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Verfahren zur Herstellung von Adrenocorticotrophin-Präparaten mit
verlängerter Wirkungsdauer und hoher Aktivität Das Patent 920 148 betrifft
ein Verfahren zur Herstellung von Adrenocorticotrophin-(ACTH)-Suspensionen mit verlängerter
Wirkungsdauer. Danach werden stabile Adrenocorticotrophinsuspensionen in der Weise
erhalten, daß man zu einer wäßrigen ACTH-Lösung ein alkalisches Protein oder Proteinabbauprodukt
und ein wasserlösliches Zinksalz hinzufügt und das pg der Lösung durch Zugabe eines
Puffersalzes oder einer Puffersalzmischung auf einen Wert zwischen 6 und 8 einstellt.
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Es hat sich nun herausgestellt, daB die nach diesem Verfahren erhaltenen
Produkte eine wesentlich kürzere klinische Wirkung, als erwartet wurde, aufweisen,
wenn von ACTH-Präparaten mit einer hohen spezifischen Aktivität, beispielsweise
solchen, die mit Hilfe von Oxy-Cellulose gereinigt worden waren (vgl. Astwood, Rabon,
Payne & Grädy, Am.Soc.73,8969 [1951]), ausgegangen und das Verfahren in der
in den Beispielen des Hauptpatentes beschriebenen Weise durchgeführt worden war.
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Die Erfindung stellt eine Modifikation der in dem Hauptpatent beschriebenen
Verfahrensweise dar, die es ermöglicht, auch bei Verwendung von ACTH= Präparaten
hoher spezifischer Aktivität die gewünschte verlängerte Wirkungsdauer mit Sicherheit
zu erreichen. Zur Erleichterung des Verständnisses des
erfindungsgemäßen
Verfahrens soll auf das Adrenocorticotrophin und das gereinigte Adrenöcorticotrophin,
das eine hohe spezifische Aktivität aufweist, näher eingegangen werden.
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Adrenocorticotrophin ist bekanntlich ein Hormon, das durch seine biologische
Wirksamkeit definiert wird und nach dem gegenwärtigen Stand der Wissenschaft, je
nach dem angewandten Herstellungsverfahren, mit Proteinen oder Peptiden verschiedener
Molekulargewichte verbunden ist. Ob der aktive Bestandteil durch ein bestimmtes
niedermolekulares Molekül, das in den Rohextrakten und gereinigten Präparaten durch
Absorptionskräfte mit fremden - Proteinen und/oder Peptiden verbunden ist, gebildet
wird oder ob er in dem natürlichen Ausgangsmaterial durch eine chemische Gruppe
in einem oder mehreren Proteinen dargestellt wird, welche durch chemische Isolierungs-
und Reinigungsmethoden abgebaut werden können, während sie ihre Aktivität behalten,
ist zur Zeit nicht bekannt. Während das sogenannte reine Proteinhormon, das nach
Li und Mitarbeiter (J. Biol. Chem. 49, 413 M943]) und nach Sayers und Mitarbeiter
(J. Biol. Chem. 49, 426 [I943]), also nach zwei verschiedenen Methoden mit einem
Molekular= gewicht von etwa 2oooo dargestellt worden ist, eine spezifische Aktivität
von I I. E. /mg (I. E. = internationale Einheiten) und einen isoelektrischen Punkt
bei 4,7 aufweist, können, wie gefunden wurde, durch Reinigung mit Ionenaustauschern
(Dixon und Mitarbeiter Nature 168, =o84 [22. Dezember =95I]) einer Gegenstromverteilung.
oder Oxy-Cellulose (Astwood und Mitarbeiter loc. cit.) ACTH-Präparate mit hoher
spezifischer Aktivität hergestellt werden, deren isoelektrischer Punkt im schwach
alkalischen Gebiet liegt.
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Von der Fachwelt war besonders darauf hingewiesen worden, daß zwar
ACTH mit verhältnismäßig niedriger spezifischer Aktivität (etwa I 1.E./mg) und einem
isoelektrischen Punkt bei p$ 7 mit Zinkprotamin schwerlösliche Komplexverbindungen
bilden kann, jedoch nicht ACTH mit hoher spezifischer Wirksamkeit, wie es beispielsweise
durch Reinigung mittels Oxy-Cellulose erhalten wird. Dies entspricht jedoch nicht
den Tatsachen.
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Untersuchungen haben ergeben, daß auch diese gereinigten ACTH-Präparate
mit hoher spezifischer Aktivität bei Behandlung mit Protamin, Zinksalz und Trinatriumphosphat
in der in Patent 92o 148 beschriebenen Weise schwerlösliche Komplexverbindungen
mit Zinkprotamin bilden. Die nach dem Zentrifugieren der gebildeten Suspension erhaltene
klare Lösung zeigt nur eine geringe Aktivität, während in den suspendierten Teilchen
beinahe die volle Aktivität wiedergefunden wird.
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Klinische Teste haben jedoch gezeigt, daß die verlängerte Wirkung
(Dauer der klinischen Wirkung) von der Konzentration, bei welcher die Fällung durchgeführt
wird, abhängig ist. So wird mit ACTH-Präparaten hoher spezifischer Aktivität eine
Wirkungsdauer erzielt, die nur verhältnismäßig wenig verlängert ist, wenn man äußerst
verdünnte ACTH-Lösung anwendet. Wird dagegen die Fällung mit entsprechend konzentrierten
Lösungen durchgeführt, so wird die Bildung von größeren Teilchen und dadurch eine
verlängerte Wirkungsdauer erreicht, die nicht unterhalb derjenigen ähnlicher Präparate
liegt, welche mit gewöhnlichem ACTH finit einer Aktivität von etwa r I. E./mg hergestellt
werden. So wurde gefunden, daß die Suspension, die nach dem Patent 920148 mit ACT-H
von einer Aktivität von etwa o,8 I. E./mg mit den Reagenzien und in den Konzentrationen,
die in dem Beispiel dieses Patentes angegeben sind, gebildet wird, hauptsächlich
ACTH-Zinkprotamin-Teilchen oder Teilchenaggregate mit einem Durchmesser von etwa
3/10o mm enthält. Außer diesen sind noch einige kleinere Teilchen mit einem Durchmesser
von etwa 1/l000 mm unter dem Mikroskop festgestellt worden.
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In - dem Beispiel des Hauptpatentes wurde eine ACTH-Menge, die
550 mg des Standardpräparates entspricht, verwendet, die nach der Annahme
der internationalen Einheiten 550 I. E. hat.
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Unter genau denselben Bedingungen wird jedoch mit einem A C T H-Präparat,
das eine Aktivität von etwa io I. E./mg (wobei mit Bezug auf dieAktivität dieselbe
Konzentration verwendet wird) eine Suspension erhalten, in welcher das Verhältnis
zwischen den kleinen und großen Teilchen ein vollkommen anderes ist. Die überwiegende
Anzahl der Teilchen weist einen Durchmesser von etwa 1/laoo mm auf, und nur ein
geringer Teil hat einen Durchmesser von etwa 3/10o mm. Solche Präparate haben eine
wesentlich kürzere klinische Wirkungsdauer.
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Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß, wenn ein ACTH-Präparat
beispielsweise des obenerwähnten Typs (Aktivität etwa io I. E./mg) in einer bezüglich
ihrer Aktivität stärker konzentrierten Lösung, z. B. in der weiter unten im Beispiel
I angegebenen Weise, gefällt wird, die überwiegende Anzahl der Teilchen (etwa 75°/0)
einen Durchmesser zwischen 3/10o und 6/10o mm aufweist, während nur eine verhältnismäßig
kleine Zahl einen Durchmesser von 1/100o mm hat.
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Die Konzentration von Adrenocorticotrophin in LE./cm3 soll vorzugsweise
einen Wert übersteigen, der dem 5fachen der spezifischen Aktivität des Adrenocorticotrophins,
ausgedrückt in I.E./mg, entspricht. Die Protaminsulfatkonzentration soll größer
als I0/0, vorzugsweise größer als 20/0 sein.
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Dem mikroskopischen Bild ist zu entnehmen, daß die größeren Teilchen
aus Einzelteilchen des kleineren Typs (etwa 1/laoo Im) aufgebaut sind. Präparate
dieses Typs zeigen eine ebenso lange klinische Wirkung wie Präparate, die in der
für ACTH mit einer Aktivität von etwa o,8 I. E./mg beschriebenen Weise hergestellt
werden. -Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, das Adrenocorticotrophin
zunächst in einem Teil der Protaminsulfatlösung zu lösen, dann mit einer entsprechenden
Menge von Zinksulfatlösung auszufällen und die Salzlösung auf einen gewünschten
pH-Wert zwischen 6 und 8 zu puffern. Darauf wird die restliche Menge der Protaminsulfatlösung
zugefügt, anschließend langsam und gleichzeitig die restliche Zinksalzlösung und
Puffersalzlösung in der Weise zugegeben,. daß das pH während der gleichzeitigen
Zugabe
der beiden letzten Reagenzien sowenig wie möglich von dem gewünschten pH-Wert zwischen
6 und 8 abweicht.
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An Hand einiger Beispiele sollen einige mögliche Verfahrenswege der
Erfindung erläutert werden. Beispiel i Eine Lösung von o,6ooo g ACTH mit einer spezifischen
Aktivität von io I. E./mg (diese Menge entspricht 6ooo LE. ACTH) in 40 cm3 Wasser
wird zu 33 cm3 wäßriger 6%iger Protaminsulfatlösung zugefügt, dann 5,12 cm3 2o%ige
Zinksulfatlösung (Zn S04 . 7 H20) und anschließend i,20 cm3 Zo%ige wäßrige Glucoselösung
und 0,9o g Tricresol zugegeben. Man stellt den pH-Wert durch Zugabe von 8 cm3 2o0/nige
wäßrige Trinatriumphosphatlösung (Na. P 04 . 12 H2 0) auf 6,6 ein und füllt die
Suspension mit 212 cm3 destilliertem Wasser auf 300 cm3 auf. Das Verfahren
wird mit sterilen Lösungen und unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
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Beispiel 2 0,107 g Adrenocorticotrophin mit einer spezifischen Aktivität
von 56 I. E./mg, welche 5992 I. E./mg ACTH entsprechen, werden in io cm3
60%iger wäßriger Protaminsulfatlösung gelöst, dann 1,55 cm3 20%iges wäßriges Zinksulfat
(ZnS04 # 7H20) zugefügt und danach i,20 cm3 2o%ige wäßrige Glucose und
0,35 g Tricresol zugesetzt. Das pH wird mit 2,3 cm3 2o 0%igem Trinatriumphosphat
(Na3 P 04. i2H20) unter Rühren auf einen Wert von 6,6 eingestellt, anschließend
weitere 23 cm3 6%ige Protaminsulfatlösung zugegeben, danach 3,57 cm3 2o%ige Zinksulfatlösung
und eine genügende Menge (5,6 cm3) 200%ige Trinatriumsulfatlösung gleichzeitig unter
Rühren zugetropft, so daß der pH-Wert während der ganzen Zeit in der Nähe des Grenzwertes
von 6,6 gehalten wird. Man verdünnt die Suspension mit 25o cm3 destilliertem Wasser,
fügt 0,55 g Tricresol hinzu und stellt den pH-Wert mit einigen Tropfen von
n/10 Salzsäure und Trinatriumphosphat wieder auf 6,6 ein und füllt die Suspension
mit 2 cm3 destilliertem Wasser auf 300 cm3 auf.