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Verfahren zur getrennten Darstellung des thyreotropen und gonadotropen
Hormons des Hypophysenvorderlappens A r o n (Comptes Rendus .de la Societe de Biologie,
Bd. ioa [19a9], S. 682 bis 68q.) hat nachgewiesen, daß wäßrige Extrakte des
Hypophysenvorderlappens neben anderen Hormonen einen Stoff enthalten, der sich durch
seine Wirkung auf die Schilddrüse, auszeichnet. Mit Hilfe dieses Stoffes, .der im
folgenden thyreotropes Hormon genannt werden soll, gelingt es, das Parenchym der
Schilddrüse zur Entwicklung und das Kolloid zum Schwinden zu bringen.
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In den bisher gewonnenen Extrakten war dieses thyreotrope Hormon noch
mit anderen Hormonen vergesellschaftet, und es gelang bis jetzt nicht, Extrakte
des thyreotropen Hormons zu gewinnen, die keine Einwirkung auf die Keimdrüsen zeigten.
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Es wurde nun gefunden, daß man das thyreotrope Hormon von dem gonadotropen
Hypophysenvorderlappenhormon trennen und beide Körper frei voneinander gewinnen
kann, wenn man wäßrige, bei gewöhnlicher Temperatur und beliebiger Wasserstoffionenkonzentration
hergestellte Extrakte oder Preßsäfte aus der Hypophyse mit eiweißfällenden Mitteln
behandelt und einerseits dem. auf diese Weise erhaltenen Niederschlag vom Fällungsmittel
befreit, andererseits die Restlaugen dieser Fällungen auf das, gonadotrope Hormon
verarbeitet.
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Der von dem Fällungsmittel wieder Niederschlag enthält das thyreotrope
Hormon. Es kann gereinigt werden, indem man die Fällung mit Eiweißfällungsmitteln
wiederholt und den Niederschlag abermals vom Fällungs@mittel befreit. Handelt es
sich um Extrakte, die besonders viel gonadotropes Hormon enthalten, so muß man.,
wenn man
die Trennung vom gonadotropen Hormon durchführen will, solche Stoffe
verwenden, die das letztere nicht ausfällen, wie z. B. saure eiweißfällende, Mittel,
mit denen in wäßriger Lösung ohne Zusatz anderer Stoffe ein pH kleiner als 3 erreicht
werden kann.
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Als besonders geeignet haben sich hierfür Trichloressigsäure, Pikrinsäure,
Sulfosalicylsäure u. dgl. erwiesen. ' Das Fällungsmittel wird aus dem Niederschlag
zweckmäßig durch Behandlung des letzteren mit organischen Lösungsmitteln entfernt.
So lassen sich z. B. die obergenannten Stoffe Pikrinsäure, Sulfosalicylsäure, Trichloressigsäure
durch Alkohol oder Äther aus dem Niederschlag leicht herauswaschen.
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Außer durch wiederholtes Fällen kann man besonders reine Präparate
dadurch gewinnen,
daß man die wäßrigen Lösungen der mit den Eiweißfällungsmitteln
erhaltenen Niederschläge auf den isoelektrischen Punkt einstellt, wodurch unwirksame
Ballaststoffe eiweißartigen Charakters ausflocken. Aus dem Filtrat kann dann das
thyreotrope Hormon durch Fällen mit einem Eiweißfällungsmittel und Entfernen des
Fällungsmittels in besonders reiner Form erhalten werden.
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Das in den Mutterlaugen der Niederschläge sich vorfindende gonadotrop.e
Hormon des Hypophysenvorderlappens kann z. B. dur h Aussalzen gewonnen werden.
| Als angsma.t@erialeignen sich für die- |
| ses Verfaren sowohl Extrakte wie auch Preß- |
säfte aus frischen Hypophysen. Mit Vorteil benutzt man bei niedriger Temperatur
getrocknete und durch Behandlung mit U-sungsmitteln entfettete Hypophysenvorderlappentrockenpulver.
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Die Auswertung der erhaltenen Präparate auf das. thyreotrope Hormon
geschieht in folgender Weise: Meerschweinchen von ioo bis i 5o g werden, immer je
zwei Tiere, mit der gleichen Dosis durch 3 Tage behandelt. Am vierten Tage werden
die Tiere getötet und die Schilddrüse histologisch untersucht. Als Einheit wird
diejenige kleinste Menge bezeichnet, welche als Tagesdosis an 3 aufeinanderfolgenden
Tagen gereicht, bei mindestens einem von zwei Tieren einen deutlich positiven Befund
(Erhöhung und Schwellung der Zellen des Follikelepithels, Vakuolisierung bis Schwund
des Kolloidinhalts, Hyperämle und meist Vergrößerung der ganzen Drüse) .auslöst.
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Beispiel i ioo g frische zermahlene Hypophysenvorderlappen werden
mit 25g Kieselgur und i5ooccm 2%iger Bicarbonatlösung über Nacht geschüttelt und
am nächsten Tage abgesaugt. Das klare Filtrat wird mit dem gleichen Volumen wäßriger
Pikrinsäurelösung versetzt, der Niederschlag abgetrennt und in mit Salzsäure angesäuertem
Alkohol suspendiert. Durch mehrfaches Auswaschen auf der Zentrifuge mit Alkohol
und zum Schluß mit Äther wird ein weißes, amorphes, in Wasser klar lösliches, fast
aschefreies Pulver in der Menge von 2,5 g erhalten, welches in mg io bis
20 Meerschweinchentinheiten enthält. Das Präparat zeigt auch in großen Dosen keinerlei
Einwirkung auf die Keimdrüsen. Zur weiteren Reinigung wird i g des so zu erhaltenden
Produkts in iooccm Nasser gelöst. Zu der Lösungwird vorsichtig n/1. Natronlauge
zugegeben bis zum Eintritt einer deutlichen Trübung. Nunmehr wird noch i ccm n110
Natronlauge zugesetzt. Von der entstandenen Fällung wird abgetrennt und aus dem
Filtrat mit Pikrinsäure die wirksame Substanz niedergeschlagen, die mit Alkohol
wie oben von der Pikrinsäure befreit wird. Es resultiert ein weißes, wasserlösliches,
leichtes Pulver, das nur schwache Ehveißreaktionen gibt und im mg bis zu ioo Meerschweincheneinheiten
enthält.
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Aus den vereinigten Mutterlaugen kann das gonadotrope Hormon hergestellt
werden, indem man sie bei -sehr niedriger Temperatur im Vakuum konzentriert, die
Pikrinsäure in bekannter Weise entfernt und hierauf das. gonadotrope Hormon aussalzt.
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Beispiel 2 2o g getrocknete und entfettete Hypophysenvorderlappen
werden mit io g Kieselgur und 30o ccm 1/4 %iger Essigsäure 2q: Stunden geschüttelt,
das klare Filtrat durch Zugabe von 40g Ammonsulfat auf je ioo ccm ausgesalzen
und die, Fällung -abgetrennt. Der Niederschlag wird in 1/4%iger Essigsäure aufgenommen;
vom Ungelösten wird abgetrennt und,die Lösung wie im Beispiel i mit Pikrinsäme weiterbehandelt.-
Es werden 7omgeines. weißere, gut wasserlöslichen Produkts mit etwa 2o Meerschweincheneinheiten
im mg erhalten.
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Beispiel 3 Zog Hypophysentrockenpulver werden wie in Beispiel z extrahiert
und das klare Filtrat durch Zusatz von 2% Trichloressigsäure gefällt. Die abgetrennte
Fällung wird auf der Zentrifuge mit Alkohol gewaschen und zum Schluß mit Äther trockengerieben.
Es resultieren 8omg einer Substanz von der gleichen Beschaffenheit, wie sie in Beispiel
e erhalten wurde.