NO130344B

NO130344B -

Info

Publication number: NO130344B
Application number: NO05106/69A
Authority: NO
Inventors: Y Kobayashi; H Kabeno; T Honda
Original assignee: Nissui Pharm Co Ltd
Priority date: 1968-12-26
Filing date: 1969-12-23
Publication date: 1974-08-19
Also published as: DK126024B; FR2027116B1; GB1279820A; FR2027116A1; CH503054A; DE1963816A1

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av Method of manufacture of

mukoprotein. mucoprotein.

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et nytt, terapeutisk aktivt mukoprotein av pattedyrs for-døyelseskanal. Det inneholder 35-55% protein og 3-15% heksose. This invention relates to a method for producing a new, therapeutically active mucoprotein from the digestive tract of mammals. It contains 35-55% protein and 3-15% hexose.

Det er kjent at hormoner som hemmer utskillelsen av mavesaft, avsondres fra pattedyrs fordcyelseskanal. Et slikt hormon, kjent som gastron, inneholdes i mavesaftene. Et annet hormon, kjent som enterogastron, inneholdes i tynntarmen. Den virkelige kjemiske struktur av disse hormoner er imidlertid ukjent. It is known that hormones that inhibit the secretion of gastric juice are secreted from the digestive tract of mammals. One such hormone, known as gastron, is contained in the gastric juices. Another hormone, known as enterogastrone, is contained in the small intestine. However, the real chemical structure of these hormones is unknown.

Fra norsk patent 123.051 er det kjent fremstilling av et glykopeptid (mukoprotein) fra maveslimhinnen eller tolvfinger-tarmen fra svin, og dette patent har således en viss likhet med foreliggende oppfinnelse. Produktet som fremstilles i henhold til foreliggende oppfinnelse, er imidlertid et mukoprotein inneholdende 35-55% protein og 3-15% heksose, mens produktet som fremstilles ifølge patentet, inneholder 3-18% aminosyre og 27-31% heksose. Videre har mukoproteinet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse en lavere molekylvekt enn glykopeptidet fremstilt ifølge.patentet. Norwegian patent 123,051 discloses the production of a glycopeptide (mucoprotein) from the gastric mucosa or duodenum from pigs, and this patent thus has a certain similarity to the present invention. The product produced according to the present invention is, however, a mucoprotein containing 35-55% protein and 3-15% hexose, while the product produced according to the patent contains 3-18% amino acid and 27-31% hexose. Furthermore, the mucoprotein produced according to the present invention has a lower molecular weight than the glycopeptide produced according to the patent.

Det har nu lykkes oppfinnerne å finne frem til en fremgangsmåte for ekstrahering av et nytt mukoprotein fra pattedyrs fordøyelseskanal, hvilket mukoprotein kjennetegnes ved en slimavsondrende virkning så vel som en anti-sår-virkning-. The inventors have now succeeded in finding a method for extracting a new mucoprotein from the digestive tract of mammals, which mucoprotein is characterized by a mucus-secreting effect as well as an anti-ulcer effect.

Formålet med foreliggende oppfinnelse er således å angi en fremgangsmåte for fremstilling av et mukoprotein fra slimhinnebelegget fra maven eller tynntarmen av et pattedyr, hvilket mukoprotein inneholder 35-55% protein og' 3-15% heksose, og har en slimavsondrende og anti-sår-virkning. The purpose of the present invention is thus to specify a method for the production of a mucoprotein from the mucous membrane coating from the stomach or small intestine of a mammal, which mucoprotein contains 35-55% protein and 3-15% hexose, and has a mucus-secreting and anti-ulcer effect.

Fremgangsmåten karakteriseres ved at slimhinnen finhakkes, den finhakkede slimhinne ekstraheres med vann,.en vandig oppløsning av fortynnet alkohol eller en vandig oppløsning av fortynnet syre, benzoesyre eller ammoniumsulfat settes til ekstrakten, bunnfallet oppsamles og oppløses i vann, og oppløs-ningen behandles med trypsin i ca. ett døgn ved ca. 3 7°C, de lavmolekylære forurensninger fjernes ved en ekstraksjon med en lavere alkylalkohol, ved dialyse eller ved trykkfiltrering under anvendelse av en fornettet dekstranmembran gjennom hvilken gelaktige forbindelser med molekylvekt over 1000 ikke kan passere, hvorefter den rensede oppløsning lyofiliseres. The method is characterized by finely chopping the mucous membrane, extracting the finely chopped mucous membrane with water, adding an aqueous solution of diluted alcohol or an aqueous solution of diluted acid, benzoic acid or ammonium sulphate to the extract, collecting the precipitate and dissolving it in water, and treating the solution with trypsin for about. one day at approx. 3 7°C, the low molecular impurities are removed by an extraction with a lower alkyl alcohol, by dialysis or by pressure filtration using a cross-linked dextran membrane through which gel-like compounds with a molecular weight above 1000 cannot pass, after which the purified solution is lyophilized.

Mukoproteinet fremstilt i henhold til oppfinnelsen kan ekstraheres fra en rekke forskjellige pattedyr, innbefattet griser, sauer, geiter eller hvaler. Det foretrekkes å anvende hvaler ved denne fremgangsmåte fordi disse er forholdsvis lett tilgjengelige som industrielle råstoffer. Innholdet av mukoprotein varierer i fordøyelseskanalen. I slimbelegget i maven, og særlig i slimbelegget i slimhinnen i maveport-kjertelområdet og i tarmene,, særlig den øvre del av tynntarmen, er innholdet av mukoprotein høyt, Det er således hensiktsmessig å ekstrahere mukoproteinet fra disse deler. The mucoprotein produced according to the invention can be extracted from a number of different mammals, including pigs, sheep, goats or whales. It is preferred to use whales in this method because these are relatively easily available as industrial raw materials. The content of mucoprotein varies in the digestive tract. In the mucous lining of the stomach, and especially in the mucous lining of the mucosa in the gastric portal gland area and in the intestines, especially the upper part of the small intestine, the content of mucoprotein is high. It is therefore appropriate to extract the mucoprotein from these parts.

Den del av fordøyelseskanalen som skal behandles, fin-,hakkes ved hjelp av en hakkemaskin og ekstraheres med kokende vann, en vandig oppløsning av fortynnet alkohol, så som en 30% etanoloppløsning, en 50% metanoloppløsning eller en 0,IN salt- The part of the alimentary canal to be treated is finely chopped using a mincer and extracted with boiling water, an aqueous solution of dilute alcohol, such as a 30% ethanol solution, a 50% methanol solution, or a 0.IN salt-

syre - 50% etanoloppløsning, eller den finhakkede fordøyelses- acid - 50% ethanol solution, or the finely chopped digestive

kanal behandles med en vandig oppløsning av fortynnet syre, så channel is treated with an aqueous solution of dilute acid, so

som en 0,IN saltsyre-oppløsning, en 5% eddiksyreoppløsning, as a 0.IN hydrochloric acid solution, a 5% acetic acid solution,

eller en 1% svovelsyreoppløsning. or a 1% sulfuric acid solution.

Ekstrakten skilles fra de faste stoffer og et felle- The extract is separated from the solids and a trap

middel tilsettes. Som fellemiddel anvendes benzoesyre eller ammoniumsulfat. For å øke dispergerbarheten av fellemidlet i ekstrakten, er det hensiktsmessig Å tilsette fellemidlet i form av en oppløsning eller suspensjon i et passende oppløsnings- agent is added. Benzoic acid or ammonium sulphate is used as a trapping agent. In order to increase the dispersibility of the trapping agent in the extract, it is appropriate to add the trapping agent in the form of a solution or suspension in a suitable solvent

middel. Når f.eks. fellemidlet er benzoesyre, kan det oppløses i aceton. medium. When e.g. the trapping agent is benzoic acid, it can be dissolved in acetone.

Bunnfallet oppsamles ved slike vanlige metoder som suge-filtrering, sentrifugalseparering e.l., og vaskes med vann og, The precipitate is collected by such common methods as suction filtration, centrifugal separation, etc., and is washed with water and,

hvis nødvendig, med alkohol, aceton, benzen eller et passende organisk oppløsningsmidde1, og tørres. if necessary, with alcohol, acetone, benzene or a suitable organic solvent1, and dry.

Det på dette trinn av fremgangsmåten dannede rå- At this stage of the process, the raw

produkt inneholdende mukoproteinet ble funnet å ha en bioak- product containing the mucoprotein was found to have a bioac-

tivitet på ca. 20 mg/kg. Dette råprodukt raffineres deretter for å få et meget aktivt stoff. Den vandige oppløsning av råproduktet reguleres til passende konsentrasjon, f.eks. en 10% tivity of approx. 20 mg/kg. This raw product is then refined to obtain a highly active substance. The aqueous solution of the crude product is regulated to a suitable concentration, e.g. a 10%

vandig oppløsning, og pH-verdien reguleres til ca. 7. Bunn- aqueous solution, and the pH value is adjusted to approx. 7. Bottom-

fallet som dannes ved tilsetning av.syre, fjernes, og oppløsningen reguleres til pH 4. Bunnfallet oppsamles og fjernes. Ved denne behandling blir det urene protein som finnes i produktet, utfelt og fjernet. Denne etterbehandling er imidlertid ikke alltid nødvendig, og i mange tilfeller kan <ien vandige oppløsning av det ovennevnte råprodukt anvendes som det er i det neste trinn. the precipitate formed by the addition of acid is removed, and the solution is adjusted to pH 4. The precipitate is collected and removed. During this treatment, the impure protein found in the product is precipitated and removed. However, this post-treatment is not always necessary, and in many cases an aqueous solution of the above-mentioned raw product can be used as is in the next step.

Trypsin settes deretter til den vandige oppløsning av råproduktet Trypsin is then added to the aqueous solution of the crude product

for å frembringe spaltning av proteinet som inneholdes i råproduktet. Oppløsningen oppvarmes deretter for å inaktivere enzymet, og de lavmolekylære forurensninger og uorganiske salter som inneholdes i oppløsningen, fjernes. to produce cleavage of the protein contained in the crude product. The solution is then heated to inactivate the enzyme, and the low molecular weight contaminants and inorganic salts contained in the solution are removed.

For å fjerne de lavmolekylære forurensninger og uor- In order to remove the low-molecular pollutants and unor-

ganiske salter kan en hvilken som helst av en rekke forskjellige metoder anvendes. En slik metode består f.eks. i at slike forurensninger som aminosyrer og peptider osv., ekstraheres og fjernes med an lavere alkylalkohol. En annen metode består i ganic salts, any of a number of different methods can be used. Such a method consists, for example, of in that such contaminants as amino acids and peptides, etc., are extracted and removed with a lower alkyl alcohol. Another method consists in

å fjerne lavmolekylære forurensninger og uorganiske salter ved hjelp av dialyse under anvendelse av en semipermeabel membran eller en ionebytterharpiks. Ulempen ved anvendelse av disse metoder er imidlertid at volumet av oppløsningen som inneholder mukoproteinet, er stort, og under behandlingen er det derfor nødvendig med ganske mye arbeid for å oppnå mukoproteinet ved konsehtrering og lyofilisering. to remove low molecular weight contaminants and inorganic salts by means of dialysis using a semipermeable membrane or an ion exchange resin. The disadvantage of using these methods, however, is that the volume of the solution containing the mucoprotein is large, and during treatment quite a lot of work is therefore required to obtain the mucoprotein by concentration and lyophilisation.

De lavmolekylære forurensninger og uorganiske salter The low molecular weight pollutants and inorganic salts

kan imidlertid elimineres og oppløsningen konsentreres i et enkelt trinn ved å øke filtreringstrykket under anvendelse av en fornettet dekstranmembran som. er fornettet i en slik grad at den er tilstrekkelig til å hindre diffusjon av noen gelaktige stoffer med molekylvekt over 1000. Eksempler på slike fornettede dekstraner er "UM-1" eller "UM-2". Det fornettede dekstran på- however, can be eliminated and the solution concentrated in a single step by increasing the filtration pressure using a cross-linked dextran membrane which. is cross-linked to such an extent that it is sufficient to prevent the diffusion of some gel-like substances with a molecular weight above 1000. Examples of such cross-linked dextrans are "UM-1" or "UM-2". The cross-linked dextran on-

føres på en porøs bæreplate så som et filtrerpapir osv., og festes til dette. Det foretrekkes å anvende en fornettet dekstran- is placed on a porous support plate such as a filter paper, etc., and attached to this. It is preferred to use a cross-linked dextran

membran som har en tykkelse på 0,05 til 0,5 mm når et filtrer- membrane that has a thickness of 0.05 to 0.5 mm when a filter

papir anvendes som bæreplate-paper is used as a carrier plate

Ved utførelse av fremgangsmåten i henhold til opp- When carrying out the procedure according to up-

finnelsen filtreres oppløsningen under forhøyet trykk med om- invention, the solution is filtered under elevated pressure with re-

røring. Trykket bør holdes ved 3,5 til 8 kg/cm 2 og fortrinnsvis ved ca. 7 kg/cm 2. Strømningshastigheten reguleres hensikts- stirring. The pressure should be kept at 3.5 to 8 kg/cm 2 and preferably at approx. 7 kg/cm 2. The flow rate is regulated appropriately

messig slik at man får en gjennomsnittlig strømningshastighet på 100-200 ml/time når det anvendes en membran med en diameter på 76 mm. properly so that an average flow rate of 100-200 ml/hour is obtained when a membrane with a diameter of 76 mm is used.

På denne måte vil forurensninger med en molekylvekt på In this way, pollutants with a molecular weight of

mindre enn 1000 og uorganiske salter som er tilstede sammen med mukoprotein, bli fullstendig filtrert og fjernet, og samtidig vil mesteparten av fuktigheten fjernes slik at den påfølgende lyofilisering gjøres lettere. less than 1000 and inorganic salts present with mucoprotein will be completely filtered and removed, and at the same time most of the moisture will be removed so that the subsequent lyophilization is made easier.

Det er ønskelig å fjerne eventuelt fellemiddel som It is desirable to remove any trapping agent such as

kan ha blitt innesluttet i råproduktet under utfellingstrinnet, ettersom tilstedeværelsen av selv små mengder av et slikt fellemiddel har en tendens til å redusere aktiviteten av proteasen som settes til produktet i det påfølgende trinn. Fellemidlet kan fjernes ved en hvilken som helst av de metoder som anvendes for rensning av råproduktet. F.eks. kan fellemidlet fjernes ved dialyse eller trykk-gel-filtrering. may have been trapped in the crude product during the precipitation step, as the presence of even small amounts of such a trapping agent tends to reduce the activity of the protease added to the product in the subsequent step. The trapping agent can be removed by any of the methods used to purify the raw product. E.g. the trapping agent can be removed by dialysis or pressure-gel filtration.

De kjemiske egenskaper for mukoproteinet fremstilt i The chemical properties of the mucoprotein produced in

henhold til oppfinnelsen, er fremdeles hovedsakelig ukjent i detalj. Sammensetningen synes imidlertid å svare til omtrent den følgende: according to the invention, is still largely unknown in detail. However, the composition seems to correspond roughly to the following:

Resultatene av en prøve utført for å fastlegge anti-sår-virkningen av mukoproteinet fremstilt i henhold til oppfinnelsen, er som vist i den følgende tabell. Prøven ble utført i henhold til Shay's metode som følger: En laparotomi ble utført på han-rotter under eterbe-døvelse. Rottene som veide 250-350 g etter 48 timers faste, ble underbundet ved maveporten og den oppsnittede del ble umiddelbart sydd. Samtidig ble en prøveoppløsning injisert i nålevenen. Etter 8 timer ble laparotomi utført under eterbedøvelse og spise- røret ombundet på et punkt like over mavemunnen. Maven ble ekstirpert, og mengden såvel som surheten av mavesaftene ble målt under anvendelse av en 0,IN natriumhydroksydoppløsning med fenolftalein som indikator. Samtidig ble tegn på sår på mave-veggen iakttatt ved sammenligning med en kontrollgruppe som var gitt saltoppløsning. The results of a test carried out to determine the anti-ulcer effect of the mucoprotein produced according to the invention are as shown in the following table. The test was performed according to Shay's method as follows: A laparotomy was performed on male rats under ether anesthesia. The rats, which weighed 250-350 g after 48 hours of fasting, were underligated at the gastric port and the cut part was immediately sutured. At the same time, a sample solution was injected into the needle vein. After 8 hours, laparotomy was performed under ether anesthesia and the tube tied at a point just above the mouth of the stomach. The stomach was excised, and the quantity as well as the acidity of the gastric juices was measured using a 0.1N sodium hydroxide solution with phenolphthalein as an indicator. At the same time, signs of ulcers on the stomach wall were observed when compared with a control group that had been given saline solution.

Det fremgår av den ovenstående tabell at hos de grupper som hadde fått henholdsvis 2,5 mg/kg og 5,0 mg/kg av mukoproteinet fremstilt i henhold til oppfinnelsen, ble sår-dannelsen i mave-kjertelen og vommen tydelig stanset, og utskillelsen av mavesaft og mavesyre ble påfallende hemmet. Hos de grupper som var behandlet med henholdsvis 1,0 mg/kg urogastron og 250 /^g/kg sialogastron, ble det iakttatt en begrenset grad av hemming av mavekjertel-sår-dannelse, mens nesten ingen sår-hemmende virkning ble iakttatt hos gruppen som var gitt 1,0 mg/kg atropinsulfat. It appears from the above table that in the groups that had received respectively 2.5 mg/kg and 5.0 mg/kg of the mucoprotein produced according to the invention, the formation of ulcers in the stomach gland and the rumen was clearly stopped, and the excretion of gastric juice and stomach acid was strikingly inhibited. In the groups treated with 1.0 mg/kg urogastron and 250 µg/kg sialogastron respectively, a limited degree of inhibition of gastric gland ulceration was observed, while almost no ulcer-inhibiting effect was observed in the group who had been given 1.0 mg/kg atropine sulfate.

EKSEMPEL 1 EXAMPLE 1

Maveportkjertel-området fra en frosset tredje mave Gastric portal gland area from a frozen third stomach

fra en hval ble gradvis tint i et lavtemperaturkammer, og slimhinnen ble forsiktig fjernet slik at man fikk 12 kg slimhinne. Slimhinnen ble finhakket med en vanlig hakkemaskin, og ca. 12 kg vann ble tilsatt og kokt i ca. 30 minutter. Oppløsningen fikk stå ved romtemperatur og ble deretter anbragt i et kaldt rom (5°) i 16 timer. Deretter ble de faste stoffer fraskilt under anvendelse av en nylonduk, og man fikk- en ekstrakt. En opp-løsning omfattende 100 g benzoesyre ble oppløst i 1 liter aceton og ble satt gradvis til ekstrakten under omrøring. Den blandede væske ble igjen omrørt i 1 time og påny anbragt i et kaldt rom (ved 5°C) i 16 timer. from a whale was gradually thawed in a low-temperature chamber, and the mucosa was carefully removed to obtain 12 kg of mucosa. The mucous membrane was finely chopped with a normal chopping machine, and approx. 12 kg of water was added and boiled for approx. 30 minutes. The solution was allowed to stand at room temperature and was then placed in a cold room (5°) for 16 hours. The solids were then separated using a nylon cloth, and an extract was obtained. A solution comprising 100 g of benzoic acid was dissolved in 1 liter of acetone and was gradually added to the extract with stirring. The mixed liquid was again stirred for 1 hour and again placed in a cold room (at 5°C) for 16 hours.

Det hvite bunnfall som ble dannet i ekstraktvæsken, ble sugefiltrert under redusert trykk, og de faste stoffer ble omhyggelig vasket med vann. Det faste materiale ble overført til et sentrifugalseparatorrør og vasket 5 ganger med 500 ml aceton og 2 ganger med 300 ml eter inntil ikke mer benzoesyre kunne finnes. De faste stoffer ble deretter tørret, og man fikk 20 g råprodukt. 10 g av dette råprodukt ble oppløst i 1 liter renset vann, og pH-verdien ble regulert til 8,0. En oppløsning inneholdende 100 mg trypsin oppløst i 10 ml vann ble tilsatt, og opp-løsningen ble holdt i 24 timer ved 3 7°C. For å inaktivere trypsinet ble oppløsningen deretter kokt i ca. 15 minutter og deretter avkjølt, og 1 liter n-butanol ble tilsatt, og blandingen ble ristet. Ved sentrifugalseparering av denne blanding ble det oppsamlet en vannfase som først ble konsentrert til 200 ml under redusert trykk og deretter raffinert ved lyofilisering. The white precipitate which formed in the extract liquor was suction filtered under reduced pressure, and the solids were carefully washed with water. The solid was transferred to a centrifugal separator tube and washed 5 times with 500 ml of acetone and 2 times with 300 ml of ether until no more benzoic acid could be found. The solids were then dried, and 20 g of crude product was obtained. 10 g of this crude product was dissolved in 1 liter of purified water, and the pH value was adjusted to 8.0. A solution containing 100 mg of trypsin dissolved in 10 ml of water was added, and the solution was kept for 24 hours at 37°C. To inactivate the trypsin, the solution was then boiled for approx. 15 minutes and then cooled, and 1 liter of n-butanol was added and the mixture was shaken. Upon centrifugal separation of this mixture, an aqueous phase was collected which was first concentrated to 200 ml under reduced pressure and then refined by lyophilization.

På denne måte fikk man 3 g raffinert mukoprpteinpulver. In this way, 3 g of refined mucoprotein powder was obtained.

EKSEMPEL 2 EXAMPLE 2

10 g av råproduktpulveret erholdt ved fremgangsmåten ifølge eksempel 1, ble oppløst i 1 liter renset vann. 20 g dietylaminoetylcellulose (DEAE-cellulose) ble satt til oppløs-ningen, og oppløsningen ble omrørt i ca. 3 timer. Umiddelbart deretter ble. oppløsningen sugefiltrert for å gi fast materiale. De faste materialer ble omhyggelig vasket med vann og deretter omrørt 2 ganger, hver gang med 30 minutter, med 50 ml vandig oppløsning av 0,IN natriumhydroksyd for å bevirke at de stoffer som var absorbert i DEAE-cellulosen, skulle komme ut. Den resulterende væske ble regulert til pH 8,0 under anvendelse av eddiksyre, og en oppløsning- laget ved å oppløse 100 mg trypsin i 10 ml vann, ble tilsatt, og det hele fikk stå ved 3 7°C i 24 timer. Oppløsningen ble kokt i ca. 15 minutter for å inaktivere trypsinet. Deretter ble oppløsningen anbragt i et cellofanrør og dialysert i 72 timer ved redusert trykk under anvendelse av vann og det gjenværende væskekonsentrat. Den konsentrerte væske ble oppløst i en blanding av alkohol og saltsyre inneholdende 7 déler etahol og 3 deler 0,IN saltsyre, og den overliggende væske som ble erholdt ved sentrifugering, ble konsentrert og tørret under redusert trykk. Man fikk således et gulaktig, hvitt pulver. 10 g of the raw product powder obtained by the method according to example 1 was dissolved in 1 liter of purified water. 20 g of diethylaminoethyl cellulose (DEAE cellulose) was added to the solution, and the solution was stirred for approx. 3 hours. Immediately thereafter was the solution suction filtered to give solid material. The solids were thoroughly washed with water and then stirred 2 times, each time for 30 minutes, with 50 ml of 0.IN sodium hydroxide aqueous solution to cause the substances absorbed in the DEAE cellulose to come out. The resulting liquid was adjusted to pH 8.0 using acetic acid, and a solution made by dissolving 100 mg of trypsin in 10 ml of water was added, and the whole was allowed to stand at 37°C for 24 hours. The solution was boiled for approx. 15 minutes to inactivate the trypsin. The solution was then placed in a cellophane tube and dialyzed for 72 hours at reduced pressure using water and the remaining liquid concentrate. The concentrated liquid was dissolved in a mixture of alcohol and hydrochloric acid containing 7 parts of ethanol and 3 parts of 0.1N hydrochloric acid, and the supernatant obtained by centrifugation was concentrated and dried under reduced pressure. A yellowish white powder was thus obtained.

EKSEMPEL 3 EXAMPLE 3

Fra en frosset hannspermasetthval, 15 m lang, ble tatt 4,75 kg slimhinne fra den øvre tynntarm. Slimhinnen ble finhakket ved hjelp av en hakkemaskin, og det dobbelte volum vann ble tilsatt.. Oppløsningen ble kokt i ca. 30 minutter, fikk stå ved romtemperatur og ble deretter anbragt i et kaldt rom (5°C) From a frozen male sperm whale, 15 m long, 4.75 kg of mucosa was taken from the upper small intestine. The mucous membrane was finely chopped using a chopping machine, and twice the volume of water was added. The solution was boiled for approx. 30 minutes, allowed to stand at room temperature and then placed in a cold room (5°C)

i 16 timer. De faste stoffer ble deretter fraskilt under anvendelse åv en nylonduk for å gi en ekstraktvæske. Under om-røring av denne ekstraktvæske ble det langsomt tilsatt en opp-løsning inneholdende 950 mg benzoesyre oppløst i 1 liter aceton. Den resulterende væske ble omrørt i ytterligere 1 time og påny anbragt i et kaldt rom (5 C) i 16 txmer. for 16 hours. The solids were then separated using a nylon cloth to give an extract liquid. While stirring this extract liquid, a solution containing 950 mg of benzoic acid dissolved in 1 liter of acetone was slowly added. The resulting liquid was stirred for an additional 1 hour and again placed in a cold room (5°C) for 16 hours.

Det hvite bunnfall som ble dannet i ekstraktvæsken, The white precipitate that formed in the extract liquid,

ble deretter sugefiltrert under redusert trykk og vasket omhyggelig med vann. Bunnfallet ble deretter overført til et sentrifugalsepareringsrør og vasket 5 ganger med 500 ml aceton was then suction filtered under reduced pressure and washed thoroughly with water. The precipitate was then transferred to a centrifugal separation tube and washed 5 times with 500 ml of acetone

og 2 ganger med 300 ml eter inntil ikke mer benzoesyre kunne finnes. Etter tørring fikk man 26,16 g råprodukt. 10 g av råproduktet ble oppløst i 1 liter renset vann, og pH-verdien ble regulert til 8,0. En oppløsning inneholdende 100 mg trypsin oppløst i 10 ml vann ble tilsatt, og oppløsningen fikk stå i 24 timer ved 37°C. Trypsinet ble deretter inaktivert ved koking i ca. 15 minutter og avkjølt. 1 liter n-butanbl ble tilsatt, and 2 times with 300 ml of ether until no more benzoic acid could be found. After drying, 26.16 g of crude product was obtained. 10 g of the crude product was dissolved in 1 liter of purified water, and the pH value was adjusted to 8.0. A solution containing 100 mg of trypsin dissolved in 10 ml of water was added, and the solution was allowed to stand for 24 hours at 37°C. The trypsin was then inactivated by boiling for approx. 15 minutes and cooled. 1 liter of n-butanebl was added,

og det hele ble ristet. Ved hj"elp av sentrifugalseparering ble. and it was all shaken. With the help of centrifugal separation,

en vannfase på buniien oppsamlet og deretter konsentrert til 200 an aqueous phase on the bunii collected and then concentrated to 200

ml under redusert trykk. Et raffinert mukoproteinpulver ble erholdt ved frysetørrihg. ml under reduced pressure. A refined mucoprotein powder was obtained by freeze-drying.

EKSEMPEL 4 EXAMPLE 4

25 g råprodukt fremstilt på samme måte som i eksempel 25 g of raw product prepared in the same way as in the example

3 ble oppløst i 500 ml vann, og oppløsningen ble regulert til pH 7,0 under anvendelse av ammoniakk. Oppløsningen ble der- 3 was dissolved in 500 ml of water, and the solution was adjusted to pH 7.0 using ammonia. The solution was there-

etter kokt i ca. 5 minutter ved 100°C, avkjølt og omrørt i ca. after cooking for approx. 5 minutes at 100°C, cooled and stirred for approx.

4 timer. 4 hours.

Etter henstand' natten over ble et bunnfall skilt fra. denne væske ved sentrifugalseparering, og 1 liter vann'med pH-verdi 7,0 ble tilsatt. Etter den samme prosess som i eksempel 3 ble væsken delt i bunnfall og filtrat, og filtratet ble satt til det foregående filtrat. Filtratet ble deretter regulert til pH 4,0 under anvendelse av eddiksyre, kokt i ca. 5 minutter, avkjølt og deretter sentrifugalseparart. Det på denne måte dannede bunnfall ble vasket med 100 ml eddiksyreoppløsning med en pH After standing overnight, a precipitate was separated. this liquid by centrifugal separation, and 1 liter of water with a pH value of 7.0 was added. Following the same process as in example 3, the liquid was divided into precipitate and filtrate, and the filtrate was added to the previous filtrate. The filtrate was then adjusted to pH 4.0 using acetic acid, boiled for approx. 5 minutes, cooled and then centrifugally separated. The precipitate formed in this way was washed with 100 ml of acetic acid solution of a pH

på 4,0. Ved å blande den vaskede væske med det foregående filtrat og ved lyofilisering av blandingen fikk man et aktivt stoff. of 4.0. By mixing the washed liquid with the previous filtrate and by lyophilizing the mixture, an active substance was obtained.

10 g av dette stoff ble deretter oppløst i 1 liter 10 g of this substance was then dissolved in 1 litre

renset vann og raffinert ved fremgangsmåten ifølge eksempel 3 purified water and refined by the method according to example 3

for å gi et raffinert mukoprotein. to yield a refined mucoprotein.

EKSEMPEL 5 EXAMPLE 5

Et råprodukt fremstilt på samme måte som i eksempel 3 A raw product prepared in the same way as in example 3

ble oppløst i 10 volummengder vann. En mettet oppløsning av ammoniumsulfat-ble tilsatt ved 20°C, og pH-verdien ble regulert til 7,0 slik at man fikk en åmmoniumsulfatkonsentrasjon på 50% ammoniumsulfat-metning. Oppløsningen fikk stå natten over i et 20°C termostatregulert rom og ble sentrifugert for å utvinne et was dissolved in 10 volumes of water. A saturated solution of ammonium sulphate was added at 20°C, and the pH value was adjusted to 7.0 so that an ammonium sulphate concentration of 50% ammonium sulphate saturation was obtained. The solution was allowed to stand overnight in a 20°C thermostatically controlled room and was centrifuged to recover a

bunnfall og en væske på toppen. Bunnfallet ble vasket i vann og ble deretter dLalysert ved 4°C under anvendelse av en cellofan-membran i 48 timer. Det indre dialysat ble lyofilisert, og man fikk et aktivt stoff. 10 g av dette stoff ble behandlet som beskrevet i eksempel 3, og man fikk et raffinert mukoprotein. sediment and a liquid on top. The precipitate was washed in water and then lysed at 4°C using a cellophane membrane for 48 hours. The inner dialysate was lyophilized, and an active substance was obtained. 10 g of this substance was treated as described in example 3, and a refined mucoprotein was obtained.

EKSEMPEL 6 EXAMPLE 6

2.500 g mave-slimhinne ble finhakket og tilsatt det dobbelte volum vann. Etter koking i 30 minutter ble ekstrahering foretatt. Etter avkjøling ble væsken filtrert, og residuet ble igjen blandet med det dobbelte volum vann og kokt i 30 minutter. Begge ekstraktvæsker ble kombinert med residuet og fikk stå natten over ved 5°C. Deretter ble den blandede væske filtrert. En oppløsning dannet ved å oppløse 500 mg benzoesyre i 1 liter aceton, ble satt til filtratet under omrøring. Omrøring ble fortsatt i 5 timer, og væsken fikk stå natten over ved 5°C. Bunnfallet ble sentrifugert, vasket med 5 1 vann, 5 1 aceton og 1 1 eter suksessivt og deretter lufttørret. Man fikk således 20 g råprodukt. 2 1 vann ble satt til 20 g av råproduktet, og pH-verdien ble regulert til 7,0. Væskefasen ble fraskilt ved sentrifugering, og 2 1 av en mettet åmmoniumsulfatoppløsning ble tilsatt. Opp-løsningen fikk deretter stå natten over ved 5°C og ble sentrifugert for å gi et annet bunnfall. Dette bunnfall ble igjen vasket med 500 ml mettet ammoniumsulfatoppløsning. Bunnfallet ble deretter oppløst i 500 ml vann og trykkfiltrert. Trykk-filtreringen utføres ved å anbringe 250 ml av oppløsningen i en beholder med en diamter på 76 mm og et indre volum på 400 ml. Oppløsningen omrøres ved hjelp av en magnetisk rører og filtrering utføres ved en gjennomsnittlig strømningshastighet på 50 ml pr. time under anvendelse av en "UM-2" membran-type. Et trykk på o 7 kg/cm 2 ble anvendt under anvendelse av en kompressor. Da residuet var redusert til ca. 50 ml, ble ytterligere 2 50 ml 2,500 g of gastric mucosa was finely chopped and twice the volume of water was added. After boiling for 30 minutes, extraction was carried out. After cooling, the liquid was filtered, and the residue was again mixed with twice the volume of water and boiled for 30 minutes. Both extract liquids were combined with the residue and allowed to stand overnight at 5°C. Then the mixed liquid was filtered. A solution formed by dissolving 500 mg of benzoic acid in 1 liter of acetone was added to the filtrate with stirring. Stirring was continued for 5 hours, and the liquid was allowed to stand overnight at 5°C. The precipitate was centrifuged, washed with 5 1 water, 5 1 acetone and 1 1 ether successively and then air dried. Thus, 20 g of crude product was obtained. 2 1 of water was added to 20 g of the crude product, and the pH value was adjusted to 7.0. The liquid phase was separated by centrifugation, and 2 l of a saturated ammonium sulfate solution was added. The solution was then allowed to stand overnight at 5°C and was centrifuged to give another precipitate. This precipitate was again washed with 500 ml of saturated ammonium sulphate solution. The precipitate was then dissolved in 500 ml of water and pressure filtered. The pressure filtration is carried out by placing 250 ml of the solution in a container with a diameter of 76 mm and an internal volume of 400 ml. The solution is stirred using a magnetic stirrer and filtration is carried out at an average flow rate of 50 ml per minute. hour using a "UM-2" membrane type. A pressure of o 7 kg/cm 2 was applied using a compressor. When the residue was reduced to approx. 50 ml, another 2 became 50 ml

av den ovennevnte oppløsning tilsatt og filtrert på samme måte. Da residuet var redusert til 50 ml, ble 100 ml renset vann tilsatt for ytterligere konsentrering til 50 ml. Etter fryse-tørring av residuet fikk man 11,8 g mukoprotein-råprodukt. 10 g av mukoprotein-råproduktet ble satt til 1000 ml vann, og opp-løsningen ble regulert til pH 8,0. En oppløsning inneholdende of the above solution added and filtered in the same manner. When the residue was reduced to 50 ml, 100 ml of purified water was added to further concentrate to 50 ml. After freeze-drying the residue, 11.8 g of mucoprotein crude product was obtained. 10 g of the mucoprotein raw product was added to 1000 ml of water, and the solution was adjusted to pH 8.0. A resolution containing

100 mg trypsin ble oppløst i 10 ml vann og ble holdt i 24 timer ved 3 7°C. Oppløsningen ble kokt i 15 minutter for ~å inaktivere trypsinet og ble deretter trykkfiltrert under anvendelse av en fornettet dek s tran-membran ("UM-2") og med en gjennomsnittlig strømningshastighet på 120 ml/time. Etter påfølgende lyofilisering fikk man 0,3 72 g raffinert mukoprotein. Utbyttet av mukoproteinet fra mave-slimhinnen var 0,18 g/kg. 100 mg of trypsin was dissolved in 10 ml of water and was kept for 24 hours at 37°C. The solution was boiled for 15 minutes to inactivate the trypsin and was then pressure filtered using a cross-linked dextran membrane ("UM-2") and at an average flow rate of 120 ml/hr. After subsequent lyophilization, 0.372 g of refined mucoprotein was obtained. The yield of the mucoprotein from the gastric mucosa was 0.18 g/kg.

EKSEMPEL 7 EXAMPLE 7

1.650 g tynntarm-slimhinne ble behandlet som beskrevet i eksempel 6. Det ble erholdt 3,45 g mukoprotein som ble behandlet med trypsin. Etter påfølgende trykkfiltrering under anvendelse av en membran av "UM-1" typen og ved en gjennomsnittlig strøm-ningshastighet på 100 ml/time fikk man 0,85 g raffinert mukoprotein . 1,650 g of small intestinal mucosa was treated as described in example 6. 3.45 g of mucoprotein was obtained which was treated with trypsin. After subsequent pressure filtration using a membrane of the "UM-1" type and at an average flow rate of 100 ml/hour, 0.85 g of refined mucoprotein was obtained.

Claims

Process for the production of a mucoprotein from the mucosal coating from the stomach or small intestine of a mammal, which mucoprotein contains 35-55% protein and 3-15% hexose, and has a mucus-secreting and anti-ulcer effect, characterized by the mucosa being finely chopped, the finely chopped mucosa is extracted with water, an aqueous solution of dilute alcohol or an aqueous solution of dilute acid, benzoic acid or ammonium sulfate is added to the extract, the precipitate is collected and dissolved in water, and the solution is treated with trypsin for approx. one day at approx. 37°C, the low molecular impurities are removed by an extraction with a lower alkyl alcohol, by dialysis or by pressure filtration using a cross-linked dextran membrane through which gel-like compounds with a molecular weight above 1000 cannot pass, after which the purified solution is lyophilized.