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Verfahren zur Herstellung von protrahiert wirkenden, injizierbaren
Insulinpräparaten Insulinpräparate mit protrahierter Wirkung stellen in klinischer
Hinsicht sehr wertvolle Arzneimittel dar. Die Depotwirkung der bekannten Insulinpräparate
beruht auf der Reaktion des Insulins in einem injizierbaren wäßrigen Medium mit
basisch reagierenden und dem menschlichen Körper fremden Substanzen. Dabei bildet
sich eine bei dem pH-Wert des menschlichen Blutes schwerlösliche oder unlösliche
Insulinverbindung. Als Beispiele für derartige mit dem Insulin umgesetzte Substanzen
seien genannt Protamin, Globin und Bis-2-methyl-4-amino-chinolyl-6-karbamid.
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Es wurde auch bereits versucht, Insulinlösungen mit protrahierter
Wirkung dadurch herzustellen, daß den Lösungen Zink in einer Menge von 25 bis 500°/o,
vorzugsweise zwischen 100 und 2000/0, bezogen auf das Trockengewicht des Insulins,
zugesetzt wurde (vgl. USA.-Patentschrift 2 143 591).
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Diesen Insulinlösungen kam jedoch keine klinische Bedeutung zu, insbesondere
infolge des erforderlichen sehr hohen Zinkgehaltes.
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Es ist auch bereits in der Literatur die Herstellung von Insulinkristallösungen
mit einem Zinkgehalt bis zu 0,9 mg pro 1000 Insulineinheiten geschildert worden
(vgl. The Journal of the Medical Association of Georgia, Bd. XXVIII, S. 41, 1939).
Von Klinikern wurde verschiedentlich von diesen Insulinpräparaten eine im Vergleich
zu der Wirkung von Lösungen des amorphen Insulins verbesserte und protrahierte Wirkung
behauptet (The Canadian Medical Association Journal, Bd. 35, S. 239 bis 251, 1936;
TheAmerican Journal
of Medical Science, New Series, Bd.195, S.236
bis 239, 1938). Tatsächlich war aber die Wirkung dieser zinkhaltigen Insulinpräparate
so kurz, daß von einer Depotwirkung im eigentlichen Sinne nicht gesprochen werden
konnte.
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Es wurde auch bereits festgestellt, daß ein Zusatz einer verhältnismäßig
kleinen Menge eines löslichen Zinksalzes zu einer wäßrigen Suspension eines amorph
ausgefällten Protamin-Insulins die protrahierte Wirkung fördert (vgl. USA.-Patentschrift
2 179 384). Diese wäßrigen insulinhaltigen Suspensionen, allgemein als PZI-Präparate
bekannt, haben eine ausgedehnte praktische Verwendung gefunden. Schließlich wurde
auch versucht, eine protrahierte Insulinwirkung mittels wäßriger Suspensionen von
ausgefälltem, keine Protomine oder ähnliche Stoffe enthaltendem Insulin zu erhalten
(vgl. Dissertation von Christian Chassagnette »Le Precipite Insuline-Zinc«, Bordeaux,
1938; Comptes Rendus de la Societe de Biologie, Bd. 130, S. 484 bis 488, 1939).
Diese Präparate, welche nur versuchsweise geprüft wurden, wurden dadurch hergestellt,
daß man zunächst eine wäßrige Zinksulfatlösung mit mehr oder weniger karbonisiertem
Natriumhydroxyd vermischte, wodurch eine Ausfällung eines Gemisches von Zinkhydroxyd
und Zinkkarbonat erhalten wurde. Hiernach wurde eine klinisch brauchbare Handelsinsulinlösung
zugegeben, wodurch eine das Insulin enthaltende Ausfällung eintrat. Die hergestellten
Suspensionen wiesen dasselbe Aussehen wie die bekannten PZI-Präparate auf, und zwar
sowohl nach Stehenlassen als auch nach Schütteln. Dies ließ darauf rüekschließen,
daß das Insulin in amorphem Zustand ausgefällt war. Durch Verwendung variierender
Mengen von Zinksulfat wurden wäßrige Suspensionen von amorphem Insulin hergestellt,
welche 2 bis 14 Gamma Zink pro Insulineinheit und 20Insulineinheiten pro Kubikzentimeter
enthielten und einen pH-Wert von etwa 6 oder genauer zwischen 5,25 und 6,35, in
Abhängigkeit des pH-Wertes der verwendeten Handelsinsulinlösung, besaßen. Mit Kaninchen
und Hunden durchgeführte Testuntersuchungen ergaben eine optimale protrahierte Insulinwirkung,
wenn die Suspensionen einen Zinkgehalt von 6 bzw. 8 Gamma pro Insulineinheiten aufwiesen.
8 Gamma Zink pro Insulineinheit enthaltende Suspensionen wurden klinisch geprüft.
Dabei wurde eine protrahierte Insulinwirkung festgestellt. Allerdings wurden mit
diesen Suspensionen keine Handelspräparate hergestellt. Untersuchungen betreffend
die Stabilität der Präparate und die Wirkung von pH-Änderungen auf die protrahierte
Wirkung wurden nicht durchgeführt.
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Es wurde nun erfindungsgemäß gefunden, daß es möglich ist, mittels
wäßriger Insulinkristallsuspensionen eine große prolongierte Insulinwirkung von
beträchtlicher klinischer Bedeutung zu erhalten. Dies muß als überraschend angesehen
werden, wenn man berücksichtigt, daß F i s h e r und S c o t t (vgl. Journal of
Pharmacology, 58, S. 93 bis 104, 1936) im Zusammenhang mit wissenschaftlichen Untersuchungen
über die Bedeutung des Vorhandenseins von Zink in Protamin-Insulin-Präparaten früher
durch Suspendieren von '0,52% Zink enthaltenden Insulinkristallen in destilliertem
Wasser eine Insulinkristallsuspension hergestellt haben, die bei subkutaner Injektion
bei Kaninchen eine Wirkung hatte, die nicht wesentlich verschieden von der Wirkung
des in Lösung befindlichen kristallinen Insulins war. Der Grund hierfür dürfte darin
liegen, daß die verwendeten Insulinkristalle sich bei dem im Blut und in den Gewebeflüssigkeiten
vorherrschenden pH-Wert (7,2) verhältnismäßig leicht lösen.
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Die vorliegende Erfindung baut unter anderem auf den folgenden Beobachtungen
auf.
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Während eine Lösung des kristallisierten Insulins mit einer Konzentration
von 40 internationalen Einheiten pro Kubikzentimeter 4 mg Zink (als Chlorid) auf
100 ccm zugesetzt sind, keine bemerkenswerte Depotwirkung besitzt, wird eine sich
über 24 Stunden hinaus erstreckende Insulinwirkung erreicht, wenn man die Lösung
auf pH 5 einstellt und sie stehen läßt. Dabei kristallisiert das gefällte Insulin,
so daß eine Kristallsuspension erhalten wird.
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Der Grund für die beobachtete Depotwirkung ist vermutlich darin zu
finden, daß die im zinkhaltigen Medium suspendierten Insulinkristalle bei dem pH
des Blutes schwerlöslich oder unlöslich sind.
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Weitere Untersuchungen haben gezeigt, daß die gewünschte protrahierte
Wirkung erreicht werden kann, wenn man in einem zur Injektion geeigneten wäßrigen
Medium Insulin in kristalliner Form in Suspension bringt, die Suspension auf einen
pH-Wert von etwa 7 einstellt und ihr einen solchen Gehalt an einem oder mehreren
der Metalle Zink, Kobalt, Nickel, Cadmium und Kupfer, vorzugsweise aber Zink, verleiht,
daß das suspendierte Kristallinsulin unlöslich oder praktisch unlöslich wird und
mindestens einen mit 1% Zink übereinstimmenden Mindestgehalt an einem oder mehreren
der genannten Metalle aufweist.
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Im Hinblick auf den Stand der Technik konnte nicht vorausgesehen werden,
daß es möglich wäre, durch Verwendung von nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten
Insulinkristallsuspensionen eine 24 Stunden oder mehr dauernde Insulinwirkung zu
erreichen. Eine solche Insulinwirkung war bisher nur in Anwesenheit von Protaminen
oder ähnlichen Stoffen erzielt worden. Die Insulinwirkung der von A u b e r t i
n und C h a s s a g n e t t e hergestellten wäßrigen Suspensionen von amorphem Insulin
ist bedeutend kürzer. Diese Suspensionen sind auch in Anbetracht ihres pH-Wertes,
der zu einer Instabilität der Suspensionen führt, für den praktischen Gebrauch ungeeignet.
Während der in der Praxis oft sehr langen Aufbewahrungszeit besteht die Gefahr,
daß das amorphe Insulin teilweise oder vollständig in kristallines Insulin umgewandelt
wird, was eine erhebliche Änderung der Insulinwirkung mit sich bringt.
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Wenn man bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens von
bekannten, einen Zinkgehalt
von etwa 0,4% aufweisende Insulinkristalle
ausgeht, und diese in einer Menge von 40 internationalen Einheiten pro Kubikzentimeter
in einer Zinkchloridlösung suspendiert, die auf einen pH-Wert von 7 eingestellt
ist und beispielsweise 0,008% Zink enthält, und dann die suspendierten Insulinkristalle
abschleudert, findet man überraschenderweise bei Analysierung der Insulinkristalle,
daß diese einen erhöhten Zinkgehalt, nämlich von mehr als 2% aufweisen. Biologische
und klinische Untersuchungen haben gezeigt, daß die verlängerte Insulinwirkung in
gewissem Maße von dem Metallgehalt der suspendierten Insulinkristalle bei pH 7 des
Suspensionsmediums abhängig ist. Demgemäß sollen nach der Erfindung die Insulinkristalle
in der erhaltenen Suspension einen Gehalt an den erwähnten Metallen von mindestens
0,35 Milliäquivalenten pro Gramm der Kristalle, entsprechend etwa 1% Zink, aufweisen.
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Was den pH-Wert der erfindungsgemäßen Suspensionen anbetrifft, so
ist es von Vorteil, daß man in weiterer Ausbildung der Erfindung die Suspensionen
auf den im Blut und in den Gewebeflüssigkeiten vorherrschenden pH-Wert einstellt.
Bei diesem pH-Wert zeigen die Suspensionen eine hohe Stabilität. Sie können selbst
bei erhöhter Temperatur 1 oder 2 Jahre ohne Abänderung ihrer prolongierten Wirkung
aufbewahrt werden.
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Erfindungsgemäß wurde ferner gefunden, daß die Unlöslichkeit der Insulinkristalle
im Suspensionsmedium bei dem pH des Blutes davon abhängig ist, daß im Suspensionsmedium
noch solche Stoffe, insbesondere Puffersubstanzen, anwesend sind, die bei der Herstellung
von klinisch brauchbaren wäßrigen Insulinpräparaten allgemeine Verwendung finden.
Wenn man z. B. gewöhnliche Insulinkristalle in einer wäßrigen Lösung suspendiert,
welche 0,008°/o Zink (als Chlorid) und 1/2o molar Natriumphosphat enthält und auf
pH 5 eingestellt ist, und die Suspension dann auf pH 7 einstellt, gehen die Kristalle
teilweise oder vollständig in Lösung. Wenn unterdessen Nickel an Stelle von Zink
verwendet wird, lösen die Kristalle sich nicht bei einer Änderung des pH nach 7.
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Vermutlich haben die Phosphationen bei neutraler Reaktion eine größere
Affinität zu den Zinkionen als die Insulinkristalle, während die Phosphationen unfähig
sind, die Nickelionen stärker als Insulin zu binden. Es ist bekannt, daß Phosphationen
zinkbindend sind und daß Insulin auch während seiner Kristallisation imstande ist,
Zink zu binden. Es war aber nicht bekannt, daß Phosphationen zu Zinkionen tatsächlich
eine größere Affinität als die Insulinkristalle besitzen.
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Wenn also der Metallgehalt der Suspensionen niedrig gehalten werden
soll, dann wird erfindungsgemäß die Einstellung der Suspensionen auf die angegebenen
pH-Werte durch einen oder mehrere Pufferstoffe, deren Anion das verwendete Metall
bei neutraler Reaktion nicht bindet, vorgenommen.
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Nach einer Ausführungsform des Verfahrens nach der Erfindung werden
Insulinkristalle in einem wäßrigen Medium suspendiert, in dem die erwähnten Metalle
enthalten sind.
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In bezug auf diesen Metallgehalt muß zunächst berücksichtigt werden,
daß zur Bildung von suspendierten Insulinkristallen mit einem gewissen Metallgehalt
ein steigender Metallgehalt des Suspensionsmediums erforderlich ist. Denn wenn die
Suspension 40 internationale Einheiten von Insulin pro Kubikzentimeter enthält,
so erhält man Insulinkristalle mit einem Zinkgehalt von annähernd 2,20/0 bei Einstellung
des pH-Wertes des Mediums auf 7, wenn das Suspensionsmedium Zink in einer Menge
von 0,008% enthält. Hingegen werden Kristalle mit einem Zinkgehalt von etwa 2,6%
erhalten, wenn das wäßrige Medium 10 internationale Einheiten von Insulin pro Kubikzentimeter
enthält. Wenn das Suspensionsmedium einen Insulingehalt von 80 internationalen Einheiten
pro Kubikzentimeter aufweist, so erhält man Insulinkristalle mit einem Zinkgehalt
von etwa 1,8°/o. In allen diesen Fällen wird vorausgesetzt, daß die Kristalle vor
der Suspendierung etwa 0,419/o Zink enthielten. Bei einer vorher festgesetzten Menge
an Insulinkristallen pro Raumeinheit des Suspensionsmediums erzeugt ein steigender
Metallgehalt im Medium einen steigenden Metallgehalt in den Kristallen.
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Bei der in der Praxis am häufigsten verwendeten Insulinkonzentration
von 40 internationalen Einheiten pro Kubikzentimeter und einem zinkhaltigen Suspensionsmedium
mit einem Zinkgehalt von 0,00219/o und Insulinkristallen mit einem Zinkgehalt von
etwa 0,4% erhalten die suspendierten Insulinkristalle bei einem pH-Wert des Suspensionsmediums
von 7 etwa 1,119/o Zink. Bei einem Zinkgehalt des Suspensionsmediums von 0,004%
weisen die Kristalle etwa 1,7 % Zink auf, während ein Zinkgehalt im Suspensionsmedium
von 0,008% den Insulinkristallen einen Zinkgehalt von ungefähr 2,219/o ergibt. Wenn
das Suspensionsmedium etwa 0,03% Zink enthält, werden die suspendierten Insulinkristalle
bei pH 7 des Mediums etwa 2,70/19 Zink enthalten.
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In den obigen Beispielen wird das Suspensionsmedium auf pH 7 eingestellt.
Bei einem höheren. pH-Wert werden die suspendierten Insulinkristalle einen höheren
Zinkgehalt aufweisen, während der Zinkgehalt der suspendierten Kristalle bei einem
niedrigeren pH-Wert kleiner sein wird.
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Ähnliche Bedingungen bestehen für die anderen Metalle. Nach einer
anderen Ausführungsform des Verfahrens nach der Erfindung suspendiert man in einem
wäßrigen, keinen Gehalt der erwähnten Metalle aufweisenden Medium Insulinkristalle
mit einem solchen Metallgehalt, daß der erforderliche Mindestgesamtmetallgehalt
der Suspension erreicht wird. Während des Suspendierens spielt sich eine chemische
Reaktion zwischen den metallreichen Insulinkristallen und dem metallfreien Medium
ab, indem die Kristalle Metall in Form von Metallionen an das Medium abgeben. Es
stellt sich also ein chemisches Gleichgewicht zwischen dem Metallgehalt der suspendierten
Kristalle und dem Metallgehalt des Suspensionsmediums ein. Dieses Gleichgewicht
ist
von der Insulinkonzentration und dem pH-Wert des Mediums abhängig. Bei einem Metallgehalt
der Suspension von mindestens 20 - A - 10-3 Milliäquivalenten pro Liter und bei
einem pH-Wert der Suspension von etwa 7 ist das Gleichgewicht so, daß die Kristalle
fast unlöslich verbleiben. Die Suspension besitzt dann die erfindungsgemäß angebrachte
protrahierte Wirkung.
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Nach einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens erfolgt die Suspendierung
der Insulinkristalle durch Kristallisation des Insulins aus einem zur Injektion
geeigneten sterilen wäßrigen Medium, dem etwaig fehlende Stoffe, wie Isotonika,
Zinkionen oder ähnliche Ionen und/oder p11-korrigierende Stoffe, zugesetzt werden.
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Es ist bekannt (vgl. USA.-Patentschrift 2143 590), Insulin aus einem
wäßrigen Medium zu kristallisieren, das Salze des Zinks, Kobalts, Nickels oder Cadmiums,
vorzugsweise ein Zinksalz, wie Zinkchlorid, und Phosphat- oder Acetatpuffer enthält.
Es ist aber vor der Erfindung nicht vorgeschlagen worden, das Kristallisationsmedium
mit den darin suspendierten Insulinkristallen als ein injizierbares Insulinpräparat
zu verwenden. Auch war es nicht bekannt, daß eine solche Suspension keine brauchbare
protrahierte Insulinwirkung aufweisen würde, wenn sie Phosphatpuffer und ein Zinksalz
enthält. Ferner wurde dem verwendeten Kristallisationsmedium nicht eine solche Zusammensetzung
gegeben, daß sie sich für Injektionszwecke eignet. Schließlich wurden die hergestellten
Insulinkristalle immer von dem Kristallisationsmedium getrennt und für sich zu injizierbaren
Insulinpräparaten verarbeitet.
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Die vorliegende Erfindung beruht weiterhin auf der Beobachtung, daß
die protrahierte Wirkung der hergestellten Insulinkristallsuspensionen in gewissem
Maße von der Größe der suspendierten Kristalle abhängig ist. So scheinen Kristalle
von einer Größe von etwa 10 p. in zinkhaltiger Suspension unter vergleichbaren Bedingungen
eine kürzere Wirkung als Kristalle mit einer Größe von 25 bis 100 #t zu geben. Es
ist deshalb nach der Erfindung vorteilhaft, Insulinkristalle mit einer Größe von
mindestens 10 #L, etwa . von 25 bis 100 Ei, zu verwenden.
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In der Diabetestherapie ist es oft erwünscht, Insulinpräparate zu
verwenden, die nicht nur eine protrahierte Wirkung, sondern auch eine ausgesprochene
Initialwirkung besitzen. Dies kann nach der Erfindung dadurch erreicht werden, daß
man den Insulinkristallsuspensionen amorphes Insulin zuführt. Es ist überraschend,
daß solche kristallines und amorphes Insulin enthaltenden Suspensionen die erforderliche
Stabilität für den praktischen Gebrauch besitzen. Es sollte eigentlich erwartet
werden, daß das in amorphem Zustand anwesende Insulin während der Aufbewahrung in
kristallines Insulin umgewandelt wird, wodurch das Präparat seine gewünschte Initialwirkung
verlieren würde.
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Das bekannte kristallisierte Handelsinsulin enthält etwa 0,4% Zink.
Nach den bekannten Kristallisationsmethodenkönnen aber auch Insulinkristalle hergestellt
werden, die Kobalt, Nickel oder Cadmium enthalten. Auch können Insulinkristalle
mit einem Zinkgehalt von mehr als 0,4%, desgleichen metallfreie Insulinkristalle
hergestellt werden. All diese Insulinkristalle können für die Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens eingesetzt werden.
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Zur Herstellung eines Suspensionsmediums, das einen Gehalt der erwähnten
Metalle aufweist, kann destilliertes Wasser für sich verwendet werden mit einem
Zusatz eines der erwähnten Metalle, z. B. in Form von deren Salzen. Aus klinischen
Gründen ist es jedoch vorteilhafter, isotonische Suspensionsmedien zu verwenden.
Stoffe wie Glukose, Kochsalz oder Glyzerin können verwendet werden, um wäßrige Medien
isotonisch zu machen. Diese Stoffe sind jedoch nur beispielsweise angeführt. Andere
Beispiele ergeben sich aus der auf diesem Gebiet vorhandenen Literatur.
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Im Hinblick auf die Stabilität und Haltbarkeit der Insulinpräparate
ist es vorteilhaft, ein oder mehrere der Konservierungsmittel anzuwenden, wie sie
gewöhnlich bei Injektionsflüssigkeiten verwendet werden. Beispiele hierfür sind
Phenol und Phenolderivate, Methyl-p-oxybenzoesäureester und Propyl-p-oxybenzoesäureester
und Phenylquecksilberacetat.
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Eine Anzahl von Beispielen von wäßrigen Suspensionsmedien, die zur
Herstellung von Insulinpräparaten nach der vorliegenden Erfindung geeignet sind
und die einen Gehalt der erwähnten Metalle aufweisen, sind nachstehend beschrieben.
Beispiel 1 Ein wäßriges Suspensionsmedium, bestehend aus einer isotonischen Lösung,
welcher ein Konservierungsmittel und eines der vorerwähnten Metalle zugesetzt wurden,
kann die folgende Zusammensetzung haben: 0,9 % Natriumchlorid, 0,1% p-Oxybenzoesäuremethylester,
0,004% Zink (als Chlorid).
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Bei Einstellung dieses Suspensionsmediums auf einen pH-Wert zwischen
6 und 7 werden gewöhnliche Insulinkristalle hierin schwerer löslich sein als in
reinem Wasser, und Kristalle mit einem erhöhten Zinkgehalt werden durch Suspension
der Kristalle gebildet. Wenn die Kristalle vor der Suspendierung etwa 0,4% Zink
enthalten und sie in einer solchen Menge zugesetzt wurden, daß die Suspension 40
internationale Einheiten pro Kubikzentimeter enthält, so enthalten die suspendierten
Kristalle etwa 1,71/o Zink.
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Bei der Verwendung von Insulinkristalleii, welche zweckmäßigerweise
größer als 10 #t sein sollen, kann es vorteilhaft sein, dem Medium einen Stabilisator
beizugeben. Der Stabilisator soll die Viskosität des Suspensionsmediums in einem
solchen Grade erhöhen, daß die Kristalle noch eine angemessene Zeit nach dem Schütteln
der Ampulle suspendiert bleiben.
Als Suspensionsstabilisatoren können
beispielsweise hochmolekulare Polysaccharide verwendet werden, jedoch ist die Erfindung
nicht auf deren Verwendung beschränkt. Es können auch andere bekannte Stabilisatoren
verwendet werden, welche unter den in Rede stehenden Bedingungen gegenüber den Insulinkristallen
und den anderen Bestandteilen des Suspensionsmediums inert sind.
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Beispiel 2 Ein wäßriges Suspensionsmedium, das aus einer isotonischen.
Lösung besteht, der ein Konservierungsmittel, eines der erwähnten Metalle und ein
Pufferstoff zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes zugesetzt wurden, kann die folgende
Zusammensetzung haben 0,8% Natriumchlorid, 0,1% p-Oxybenzoesäuremethylester, 0,008%
Zink (als Chlorid), 1/12o molares Natriumacetat.
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Der pH-Wert wird mit NaOH auf etwa 7 eingestellt. Wenn Insulinkristalle,
die etwa 0,4% Zink enthalten, in diesem Medium in einer solchen Menge suspendiert
werden, daß die Suspension 40 internationale Einheiten pro, Kubikzentimeter enthält,
so enthalten die suspendierten Kristalle etwa 2,2% Zink. Beispiel 3 Ein wäßriges
Suspensionsmedium, das die gleiche Azidität wie die Gewebeflüssigkeit im menschlichen
Körper besitzt und mit dem Blut isotonisch ist, kann die folgende Zusammensetzung
haben: 1,3 Volumprozent Glyzerin, 0,1% p-Oxybenzoesäuremethylester, 0,002% Zink
(als Chlorid), 1/12omolare Diäthyl-barbitursäure.
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Der pH-Wert wird mit NaOH auf etwa 7,2 eingestellt. Weniger als 2
internationale Einheiten Insulin pro Kubikzentimeter werden in diesem Suspensionsmedium
in Lösung übergehen. Wenn Insulinkristalle, welche etwa 0,4% Zink enthalten, in
einer solchen Menge hierin suspendiert werden, daß die Suspension 40 internationale
Einheiten pro Kubikzentimeter enthält, so enthalten die suspendierten Kristalle
etwa 1% Zink.
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Beispiel 4 Ein wäßriges Suspensionsmedium mit schwacher alkalischer
Reaktion kann die folgende Zusammensetzung haben: 1,3 Volumprozent Glyzerin, 0,1%
p-Oxybenzoesäuremethylester, 0,16% Zink (als Chlorid), 1/12o molare Borsäure.
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Der pH-Wert wird mit NaOH auf etwa 8 eingestellt. Auch in diesem Suspensionsmedium
werden weniger als 2 internationale Einheiten Insulin pro Kubikzentimeter in Lösung
übergehen. Wenn Insulinkristalle, welche etwa 0,4% Zink enthalten, in diesem Medium
in einer solchen Menge suspendiert werden, daß die Suspension 40 internationale
Einheiten pro Kubikzentimeter enthält, und wenn dann das Suspensionsmedium beispielsweise
mit HCl auf pH 7 eingestellt wird, so enthalten die Insulinkristalle etwa 2,5% Zink.
Beispiel 5 Es wird eine wäßrige Lösung hergestellt, die 0,8 % Natriumchlorid, 0,1%
p-Oxybenzoesäuremethylester, 0,008% Nickel (als Chlorid), 1/12o molares Natriumphosphat
enthält, und die Lösung wird mit HCl auf pH 7 eingestellt.
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Werden Insulinkristalle mit einem Nickelgehalt von etwa 0,3% in dieser
Lösung in einer solchen Menge suspendiert, daß die Suspension 40 internationale
Einheiten pro Kubikzentimeter enthält, so weisen die suspendierten Insulinkristalle
einen Nickelgehalt von etwa 1,2% auf.
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Beispiel 6 Es wird eine wäßrige Lösung hergestellt, die 1,3 Volumprozent
Glyzerin, 0,2% p-Oxybenzoesäuremethylester, 0,014% Cadmium (als Chlorid), 1/12o
molares Natriumacetat enthält und mit NaOH auf pH 7 eingestellt wird. Werden Insulinkristalle
mit einem Zinkgehalt von etwa 0,4% hierin in einer solchen Menge suspendiert, daß
die Suspension 40 internationale Einheiten pro Kubikzentimeter enthält, so weisen
die Insulinkristalle etwa 3% Cd auf. Beispiel ? Es wird eine wäßrige Lösung hergestellt,
die 0,8 % Natriumchlorid, 0,1% p-Oxybenzoesäuremethylester, 0,006% Kupfer (als Chlorid),
1/12o molares Natriumacetat enthält und deren pH-Wert mit HCl auf 6 eingestellt
ist.
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Werden Insulinkristalle mit einem Zinkgehalt von etwa 0,4% hierin
in einer solchen Menge suspendiert, daß 40 internationale Einheiten pro Kubikzentimeter
in der Suspension vorhanden sind, so enthalten die suspendierten Insulinkristalle
Kupfer.
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Der Gehalt der Kristalle an Kupfer und Zink zusammen beträgt mehr
als 0,35 Milliäquivalent.
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Die Suspensionsmedien für die Insulinkristalle sind bei den oben erwähnten
Beispielen derart zusammengesetzt, daß die Kristalle in den Medien praktisch unlöslich
sind. Die so hergestellten Insulinpräparate zeichnen sich infolgedessen in erster
Linie durch ihre verlängerte Wirkung aus. Es können jedoch wie bereits erwähnt auch
Präparate, die teils eine verlängerte Insulinwirkung, teils eine
Initialwirkung
des Insulins aufweisen, hergestellt werden.
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Beispiel 8 Es wird eine salzsaure wäßrige Lösung hergestellt, die
1,3 Volumprozent Glyzerin, 0,1% p-Oxybenzoesäuremethylester, 0,008% Zink (als Chlorid),
1/12o molare Diäthyl-barbitursäure, 0,087% Insulin (23 internationale Einheiten
pro Milligramm), gelöst in HCI, enthält. Der pH-Wert der Lösung wird mit NaOH auf
ungefähr 7 eingestellt, wobei das gelöste Insulin sich in amorphem Zustand niederschlägt
(20 internationale Einheiten pro Kubikzentimeter) . Wenn Insulinkristalle in dem
gebildeten, amorphen Insulin enthaltenden Medium suspendiert werden, so wird bei
subkutaner oder intramuskulärer Injektion der Suspension sowohl ein Initialeffekt
als auch eine Depotwirkung erzielt.
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Beispiel 9 Es wird eine salzsaure wäßrige Lösung hergestellt, welche
0,1% p-Oxybenzoesäuremethylester, 0,008% Zink (als Chlorid), 0,056 % Insulin (24
internationale Einheiten pro Milligramm) in HCl gelöst enthält, und der pH-Wert
der Lösung wird mit NaOH auf etwa 7 eingestellt, wodurch das gelöste Insulin in
amorphem Zustand ausgefällt wird (13,4 internationale Einheiten pro Kubikzentimeter)
.
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9 Volumteile dieser Suspension von amorphem Insulin werden mit 1 Volumteil
einer Insulinkristallsuspension folgender Zusammensetzung vermischt 1,17% Insulinkristalle
(24 internationale Einheiten pro Milligramm) mit einem Zinkgehalt von 0,4 0/0, 7
% Natriumchlorid, 0,1molares Natriumacetat und genügend HCl zur Herbeischaffung
von einem pH-Wert von etwa 5,5.
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Der pH-Wert der Mischung wird mit NaOH auf etwa 7 eingestellt. Bei
subkutaner oder intramuskulärer Injektion gibt diese Mischung einen Initialeffekt
infolge der Anwesenheit von amorphem Insulin und eine verlängerte Wirkung- infolge
der Anwesenheit von Insulinkristallen.
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In den oben erwähnten erläuternden Beispielen wurden die verwendeten
Metalle in Form ihrer Chloride zugesetzt. Es steht jedoch ihrer Hinzufügung in Form
anderer anorganischer oder organischer Verbindungen, wie z. B. Sulfaten, Nitraten
oder Acetaten, nichts im Wege. Auch können Hydroxyde und Oxyde der Metalle verwendet
werden, sofern sie bei der Präparation mindestens teilweise in Lösung gehen, so
daß Metallionen für das Insulin zur Verfügung stehen. Sämtliche Metalle dürfen in
divalenter Form verwendet werden.
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In den vorhergehenden Beispielen sind die Insulinkristalle separat
hergestellt unter Anwendung von aseptischer Kristallisation, und die Kristalle werden
dann einem fertigen, sterilen wäßrigen Suspensionsmedium unter Anwendung aseptischer
Bedingungen zugesetzt.
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Gemäß der Erfindung ist es auch möglich, das Insulin in dem fertigen
Suspensionsmedium kristallisieren zu lassen, wie es beispielsweise in den folgenden
Beispielen beschrieben ist. Beispiel 10
174 mg reines amorphes Insulin werden
in 20 ccm 0,01 n-Salzsäure gelöst, und in der angegebenen Reihenfolge werden hinzugefügt:
20 ccm einer 4%igen Natriumchloridlösung, 10 ccm einer 1/1zmolaren Natriumacetatlösung,
50 ccm einer Lösung, die 0,004% Zink als Zinkchlorid und 0,2 % p-Oxybenzoesäuremethylester
enthält.
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Der pH-Wert wird dann mit Salzsäure auf etwa 5 herabgesetzt, und der
pH-Wert der Suspension wird auf 7 eingestellt. Nach Stehen wird das gefällte Insulin
kristallin.
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Gemäß der Erfindung kann auch die Mutterlauge der Insulinkristalle
als Suspensionsmedium verwendet werden, wobei der Mutterlauge allenfalls fehlende
Stoffe, wie z. B. isotonische Stoffe, Zink oder ähnliche Metalle, Suspensionsstabilisatoren,
und den pH-Wert korrigierende Stoffe ergänzend zugesetzt werden. Beispiel 11 174
mg kristallines Insulin werden in 20 ccm 0,01 n-Salzsäure aufgelöst, wozu 20 ccm
einer 4% Natriumchloridlösung und 10 ccm von 1/1zmolarer Natriumacetatlösung zugesetzt
werden.
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Der pH-Wert der Lösung wird dann auf 5,5 eingestellt. Nach Beendigung
der Kristallisation werden 50 ccm einer Zinkchloridlösung, die 0,0160/0 Zink und
0,2°/o p-Oxybenzoesäuremethylester enthält, hinzugefügt. Der pH-Wert der resultierenden
Suspension wird nachher auf 7 eingestellt.
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Wie aus dem Vorgesagten hervorgeht, kann das Metall sowohl vor als
auch nach der Suspendierung der Insulinkristalle in dem Medium zugesetzt werden.
Es ist demzufolge auch möglich, von aseptisch hergestellten Insulinkristallen auszugehen,
welche in einem wäßrigen Medium suspendiert werden, dem das gewünschte Metall später
zugesetzt wird. Beispiel 12 Es wird eine Lösung hergestellt, die 1,3 Volumprozent
Glyzerin, 0,1% p-Oxybenzoesäuremethylester, 1/12o molares Natriumacetat enthält,
und der pH-Wert wird mit NaOH auf 7 eingestellt. Werden 1,7 g Insulinkristalle mit
einem
Zinkgehalt von etwa 2% in 11 dieser wäßrigen Lösung suspendiert,
so werden die Kristalle ungelöst bleiben, es wird sich aber ein Teil des Zinks in
dem Suspensionsinedium lösen, indem sich ein solches Gleichgewicht einstellt, daß
die suspendierten Kristalle etwa 1,4% Zink enthalten.
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Bei diesem Beispiel wird das in Frage kommende Metall dem Suspensionsmedium
durch die Kristalle zugesetzt, nämlich des Suspendierens.