DE936205C

DE936205C - Verfahren zur Gewinnung des Coferments der Carbonanhydrase

Info

Publication number: DE936205C
Application number: DESCH13474A
Authority: DE
Inventors: Et Herbert Dr Rer Nat M Keller
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1953-09-10
Filing date: 1953-09-10
Publication date: 1955-12-07

Description

Verfahren zur Gewinnung des Coferments der Carbonanhydrase Man kennt bereits eine Reihe von Methoden zur Gewinnung von Präparaten, in welchen die im tierischen und pflanzlichen Organismus vorkommende Kohlensäureanhydratase (Carbonanhydrase), d. h. das die Reaktionen katalysierende Ferment mehr oder weniger stark angereichert ist. Als Ausgangsmaterial werden häufig rote Blutkörperchen oder auch Pflanzenbestandteile verwendet. Eine Zerlegung dieses Ferments in Apo- und Coferment unter Reindarstellung des letzteren ist indessen in der Literatur noch nicht beschrieben.
Es wurde nun gefunden, daß man das Coferment der Carbonanhydrase aus Rohpräparaten des Ferments, welche z. B. nach M e 1 d r u m und R o u g h t o n (J. Physiol., Bd. 75, S. 3, r932 und Bd. 75, S. 15, 1932) hergestellt wurden, in verhältnismäßig einfacher und technisch durchaus brauchbarer Weise gewinnen kann, wenn man wie folgt vorgeht: Aus dem Rohferment-Präparat oder aus dem wäß.rigen Alko'hol-Chloroform-Extrakt des Meldrum-Roughtonschen Präparates oder aus anderen wäßrigen Carbonanhydrase enthaltenden Lösungen, in welchen das Ferment durch chemische (z. B. Hämolyse) oder mechanische (z. B. Homogenisation von zelligem Material) Maßnahmen in Lösung gebracht worden ist, wird das Eiweiß ausgefällt - wobei sich vorzugsweise 2 bis zo°/oige Lösungen als zweckmäßig erwiesen haben -, und zwar etwa dadurch, daß man die klar filtrierten Lösungen z. B. auf dem Wasserbad kurze Zeit erwärmt. Nach Abtrennung des- koagulierten Eiweißes kann eine weitere Behandlung mit Eiweiß-Fällungsmitteln, etwa Phosphorwolframsäure, erfolgen.
Die auf diese Weise erzielten klaren Lösungen werden mit einem organischen wassermischbaren Lösungsmittel, z. B. Azeton, bei niederer Temperatur versetzt, wobei ein Niederschlag ausfällt. Dieser wird mit Wasser ausgezogen. Versetzt man die klar löslichen wäßrigen Auszüge mit der wäßrigen Lösung eines ein schwerlösliches Salz des Coferments bildenden Metallsalzes oder mit einer wäßrigen Lösung eines entsprechenden Hydroxyds, z. B. mit Ba(OH)2, welches mit dem Coferment ein schwerlösliches Salz bildet, so fällt dieses schwerlösliche Salz, etwa das Bä-Salz des Coferments, das man durch Auswaschen, z. B. mit kleinen Mengen Wasser und Alkohol, weitgehend von anhaftenden Verunreinigungen befreien kann, aus. Das schwerlösliche Salz kann durch die üb- lichen Methoden wieder zerlegt werden; bei einem Ba-Salz z. B. kann durch Ausfällung des Ba als Sulfat das Coferment mühelos wieder in Lösung gebracht werden. Das freie Coferment kann im Vakuum oder auch bei normalem Druck bei mäßig hoher Temperatur zur Trockne eingedampft oder durch erneuten Zusatz von organischen Lösungsmitteln ausgefällt werden. Dabei kann unter geeigneten Bedingungen das reine Coferment auch in kristallisierter Form erhalten werden. Dieses soll zu wissenschaftlichen und therapeutischen Zwecken verwendet werden.
Die verschiedenen Einzelmerkmale des beschriebenen Verfahrens sind für sich in der Enzym-Technik bei anderen Arten von Enzymen bekannt. Die beschriebene und beanspruchte Kombination der verschiedenen Einzelmerkmale bedeutet jedoch eine Erfindung, weil das Verfahren als solches zu einem überraschenden, vom Fachmann nicht voraussehbaren Erfolg führt und die Endprodukte außerdem wertvolle, nicht voraussehbare Eigenschaften besitzen. Die in der Natur vorkommenden Stoffe enthalten Eiweiß - und besitzen dementsprechend nur eine beschränkte Anwendungsmöglichkeit. Die Produkte, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden, sind demgegenüber eiweißfrei und hitzestabil. Sie eignen sich für eine phärmazeütische Verwendung weit besser als die in der Natur vorkommenden Produkte." Besonders können sie zur Bekämpfung von zentralnervösen Erregungszuständen verwendet werden.
Beispiel = q. g Rohferment, gelöst-in ioo ccm Aqu. bidest., werden io Minuten bei ioo° C auf dem Wasserbad erhitzt: Durch Abnutschen (Weißband Filtrier= papier S & S) erhält man 85 ccm klare, gelbbraune Lösung.- Diese wird mit i5o ccm Azeton versetzt und iöo Minuten bei -3° C- belassen. Der entstandene-Niederschlag wird bei3ooo Touren in der Kälte abzentrifugiert. Das Sediment wird in 3o ccm Aqu. bidest. gelöst und die unlöslichen Bestandteile erneut bei 3ooo Touren abzentrifugiert. Die klare überstehende Lösung wird bei 25° C mit 2o ccm wäßriger, gesättigter Ba(OH)2 Lösung versetzt. Der entstehende Niederschlag wird mit kleinen Mengen. Aqu. bidest., g6o/oigem Äthanol, Aqu. dest. hintereinander gewaschen und dann mit 12 ccm n/ioo H2 S 0, unter starkem Rühren versetzt. Der dabei entstandene Niederschlag wird abzentrifugiert, die überstehende, völlig klare, schwach grüngelblich fluoreszierende Lösung wird im Ölbad bei -I- 9o° C und 76o mm Hg Druck zur Trockne eingeengt. Das entstehende, stark hygroskopische Trockenpulver stellt das reine Coferment dar.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Gewinnung des Coferments der Carbonanhydrase aus tierischem oder pflanzlichem Material, dadurch gekennzeichnet, daß man aus Rohpräparaten, in welchen die Carbonanhydrase durch die bekannten Methoden in Freiheit gesetzt ist, d. h. nicht mehr im Innern geschlossener tierischer oder pflanzlicher Zellen sich befindet, das- Eiweiß in wäßrigen oder wäßrig-alkoholischen Lösungen ausfällt, die hierbei entstandene Fällung abtrennt, die klare, wäßrige Lösung bei niederer Temperatur mit wasserlöslichen, organischen Lösungsmitteln, wie Azeton, versetzt, den hierbei entstehenden Niederschlag mit Wasser auszieht, aus dem wäßrigen Auszug durch Zusatz eines Metall-, insbesondere Erdalkalimetall-Salzes oder -Hydroxyds ein schwerlösliches Salz des Coferments bildet, welches ausfällt und durch geeignetes Auswaschen, z. B. mit relativ kleinen Mengen Wasser und-Alkohol, von anhaftenden Verunreinigungen befreit wird, worauf man das Salz durch. Umfällen von Metallverbindungen od. ä. befreit und das reine Coferment wieder in Lösung bringt, woraus es in an sich bekannter Weise direkt gewonnen wird.
2: Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausfällung des Eiweißes ' durch kurzes Erwärmender Lösung erfolgt und gegebenenfalls noch eine weitere Behandlung mit Eiweißfällungsmitteln, wie Phosphorwolframsäure, angeschlossen wird.
3. Verfahren nach Anspruch i und 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung des schwerlöslichen Cofermentsalzes wasserlösliche Salze oder Hydroxyde von Erdalkalimetallen verwendet werden. q.. Verfahren nach Anspruch i, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß aus wäßrigen Lösungen des Coferments entweder mittels organischer Lösungsmittel oder durch Eindampfen bei Temperaturen bis zu iöo° C das Coferment in Substanz gewonnen wird.