AT109398B - Verfahren zum Gewinnung und Reinigung des aktiven antidiabetisch wirkenden Hormons der Bauchspeicheldrüse und verwandter Drüsen. - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Gewinnung und Reinigung des aktiven antidiabetisch wirkenden Hormons der   Bauchspeicheldrüse   und verwandter Driisen. 



   Gegenstand der   Erfindumg   ist die Gewinnung eines von. indifferenten und schädlichen
Stoffen freien Produkts in beständiger, konzentrierter, sehr reiner Form, das die physiologischen und therapeutischen Kennzeichen und Reaktionen des für die Umwandlung von Zucker im tierischen Körper wesentlichen, aktiven, antidiabetischen Hormons der   Bauchspeicheldrüse   besitzt und imstande ist. die hauptsächlichen schädlichen Wirkungen der   Zuckerharnruhr   (Diabetes mellitus) zu beseitigen. 



   Es ist bereits bekannt, dass die   Bauchspeicheldrüse-einschliesslich   derjenigen von Landtieren und   Knorpelfischen,   sowie der verwandten Drüsen von   Beinfischen--normalerweise   als eine innere Ausscheidung ein aktives Hormon erzeugt, welches für die Umwandlung von Zucker im Tierkörper wesentlich ist, und dass Zuckerharnruhr eintritt, wenn diese Ausscheidung fehlt oder ungenügend wird. Jahrelang suchten Forscher   vergebens,   dieses aktive Hormon aus der   Bauchspeicheldrüse   in einer Form zu gewinnen, in der es mit Sicherheit verabreicht werden kann und bei der Verabreichung an Menschen eine Abschwächung der diabetischen Symptome bewirkt.

   Die Herstellung eines solchen Stoffes gelang jedoch erst nach den Arbeiten von Banting, Best und Collip, deren Verfahren ganz kurz folgende Hauptschritte aufweist :
1. Das Ausziehen der   Bauchspeicheldrüse, - noch   bevor irgendeine beträchtliche Menge des darin enthaltenen Hormons durch Trypsin und andere Enzyme der Pankreas zerstört worden   ist,-mittels   eines geeigneten Lösungsmittels, das die Hormone auszieht und entweder die zerstörenden Enzyme, wie z. B. Trypsin,   zurücklässt   oder ihre zerstörende Wirkung auf das antidiabetische Hormon verhindert oder beides tut. 



   2. Die Abscheidung und Trennung der verschiedenen ursprünglich ausgezogenen Bestandteile durch fraktionierte Fällung. Hiefür ist Alkohol mit besonderem Erfolge benutzt worden, und der Niederschlag, der nach vorausgehender Entfernung von bei niedrigerer alkoholischer Konzentration erhaltenen Niederschlägen bei einer Alkoholkonzentration von etwa   80-900/0   gewonnen wird, enthält den grösseren Teil des gewünschten antidiabetischen Hormons. 



   3. Die Lösung dieses hormonhaltigen Niederschlages in Wasser. 



   4. Die Einstellung der antidiabetischen   Aktivität   der so erhaltenen Lösung auf eine bestimmte Stärke, wobei unter der Einheit der weiter unten erwähnten Aktivität jene Menge zu verstehen ist, die, einem normalen Kaninchen von 1    & /Gewicht eingespritzt,   den Blutzucker innerhalb 6 Stunden unter   0'0450/0   herabmindert und Zuckungen hervorruft. 



   Das beste vor vorliegender Erfindung erhaltene Produkt wies gewöhnlich pro Einheit der antidiabetischen Aktivität einen Stickstoffgehalt von   0'2-1     J1Ig   und oft darüber hinaus auf und enthielt auch einige anorganische Salze. Ausserdem war dieses Produkt oft und in veränderlichem Grade nicht haltbar, sowie bisweilen in unberechenbaren und nicht vorauszusagendem Grade zerstört, so dass man sich auf seine Wirksamkeit nicht verlassen konnte. Obgleich das Hormon selbst wahrscheinlich stickstoffhaltig ist, stammt der Stickstoffgehalt vermutlich haupt-   sächlich   aus verunreinigenden Proteinen oder deren Spaltprodukten, die unter gewissen Bedingungen unangenehme Wirkungen verursachten, wie   Empfi. ndlichmachung   und Verhärtung an der Injektionsstelle.

   Als Verunreinigungen traten weiter auf : phosphorhaltige und Purin-bzw. 



  Pyrimidin-Gruppen enthaltende Stoffe. 
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 eine   Beständigkeit,   die nach mehr als drei Monaten noch keine bestimmbare   Verminderung   aufweist. Seine Reinheit ist so gross, dass bei vielen tausend Patienten, denen das Produkt bisher verabreicht wurde, nicht ein einziger Fall von Empfindlichkeit oder Verhärtung oder irgendeiner anderen schädlichen Wirkung bekanntgeworden ist. 



   Der Stickstoffgehalt dieses Produkts ist im Vergleich zu dem früheren Produkte sehr stark vermindert und beträgt nur   O'l   mg pro Einheit der antidiabetischen Aktivität. Er beträgt häufig sogar nur 0-005-0-05 mg pro Einheit der antidiabetischen Aktivität. Um diesen Reinheitsgrad zu erreichen, können bisweilen mehrere wiederholte Fällungen mit abwechselndem Wiederauflösen der gebildeten Niederschläge nötig sein. Ist er jedoch einmal erreicht, so bewirken weitere wiederholte Fällungen keine weitere wesentliche Verringerung des Stickstoffgehaltes mehr. Ausserdem ist dieser Niederschlag bzw. die aus ihm erstellte Lösung wirklich frei von   wasserlöslichen   Verunreinigungen,-wie z.

   B. anorganischen Salzen, phosphorhaltigen Stoffen, 

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   Purin-und Pyrimidingruppen enthaltenden Substanzen-die   in den bisher bekannten Produkten stets wahrnehmbar sind. Die endgültige Lösung ist   vollständig   klar und in kleinen Mengen farblos wie Wasser, während die bisher bekannten Produkte selbst in kleinen Mengen betrachtliche Färbung zeigten. 



   Nach vorliegender Erfindung wird die Gewinnung und Reinigung des Hormons durch die Einstellung der   Wasserstoffionenkonzentration   der das Hormon enthaltenden Lösung auf den isoelektrischen Punkt   zwischen ! einem Wert   von   P 4-P   7 bewirkt, wobei ein das Hormon enthaltender oder mit dem Hormon verbundener Niederschlag erhalten wird. 



   Es ist bekannt, dass Banting, Best und Collip die Methode der isoelektrischen Fällung bei ihren Untersuchungen benutzten, indessen wendeten sie diese für einen anderen Zweck und mit abweichenden Ergebnissen an. Sie benutzten sie in der Absicht, unerwünschte Verunreinigungen zu fällen und das antidiabetische Hormon in der Lösung zu belassen. 



    Demgegenüber   wird diese Arbeitsweise gemäss vorliegender Erfindung benutzt, das antidiabetische Produkt selbst zu   fällen und zit   konservieren, und die unerwünschten Stoffe in der Lösung zu belassen. 



   Es ist auch gefunden worden, dass die Beständigkeit der bisher als Endprodukt betrachteten Lösung wenigstens zum Teil durch die   Wasserstomonenkonzentration   der Lösung beeinflusst werden kann. Liegt die Wasserstoffionenkonzentration innerhalb eines PH-Bereiches von ungefähr 4-7, so tritt eine Verschlechterung des antidiabetischen   Wirkungsvermögens   der Lösung ein, die wenigstens zum Teil von der   Wasserstoffionenkonzeniration   abhängig ist.   Möglicherweise   ist diese Verschlechterung zum Teil die Folge einer zerstörenden Wirkung von in der Lösung vorhandener verunreinigender stickstoffhaltiger Substanz.

   Zum grossen Teil ist sie jedoch nicht das Ergebnis der Zerstörung des Hormons, sondern der langsamen Bildung eines das antidiabetische Hormon enthaltenden Niederschlages aus der Lösung, wodurch die Aktivität der Lösung vermindert wird. Die Geschwindigkeit und der Umfang der Bildung dieses hormonhaltigen Niederschlages ändern sich mit der   Wasserstoffionenkonzentration   der Lösung und nehmen zu, wenn man sich dem isoelektrischen Punkte nähert. Die isoelektrische Fällung ist um so deutlicher begrenzt, die Geschwindigkeit der Bildung des Niederschlages wird um so mehr beschleunigt, und dessen Ausbeute wird vergrössert, je reiner die Lösung ist.

   Der Niederschlag beginnt sich unter günstigen Bedingungen bei einem PH von ungefähr 4 zu bilden, erreicht bei einem PH von ungefähr   4'5-5'5   die   Höchstmenge   und ist der Hauptsache nach bei einem PH von ungefähr 6'5-7 wieder vollkommen gelöst, ausgenommen wenn die Konzentration der Verunreinigungen in der Lösung so hoch ist, dass der Niederschlag, der sich sonst bilden würde, in Lösung gehalten wird. In diesem Falle kann die Lösung verdünnt werden, so dass der Niederschlag sich bildet. 



   Die vorliegende Erfindung wendet daher als einen Weg zur Erlangung des beständigen und gereinigten antidiabetischen Hormons ein Verfahren an, welches vorteilhaften Gebrauch von dem früher Störungen verursachenden Bestreben der Niederschlagbildung macht. 



   Es ist zwar nicht nötig, aber doch vorzuziehen, von dem Endprodukt des bekannten Verfahrens auszugehen. Die Wirksamkeit des Verfahrens der isoelektrischen Fällung einer das antidiabetische Hormon enthaltenden Substanz nimmt, wie bereits oben angedeutet, zu, je weniger die Lösung des Hormons, aus der der Niederschlag hergestellt wird, durch andere Substanzen verunreinigt ist. Daher ist es vorzuziehen, das Verfahren auf solche Lösungen anzuwenden, aus denen die Hauptmenge verunreinigender Stoffe bereits erfolgreich entfernt worden ist. 



   Bei dem letzterwähnten Verfahren wird die   Wasserstomonenkonzentration   so nahe als möglich auf den isoelektrischen Punkt der Substanz oder Substanzen'eingestellt, die bei   Fällung   ans einer solchen Lösung das antidiabetische Hormon einschliessen oder mit ihm verbunden sind. Bei dem isoelektrischen Punkt liegt das   PlI zwischen 4 und   7. Der Ausdruck   . antidiabetisehe Substanz"ist   in dem vorliegenden Falle gewählt worden, um damit das anti-   diabetische   Hormon, sei es allein oder in Verbindung mit anderen, aus der   Bauchspeicheldrüse   mit extrahierten Stoffen zu bezeichnen. Die nach dem bekannten Verfahren hergestellte Lösung kann durch entsprechende Leitung dieses Verfahrens bereits auf das gewünschte PH gebracht worden sein.

   Ist das PH jedoch zu niedrig, so kann es durch Zusatz eines Alkalis, vorzugsweise Natriumhydroxid, erhöht werden, während, wenn es zu hoch ist, eine Säure, vorzugsweise Salzsäure, hinzugefügt werden kann. Wenn sich der Niederschlag bildet, kann eine Veränderung in der Wasserstoffionenkonzentration eintreten, es ist jedoch nicht nötig, ein konstantes   PlI   aufrechtzuerhalten ; denn obgleich der isoelektrische Punkt irgendwo zwischen   4'5   und   5'5   auf der PH-Skala zu liegen scheint, wird der Niederschlag in grösserem oder geringerem Umfange auch in den PH-Bereich 4-7 erhalten, so dass jede Wasserstoffionenkonzentration innerhalb dieses Bereiches benutzt werden kann. Die besten Ergebnisse sind bisher jedoch mit einem PH zwischen 4'5 und   j'5   erhalten worden.

   Nachdem das PH so 

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Claims (1)

1. nahe wie möglich auf den isoelektrischen Punkt eingestellt worden ist, lässt man die Lösung stehen, um den Niederschlag sich bilden zu lassen. Die Bildung des Niederschlages nimmt im allgemeinen einige Tage oder eine Woche in Anspruch. obgleich ein trennbarer Niedersehlag schon innerhalb weniger Stunden erhalten werden kann. Von Zeit zu Zeit wird der Niederschlag entfernt und die Wasserstoffionenkonzentration zweckmässig wieder auf das oben erwähnte günstigste PH eingestellt, wodurch weitere Niederschlagsmengen erhalten werden. Die Bildung des Niederschlages wird durch Kühlen der Lösung beschleunigt.

   Die so erhaltenen Niederschläge werden in Wasser gelöst, das entweder eine Säure, vorzugsweise Salzsäure oder eine. Base, vorzugsweise Natriumhydroxyd enthält. Diese Lösung ist zur subkutane Injektion geeignet. Die Wasserstoffionenkonzentration wird auf irgendein gewünschtes PH eingestellt. Für die meisten Zwecke ist dies ein ausserhalb des fg-Bereiches 4-7 für die Fällung liegendes Pir, so dass das Hormon gelöst bleibt, und es hat sich heraus- gestellt, dass ein PH von 3'5 für gewöhnliche therapeutische Zwecke geeignet ist. Das PlI kann jedoch nötigenfalls auch geringer sein, und es wird häufig ein Plr von 2 benutzt.

   Für Sonderzwecke kann ein höheres PH benutzt werden, entweder innerhalb des isoelektrischen Bereiches oder oberhalb desselben. Lösungen mit einem Pur vos 12 sind wirksam angewendet worden.

   Die Gesamtzahl der durch dieses Verfahren gewonnenen Einheiten wirksamer antidiabetischer Substanz beträgt bisweilen 900/"der-vor der Fällung in der Lösung befindlichen.

   Sie schwankt mit der Vollständigkeit der erhaltenen Fällung.

   Beispiel : 1 Ic. y Bauchspeicheldrüse vom Schwein werden so weitgehend wie möglich vom anhängenden Fett befreit und mittels einer gewöhnlichen Fleischmühle in Gegenwart des l Vs fachen Volumens 950/obigen Alkohols, dem 0'20/0 Schwefelsäure zugesetzt sind, gemahlen. Diese so gewonnene Mischung wird ungefähr 2 Stunden lang stehen gelassen und dann mit Hilfe einer Zentrifuge filtriert. Alsdann wird ein zweiter Auszug mit gleichen Mengen 70% igen Alkohols hergestellt, wieder filtriert und darauf werden beide Auszüge vereinigt. Die vereinigten Auszüge werden dann auf 1i15 ihres ursprünglichen Volumens eingedampft und darauf filtriert.

   Das wässerige Filtrat wird durch erneuten Alkoholzusatz auf 800/0 Alkoholgehalt gebracht, wodurch die Proteine und einige anorganische Salze niedergeschlagen werden. Nach dem Filtrieren wird das Filtrat auf 930/0 Alkoholgehalt gebracht, wodurch das aktive Hormon ausgeschieden wird. Der Niederschlag wird gesammelt und in angesäuertem Wasser gelöst. Durch Hinzufügung von Natriumhydroxyd zur Lösung wird auf den isoelektrischen Punkt eingestellt.

   Der gebildete. Niederschlag wird wieder in angesäuertem Wasser gelöst und nochmals gefällt.

   Das ausgefällte Produkt wird endlich in angesäuertem Wasser bei einem Pu serte von ungefähr 3 gelöst, durch Berkefeld-Filter getrieben und in Ampullen von 5 e Inhalt gefüllt.

   Das geschilderte Verfahren ergibt vor der isoelektrischen Fällung beständig eine Lösung von ziemlich hohem Säuregehalt. Aus diesem Grunde wird immer zum Zwecke der maximalen Fällung Natriumhydroxyd hinzugefügt. Die erforderliche Alkalimenge kann nicht bestimmt angegeben werden. In der Praxis ist die Höchstausbeute an Niederschlag das Endziel.

   Die Ausbeute an gereinigtem hormonhaltigem Niederschlag beträgt etwa 1 g aus 8 kg der verwendeten Drüsen.

   PATENT-ANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Gewinnung und Reinigung des aktiven antidiabetischen Hormons der Bauspeicheldrüse und verwandter Drüsen, dadurch gekennzeichnet, dass die Wasserstoffionenkonzentration des in bekannter Weise unmittelbar aus den Drüsen gewonnenen Auszuges derart zwischen einem Wert von PH 4 bis PlI 7 eingestellt wird, dass ein Niederschlag. welcher das Hormon enthält,'ausgefällt wird, und dass der so gebildete Niederschlag von der Flüssigkeit getrennt und konserviert wird.

   2. Verfahren nach Anspruch l : dadurch gekennzeichnet, dass an Stelle des unmittelbar aus der Bauchspeicheldrüse gewonnenen Auszugs die Lösung eines durch fraktionierte Fällung in an sich bekannter Weise bereits vorgereinigten Produkts zur Anwendung gelangt.