-
Verfahren zur Gewinnung von Chorion-Hormon Schon seit dem Jahre 1927
ist bekannt, daß die die Keimdrüsen stimulierenden Hormone des Hypophyeenvorderlappens
sich im Blut schwangerer Frauen etwa vom Beginn des ersten- Schwangerschaftsmonats
vorfinden. Bald darauf wurde bekannt, daß dieselben Hormone auch in den männlichen
und weiblichen Keimdrüsen, in Plazenten und im Blut von schwangeren und trächtigen
Säugetieren, z. B. trächtigen Stuten, vorkommen. Diese Hormone wurden durch iein@e
Anzahl von Namen gekennzeichnet, im allgemeinen als eine dem Hypophysenvorderlappen
ähnlich wirkende Substanz und neuerdings als gonadotropes Chorion-Horman. Die vorliegende
Erfindung betrifft die Abtrennung eines solchen Chorion-Hormons in hochgereinigtem
Zustande aus Organen, Körperflüssigkeiten u. a. von Säugetieren, welche dieses Hormon
enthalten. Das beanspruchte Verfahren besteht darin, daß man das Ausgangsmaterial
in mehrere flüssige Phasen überführt, von denen die eine eine den Wirkstoff enthaltende
wäßrige Phase ist `und eine andere ein Gel darstellt, welches proteinartige Verunreinigungen
in loser molekularer Bindung mit einer indifferenten, mit Wasser nicht mischbaren
Substanz enthält. Diese lose molekulare Bindung muß hinreichend fest sein, um durch
Zentrifugieren nicht in ihre Bestandteile zerlegt zu werden.
Es
handelt sich also um ein Schaumausschüttelungsverfahren. In der Patentschrift 684:256
ist bereits vorgeschlagen worden, das thyreotrope und das gonadotrope Hypophysenvorderlappenhormon
aus Serum mittels des Schaumausschüttelungsverfahrens von den begleitenden Eiweißstoffen
abzutrennen. Nach der amerikanischen Patentschrift 2:2o?, o29 erhält man nach dem
gleichen Verfahren aus dem Serum trächtiger Stuten ein Gemisch der gonadotropen
und thyreotropen Hormone.
-
Erfindungsgemäß erhält - man nun das Chorion-Hormon an sich in recht
reiner Form aus Körperflüssigkeiten oder Organextrakten durch das Schaumausschüttelungsverfahren,
wenn man die das Hormon enthaltenden Flüssigkeiten bei saurer Reaktion, zweckmäßig
unterhalb p$ 5, verwendet.
-
Zweckmäßig wird ein geeigneter wäßriger Extrakt, der das Chorion-Hormon
enthält, bis zu einem p$ von mindestens 5 angesäuert und mit einer indifferenten,
mit Wasser nicht mischbaren organischen Flüssigkeit geschüttelt, worauf man die
iv äßrige Phase von den anderen erhaltenen Schichten abtrennt und das Chorion-Hormon
aus dieser wäßrigen Phase nach an sich bekannten Verfahren isoliert. Unter indifferenten,
mit Wasser nicht mischbaren organischen Flüssigkeiten werden neutrale organische,
mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeiten verstanden, welche bei Berührung mit Wasser
eine Grenzfläche und mit Protein ein Gel bilden. Die Löslichkeit der mit Wasser
nicht mischbaren Flüssigkeit in Wasser soll vorzugsweise nicht weniger als 5 % und
nicht mehr als io 1/o betragen. jedoch kann die Löslichkeit auch größer sein und
doch können befriedigende Ergebnisse erhalten werden, wenn nur die organische Flüssigkeit
. mit Wasser eine deutliche Trennschiebt @ ergibt. Eine besonders geeignete Flüssigkeit
dieser Art ist Chloroform, doch können auch andere Verbindungen, wie Methylenchlorid,
Cyclohexanon. Amylalkohol, Dichloräthylen und Äthylenchlorid oder Mischungen derselben
miteinander, beispielsweise von Chloroform und Amylalkohol Verwendung finden.
-
Vorzugsweise läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren so ausführen,
daß man aus Blut trächtiger Säugetiere. welches das Chorion-Hormon enthält, in an
sich bekannter Weise einen wäßrigen Auszug herstellt. Dieser wäßrige Auszug wird
auf ein pH von mindestens 5, vorzugsweise von P114 eingestellt und mit der Hälfte
seines Volumens einer indifferenten, mit Wasser nicht mischbaren organischen Flüssigkeit
geschüttelt, zweckmäßig in Gegenwart eines Salzes in einer Menge, die ausreicht,
die zur Gel-Bindung erforderliche elektrische Ladung zu schaffen, die aber nicht
ausreicht, um die anschließende Phasenbildung zu verhindern oder zu beeinträchtigen.
Danach wird die wäßrige, #das Chorion-Hormon enthaltende Schicht abgetrennt und
die Behandlung mit Chloroform mindestens noch einmal wiederholt. bevor inan das
Chorion-Hormon aus der wäßrigen Schicht abscheidet.
-
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern: Beispiel 1,2
kg eines mit Aceton hergestellten Trockenpulvers aus Serum, erhalten aus dein Blut
trächtiger Stuten, werden 5 Stunden mit 81 Wasser unter Zusatz eines zur Herstellung
eines p$ von 8,5 erforderlichen Volumen 2o°/oiger Natronlauge extrahiert. Nachdem
man die Mischung eine halbe Stunde zentrifugiert hat, wird die Lösung vorn Unlöslichen
dekantiert und sofort stark gekühlt. Der nach dein Dekantieren hinterbleibende Rückstand
wird noch dreimal mit je etwa 41 Wasser je i Stunde extrahiert. Der wäßrige Extrakt
wird jeweils vom Unlöslichen getrennt und wie der erste Extrakt gekühlt; dann werden
dieExtrakte vereinigt unddurchZugabeeiner ausreichenden Menge von Essigsäure auf
PH 3,8 bis 4,0 gebracht. Die vereinigten Extrakte -,werden 21/.# Stunden finit der
Hälfte ihres Volumens an Chloroform und 300 ccm Amylalkohol geschüttelt;
dann läßt man das Ganze bei einer Temperatur von höchstens 20° stehen.
-
Die obere wäßrige Schicht, welche das Chorion-Hormon enthält, wird
von der entstandenen Chloroform-Gel-Schicht durch Zentrifugieren und Dekantieren
getrennt. Durch Zugabe einer ausreichenden Menge 2oo/oiger ,\ atronlauge wird sie
sofort auf i pH von etwa 6 eingestellt, wobei man ebenfalls eine Temperatur von
höchstens 20° nicht überschreitet.
-
Die abgetrennte Chloroforrnschicht, welche aus dem Gel und einer flüssigen
Chloroformphase besteht, wird i Stunde mit 3 1 Wasser, 30 cein Amylalkohol
und 5o ccm einer 3oo/oigen Natriumsulfatlösung geschüttelt, um die letzten Reste
des Choriori-Hormons zu gewinnen, die sich etwa noch in der Chloroformschicht befinden.
Nach dem Zentrifugieren und Dekantieren wird die erhaltene wäßrige Schicht mit der
oben beschriebenen zuerst abgetrennten wäßrigen Schicht vereinigt, wobei man ein
Gesamtvolumen von durchschnittlich etwa 181 erhält. Die vereinigten wäßrigen Schichten
werden nach Zugabe von i o/o Natriumacetat, berechnet auf das Gesamtvolumen, mit
dem 51/=fachen ihres Volumens an mit io o/o Aceton vergällten Alkohol versetzt.
Falls nötig, wird das pu
erneut auf etwa 6,5 eingestellt. Man erhält
eine Füllung, die unter anderem auch das Chorion-Hormon enthält. Man läßt die Fällung
einige Stunden absetzen, dekantiert die überstehende alkoholische Lösung vom Niederschlag
und zentrifugiert den Niederschlag. Der beim Zentrifugieren erhaltene feste Rückstand
wird mit Aceton aufgerührt, abgesaugt und mit Aceton und Äther getrocknet. Schließlich
trocknet man die erhaltene Fällung im Exsikkator über Schwefelsäure. Man erhält
so etwa ioo g feste Substanz, die etwa 83 0/0 der Wirksamkeit des Ausgangsmaterials
enthält. Der bei Extraktion mit wäßrig-alkoho-Tischen Lösungen unlöslich gebliebene
Anteil beläuft sich im trockenen Zustande auf etwa 5o bis 85o g und enthält noch
etwa io.% der physiologischen Wirksamkeit des Ausgangsinaterials. Das. getrocknete
Chloroform-Gel wiegt etwa i8o g und enthält nur a 0/0 oder noch weniger an physiologischer
Wirksamkeit. 97 bis 99 0/0 der Proteine, die in dem Ausgangsmaterial enthalten waren,
werden durch diese Chloroformbehandlung entfernt. Diese fast völlige Entfernung
der Proteine allein durch eine einmalige Chloroformbehandlung steht in scharfem
Gegensatz zu der nur teilweisen Entfernung, die durch Chloroformbehandlung bei nichtsaurer
Reaktion erhalten wird.
-
Die das Chorion-Hormon enthaltende Fraktion besteht zu 9o bis 95 0%
aus Natriumsulfat, woraus hervorgeht, daß die Proteine durch die Chloroformbehandlung
zn mehr als 99 % entfernt wurden. Das Natriumsulfat läßt sich weitgehend durch Dialyse
der wäßrigen Lösung durch eine Membran aus regenerierter Cellulose entfernen. Eine
geringe Salzmenge wird jedoch absichtlich für eine anschließende zweite Chloroformbehandlung
im Präparat belassen.
-
Nach der Dialyse wird die Lösung auf ein pii von 3,8 bis q. durch
Zugabe der erforderlichen Menge von Essigsäure eingestellt und die angesäuerte Lösung
z Stunden mit der Hälfte ihres Volumens an Chloroform unter Zusatz von Amylalkohol
je Liter geschüttelt. Nachdem man durch Zentrifugieren und Dekantieren die Chloroformschicht
abgetrennt hat, wird die wäßrige Schicht auf pii 5 neutralisiert, das abgetrennte
Chloroform und die Gelschicht erneut mit a5o ccm Wasser i Stunde geschüttelt. Die
abgetrennten wäßrigen Schichten werden schließlich vereinigt und bei einem pg von
etwa 6 mit dem Sechsfachen ihres Volumens an Alkohol in Gegenwart von 2 0% Natriumacetat,
berechnet auf das Gesamtvolumen, behandelt. Nachdem man das Absitzen und das Zusammenballen
der erhaltenen Fällung abgewartet hat, trennt man diese durch Zentrifugieren und
Filtration 11 ab. Die so erhaltene Fällung wiegt etwa 5 bis 6,-, und enthält rund
6ooo Evans-Einheiten, während das Ausgangsmaterial etwa 30 Evans-Einheiten
je Gramm enthielt. 98 0/0 der physiologischen Wirksamkeit der ersten Fraktion werden
durch die zweite Chloroformbehandlung wiedergewonnen.
-
Die Fraktion, die man durch die zweite Chloroformbehandlung gewonnen
hat, wird nochmals wie zuvor behandelt, mit anderen Worten, dialysiert und darauf
mit Chloroform geschüttelt. An Stelle der-Fällung der erhaltenen vereinigten wäßrigen
Schichten mit Alkohol, wird die Fällung nun in zwei Stufen vorgenommen. In der ersten
Stufe der Fällung wird das pg der vereinigten wäßrigen Schichten zierst auf 7,5
bis 8 eingestellt und dann 473 des Volumens an 95o%igem Alkohol und 2,5 % Natriumacetat,
berechnet auf das Gesamtflüssigkeitsvolumen, zugefügt. Die erhaltene Fällung wird
nach mehrstündigem Absitzen bei einer Temperatur von höchstens ao° durch Zentrifugieren
abgetrennt. Die klare überstehende Flüssigkeit gibt eine weitere Fällung, wenn man
mehr Natriumacetat hinzufügt und sorgfältig Temperaturerhöhung vermeidet. Die. abgetrennte
Fällung wird zweimal mit 60%0igem Alkohol, der 2i/2 0/0 Natriumacetat enthält, gewaschen.
Nach dem Zentrifugieren werden die so erhaltenen Waschflüssigkeiten mit der ersten
überstehenden Lösung vereinigt. In der zweiten Stufe der Fällung werden die vereinigten
Lösungen, die von der ersten Fällung stammen, auf pg 6 durch Zugabe der erforderlichen
Menge Essigsäure eingestellt. Dann fügt man das doppelte Volumen an Alkohol und
i % Natriumacetat, berechnet auf das Gesamtflüssigkeitsvolumen, hinzu. Man läßt
mehrere Stunden bei einer Temperatur von nicht über 2o° stehen, zentrifugiert die
entstandene Fällung ab, wäscht mehrere Male mit Alkohol und trocknet mit Aceton
und Äther. Das so erhaltene Chorion-Hormon liegt nun in reinem Zustande vor und
zeigt eine Wirksamkeit von rund i3000oEvans-Einheiten je Gramm. Es ist ein weißes,
geruch= und geschmackloses Pulver. vollständig löslich in 6o%igem Alkohol, der 21/2
% Natriumacetat enthält, in 6o0%igem Aceton und allgemein in mit Wasser mischbaren
organischen Flüssigkeiten. Es ist unlöslich in Chloroform, Äther und Petroläther.
Mit Pikrinsäure oder basischem Bleiacetat gibt es keinen Niederschlag. Die Probe
auf Eiweiß mittels Sulfosalicvlsäure und ähnlichen Eiweißreagenzien fällt negativ
aus, ebenso die Reaktion auf Cystin. Das Chorion-Hormon ist also frei von Eiweißstoffen,
selbst solchen vom Typus der Serummucoide und frei von jeder anaphylaktischen Wirkung
bei
Anwendung am- Menschen, selbst in Dosen von ioo Evans-Einheiten.
Es hat ein definiertes Absorptionsspektrum, aber keinen scharfen Schmelzpunkt: es
enthält 9,80/, Stickstoff und ähnelt in seinem Verhalten mehr einem Protein voin
Typ der Seruminucoide als einem wahren Protein. Offenbar sind in seinem Molekül
ein Proteinrest, Aminohexosegruppen, Hexosegruppen und Acetylgruppen enthalten.
Das Verhältnis vom Aminohexosestickstoff zum Gesamtstickstoff beträgt etwa- i :
12,3- Wahrscheinlich ist die Aminohexosegruppe an eine Hexosegruppe gebunden
und in bezug auf das Gesamtmolekül sind wahrscheinlich j e zwei Acetylgruppen in
den Aminohexosegruppen vorhanden. Diese Acetylgruppen befinden sich entweder beide
an den Aminohexosegruppen, es kann aber auch eine von ihnen an die Aminogruppe der
Aniitioliexose gebunden sein.
-
Beispiel e 21,51.- frische Pferdeplazenten, die insgesamt eine physiologische
Wirksamkeit von 43oo Ratteneinheiten aufweisen, werden fein zerkleinert und durch
Schütteln mit 215 ccm Wasser, das durch Zusatz von Natronlauge auf PH 8,5 gebracht
war, 3 Stunden extrahiert. Nach Dekantieren des wäßrigen Extraktes wird das Material
noch zweimal mit je 107 ccm Wasser jeweils 3 Stunden extrahiert.
-
Die vereinigten wäßrigen Extrakte werden durch Zugabe der benötigten
Menge 2 n Schwefelsäure auf i px von etwa 3,9 eingestellt. Der angesäuerteExtrakt
wirda Stunden mit dem gleichen Volumen Äthylenchlorid geschüttelt. Dabei bildet
sich ein Gel. Nach dem Zentrifugieren wird die wäßrige Schicht vom Gel und der Äthylenchloridscliicht
abgetrennt und nach dem Neutralisieren mit 2o'/,i,-er- Natronlauge mit dem 6fachen
\'olumen Alkohol, der eine geringe Menge Natriumacetat enthält, versetzt, wobei
sich eine Fällung bildet. die das Chorion-Hormon enthält. Die Mischung wird dann
abgekühlt, nach einigem Stehen wird die Fällung abgetrennt und, wie im Beispiel
i angegeben,, getrocknet. Man erhält so 5oo mg eines Materials, das nach der Auswertung
8ooo Ratteneinheiten je Gramm enthält.
-
Das trockene Pulver wird nach Lösung in ccm Wasser in eine Dialysierhülse
aus regenerierter Cellulose gebracht und 12 Stunden gegen fließendes Wasser dialysiert.
Nach 6stündiger Dialyse wird der Hülseninhalt mit einem 6fachen Volumen Alkohol,
der eine geringe Menge Natriumacetat enthält, versetzt, wobei das Chorion-Hormon
ausfällt. Man erhält etwa 45 mg eines weißen Pulvers mit 82 ooo Ratteneinheiten
je Gramm. Wenn die Behandlung mit Äthvlenclilorid und auch die "'#,ll:oholfällung,
wie im Beispiel i beschrieben, zweimal durchgeführt werden, erhält man ein Produkt
von Eigenschaften, die im Beispiel i beschrieben sind.
-
Beispiel 3 5oo cctn Serum schwangerer Frauen, die 1% Natriumcitrat
und nach der Auswertung 5ooo Einheiten enthalten, werden durch Zugabe einer hinreichenden
Menge Essigsäure auf PH 3,9 eingestellt und i Stunde mit 5oo ccm Chloroform und
2o ccm Cycloliexanon geschüttelt. Dabei entsteht ein Gel. Nach dem Zentrifugieren
wird die wäßrige Schicht von der Chlorofornischicht und dem Gel abdekantiert und
filtriert. Man gibt das 6fache Volumen Alkohol, der eine geringe Menge Natriumacetat
enthält, zum Filtrat hinzu und kühlt die Mischung dann ab. Nach einigen Stunden
wird die klare überstehende Flüssigkeit von der erhaltenen Fällung abdekantiert
und die Fällung zentrifugiert. Nachdem man sie durch Behandlung mit Aceton und Äther
getrocknet hat, erhält man i78 mg eines Pulvers, welches das Chorion-Hormon enthält
und insgesamt 4800 Einheiten oder 27 000 Einheiten je Gramm an physiologischer
Wirksamkeit aufweist. Das so erhaltene Pulver wird in 5 ccm Wasser gelöst, das PH
auf 3,8 eingestellt und die saure Lösung mit 5 cctn Chloroform geschüttelt. Nach
dem Zentrifugieren trennt man die wäßrige Schicht von der Chloroformschicht und
dem Gel ab und versetzt sie mit 30 ccm Alkohol, der eine kleine Menge Natriumacetat
enthält. Die Fällung, welche das Chorion-Hornion enthält, wird nach mehrstündiger
Aufbewahrung bei niedriger Temperätur durch Zentrifugieren abgetrennt und im Exsikkator
getrocknet. Man erhält so 45 mg Trockenpulver, welches eine physiologische Wirksamkeit
von c)o ooo Einheiten je Gramm besitzt.
-
Beispiel. 21,51 Plasma trächtiger Stuten werden mittels Essigsäure
auf PH 3,75 eingestellt und mit einer Lösung von ioo g Natriumsulfat in
300 ccm Wasser versetzt. Diese Mischung wird 2 Stunden mit 10,75 1
Chloroform und 400 ccm Amylalkohol geschüttelt. Nach dem Zentrifugieren läßt sich
eine etwa 121 betragende wäßrige Schicht von dem Gel und der Chloroformschicht abtrennen.
Sie wird auf unter 2o° abgekühlt. Das Gel und die Chloroformschichf «-erden noch
zweimal mit je 121 Wasser, in welchem 6o,- Natriumsulfat gelöst sind, ausgeschüttelt.
Die drei w äßri.gen Lösungen werden vereinigt und durch Zugabe von ao%iger Natronlauge
auf PH 6 bis 7 neutralisiert. Diese Neutralisierung ist nicht unbedingt erforderlich,
aber sie vermindert
die Gefahr, daß sich das Hormon zersetzt. Die
vereinigten Lösungen werden mit dem 5- bis 6fachen ihres Volumens an Alkohol versetzt.
Die entstehende Fällung läßt man dann mehrere Stunden bei einer Temperatur von unter
:200/, absetzen, hebert die überstehende Flüssigkeit ab und zentrifugiert den Rückstand.
Der Rückstand wird darauf mit Aceton aufgeschwemmt, abgesaugt und auf dem Filter
durch Waschen mit Aceton und Äther getrocknet. Der Trockenrückstand wiegt etwa Zoo
g und besteht zu mehr als 9o% aus Salzen.
-
Dieses Produkt wird mit 11 Wasser extrahiert. Nach dem Zentrifugieren
bewahrt man die abgetrennte überstehende Flüssigkeit bei einer Temperatur von unter
2o0 auf und extrahiert den Rückstand erneut zweimal mit je Zoo ccm Wasser. Danach
wird der Rückstand verworfen. Die erste Extraktionslösung wird in einer Eis-Kochsalz-Mischung
gekühlt, bis ein großer Teil des Natriumsulfats auskristallisiert ist. Dieser Salzanteil
wird durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt. Er wird mit wenig eiskaltem
Wasser ge-# waschen und dann verworfen. Die Mutterlauge wird nun mit den beiden
anderen Extraktionsflüssigkeiten vereinigt. Die vereinigten Lösungen werden bei
niedriger Temperatur durch eine Cellophanmembran dialysiert. Die dialysierte Lösung
wird mit dem 6fachen Volumen Alkohol, der etwas Natriumacetat enthält, gefällt.
Die Fällung wird, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben, aufgearbeitet
und liefert etwa to g Trockenpulver.
-
Dieses Pulver wird in 50 ccm Wassergelöst und mit Essigsäure auf pg
3,7 eingestellt. Dann wird die Lösung etwa 2 Stunden mit So ccm Chloroform und wenig
Amylalkohol geschüttelt. Nach dem Zentrifugieren wird die wäßrige Lösung bei einer
Temperatur von unter 2o0 aufbewahrt, während die Chloroformschicht und das Gel 1/2
Stunde mit So ccm einer z °/°igen Natriumsulfatlösung geschüttelt werden. Dadurch
werden etwa 2 g unwirksame Proteinstoffe entfernt. Die vereinigten wäßrigen Auszüge
werden neutralisiert und mit dem 6fachen ihres Volumens an Alkohol, der etwas Natriumacetat
enthält, versetzt. Die entstehende Fällung beträgt etwa 8 g. Sie wird in 6o ccm
Wasser gelöst und möglichst vollständig dialysiert. Die Dialyse kann auch ohne vorhergehende
Fällung und Wiederauflösung durchgeführt werden. Nach Beendigung der Dialyse entfernt
man die Flüssigkeit aus der Dialysiermembran und stellt ihr p$ auf 7,5 bis 8 ein.
Dann fügt man Alkohol bis zur Konzentration von 6o0/0 hinzu. Durch Zugabe von 2,5°/°
Natriumacetat entsteht eine Fällung. Diese wird abzentrifugiert und wenigstens noch
einmal mit 6o °/°igem Alkohol, der eine geringe Menge Natriumacetat enthält, extrahiert.
Der nun verbleibende Rückstand enthält keine nennenswerten Hormonmengen mehr und
kann verworfen werden. Die vereinigten Lösungen, die wasserklar sind, werden mit
1l/2 Teilen Alkohol gefällt und mehrere Stunden bei einer Temperatur von unter 2o0
zum Absitzen aufbewahrt. Die so erhaltene Fällung wird in der in den vorhergehenden
Beispielen beschriebenen Weise aufgearbeitet und liefert 1,389 eines Trockenpulvers,
das in der Auswertung 78 ooo Ratteneinheiten aufwies. Die Wirksamkeit des als Ausgangsmaterial
dienenden Plasmas wurde zu 3,7 Ratteneinheiten je Kubikzentimeter bestimmt; es enthält
aber insgesamt 79 5oo Ratteneinheiten. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert demnach
ein Produkt, das 980/, der Wirksamkeit des Ausgangsmaterials enthält.
-
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können auch andere
das Chorion-Hormon enthaltende Ausgangsstoffe als die in den Beispielen angegebenen
Verwendung finden. Je nach dem gewählten Material kann dieses-auch einer geeigneten
Vorbehandlung unterworfen werden, ehe man die Extraktion mit wäßrigen Lösungen vornimmt.
Solche geeigneten Vorbehandlungen sind z. B. Vermahlen, Entfernung eines Salzüberschusses;
Einfrieren, um das granuläre und celluläre Gewebe zu zerstören, Eindampfen und Konzentrieren
unter milden Bedingungen, geeignete Vorextraktion und Vorfällung usw.
-
Zur Herstellung wäßriger Extrakte verwendet man vorzugsweise eine
wäßrige Lösung .einer anorganischen Base, beispielsweise Natrium- oder Kaliumhydroxy
d, Natrium- oder Kaliumcarbonat, Ammoniak, Lithiumhydroxy d oder Bariumhydroxyd;
jedoch können auch Lösungen von Pyridin, Trimethylamin, Harnstoff und anderen stickstoffhaltigen
organischen Basen sowie von Essigsäure, Phosphorsäure oder Milchsäure Verwendung
finden-Das Schütteln mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit zur Gehbildung
muß hinreichend intensiv geschehen, so daß sich augenblicklich eine Emulsion mit
dem wäßrigen Extrakt bildet. Es ist wichtig, daß das p$ des wäßrigen Extrakts nicht
höher als 5 liegt, vorzugsweise unter 4., bevor man mit dem Schütteln mit der mit
Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit beginnt. Wenn das pg wesentlich unter 3 liegt,
müssen die anderen Bedingungen, z. B. die Temperatur, vorzugsweise milde gewählt
werden. Die Einstellung des pH kann auch auf andere bekannte Weise erfolgen, z.
B. durch Zugabe einer organischen Säure, wie Essigsäure, oder durch Zugabe geeigneter
saurer
Salze: Während der im weiteren Verlauf des Verfahrens angewendeten Behandlung mit
mit Wasser nicht mischbaren organischen Flüssigkeiten wird das pti vorteilhaft auf
demselben Wert gehalten.
-
Es hat sich als wesentlich herausgestellt, daß das Volumen des wäßrigen
Extraktes nicht mehr als das doppelte Volumen der zur Gelbildung angewendeten, mit
Wasser nicht mischbaren Flüssigkeiten beträgt. Man vermindert daher das Volumen
der wäßrigen Lösung vor der zweiten und jeder weiteren Behandlung mit der mit Wasser
nicht mischbaren Flüssigkeit. Diese Volumenverminderung kann in jeder geeigneten
Weise durchgeführt werden, beispielsweise durch vorsichtiges Eindampfen oder durch
Fällung des Chorion-Hormons mitanschließendern Wiederauflösen in einer geringeren
Wassermenge. Gleichzeitig mit der Verminderung des Volumens der wäßrigen Schicht
ist darauf zu achten, daß die Konzentration der in dieser enthaltenen Salze vermindert
wird, um Störungen bei der Trennung der Schichten während der späteren Behandlung
mit mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeiten zu vermeiden. Wenn eine hinreichende
Menge der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit zur Gelbildung verwendet wird,
bilden sich drei Schichten. Die erste ist die wäßrige Schicht, welche das Chorion-Hormon
enthält; die zweite besteht aus der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit; die
dritte schließlich besteht aus dem gebildeten Gel und stellt wahrscheinlich eine
lose molekulare Verbindung der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit mit den wahren
Proteinen dar. Das gebildete Gel kann auf jedem der üblichen Wege abgetrennt werden,
beispielsweise durch Zentrifugieren, Dekantieren, Filtrieren usw. Es muß betont
werden, daß diese Behandlung mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit ein
Trennungsverfahren darstellt, welches die Entfernung der begleitenden Proteine in
Form eines Gels umfaßt. Es ist nicht etwa ein Extraktionsverfahren zur Gewinnung
des Chorion-Hormons.
-
Nach der Behandlung mit der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit,
wie Chloroform, werden die in der wäßrigen Schicht verbleibenden Serummucoide entfernt
und das Chorion-Hormon nach dem gebräuchlichen Verfahren isoliert, wie solches beispielsweise
in der britischen Patentschrift 313 9'3, Beispiel i, und in der britischen
Patentschrift 336 4;71, Seite I, Zeile :2i ff., beschrieben ist. Vorzugsweise jedoch
benutzt man folgendes Verfahren Vor der Fällung der Serummucoide wird die wäßrige
Schicht auf ein pg zwischen 6 und 9 eingestellt und ein großes Volumen einer mit
einem geeigneten Salz gesättigten, mit Wasser mischbaren organischen Flüssigkeit
hinzugefügt, wodurch die Serummucoide gefällt werden, ohne daß gleichzeitig das
Chorion-Hormon mit fällt. Wenn als organische wasserlösliche Flüssigkeit Alkohol
oder Aceton gewählt wird, fügt man davon so viel hinzu, daß deren Konzentration
in der Gesamtflüssigkeit 45 bis 70°/0, vorzugsweise 6o bis 650'o, beträgt. Die genaue
Menge der wasserlöslichen Flüssigkeit, die zur Fällung notwendig ist, hängt zu einem
gewissen Grade von dem pu der wäßrigen Schicht, welche die Serumtnucoide und das
Chorion-Hormon enthält, ab. Geeignete neutrale organische Lösungsmittel sind beispielsweise:
aliphatische Alkohole, wie Methyl-, Äthyl-, Propyl-, tertiärer Butylalkohol, sowie
Aceton, Äthylenglykol und eine Anzahl weiterer mit Wasser mischbarer Flüssigkeiten,
die jedem Fachmann bekannt sind. Als Salze, die man den neutralen, mit Wasser mischbaren
organischen Flüssigkeiten zufügt oder die bei der Behandlung mit Wasser nicht mischbarer
. Flüssigkeiten zufügt oder die bei der Behandlung mit Wasser nicht mischbarer Flüssigkeiten
Verwendung finden, sind z. B. die Acetate und Chloride des Natriums, Kaliums, Lithiums,
Ammoniums, Magnesiums, die Sulfate des Natriums, Kaliums, Ammoniums, Calciumchlorids
und andere geeignet. Eine Konzentration von 1/4 bis 5 °/o der Salze ist im allgemeinen
ausreichend, um die als Fällungsmittel gewählte, mit Wasser mischbare organische
Flüssigkeit zu sättigen. Nachdem man den aus den Serummucoiden bestehenden Niederschlag
abgetrennt hat, fällt man das Chorion-Hortnon durch Steigerung der Konzentration
der neutralen, mit Wasser mischbaren organischen Flüssigkeit, wie Aceton oder Alkohol
auf mindestens 75 bis 8o % oder darüber, bezogen auf die Gesamtflüssigkeitsmenge,
bei einem pg von 7 bis B. Die so entstandene Fällung enthält das Chorion-Hormon
und etwa 85 bis go°/o Salze; sie wird vorzugsweise durch Dialyse aus einer regenerierten
Cellulosemembran o. dgl. weiter gereinigt.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren hat viele Vorteile. Einmal kann ein
hochgereinigtes Chorion-Hormon aus Rohmaterial, das nur etwa o,or % davon
enthält, isoliert werden. Daß das Verfahrensprodukt sehr rein und praktisch frei
von begleitenden Einweißstoffen ist, wird durch die Tatsache erwiesen, daß Dosen
von ioo Evans-Einheiten und darüber bei Darreichung am Menschen keine Antigenreaktionen
geben. Die Evanseinheit ist in American Journal of Physiology roo, S. 14.1 (1932j,
definiert als diejenige Menge, welche eine Verfünffachung des Gewichtes des Ovars
einer Ratte bewirkt, wenn sie täglich dreimal
2 Tage lang subcutan
injiziert wird und die Tiere nach einer Gesamtdauer von 96 Stunden getötet werden.