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Verfahren zur Reingewinnung des aktiven, antidiabetisch wirkenden
Hormons der Bauchspeicheldrüse und verwandter Drüsen. Gegenstand der Erfindung ist
die Gewinnung eines von indifferenten und schädlichen Stoffen freien Produkts in
beständiger, konzentrierter, sehr reiner Form, das die physiologischen und therapeutischen
Kennzeichen und Reaktionen des für die Umwandlung von Zucker im tierischen Körper
wesentlichen, aktiven, antidiabetischen Hormons der Bauchspeicheldrüse besitzt und
imstande ist, die hauptsächlichen schädlichen Wirkungen der Zuckerharnruhr (diabetes
mellitus) zu beseitigen.
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Es ist bereits bekannt, daß die Bauchspeicheldrüse - einschließlich
derjenigen von Landtieren und Knorpelfischen sowie der verwandten Drüsen von Beinfischen
- normalerweise als eine innere Ausscheidung ein aktives Hormon erzeugt, welches
für die Umwandlung von Zucker im Tierkörper wesentlich ist, und daß Zuckerharnruhr
eintritt, wenn diese Ausscheidung fehlt oder ungenügend wird. Jahrelang suchten
Forscher vergebens, dieses aktive Hormon aus der Bauchspeicheldrüse in einer Form
herzuleiten, in der es mit Sicherheit verabreicht werden kann und bei der Verabreichung
an Menschen. eine Abschwächung der diabetischen Syndrome bewirkt. Die Herstellung
eines solchen Stoffes gelang jedoch erst nach den Arbeiten von Banting, Best und
Collip, deren Verfahren ganz kurz folgende Hauptschritte aufweist: r. Das Ausziehen
der Bauchspeicheldrüse - noch bevor irgendeine beträchtliche Menge des darin enthaltenen
Hormons durch Trypsin und andere Enzyme der Pankreas zerstört worden ist - mittels
eines geeigneten Lösungsmittels, das die Hormone auszieht und entweder die zerstörenden
Enzyme, wie z. B. T rypsin, zurückläßt oder ihre zerstörende Wirkung auf das antidiabetische
Hormon verhindert oder beides tut.
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2. Die Abscheidung und Trennung der verschiedenen ursprünglich ausgezogenen
Bestandteile durch fraktionierte Fällung. Hierfür ist Alkohol mit besonderem Erfolge
benutzt worden, und der Niederschlag, der nach voraufgehender Entfernung von bei
niedrigerer alkoholischer Konzentration erhaltenen Niederschlägen bei einer Alkoholkonzentration
von etwa 8o bis go Prozent erhalten wird, enthält den größeren Teil des gewünschten
antidiabetischen Hormons.
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3. Die Lösung dieses hormonhaltigen Niederschlages in Wasser.
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Die Einstellung der antidiabetischen Aktivität der so erhaltenen Lösung
auf eine bestimmte Stärke, wobei unter der Einheit der weiter unten erwähnten Aktivität
jene Menge zu verstehen ist, die, einem normalen
Kaninchen von i
kg Gewicht eingespritzt, den Blutzucker innerhalb 6 Stunden unter 0,045 Prozent
herabmindert und Zuckungen hervorruft.
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Das beste vor vorliegender Erfindung erhaltene Produkt wies gewöhnlich
pro Einheit der antidiabetischeil Aktivität einen Stickstoffgehalt von o,2 bis i,o
mg und oft darüber hinaus auf und enthielt auch einige anorganische Salze. Außerdem
war dieses Produkt oft und in veränderlichem Grade nicht haltbar sowie bisweilen
in unberechenbarem und nicht vorauszusagenden Grade zerstört, so daß man sich auf
seine Wirksamkeit nicht verlassen konnte. Obgleich das Hormon selbst wahrscheinlich
stickstoffhaltig ist, stammt der Stickstoffgehalt vermutlich hauptsächlich aus verunreinigenden
Proteinen oder deren Spaltprodukten, die unter gewissen Bedingungen unangenehme
Wirkungen verursachten, wie Empfindlichinachung und Verhärtung an der Injektionsstelle.
Als Verunreinigungen traten weiter auf: Phosphorhaltige und Purin- bzw. Pyriillidingruppen
enthaltende Stoffe.
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Gemäß vorliegender Erfindung wird ein Produkt erhalten, dessen antidiabetische
Wirkung leicht vorausbesti-tnint und das daher gefahrlos verordnet werden kann.
Dieses Produkt besitzt eine Beständigkeit, die nach mehr als drei 'Monaten noch
keine bestimmbare Verminderung aufweist. Seine Reinheit ist so groß, daß von vielen
Tausend Patienten, denen das Produkt bisher verabreicht wurde und unter denen sich
auch solche befanden, bei denen sich nach Anwendung der besten bis dahin zu erhaltenden
Produkte Einpfindlichkeits- und Verhärtungswirkungen zeigten, nicht ein einziger
Fall von Empfindlichkeit oder Verhärtung oder irgendeiner anderen schädlichen Wirkung
bekannt geworden ist.
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Der Stickstoffgehalt dieses Produkts ist im Vergleich zu dem früherer
Produkte sehr stark vermindert und beträgt mir o,i mg pro Einheit der antidiabetischen
Aktivität. Er beträgt häufig sogar nur o,oo5 bis 0,05 mg pro Einheit
der antidiabetischen Aktivität. Um diesen Reinheitsgrad zu erreichen, können bisweilen
mehrere wiederholte Fälhingen mit abwechselndem Wiederauflösen der gebildeten \
iederscllläge nötig sein. Ist er jedoch einmal erreicht, so bewirken weitere wiederholte
Fällungen keine weitere wesentliche Verringerung des Stickstoffgehalts mehr. Außerdem
ist dieser -Niederschlag bzw. die aus ihm erstellte Lösung wirklich frei von wasserlöslichen
Verunreinigungen, wie z. B. anorganischen Salzen, phosphorhaltigen Stoffen, Purin-
und Pyrimidingruppen enthaltenden Substanzen, die in den bisher bekannten Produkten
stets wahrnehmbar sind. Die endgültige Lösung ist vollständig klar, und in kleinen
Mengen farblos wie Wasser, während die bisher bekannten Produkte selbst in kleinen
Mengen beträchtliche Färbung zeigten.
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Wegen dieser weitgehenden Reinigung ist die Wirkung bei der Verabreichung
sehr eng, wenn nicht völlig auf die Beseitigung der diabetischen Syndrome beschränkt,
und frei von unerwünschten Nebenwirkungen.
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Diese Reinigung kann durch verschiedene Verfahren bewirkt werden,
aber es ist vorzuziehen, sie durch die Einstellung der Wasserstoffionenkonzentration
der das Hormon enthaltenden Lösung auf den isoelektrischen Punkt zu bewirken, wobei
ein das Hormon enthaltender oder mit dem Hormon verbundener Niederschlag erhalten
wird.
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Es ist bekannt, daß Banting, Best und Collip die Methode der isoelektrischen
Fällung bei ihren Untersuchungen benutzten, indessen wendeten sie diese für einen
anderen Zweck und mit abweichenden Ergebnissen an. Sie benutzten sie in der Absicht,
unerwünschte Verunreinigungen zu fällen und (las antidiabetische Hormon in der Lösung
zu belassen. Demgegenüber wird diese Arbeitsweise gemäß vorliegender Erfindung benutzt,
das antidiabetische Produkt zu fällen und zu konservieren, und die unerwünschten
Stoffe in der Lösung zu belassen.
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Es ist auch gefunden worden, daß die Beständigkeit der bisher als
Endprodukt betrachteten Lösung wenigstens zum Teil durch die Wasserstoffionenkonzentration
der Lösung beeinflußt werden kann. Liegt die Wasserstoffionenkonzentrationinnerhalb
eines PH-Bereichs von ungefähr :4 bis 7, so tritt eine Verschlechterung des antidiabetischen
Wirkungsvermögens der Lösung ein, die wenigstens zum Teil von der Wasserstoftionenkonzentration
abhängig ist. Möglicherweise ist diese Verschlechterung zum Teil die Folge einer
zerstörenden Wirkung von in der Lösung vorhandener verunreinigender stickstoffhaltiger
Substanz. Zum großen Teil ist sie jedoch nicht das Ergebnis der Zerstörung des Hormons,
sondern der langsamen Bildung eines das antidiabetische Hormon enthaltenden Niederschlages
aus der Lösung, wodurch die Aktivität der Lösung vermindert wird. Die Gegchwindigkeit
und der Umfang der Bildung dieses hormonhaltigen N iederschlages ändern sich mit
der Wasserstoffionenkonzentration der Lösung und nehmen zu, wenn man sich dem isoelektrischen
Punkte nähert. Der isoelektrische Punkt ist deutlicher begrenzt, die Geschwindigkeit
der Bildung des Niederschlages wird beschleunigt, und dessen Ausbeute wird
vergrößert,
je reiner die Lösung ist. Der Niederschlag beginnt sich unter günstigen Bedingungen
bei einem PH von ungefähr q. zu bilden, erreicht bei einem PH
von ungefähr
4,5 bis 5,5 die Höchstmenge und ist der Hauptsache nach bei einem PH
von ungefähr
6,5 bis 7 wieder vollkommen gelöst, ausgenommen wenn die Konzentration der Verunreinigungen
in der Lösung so hoch ist, daß der Niederschlag, der sich sonst bilden würde, in
Lösung gehalten wird. In diesem Falle kann -die Lösung verdünnt werden, so daß der
Niederschlag sich bildet.
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Die vorliegende Erfindung wendet daher als einen Weg zur Erlangung
des beständigen und gereinigten antidiabetischen Hormons ein Verfahren an, welches
vorteilhaften Gebrauch von demselben früher Störungen verursachenden Bestreben der
Niederschlagbildung macht.
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Es ist zwar nicht nötig, aber doch vorzuziehen, von dem Endprodukt
des bekannten Verfahrens auszugehen. Die Wirksamkeit des Verfahrens der isoelektrischen
Fällung einer das antidiabetische Hormon enthaltenden Substanz nimmt, wie bereits
oben angedeutet, zu, je weniger die Lösung des Hormons, aus der der Niederschlag
hergestellt wird, durch andere Substanzen verunreinigt ist. Daher ist es vorzuziehen,
das Verfahren auf solche Lösungen anzuwenden, aus denen die Hauptmenge verunreinigender
Stoffe bereits erfolgreich entfernt worden ist.
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Bei dem letzterwähnten Verfahren wird die Wasserstoffionenkonzentration
so nahe als möglich auf den isoelektrischen Punkt der Substanz oder Substanzen eingestellt,
die bei Fällung aus einer solchen Lösung das antidiabetische Hormon einschließen
oder mit ihm verbunden sind. Bei dem isoelektrischen Punkte liegt das
PH zwischen 4 und 7. Der Ausdruck »antidiabetische Substanz« ist in dem vorliegenden
Falle gewählt worden, um damit das antidiabetische Hormon, sei es allein oder in
Verbindung mit anderen, aus der Bauchspeicheldrüse mitextrahierten Stoffen zu bezeichnen.
Die nach dem bekannten Verfahren hergestellte Lösung kann durch entsprechende Leitung
dieses Verfahrens bereits auf das gewünschte PH gebracht worden sein. Ist
das PH jedoch zu niedrig, so kann es durch Zusatz eines Alkalis, vorzugsweise
N atriumhydroxvd, erhöht werden, während, wenn es zu hoch ist, eine Säure, vorzugsweise
Salzsäure, hinzugefügt werden kann. Wenn sich der Niederschlag bildet, kann eine
Veränderung in der Wasserstoffionenkonzentration eintreten, es ist jedoch nicht
nötig, ein konstantes PH aufrechtzuerhalten; denn obgleich der isoelektrische
Punkt irgendwo zwischen 4,5 und 5,5 auf der PH-Skala zu liegen scheint, wird der
Niederschlag in größerem oder geringerem Umfange auch in dem PH-Bereich q. bis 7
erhalten, so daß jede Wasserstoffionenkonzentration innerhalb dieses Bereiches benutzt
werden kann. Die besten Ergebnisse sind bisher jedoch mit einem PH zwischen
4,5 und 5,5 erhalten worden. Nachdem das PH so nahe wie möglich auf den isoelektrischen
Punkt eingestellt worden ist, läßt man die Lösung stehen, um den Niederschlag sich
bilden zu lassen. Die Bildung des Niederschlages nimmt im allgemeinen einige Tage
oder eine Woche in Anspruch, obgleich ein trennbarer Niederschlag schon innerhalb
weniger Stunden erhalten werden kann. Von Zeit zu Zeit wird der Niederschlag entfernt
und die Wasserstoffionenkonzentration zweckmäßig wieder auf das oben erwähnte günstigste
PH eingestellt, wodurch weitere Niederschlagsmengen erhalten werden. Die Bildung
des Niederschlages wird durch Kühlen der Lösung beschleunigt.
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Die so erhaltenen Niederschläge werden in Wasser gelöst, das entweder
eine Säure, vorzugsweise Salzsäure, oder eine Base, vorzugs-«eise Natriumhydroxyd,
enthält. Diese Lösung ist zur subkutanen Injektion geeignet. Die Wasserstoffionenkonzentration
wird auf irgendein gewünschtes PH eingestellt. Für die meisten Zwecke ist
dies ein außerhalb des PH-Bereichs ,4 bis 7 für die Fällung liegendes PH, so daß
das Hormon gelöst bleibt, und es hat sich herausgestellt, daß ein PH von
3,5 für gewöhnliche therapeutische Zwecke geeignet ist. Das PH kann jedoch
nötigenfalls auch geringer sein, und es wird häufig ein PH von z benutzt.
Für Sonderzwecke kann ein höheres PH benutzt werden, entweder innerhalb des
isoelektrischen Bereiches oder oberhalb desselben. Lösungen mit einem
PH von 12 sind wirksam angewendet worden.
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Die Gesamtzahl der durch dieses Verfahren gewonnenen Einheiten wirksamer
antidiabetischer Substanz beträgt bisweilen 9o Prozent der vor der Fällung in der
Lösung befindlichen. Sie schwankt mit der Vollständigkeit der erhaltenen Fällung.
Beispiel. Ein Pfund Bauchspeicheldrüsen vom Schwein werden so weitgehend wie möglich
vorn anhängenden Fett befreit und mittels einer gewöhnlichenFleischmühle im r '/2fachen
Volumen 95prozentigen Alkohols, dem o,2 Prozent Schwefelsäure zugesetzt sind, gemahlen.
Diese Mischung wird ungefähr 2 Stunden lang stehengelassen und dann mit Hilfe einer
Zentrifuge filtriert. Alsdann wird ein zweiter Auszug mit gleichen Mengen 7oprozentigen
Alkohols hergestellt, wieder
filtriert-' und darauf werden beide
Auszüge vereinigt. Die vereinigten Auszüge werden dann auf %6 ihres ursprünglichen
Volumens eingedampft und darauf filtriert. Das wässerige Filtrat wird durch erneuten
Alkoholzusatz auf 8o Prozent Alkoholgehalt gebracht, wodurch die Proteine und einige
anorganische Salze niedergeschlagen werden. Nach dem Filtrieren wird das Filtrat
auf 93 Prozent Alkoholgehalt gebracht, wodurch das aktive Hormon ausgeschieden wird.
Der Niederschlag wird gesammelt und in angesäuertem Wasser gelöst. Durch Hinzufügung
von Natriumhydroxyd zur Lösung wird auf den isoelektrischen Punkt eingestellt. Der
gebildete Niederschlag wird wieder in angesäuertem Wasser gelöst und nochmals gefällt.
Das ausgefällte Produkt wird endlich in angesäuertem Wasser bei einem PH-Werte von
ungefähr 3 gelöst, durch Berkefeld-Filter getrieben und in Ampullen von 5 ccm Inhalt
gefüllt.
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Das geschilderte Verfahren ergibt vor der isoelektrischen Fällung
beständig eine Lösung von ziemlich hohem Säuregehalt. Aus diesem Grunde wird immer
zum Zwecke der maximalen Fällung Natriumhydroxyd hinzugefügt. Die erforderliche
Alkalimenge kann nicht bestimmt angegeben werden. In der Praxis ist die Höchstausbeute
an Niederschlag das Endziel.
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Die Ausbeute an gereinigtem hormonhaltigen Niederschlag beträgt etwa
i g aus 8 kg der verwendeten Drüsen.