Verfahren zur Trennung des auf die Schilddrüse wirkenden Stoffes und des gonadotropen Hypophysenvorderlappenhormons aus dem Hypophysenvorderlappen. Aron (Comptes Rendus de la Societe de Biologie, Bd. 102 [19,2,9], S.,682 bis 684) hat nachgewiesen, dass wässerige Extrakte des Hypophy senvorderlappens neben andern Hormonen einen Stoff enthalten,
der sich durch seine Wirkung auf die Schilddrüse auszeichnet. Mit Hilfe dieses Stoffes, der im folgenden thyreotropes Hormon genannt werden soll, gelingt es, das Parenchym der Schilddrüse zur Entwicklung und das Kol loid zum Schwinden zu bringen.
In den bisher gewonnenen Extrakten war dieses thyreotrope Hormon noch mit andern. Hormonen vergesellschaftet, und es gelang bis jetzt nicht, Extrakte des thyreotropen Hormons zu gewinnen, die keine Einwirkung auf die Keimdrüsen zeigten.
Es wurde nun gefunden, dass man das thyreotrope Hormon von dem gonadotropen- Hypophysenvorderlappenhormon trennen und. beide Körper frei voneinander gewinnen kann, wenn man durch Behandeln von Hypo- physenvorderlappen bei gewöhnlicher Tempe= ratur erhaltene, die Hormone enthaltende Lösungen, zum Beispiel Extrakte oder Press- sIfte, mit Mitteln behandelt, die geeignet sind,
das thyreotrope Hormon in Form einer Verbindung auszufällen und einerseits den auf diese Weise erhaltenen Niedersehlag vom Fällungsmittel befreit, anderseits aus den beim Abtrennen der Verbindung und beim Zersetzen der Verbindung erhaltenen ver einigten Filtraten das gonadotrope Hormon abscheidet. Die erhaltenen Endprodukte-sol- len als Arzneimittel Verwendung finden.
Der von dem Fällungsmittel befreite Niederschlag enthält das thyreotrope Hor mon. Es kann gereinigt werden, indem man denselben wieder auflöst und die Lösung nach erfolgter Filtration mit Mitteln behan delt, die geeignet sind, das Hormon in Form einer Verbindung auszufällen.
Als, Fäliungs- mittel, die das thyreotrope Hormon in Form einer Verbindung auszufällen vermögen, kön- nen Pikrinsäure, Sulfosalicylsäure, T'richlor- essigsäure oder Schwermetallsalze, wie Blei acetat, oder Kolloide, wie Eisenhydrogyd, Tonerde und ähnliche verwendet werden, die alle sehr .gute Resultate zeitigen, so.
@dass, an zunehmen ist, dass die Fällung bei allen ana loge Anlagerungsverbindungen liefert, wie dies bei Verwendung von Pikrinsäure und Trichloressigsäure der Fall ist.
Das Entfernen des Fällungsmittels aus. .dem Niederschlag geschieht zweckmässig mit organischen Lösungsmitteln; so lassen sich Pikrinsäure, Sulfosalicylsäure, Trichloreassig- säure, durch Alkohol oder Äther, essigsaures Blei :durch Alkohol, der mit Essigsäure ver setzt ist, aus, dem Niederschlag wieder her auswaschen.
Mit Kolloiden, wie Eisen hydrogyd, gefällte Niederschläge werden zweckmässig in verdünnten Säuren gelöst, aus diesen Lösungen kann dann das thyreotrope Hormon -durch solche Eiweiss.fällungsmittel gefällt werden, die in organischen Läsungs- mitteln löslich sind.
Über die sieh. bei dem Verfahren der vor liegenden Erfindung abspielenden chemi schen Reaktionen lässt siel; beiden zur Zeit noch beschränkten Kenntnissen der Zusam- mensetzung der Hormone nur wenig sagen;
doch handelt es sich hier offenbar um eine chemische Reaktion zwischen thyreotropen Hormon und Fällungsmittel, möglicher weise um :die Bildung einer salzartigen Ver bindung, die sich sehr leicht wieder in ihre Bestandteile aufspalten lässt. Es können natürlich auch Molekül- oder Anlagerungs verbindungen entstehen.
Die genannten Fäl- lungsmittel, wie zum Beispiel Pikrinsäure, sind ja, wie bekannt, sehr befähigt zur Bil- .dung solcher Verbindungen.
Ein Beweis da für, dass es sich um einen chemischen Vor gang handelt, ist in der Tatsache zu er blicken, dass da-9 gonadotrope Hormon in Lö sung bleibt, während das thyreotrope aus gefällt wird, wobei man wohl mit Recht an nehmen kann, dass das letztere eine chemische Reaktion mit dem Fällungsmittel eingeht.
Ausser durch wiederholtes Fällen kann man besonders reine Präparate dadurch ge- winnen, dass man die wässerigen Lösungen :der mit den Fällungsmitteln erhaltenen Nie derschläge auf den isoelektrischen Punkt ein stellt, wodurch unwirksame Ballaststoffe eiweissartigen Charakters ausflocken.
Aus .dem Filtrat kann dann das. thyreotrope Hor mon .durch Fällen mit einem Eiweissfällungs- mittel und Entfernen des Fällun:gsmittels in besonders reiner Form erhalten werden.
Das in, den Mutterlaugen der Nieder- schläge sich vorfindende gonadotrope Hor mon des Hypophysenvorderlappens, kann zum Beispiel durch Aussalzen gewonnen werden.
Als Ausgangsmaterial eignen sich für dieses Verfahren sowohl Extrakte, wie auch Presssäfte aus frischen Hypophysen, die bei gewöhnlicher Temperatur erhalten wurden. Mit Vorteil benutzt man getrocknete und :durch Behandlung mit Lösungsmitteln entfettete Hypophysenvorderlappentrocken- pulver.
Die Auswertung der erhaltenen Präpa rate auf das thyreotrope Hormon geschieht in folgender Weise: Meerschweinchen von 100 bis 150 gr wer den, immer je zwei Tiere, mit der gleichen Dosis :durch drei Tage behandelt. Am vier ten Tage werden die Tiere getötet und die Schilddrüse histologisch untersucht.
Als Ein heit wird diejenige kleinste Menge bezeich net, welche als Tagesdosis an drei aufeinan- derfolgenden Tagen gereicht, bei mindestens einem von zwei Tieren einen deutlich posi- tiven Befund (Erhöhung und Schwellung der Zellen des Föllikelepithels, Vakuolisierung biss .Schwund des Kolloidinhaltes, Hyperämie und meist Vergrösserung der :ganzen Drüse) auslöst.
Beispiel <I>1:</I> 100 gr frische zermahlene Hypophysen vorderlappen werden bei gewöhnlicher Tem peratur mit 25 gr Kieselgur und 1500 cm@ 2%iger Bikarbonatlösung über Nacht ge schüttelt und die Lösung am nächsten Tage abgesaugt. Das klare Filtrat wird mit dem gleichen. Volumen wässeriger Pikrinsäure- lösung versetzt, der Niederschlag abgetrennt und in mit Salzsäure angesäuertem Alkohol suspendiert.
Durch mehrfaches Auswaschen auf der Zentrifuge mit Alkohol und zum Schluss mit Äther wird ein weisses, amorphes, in Wasser klar lösliches, fast aschefreies Pulver in der Menge von ,2,5 gr erhalten, wel ches im mgr 10 bis 2.0 Meerschweinchenein- heiten enthält. Das Präparat zeigt auch in grossen Dosen keinerlei Einwirkung auf die Keimdrüsen. Zur weiteren Reinigung wird 1 gr des so erhaltenen Produktes in 100 cm' Wasser gelöst.
Zu der Lösung wird vorsichtig n,!10 Natronlauge zugegeben bis zum Eintritt einer deutlichen Trübung. Nun mehr wird noch 1. cm' n110 Natronlauge zu gesetzt. Von der entstandenen Fällung wird abgetrennt und aus dem Filtrat mit Pikrin- säure die wirksame Substanz niedergeschla gen, die mit Alkohol wie oben von der Pikrinsäure befreit wird. Es resultiert ein weisses, wasserlösliches leichtes Pulver, das nur schwache Eiweissreaktionen gibt und im mgr bis zu 100 Meerschweincheneinheiten enthält.
Aus den vereinigten Mutterlaugen wird .las gonadotrope Hormon hergestellt, indem man sie bei sehr niedriger Temperatur im Vakuum konzentriert, die Pikrinsäure in be kannter Weise entfernt und hierauf das gonadotrope Hormon aussalzt.
<I>Beispiel 2:</I> 20 gr getrocknete und entfettete Hypo- physenvorderlappen werden bei gewöhnlicher Temperatur mit 10 gr Kieselgur und 300 cm' 1/4%iger Essigsäure 24 Stunden geschüttelt, das klare Filtrat durch Zugabe von 40 gr Ammonsulfat auf je 100 cm' ausgesalzen und die Fällung abgetrennt.
Der Niederschlag wird in 1/ 4%iger Essigsäure aufgenommen; vom Ungelösten wird abgetrennt und die Lö sung wie in Beispiel 1 mit Pikrinsäure wei- terbehandelt. Es. werden 70 mgr eines weissen, gut wasserlöslichen Produktes mit etwa 20 Meerschweincheneinheiten im mgr erhalten. Die Isolierung des gonadotropen Hormons erfolgt wie im Beispiel 1 ange geben.
<I>Beispiel 3:</I> 20 gr Hypophysentrockenpulver werden wie in Beispiel 2 extrahiert und das klare Filtrat durch Zusatz von 2% Trichloressig- säure gefällt. Die abgetrennte Fällung wird auf der Zentrifuge mit Alkohol gewaschen und zum Schluss mit Äther trocken gerieben. Es resultieren 80 mgr einer Substanz von der gleichen Beschaffenheit, wie sie in Beispiel 2 erhalten, wurde.
Aus den Filtraten wird das gonadotrope Hormon wie im Beispiel 1 angegeben isoliert.