, plasmin og chymotrypsin, f.eks. kallikreininhibitoren fra kvegorganer, som lunger, parotis, lever, milt og pankreas, som dessuten hemmer enzymene trypsin, chymotrypsin og plasmin, og som er identiske med den i 1936 av Kunitz og Northrop fra oksepankreas isolerte trypsininhibitor (oversikt av R. Vogel, I. Trautschold og E. Werle i Natiirliche Proteinasen-Inhibitoren, George Thieme Verlag, Stuttgart 1968), kan konsentreres ved at et vannuoppløselig enzympolymer-addisjonsprodukt hvor enzymet er trypsin, chymotrypsin eller kallikrein, bringes i kontakt med en oppløsning av den angjeldende inhibitor for dannelse av et vannuopp-løselig enzympolymer-addisjonsprodukt-inhibitor-kompleks, hvorfra alle ledsagerstoffer utvaskes med vandige pufferoppløsninger, hvoretter komplekset bringes til dissosiasjon i sur oppløsning eller spaltes med urinstoffoppløsning og den konsentrerte inhibitorholdige oppløsning skilles fra det uoppløselige enzympolymeraddisjonsprodukt.

På samme måte kan man også konsentrere inhibitorer

for de samme.enzymer fra bukspyttkjertel, fra sædblærer, submandi-bularis-kjertler og sekreter fra disse kjertler, fra sera og fra

. kornfrø, f.eks. fra søyabønner og mais.

Med hensyn til de polymere som skal anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse, skal disse inneholde funksjonelle grupper som er' i stand til å reagere med de nevnte enzymer etter peptid-kjemiens metoder. Her skal i første rekke nevnes de harpikser som inneholder anhydridgrupper, syrekloridgrupper, isocyanatgrupper og azidgrupper, samt de harpikser som inneholder aktiverte fluoratomer (jfr. Makromolekular-Chemie, 39 , (1960), side 13 oversikt i Ann. Rev. Biochem., 35, (1966), side-873). Også de kjente i handelen værende karboksylholdige ionebytterharpikser kommer etter innføring av aktiverte grupper som deretter kan reagere med enzymene, i betrakt-ning, (sml. Ann. Rev. Biochemistry, 35, 873 (1966)).

Ved utførelsen av den her omhandlede fremgangsmåte vaskes enzympolymeraddisj onsprodukt-inhibitor-komplekset grundig med vandige pufferoppløsninger for fjernelse av ledsagerstoffer og forurensninger og bringes deretter til dissosiasjon. Denne dissosiasjon skjer i sur oppløsning, f.eks. ved forskyvning av pH-verdien eller ved tilsetning av en urinstoffoppløsning som kan spalte komplekset.

Den her omhandlede fremgangsmåte har den fordel at det ved anvendelse herav på enkel måte er mulig med gode utbytter og renhetsgrader å konsentrere, rense og isolere de omhandlede inhibitorer, som det hittil har vært vanskelig og kostbart å konsentrere fra urene oppløsninger.

Utførelseseksempler.

Som polymere anvendes de såkalte EMA-harpikser, bestående av kopolymere av etylen og maleinsyreanhydrid. Videre anvendes krystallisert trypsin og chymotrypsin og kallikrein inneholdende ca. 2^ug protein pr. KE samt inhibitorholdige vevs-ekstrakter.

Forsøksbetingelser.

(Tallene henviser til tabellens angivelser).

A. EMA- trypsin: Fremstillingen av EMA-trypsin-cellulose-søylene samt bindingen av kallikrein-inhibitor (A.l.) fra vevs-ekstrakter og dens etterfølgende dissosiasjon fra trypsin-harpiks-inhibitor-komplekset samt eluering fra søylen med sure puffere gjennomføres etter følgende forskrift.

Fremstilling av det vannuoppløselige trypsin- polymer- derivat ( A) :

Det vannuoppløselige trypsin-polymer-derivat fremstilles analogt med forskriften fra Katchalski et al. (Biochemistry 3, 1905 (1964)) på følgende måte: 5 g trypsin oppløst i 500 ml 0,2-n kaliumfosfatpuffer med en pH-verdi på 7,5, suspenderes med 1 g maleinsyreanhydrid-etylen-copolymer i 1 liter av ovennevnte puffer og tilsettes 100 ml av en 0,l$'s vandig oppløsning av heksametylendiamin. Heksametylendiamin tjener til tverrbinding av kopolymerkjedene og dermed til nedsettelse av enzympolymeraddisjonsproduktets oppløselighet. Etter omsetningen blandes produktet med det dobbelte volum fraslemmet cellulosepulver og helles på'en søyle. Denne vaskes med 0,1-n trietanolaminpuffer med pH = 7,8, som dessuten er 0,1 molar med hensyn til MaCl og 0,01 molar med hensyn til CaCl2, inntil det ikke mer finnes mer aktivt trypsin i eluatet. Alle operasjoner gjennomføres under avkjøling (4°C).

A. l. Rensning av kallikreininhibitoren:

Vevshomogenatet, som inneholder inhibitoren, f.eks.

av okselunger, befris, for protein med perklorsyre eller etanol, konsentreres i vakuum og innstilles med puffer (sml. ovenfor) på en pH-verdi på 7,8. Det helles direkte på den ovenfor omtalte søyle. Denne kan komplekst binde en inhibitormengde som kan hemme ca. lg trypsin. Etterat inhibitoroppløsningen er rent gjennom søylen, vaskes denne fri for protein med vandig pufferoppløsning. Deretter elueres inhibitoren igjen fra søylen med en pufferoppløsning (ph = 2) av HCl'og KC1 (0,-2-n KC1). Etterat pH-verdien erinnstillet på 7,8

(se ovenfor), kan søylen anvendes til neste renseoperasjon. Den kan, hvis det arbeides under avkjøling (4°C, vann), anvendes til iso-lering av trypsininhibitorer i flere måneder uten merkbart kapasi-tetstap. Den således isolerte inhibitor er fullstendig fri for ledsagende proteiner (spesifik aktivitet 2,8 TlmE/^ug protein). Utbyttet er ca. 80%, hvis rensningen foretas ved 4 til 8°C. Etter inndampning befris den sure inhibitoroppløsning for salt (dextrangel, dialyse) og lyofiliseres.

De oppnådde utbytter av rene, ennå saltholdige inhibitorer fremgår av.tabellen. På analog måte isoleres de i tabellen angitte trypsininhibitorer A.2. og A.3.

Den under A.l. angitte fremgangsmåte kan såvel med hensyn til den anvendte arbeidsmåte (a) som med hensyn til den anvendte, harpiks (b eller c) varieres således som det fremgår av det

følgende:

a) Et trypsin-harpiks-kompleks fremstilles ifølge A. 2. fra 500 mg maleinsyreanhydrid-etylen-cpolymerisat og 250 mg trypsin

(183 enheter) og frasentrifugeres. Den gjenværende fra trypsin-harpiksen vaskes 5 ganger med 0,05 molar fosfatpuffer med pH = 7>0 og 5 ganger med 0,1 molar natriumklorid på sentrifugen. Vaskevannet er deretter fritt for enhver tryptisk aktivitet. De samlede ovenstående væsker har en trypsinaktivitet på 10 enheter. Dermed er ca. 95% av det anvendte trypsin bundet til harpiksen. Til harpiksen settes det deretter under isavkjøling (ved pH = 7,0) 2,12 ml av en rå, for protein befridd oppløsning av inhibitoren fra svinepankreas, som inneholder 18,7 enheter inhibitor (spesifikk aktivitet 55 mE/mg protein ifølge Waddell). Etter 5 minutters omrøring avsentrifugeres harpiksen og vaskes 5 ganger med 0,1 molar natriumkloridoppløsning på sentrifugen.

De forenede ovenstående væsker viser ikke lengere noen trypsinhemming. Residuet suspenderes deretter i isbad i 100 ml 0,1 molar natriumkloridoppløsning og innstilles på en pH-verdi på 2,0 med 50 ml 0,1-n saltsyre. Det sentrifugeres og residuet vaskes 'ennå en gang i en blanding av 150 ml 0,1 molar natriumklorid og 0,1-n HC1 med pH 2,0 på sentrifugen. De forenede ovenstående væsker har en hemmende virkning på 11,9 enheter, dvs. 6l% av det anvendte hemmende stoff. Den spesifikke hemmende virkning er 900 mE/mg protein ifølge Waddell. Konsentreringen er dermed l6-doblet. Harpiksen kan anvendes igjen.

b) 0,4 g maleinsyreanhydrid-vinylpyrrolidon-copolymerisat (inneholdende 53$ vinylpyrrolidon) omsettes ifølge A.2. med 2,0 g

trypsin (1168 enheter) og fylles på en søyle sammen med cellulosepulver. Søylen fylles med 163 enheter av en rå inhibitoroppløsning fra svinepankreas, vaskes og elueres med en oppløsning av 0,1 molar saltsyre og 0,1 molar natriumklorid. Utbyttet av inhibitor er 99 enheter, dvs. 6l% av den anvendte mengde.

c) Et copolymerisat av metakrylsyre og metakrylsyre-3-fluor-anilid ifølge Manecke (Makromolekular-Chemie, 39, 13 (1960))

omsettes med trypsin ved 4°C i 0,1 molar bikarbonatpuffer i suspen-sjon. Den fremkommende harpiks blandes med cellulosepulver, fylles på en søyle og utvaskes ved 4°C med 0,1 molar trietanolaminpuffer med pH = 7,8, inntil det ikke lenger kan påvises trypsin i eluatet. Til denne søyle settes det deretter ved pH = 7,8 en uren oppløsning

av svinepankreas-inhibitoren og det ettervaskes med 0,1 molar trietanolaminpuffer med pH=7,8, inntil det i eluatet ikke lengere kan påvises noen inhibitor. Den på søylen fikserte inhibitor

elueres heretter med en oppløsning av 0,1 molar HC1 i 0,1 molar NaCl.

B. EMA- chymotrypsin ( chymotrypsinpolymeraddisjonsprodukt):

200 mg EMA homogeniseres i kort tid i 200 ml puffer

ved 0°C og omrøres i 3 min. med 20 ml av en 0,1$'s heksametylendi-aminoppløsning. Heretter tilsettes det 1 g a-chymotrypsin, oppløst i 100 ml 0,2 molar fosfatpuffer ved pH = 7, 5 og blandingen omrøres natten over ved 0-4°C, idet oppløsningens pH-verdi holdes på 7,5

ved eventuell tilsetning av puffer.

Utfellingen vaskes (sentrifugering) flere ganger med trietanolamin-pufferoppløsning med pH = 7>8 (0,1 molar trietanol-amin, 0,1 molar NaCl og 0,01 molar CaCl2), hvoretter den røres sammen med ca. det 3-dobbelte volum cellulosepulver og helles på en vann-avkjølt søyle.. Søylen vaskes ytterligere i 6 timer med den samme puffer.

Adsorpsjon av inhibitorer:

B.l.) 50.000 K1E kallikrein-inaktivator, oppløst i ovennevnte puffer med pH = 7*8, adsorberes fullstendig på søylen. Elueringen av kallikrein-inaktivatoren skjer kvantitativt med

0,25 molar KCl/HCl-puffer med pH =2,0.

B.2.) En med perklorsyre for protein befridd og over dextrangel for salt befridd ekstrakt av oksepankreas inneholder 200.000 ImE trypsin, hvorav ca. 50$ skyldes tilstedeværelsen av Kunitz-inhibitoren. Ekstraktet overføres etter titetning av NaCl (0,2 molar) og puffer med pH = 8,0 på EMA-chymotrypsinsøylen. I søylefiltratet ble det funnet 100.000 ImE trypsin, hvorav bare mindre enn 1% skyldes tilstedeværelse av Kunitz-inhibitoren.

Den i søylefiltratet fra EMA-chymotrypsinsøylen til-stedeværende spesifikke trypsininhibitor renses deretter over en EMA-trypsinsøyle (jfr. A.2. og A.3.). Ved hjelp av denne fremgangsmåte lykkes den nesten kvantitative fraskillelse og rensning av Kunitz-inhibitor og spesifikk trypsininhibitor i ett arbeidstrinn, da søylefiltratet fra EMA-chymotrypsinsøylen overføres direkte på trypsinsøylen. Etter eluering av søylene med sur oppløsning fore-ligger begge inhibitorer i ren form.

C. EMA- kallikrein:

400 mg EMA homogeniseres i kort tid i 200 ml 0,2 molar fosfatpuffer med pH = 7,5 ved 0°C og 2 ml l$'s heksametylendiamin-oppløsning settes til blandingen som omrøres i 3 min. ved 0°C. Deretter tilsettes det 100.000 KE kallikrein (2 y protein/KE), oppløst i 20 ml 0,2 molar fosfatpuffer med pH = 7,5 og suspensjonen omrøres natten over ved 0-4°C. EMA-kallikreinen (99-500 KE bundet til EMA) blandes med ca. det firedobbelte volum cellulosepulver og fylles på en vannavkjølt og med et 1 cm høyt lag av dextrangel fylt søyle.

Cl.) Etter vasking av EMA-kallikreinsøylen med

0,1 molar trietanolaminpuffer (+ 0,2 molar NaCl) med pH = 7,8 adsorberes 75.000 KIE av den anvendte 80.000 KIE kallikrein-inaktivator på søylen. 40.000 KIÉ elueres igjen med ammonium-acetatpuffer med pH = 2. Ved mindre søyler er utbyttet av eluert kallikrein-inaktivator 100$. EMA-kallikreinsøylen kan ved pH =

7,8 på ny fylles med kallikrein-inaktivator, og den bundne kallikrein beskadiges altså ikke av elueringspufferen med pH = 2. Kallikrein-inaktivatoren kan dessuten elueres fra EMA-kallikreinsøylen ved hjelp av en 8 molar urinstoffoppløsning (+ 0,1 molar trietanolamin-puf f er med pH = 7,8) ved en nøytral pH-verdi. Utbyttet av kallikrein-inaktivator er herved etter fraskillelse av urinstoffet ved hjelp av en dextrangelsøyle opptil 100$.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til konsentrering av inhibitorer for kallikrein, trypsin, plasmin og chymotrypsin, karakterisert ved at et vannuoppløselig enzympolymeraddisjonsprodukt hvor enzymet er trypsin, chymotrypsin eller kallikrein, bringes i kontakt med en oppløsning av den angjeldende inhibitor for dannelse av et vann-uoppløselig enzympolymeraddisj onsprodukt-inhibitor-kompleks, hvorfra alle ledsagerstoffer utvaskes med vandige pufferoppløsninger, hvoretter komplekset bringes til dissosiasjon i sur oppløsning eller spaltes med urinstoffoppløsning og den konsentrerte inhibitorholdige oppløsning skilles fra det uoppløselige enzympolymeraddisjonsprodukt .