RU2696289C1 - Method of producing lucerne trypsin inhibitor - Google Patents

Method of producing lucerne trypsin inhibitor Download PDF

Info

Publication number
RU2696289C1
RU2696289C1 RU2018142347A RU2018142347A RU2696289C1 RU 2696289 C1 RU2696289 C1 RU 2696289C1 RU 2018142347 A RU2018142347 A RU 2018142347A RU 2018142347 A RU2018142347 A RU 2018142347A RU 2696289 C1 RU2696289 C1 RU 2696289C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
inhibitor
trypsin inhibitor
lucerne
trypsin
sodium chloride
Prior art date
Application number
RU2018142347A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Елена Борисовна Артюшкова
Юрий Васильевич Фурман
Николай Иванович Жеребилов
Михаил Юрьевич Смахтин
Михаил Петрович Гладченко
Александр Васильевич Аниканов
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации filed Critical Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority to RU2018142347A priority Critical patent/RU2696289C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2696289C1 publication Critical patent/RU2696289C1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

FIELD: manufacturing technology.
SUBSTANCE: invention relates to a method of producing a lucerne trypsin inhibitor. A method for producing a lucerne trypsin inhibitor by way of thermal coagulation of juice obtained from a vegetal mass of lucerne, affine chromatography on a specific sorbent, wherein purification of the lucerne trypsin inhibitor is carried out in one step, for this purpose, the brown juice is placed into a container with a mixer and a sorbent trypsin-sepharose is added to the container, then content is mixed, pigments and nonspecific bound proteins are removed by washing with water and acetate buffer with 0.3 M sodium chloride, inhibitor desorption is carried out with 0.15 M acetate buffer solution with 0.3 M sodium chloride, fine purification of the inhibitor is carried out by gel filtration on sephadex G-75, then the inhibitor is precipitated with ammonium sulphate to saturation of 70 % with subsequent centrifugation and subjected to dialysis through a semipermeable membrane against water with 0.3 M sodium chloride, obtained trypsin inhibitor is frozen and dried in a lyophilic drier under certain conditions.
EFFECT: method described above simplifies the method of producing the target product, reduces the time required for the preparation process and increases the degree of purification of the lucerne trypsin inhibitor.
1 cl

Description

Изобретение относится к способу получения ингибитора трипсина из люцерны посевной направленно на сокращение времени проведения процесса получения и увеличения степени очистки ингибитора трипсина из люцерны.The invention relates to a method for producing trypsin inhibitor from alfalfa inoculum aimed at reducing the time of the process of obtaining and increasing the degree of purification of trypsin inhibitor from alfalfa.

Известен способ получения ингибитора трипсина из люцерны А.С. СССР №1440924, заключающийся в связывании ингибитора трипсина из коричневого сока на аффинном сорбенте. Сорбент представляет собой поливиниловый спирт волокнистой структуры, предварительно активированный n-толуолсульфохлоридом и содержащим 47-60 мг трипсина на 1 г сухого сорбента, с последующей десорбцией целевого продукта.A known method of producing a trypsin inhibitor from alfalfa A.S. USSR No. 1440924, which consists in the binding of a trypsin inhibitor from brown juice on an affinity sorbent. The sorbent is a polyvinyl alcohol of fibrous structure, pre-activated with n-toluenesulfonyl chloride and containing 47-60 mg of trypsin per 1 g of dry sorbent, followed by desorption of the target product.

Недостатком известного способа является длительность проведения процесса получения и недостаточная степень очистки ингибитора трипсина, которая составила 150-159 раз.The disadvantage of this method is the length of the production process and the insufficient degree of purification of the trypsin inhibitor, which was 150-159 times.

Наиболее близким к заявленному является способ получения ингибитора трипсина А.С. СССР №1162081 [Новиков Ю.Ф., Новиков Н.Н., Соколова Е.В., Шаповал И.В., Пройдак Н.И., Любецкая Х.А., Сухинин В.Н., Маслова Н.Ф., Потапов Н.В.]. В соответствии с этим способом сок коричневого цвета, полученный из люцерны посевной, использовали для биоспецифической колоночной хроматографии, в колонке объемом 265 см3 (150×15). Всего использовали 17 порций сока общим объемом 4,2 литра.Closest to the claimed is a method of producing a trypsin inhibitor A.S. USSR No. 1162081 [Novikov Yu.F., Novikov N.N., Sokolova E.V., Shapoval I.V., Proydak N.I., Lyubetskaya H.A., Sukhinin V.N., Maslova N.F. ., Potapov N.V.]. In accordance with this method, brown juice obtained from seed alfalfa was used for biospecific column chromatography in a column of 265 cm 3 (150 × 15). A total of 17 servings of juice were used with a total volume of 4.2 liters.

Недостатком известного способа является многоэтапность и длительность проведения очистки ингибитора при проведении биоспецифической хроматографии, поскольку она проводилась в колонке с объемом 265 см3. Ограниченный объем колонки приводит к тому, что супернатант, полученный после центрифугирования, необходимо делить на 17 порций. Такое длительное и многоэтапное проведение операции очистки приводит к потерям продукта, снижению степени очистки и снижению активности ингибитора.The disadvantage of this method is the multi-stage and duration of purification of the inhibitor during biospecific chromatography, since it was carried out in a column with a volume of 265 cm 3 . The limited column volume causes the supernatant obtained after centrifugation to be divided into 17 portions. Such a long and multi-stage purification operation leads to product losses, a decrease in the degree of purification, and a decrease in inhibitor activity.

Технический результат изобретения - упрощение способа получения целевого продукта. Направленно на сокращение времени проведения процесса получения и увеличения степени очистки ингибитора трипсина из люцерны посевной.The technical result of the invention is the simplification of the method of obtaining the target product. It is aimed at reducing the time of the process of obtaining and increasing the degree of purification of the trypsin inhibitor from alfalfa.

Технический результат достигается тем, что очистку ингибитора трипсина из люцерны посевной проводят в один этап, в емкости с мешалкой с прибавлением сорбента. Сок коричневого цвета помещают в емкость с мешалкой и сюда же вносят сорбент трипсин-сефарозу, содержимое перемешивают в течение 10-15 минут, температуру в емкости поддерживают в диапазоне 36-38°С. Полноту связывания ингибитора трипсина определяют в отдельном опыте по величине активности трипсина. Пигменты и неспецифические связанные белки удаляют промыванием водой и ацетатным буфером с 0,3 М хлоридом натрия, рН раствора 7.The technical result is achieved by the fact that the cleaning of the trypsin inhibitor from alfalfa is carried out in one step, in a container with a stirrer with the addition of a sorbent. Brown juice is placed in a container with a stirrer, and trypsin-sepharose sorbent is added thereto, the contents are mixed for 10-15 minutes, the temperature in the container is maintained in the range of 36-38 ° С. The completeness of binding of the trypsin inhibitor is determined in a separate experiment by the value of the trypsin activity. Pigments and non-specific bound proteins are removed by washing with water and acetate buffer with 0.3 M sodium chloride, pH 7.

Десорбцию ингибитора осуществляют 0,15 М ацетатным буферным раствором с 0,3 М хлоридом натрия. Тонкую очистку ингибитора проводят методом гель-фильтрации на сефадексе G-75. Ингибитор осаждают сернокислым аммонием до насыщения 70% с последующим центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 15 минут и подвергают диализу через полупроницаемую мембрану против воды с 0,3 М хлоридом натрия. Полученный ингибитор трипсина замораживают и сушат в лиофильной сушилке.The desorption of the inhibitor is carried out with 0.15 M acetate buffer solution with 0.3 M sodium chloride. Thin purification of the inhibitor is carried out by gel filtration on Sephadex G-75. The inhibitor is precipitated with ammonium sulfate to a saturation of 70%, followed by centrifugation at 5000 rpm for 15 minutes and dialyzed through a semipermeable membrane against water with 0.3 M sodium chloride. The resulting trypsin inhibitor was frozen and dried in a freeze dryer.

Удельная активность полученного ингибитора трипсина составила 7,41±0,86 мг/мг белка, степень очистки 180-190 раз. Выход целевого продукта составил около 0,012-0,013 г из 1 килограмма исходного сырья.The specific activity of the obtained trypsin inhibitor was 7.41 ± 0.86 mg / mg protein; the degree of purification was 180-190 times. The yield of the target product was about 0.012-0.013 g from 1 kilogram of feedstock.

Осуществление заявленного способа поясняется следующим примером технологического процесса.The implementation of the claimed method is illustrated by the following example of a technological process.

Люцерну посевную в стадии бутонизации скашивают, измельчают при помощи измельчителя «Волгарь -5 А», отбирают 5 килограмм, далее из измельченной массы отжимают зеленый сок. В емкости, методом температурной коагуляции, нагревая сок до температуры 85°С, отделяют сопутствующие вещества, образовавшийся осадок осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 минут. Полученный раствор помещают в емкость объемом 8000 см3 для проведения сорбции, в нее вносят сорбент - трипсин-сефарозу, содержимое перемешивают в течение 10-15 минут, температуру раствора поддерживают в диапазоне 36-39°. Полноту связывания ингибитора трипсина определяют в отдельном опыте по активности трипсина. Пигменты и неспецифические связанные белки удаляют промыванием содержимого водой и ацетатным буфером с 0,3 М хлорида натрия, рН равна 7.The alfalfa sown in the budding stage is mowed, crushed using a Volgar-5 A grinder, 5 kilograms are taken, then green juice is squeezed out of the crushed mass. In the container, by temperature coagulation, heating the juice to a temperature of 85 ° C, the accompanying substances are separated, the precipitate formed is precipitated by centrifugation at 5000 rpm for 15 minutes. The resulting solution is placed in a container with a volume of 8000 cm 3 for sorption, a sorbent - trypsin-sepharose is added to it, the contents are mixed for 10-15 minutes, the temperature of the solution is maintained in the range of 36-39 °. The completeness of trypsin inhibitor binding is determined in a separate experiment by trypsin activity. Pigments and nonspecific bound proteins are removed by washing the contents with water and acetate buffer with 0.3 M sodium chloride, pH 7.

Десорбцию ингибитора осуществляют 0,15 М ацетатным буферным раствором с 0,3 М хлорида натрия. Ингибитор трипсина из полученного раствора осаждают сернокислым аммонием до насыщения 70% с последующим центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 15 минут. Тонкую очистку ингибитора проводят методом гель-фильтрации на сефадексе G-75. После очистки ингибитор подвергают диализу через полупроницаемую мембрану против воды с 0,3 М хлорида натрия. Полученный ингибитор трипсина замораживают и сушат в лиофильной сушилке.The desorption of the inhibitor is carried out with 0.15 M acetate buffer solution with 0.3 M sodium chloride. Trypsin inhibitor from the resulting solution is precipitated with ammonium sulfate to a saturation of 70%, followed by centrifugation at 5000 rpm, for 15 minutes. Thin purification of the inhibitor is carried out by gel filtration on Sephadex G-75. After purification, the inhibitor is dialyzed through a semipermeable membrane against water with 0.3 M sodium chloride. The resulting trypsin inhibitor was frozen and dried in a freeze dryer.

Выход целевого продукта составляет около 0,012 г из 1 килограмма исходного сырья, степень очистки 180-190 раз. Удельная активность полученного ингибитора трипсина составила 7,41±0,86 мг/мг белка.The yield of the target product is about 0.012 g from 1 kilogram of feedstock, the degree of purification 180-190 times. The specific activity of the obtained trypsin inhibitor was 7.41 ± 0.86 mg / mg protein.

Предлагаемая совокупность отличительных признаков (проведение процесса очистки в один этап в емкости с мешалкой, тонкая очистка ингибитора методом гель-фильтрации на сефадексе G-75, осаждение продукта сернокислым аммонием до насыщения 70% и диализ его через полупроницаемую мембрану) взамен многоэтапного способа получения ингибитора трипсина в колонке с объемом 265 см, включающий биоспецифическую очистку ингибитора трипсина в один этап, тонкую очистку методом гель-фильтрации, осаждение сернокислым аммонием, диализ и лиофильное высушивание готового продукта позволяет:The proposed set of distinctive features (carrying out the cleaning process in one step in a container with a stirrer, fine cleaning the inhibitor by gel filtration on Sephadex G-75, precipitating the product with ammonium sulfate to saturation 70% and dialyzing it through a semipermeable membrane) instead of a multi-stage method for producing trypsin inhibitor in a column with a volume of 265 cm, including biospecific purification of the trypsin inhibitor in one step, fine purification by gel filtration, precipitation with ammonium sulfate, dialysis and freeze drying the finished product, you can:

- упростить способ получения целевого продукта - ингибитора трипсина;- simplify the method of obtaining the target product is a trypsin inhibitor;

- увеличить степень очистки целевого продукта (степень очистки 180-190 раз) за счет проведения процесса биоспецифической сорбции в один этап и тонкой очистки методом гель-фильтрации с последующим осаждением сернокислым аммонием и лиофильной сушкой.- increase the degree of purification of the target product (degree of purification 180-190 times) due to the process of biospecific sorption in one step and fine purification by gel filtration, followed by precipitation with ammonium sulfate and freeze drying.

- получить целевой продукт с более высокой удельной активностью (удельная активность полученного ингибитора трипсина составляла 7,41±0,86 мг/мг белка).- to obtain the target product with a higher specific activity (the specific activity of the obtained trypsin inhibitor was 7.41 ± 0.86 mg / mg protein).

Claims (1)

Способ получения ингибитора трипсина из люцерны посевной путем температурной коагуляции сока, полученного из вегетативной массы люцерны, аффинной хроматографии на специфическом сорбенте, отличающийся тем, что очистку ингибитора трипсина из люцерны посевной проводят в один этап, при этом сок коричневого цвета помещают в емкость с мешалкой и сюда же вносят сорбент трипсин-сефарозу, затем содержимое перемешивают в течение 10-15 минут, температуру в емкости поддерживают в диапазоне 36-38°С, пигменты и неспецифические связанные белки удаляют промыванием водой и ацетатным буфером с 0,3 М хлоридом натрия, рН раствора 7, десорбцию ингибитора осуществляют 0,15 М ацетатным буферным раствором с 0,3 М хлоридом натрия, тонкую очистку ингибитора проводят методом гель-фильтрации на сефадексе G-75, далее ингибитор осаждают сернокислым аммонием до насыщения 70% с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 минут и подвергают диализу через полупроницаемую мембрану против воды с 0,3 М хлоридом натрия, полученный ингибитор трипсина замораживают и сушат в лиофильной сушилке.A method of producing trypsin inhibitor from alfalfa inoculum by temperature coagulation of juice obtained from the vegetative mass of alfalfa, affinity chromatography on a specific sorbent, characterized in that the cleaning of the trypsin inhibitor from alfalfa is inoculated in one step, while the brown juice is placed in a container with a stirrer and trypsin-sepharose sorbent is added here, then the contents are stirred for 10-15 minutes, the temperature in the container is maintained in the range of 36-38 ° C, pigments and non-specific bound proteins are removed by washing with water and an acetate buffer with 0.3 M sodium chloride, pH 7, the desorption of the inhibitor is carried out with 0.15 M acetate buffer solution with 0.3 M sodium chloride, the inhibitors are finely purified by gel filtration on Sephadex G-75, then the inhibitor is precipitated with ammonium sulfate to a saturation of 70%, followed by centrifugation at 5000 rpm for 15 minutes and dialyzed through a semipermeable membrane against water with 0.3 M sodium chloride, the resulting trypsin inhibitor was frozen and dried in a freeze dryer.
RU2018142347A 2018-11-29 2018-11-29 Method of producing lucerne trypsin inhibitor RU2696289C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018142347A RU2696289C1 (en) 2018-11-29 2018-11-29 Method of producing lucerne trypsin inhibitor

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018142347A RU2696289C1 (en) 2018-11-29 2018-11-29 Method of producing lucerne trypsin inhibitor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2696289C1 true RU2696289C1 (en) 2019-08-01

Family

ID=67586824

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018142347A RU2696289C1 (en) 2018-11-29 2018-11-29 Method of producing lucerne trypsin inhibitor

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2696289C1 (en)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1162081A1 (en) * 1983-07-08 1991-12-30 Центральный Научно-Исследовательский И Проектно-Технологический Институт Механизации И Электрификации Животноводства Южной Зоны Ссср Method of extracting trypsin inhibitor
RU2524668C1 (en) * 2013-05-06 2014-07-27 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Астраханская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО АГМА Минздрава России) Method for recovery of sperm-specific human antitrypsin
US20140295004A1 (en) * 2002-01-25 2014-10-02 Akzo Nobel Surface Chemistry Llc Bioactive botanical cosmetic compositions and processes for their production
RU2626541C2 (en) * 2008-04-30 2017-07-28 Ксилеко, Инк. Processing of biomass
CN108059671A (en) * 2018-02-07 2018-05-22 中国农业科学院植物保护研究所 A kind of alfalfa trypsin inhibitor MT-mth2-36p5 and its encoding gene and application

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1162081A1 (en) * 1983-07-08 1991-12-30 Центральный Научно-Исследовательский И Проектно-Технологический Институт Механизации И Электрификации Животноводства Южной Зоны Ссср Method of extracting trypsin inhibitor
US20140295004A1 (en) * 2002-01-25 2014-10-02 Akzo Nobel Surface Chemistry Llc Bioactive botanical cosmetic compositions and processes for their production
RU2626541C2 (en) * 2008-04-30 2017-07-28 Ксилеко, Инк. Processing of biomass
RU2524668C1 (en) * 2013-05-06 2014-07-27 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Астраханская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО АГМА Минздрава России) Method for recovery of sperm-specific human antitrypsin
CN108059671A (en) * 2018-02-07 2018-05-22 中国农业科学院植物保护研究所 A kind of alfalfa trypsin inhibitor MT-mth2-36p5 and its encoding gene and application

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104152519B (en) A kind of preparation method of enzyme dissolubility high-purity superhelix NTx albumen
CN107532191B (en) Preparation method of broccoli protein peptide, prepared broccoli protein peptide and application thereof
WO2013131494A1 (en) Method for producing low-ash poultry plasma protein powder by utilizing poultry blood
CN110272934A (en) The extracting method and its application of endothelium corneum gigeriae galli small-molecular peptides
CN104039164A (en) Rice-protein composition and method for manufacturing same
WO2017005134A1 (en) Preparation method and use of linseed polysaccharide having antiviral and immunological activity
JP4416188B2 (en) Method for isolating proteinase inhibitor protein from potato tubers
RU2696289C1 (en) Method of producing lucerne trypsin inhibitor
CN101333245B (en) Method for separating human serum albumin
CN104877007B (en) Yak milk lactalbumin source ACE inhibitor peptides and preparation method thereof
US11834481B1 (en) Salty taste enhancing peptide derived from dry-cured ham and preparation method thereof
CN112521487A (en) Improved production process of human serum albumin
CN110183550A (en) A kind of preparation process of refined heparin sodium
CN116813711A (en) Jerusalem artichoke peptide capable of reducing blood sugar and resisting oxidization, preparation method and application thereof
KR101437259B1 (en) Sequential Separation of Lysozyme and Ovalbumin from Chicken Egg White
JPS58500737A (en) Method for isolating proteins from plant leaves
EP1526116A1 (en) Method for the isolation of biologically active substances from by-product or waste flows, and biologically active substances obtained therefrom
CN104356231B (en) A kind of effective method for removing human immunoglobulin(HIg) polymer
RU2483565C2 (en) Method for production of modified protein isolate of sunflower press cake
JPH03279396A (en) Rhodophyceae lectin and production thereof
SU411867A1 (en)
WO2017190396A1 (en) Method for preparing α-1,6-glucan
JPH0499448A (en) Oil seed-derived protein
SU875660A1 (en) Process for preparing proteinaceous food jellies
JPH0356500A (en) Extraction of egg yolk phosvitin

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20201130