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Die vorliegende Erfindung betrifft monomere Analoga des Human-Insulins. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung verschiedene parenterale Formulierungen, welche ein monomeres
Insulin-Analogon, Zink, Protamin und ein Phenolderivat enthalten. Die Formulierungen ergeben eine längere Wirkungsdauer. Ein Verfahren zur Herstellung von Insulin-Analogon-Protamin-Formu- lierungen ist ebenfalls beschrieben.
Seit der Einführung des Insulins in den Zwanzigerjahren dieses Jahrhunderts sind kontinuierliche Fortschritte zur Verbesserung der Behandlung des Diabetes mellitus gemacht worden. Grosse
Fortschritte sind hinsichtlich der Reinheit und Verfügbarkeit des Insulins mit der Entwicklung der Technologie unter Verwendung von rekombinanter DNA gemacht worden. Es sind auch verschiedene Formulierungen mit unterschiedlicher Wirksamkeit in bezug auf die Zeit entwickelt worden.
Gegenwärtig sind im Handel generell sieben Insulinformulierungen erhältlich: Reguläres Insulin, Semilente-Insulin, Globin-Insulin, Isophane-Insulin, Insulin-Zink-Suspension, Protamin-Zink-Insulin und Ultralente-Insulin.
Trotz der stattlichen Reihe von verfügbaren Formulierungen ermangelt es der Therapie mit subkutanen Injektionen noch immer daran, für den Patienten eine praktische Regelung und Kontrolle hinsichtlich einer Normalisierung des Blutzuckers zu schaffen. Häufige Abweichungen von den normalen Blutzuckerwerten im Verlauf der Lebenszeit eines Patienten führen zu einer Blutzuckererhöhung (Hyperglykämie) oder zu einer Hypoglykämie sowie zu Langzeit-Komplikationen, einschliesslich einer Retinopathia diabetica, einer Neuropathie, einer Nephropathie und von Mikround Makroangiopathien.
Um die Vermeidung extremer Blutzuckerwerte zu unterstützen, wenden Diabetiker häufig eine Therapie in der Form von Mehrfachinjektionen an, wobei das Insulin zu jeder Mahlzeit verabreicht wird. Diese Therapie ist jedoch noch nicht optimiert worden. Das im Handel erhältliche, am raschesten wirkende Insulin erreicht seine Spitzenwirksamkeit zu spät nach der Injektion, und seine Wirkung hält zu lange an, so dass keine optimale Regelung der Glukosegehalte erzielt wird. In jüngster Zeit sind daher beträchtliche Anstrengungen dahingehend unternommen worden, InsulinFormulierungen und Insulin-Analoga-Formulierungen zu schaffen, welche die Kinetik des Vorganges der subkutanen Resorption verändern.
Da alle im Handel erhältlichen, pharmazeutischen Formulierungen des Insulins dasselbe im selbst-assoziierten Zustand enthalten, und zwar überwiegend in der Form des Hexamers, wird angenommen, dass diejenige Stufe, welche die Geschwindigkeit der Resorption des Insulins aus dem subkutanen Injektionsdepot in den Blutstrom beschränkt, die Dissoziation des selbst-aggregierten Insulin-Hexamers ist. Kürzlich sind monomere Insulin-Analoga entwickelt worden, welche weniger anfällig für eine Assoziation zu Formen von höherem Molekulargewicht als das Humaninsulin sind. Dieser Mangel an Selbst-Assoziation ist auf Modifikationen in der Aminosäurensequenz des Humaninsulins zurückzuführen, welche die Assoziation dadurch verringern, dass sie in erster Linie die Bildung von Dimeren unterbrechen. Siehe z. B.
Brems et al., Protein Engineering, 5:6, 527-533 (1992) ; und Brange et al., Nature, 333 :679-682 (1988).Demgemäss weisen die monome- ren Insulin-Analoga einen vergleichsweise rascheren Beginn der Aktivität als das native HumanInsulin auf, sie behalten aber zugleich die biologische Wirksamkeit des nativen Human-Insulins bei Diese Insulin-Analoga führen zu einer raschen Resorption, mit dem Ziel, die Injektionszeit und die Spitzenaktivität des Insulins näher an die nach dem Essen auftretende, mit der Antwort auf eine Mahlzeit verbundene Abweichung des Glukosespiegels heranzubringen.
Die physikalischen Eigenschaften und Kennzeichen der monomeren Analoga sind zu jenen des Insulins nicht analog. Beispielsweise führen Brems et al. aus, dass verschiedene monomere Analoga nur eine geringe, oder überhaupt keine durch Zink induzierte Assoziation aufweisen.
Jegliche Assoziation, welche beobachtet wird, findet zu einer Vielzahl von Formen mit höherem Molekulargewicht statt. Dies stellt einen drastischen Unterschied zum Insulin dar, welches in Gegenwart von Zink fast ausschliesslich in einer wohlgeordneten Hexamerstruktur vorliegt. Brange et al., Diabetes Care, 13 : (1990). Der Mangel an Assoziierung trägt zu den charakteristi- schen Eigenschaften der raschen Wirksamkeit der Analoga bei. Da die Analoga eine niedrigere Neigung zum Assoziieren aufweisen, ist es durchaus überraschend, dass ein monomeres InsulinAnalogon formuliert werden kann, das eine mittlere Wirkungsdauer aufweist.
Durch die vorliegende Erfindung wird eine Formulierung mit monomeren Insulin-Analoga geschaffen, welche bei ihrer Verwendung eine mittlere Wirkungsdauer ergibt. Die Erfindung schafft
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weiterhin einen neuen, Insulin-Analogon-NPD genannten Protaminkristall. Die vorliegende Erfindung schafft auch ein Gemisch aus Insulin-Analogon-NPD und einem löslichen, monomeren Insulin-Analogon. Dieses Gemisch ergibt einen raschen Wirkungsbeginn und eine mittlere Wirkungsdauer. Demgemäss weist das Gemisch Vorteile sowohl gegenüber dem Insulin als auch gegenüber dem monomeren Analogon auf. Durch die vorliegende Erfindung wird weiterhin ein Verfahren zur Herstellung gleichförmiger Kristalle des insulin-Analogons-NPD zur Verfügung gestellt.
Durch die vorliegende Erfindung wird eine Insulin-Analogon-Protamin-Formulierung geschaffen, welche enthält: ein monomeres Insulin-Analogon, Protamin, Zink und ein Phenolderivat.
Durch die Erfindung wird weiterhin ein Komplex aus einem kristallinen Insulin-Analogon-
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Human-Insulin-NPD enthält: ein LysB28ProB29-Human-lnsulin, 0,27 bis 0,32 mg Protamin/100 E des
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Insulin-NPD zur Verfügung gestellt, welches umfasst : Vereinigen einer wässrigen Lösung von LysB28ProB29-Human-lnsulin in einem hexameren Assoziationszustand, und einer Protaminlösung bei einer Temperatur von 8 bis 22 C; wobei diese wässrige Lösung 0,35 bis 0,9 Gew.-% Zink, LysB28ProB29-Human-lnsulin und ein
Phenolderivat, bei einem pH-Wert von 7,1 bis 7, 6 enthält;
und wobei diese Protaminlösung Protamin bei einem pH-Wert von 7,1 bis 7,6 in einer solchen
Menge enthält, dass die Endkonzentration des Protamins 0,27 bis 0,32 mg Protamin/100 IE (Inter- nationaler Einheiten) des Insulin-Analogons beträgt.
Durch die Erfindung werden auch Formulierungen geschaffen, welche sowohl rasch wirkend als auch von mittlerer Wirksamkeit sind. Die Formulierungen sind Gemische aus monomerem
Insulin-Analogon und kristallinem Insulin-Analogon-NPD, wobei das Gewichtsverhältnis der zwei
Komponenten 1 bis 99 : 99 bis 1 beträgt.
Zum Behandeln eines Patienten, der an Diabetes mellitus leidet, wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche Insulin-Analogon-Protamin-Kristalle enthält, an diesen Patienten verabreicht.
Die Fig. 1 zeigt eine graphische Darstellung des Wirkungsprofiles von LysB28ProB29-hl-NPD und Human-Insulin-NPH. Die Kurve wurde durch Auftragen der Werte von E/ml gegen die Infusionszeit erhalten. Die Fig. zeigt die Vorteile der vorliegenden Erfindung auf.
Die Fig. 2 zeigt eine Abbildung der AspB28-Human-lnsulin-Protamin-Kristalle der vorliegenden Erfindung. Das Bild wurde bei 1000-facher Vergrösserung mit differentiellem Phasenkontrast gemacht.
Die Fig. 3 zeigt eine Abbildung der LysB28ProB29-hl-Protamin-Kristalle der vorliegenden Erfindung. Das Bild wurde bei 1000-facher Vergrösserung mit differentiellem Phasenkontrast gemacht.
Wie oben bereits erwähnt worden ist, werden durch die Erfindung verschiedene Formulierungen eines monomeren Insulin-Analogons geschaffen. Die hierin verwendeten Ausdrücke : meres Insulin-Analogon" oder "Insulin-Analogon" bedeuten ein rasch wirkendes Insulin-Analogon, das für eine Dimerisierung oder Selbst-Assoziation weniger anfällig ist. Das monomere InsulinAnalogon ist ein Human-Insulin, worin Pro in der Position B28 durch Asp, Lys, Leu, Val oder Ala ersetzt worden ist; und Lys in der Position B29 entweder Lysin oder Prolin; Des (B28-B30); oder Des (B27) ist. Monomere Insulin-Analoga sind in der EP 383 472 A und in der EP 214 826 A beschrieben, welche Schriften durch Bezugnahme darauf in die vorliegenden Unterlagen aufgenommen werden.
Ein Fachmann wird erkennen, dass andere Modifikationen an dem monomeren InsulinAnalogon möglich sind. Diese Modifikationen sind auf dem Fachgebiet umfassend anerkannt und umfassen den Ersatz des Histidinrestes in der Position B10 durch Asparaginsäure; den Ersatz des Phenylalaninrestes in der Position B1 durch Asparaginsäure; den Ersatz des Threoninrestes in der Position B30 durch Alanin; den Ersatz des Serinrestes in der Position B9 durch Asparaginsäure; die Deletion der Aminosäure(n) in der alleinigen Position B1 oder in Kombination mit einer Deletion in der Position B2 ; die Deletion des Threonins aus der Position B30.
Alle in dieser Beschreibung verwendeten Abkürzungen für Aminosäuren sind in der Technik üblich. Besonders bevorzugte, monomere Insulin-Analoga sind das LysB28ProB29-Human-lnsulin
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B28 ist Lys ; ist Pro) und das AspB28-Human-lnsulin (B28 ist Asp).
Die Ausdrücke "monomeres Insulin-Analogon-NPD" oder "Insulin-Analogon-NPD" bedeuten eine Suspension von kristallinem Insulin-Analogon und Protamin in einer Formulierung. NPD steht ür Neutral Protamine Formulation gemäss DeFelippis. Die Zusammensetzung wird nach dem hierin beschriebenen, beanspruchten Verfahren hergestellt. Die verwandten Ausdrücke "Insulin-Analo-
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< ristalle" beziehen sich auf die Insulin-Analogon-Protamin-Kristalle in der NPD-Formulie-rung.
Der hierin verwendete Ausdruck "Behandeln" beschreibt die Führung eines Patienten und die =ürsorge für denselben, zu dem Zweck, die Krankheit, den Zustand oder die Störung zu bekämpen, und er umfasst die Verabreichung einer Verbindung gemäss der vorliegenden Erfindung, um @en Ausbruch der Symptome oder Komplikationen zu verhindern, um die Symptome oder Komplicationen zu lindern, oder um die Krankheit, den Zustand oder die Störung zu eliminieren.
Der Ausdruck "isotonisch machendes Mittel" bezieht sich auf ein Mittel, das physiologisch tole- @ert wird, und welches der Formulierung einen geeigneten Tonus von solcher Art verleiht, dass iadurch ein Nettofluss von Wasser quer durch die Zellmembran verhindert wird. Verbindungen, wie :.B. Glycerin, werden gewöhnlich für solche Zwecke in bekannten Konzentrationen verwendet. Die < onzentration des isotonisch machenden Mittels fällt in jenen Bereich, der auf dem Fachgebiet für nsulinformulierungen bekannt ist.
Der Ausdruck "Phenolderivat" steht für m-Kresol, Phenol oder vorzugsweise für ein Gemisch von m-Kresol und Phenol.
Der Ausdruck "bezogen auf die freien Basen" gibt die Menge des Protamins in der Formulieung an. Durch den Bezug auf die freien Basen werden Korrekturen hinsichtlich des Wasser- und 3alzgehaltes der im Handel erhältlichen und gewöhnlich in parenteralen Formulierungen verwen- deten Protaminsalze angebracht. Das bevorzugte Protamin, nämlich Protaminsulfat, ist ein etwa 30%iges Protamin.
Die Ausdrücke "IE" oder "E" stehen für internationale Einheit(en).
Der Ausdruck "Isophanverhältnis" steht für die Gleichgewichtsmenge an Protamin, die nach den Lehren von Krayenbühl und Rosenberg, STENO MEMORIAL HOSPITAL REPORT (KOPEN- @AGEN), 1:60 (1946), zum Komplexieren mit dem Analogon erforderlich ist. Das Isophanverhältnis wird durch Titration auf eine Art und Weise bestimmt, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt und in < rayenbühl et al. beschrieben ist.
Durch die vorliegende Erfindung wird eine Insulin-Analogon-Protamin-Formulierung geschafen, welche enthält : ein monomeres Insulin-Analogon, Protamin, Zink und ein Phenolderivat. Die < onzentration des Protamins beträgt vorzugsweise 0,2 bis 1,5 mg Protamin auf 100 E des Insulin- nalogons, bezogen auf die freien Basen. In höchstem Masse bevorzugt beträgt der Bereich des 'rotamins 0,27 mg/100 E bis 0,35 mg/100 E. Die Zinkkonzentration beträgt 0,35 Gew. -% bis ),9 Gew.-%. Vorzugsweise beträgt die Zinkkonzentration etwa 0,7%.
Das Phenolderivat ist m-Kresol, Phenol oder ein Gemisch aus m-Kresol und Phenol. Vorzugsveise ist das Phenolderivat m-Kresol und Phenol. Die Konzentration des Phenolderivates ist dem =achmann bekannt. Die Konzentrationen müssen ausreichen, um die Wirksamkeit als Konservieungsmittel, nämlich im Sinne einer Hemmung des Mikrobenwachstums, aufrechtzuerhalten. Im allgemeinen liegt die Konzentration der Phenolverbindung z.
B. in einem Bereich von 1,0 mg/ml bis @,0 mg/ml; und vorzugsweise ist sie grösser als etwa 2,5 mg/ml. Die in höchstem Masse bevorzugte Konzentration beträgt etwa 3 mg/ml Das Vorhandensein eines Phenolderivates ist kritisch, weil Jasselbe nicht nur zum Komplexieren des Analogons, des Protamins und des Zinks wirksam ist, sondern auch als Konservierungsmittel dient. Es wird jedoch angenommen, dass nur 1 Molekül @es Phenols pro Molekül des Insulin-Analogons an die Kristallstruktur gebunden ist.
Vorzugsweise wird zu der Formulierung ein isotonisch machendes Mittel zugesetzt. Das bevor- : ugte, isotonisch machende Mittel ist Glycerin. Die Konzentration des isotonisch machenden Mittels beträgt z. B. 14 mg/ml bis 18 mg/ml, vorzugsweise etwa 16 mg/ml.
Der pH-Wert der Formulierung kann mit einem physiologisch tolerierten Puffer, vorzugsweise einem Phosphatpuffer, wie z.B. zweibasigem Natriumphosphat, gepuffert werden. Andere physiolo- jisch tolerierte Puffer umfassen TRIS, Natriumacetat oder Natriumcitrat. Die Auswahl und Kon- :entration des Puffers sind auf dem Fachgebiet bekannt. Im allgemeinen beträgt die Konzentration :.B. etwa 1,5 mg/ml bis 5,0 mg/ml, vorzugsweise 3,8 mg/ml.
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Durch die vorliegende Erfindung werden weiterhin spezifische Bedingungen geschaffen, unter welchen das insulin-Analogon-Protamin als stabiler Kristall vorliegt. Die Formulierungen dieser Kristalle werden als Insulin-Analogon-NPD definiert. Die Insulin-Analogon-NPD ist eine formulierte Suspension von Insulin-Analogon-NPD-Kristallen und ergibt bei ihrer Verwendung eine mittlere Wirkungsdauer. Das Aktivitätsprofil der Insulin-Analogon-NPD ist im Hinblick auf das Fehlen von Selbst-Assoziation des monomeren Analogons durchaus überraschend.
Die Fähigkeit zur Bildung einer Formulierung mit mittlerer Wirkungsdauer mit einem monome-
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NPD und Human-Insulin-NPH. Das NPD-Profil gleicht jenem der Insulin-NPH. Die Wirkungsdauer für die NPD-Formulierung und jene für die Insulin-NPH-Formulierung sind etwa gleich. Am wichtigsten ist es jedoch, dass die vorliegende Formulierung rascher ansteigt und während eines längeren Zeitraumes stabil bleibt als die Insulin-NPH. Dieser Unterschied ist im Hinblick auf das eine schnelle Wirkung anzeigende Profil des monomeren Analogons durchaus unerwartet.
Eine besonders bevorzugte Insulin-Analogon-Protamin-Formulierung, LysB28ProB29-Human- Insulin-NPD, enthält : LysB28ProB29-Human-lnsulin, 0,27 bis 0,32 mg Protamin/100 E des InsulinAnalogons, 0,35 bis 0,9 Gew.-% Zink und ein Phenolderivat. Die Konzentration des Protamins beträgt vorzugsweise 0,3 mg/100 E, bezogen auf die freien Basen.
Durch die Erfindung wird auch ein Verfahren zur Herstellung von LysB28ProB29-Human-lnsulin- Protamin-Kristallen geschaffen, welches Verfahren umfasst:
Vereinigen einer wässrigen Lösung von LysB28ProB29-Human-lnsulin in einem hexameren Assoziationszustand, und einer Protaminlösung bei einer Temperatur von 8 bis 22 C; wobei diese wässrige Lösung 0,35 bis 0,9 Gew.-% Zink, LysB28ProB29-Human-lnsulin und ein Phenolderivat, bei einem pH-Wert von 7,1 bis 7, 6 enthält; und wobei diese Protaminlösung Protamin bei einem pH-Wert von 7,1 bis 7,6 in einer solchen Menge enthält, dass die Endkonzentration des Protamins 0,27 bis 0,32 mg Protamin/100 E (Einheiten) des Insulin-Analogons beträgt.
Zum Zeitpunkt der Erfindung war es bekannt, dass monomere Insulin-Analoga eine geringere Neigung, sich zu assoziieren und Hexamere zu bilden, aufweisen. Die Bedingungen, welche erforderlich sind, um zu bewirken, dass sich die monomeren Insulin-Analoga mit dem Protamin unter Bildung von Kristallen assoziieren, waren bisher auf dem Fachgebiet unbekannt. Frühere Untersuchungen beziehen sich auf Insulin. Die Lehren hinsichtlich der Herstellung der Insulin-NPH (einer neutralen Protaminformulierung gemäss Hagedorn) oder von Isophan-Insulin-Formulierungen gemäss Krayenbühl und Rosenberg, STENO MEMORIAL HOSPITAL REPORT (KOPENHAGEN), 1:60 (1946), sind im Hinblick auf die unterschiedlichen Eigenschaften der monomeren InsulinAnaloga nicht relevant.
Tatsächlich führt das technische Verfahren zur Erzeugung von HumulinNTM (Insulin-NPH), welches ein Säure-neutrales Verfahren ist, nicht zur Erzeugung einer kristallinen Insulin-Analogon-NPD.
Am wichtigsten ist es jedoch, dass gefunden worden ist, dass die Parameter des vorliegenden Verfahrens - nämlich die Temperatur der Kristallisation und die Bildung eines Hexamerkomplexes aus dem Insulin-Analogon, Zink und dem Phenolderivat, kritische Beschränkungen für die Bildung
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Die Kristallisationstemperatur muss 8 C bis 22 C, vorzugsweise 13 C bis 17 C betragen. Liegt die Temperatur ausserhalb dieses Bereiches, dann entsteht eine grösstenteils amorphe InsulinAnalogon-Protamin-Formulierung.
Es ist auch entscheidend, dass das Insulin-Analogon vor der Kristallisation in einen hexameren Zustand umgewandelt wird. Die Kristallisation führt zu einem amorphen Produkt, wenn das Verfahren mit einem monomeren Assoziationszustand durchgeführt wird. Die Kristalle bilden sich ohne Umrühren innerhalb von 5 bis 36 h. Kristalle von guter Qualität bilden sich im allgemeinen in 24 h.
Das lösliche, monomere Insulin-Analogon wird zu einem hexameren Assoziationszustand komplexiert, dass in dem man das feste, monomere Analogon in einem Verdünnungsmittel suspendiert, welches das Phenolderivat enthält, und dass in dem man Zink hinzufügt, bis dessen Konzentration 0,35 Gew. -% bis 0,9 Gew.-% beträgt. Das Zink wird vorzugsweise als Salz zugegeben. Repräsentative Beispiele von Zinksalzen umfassen Zinkacetat, Zinkbromid, Zinkchlorid, Zinkfluorid, Zinkiodid und Zinksulfat. Der Fachmann wird erkennen, dass es viele andere Zinksalze gibt, welche in dem Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden können.
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Vorzugsweise werden Zinkacetat oder Zinkchlorid verwendet.
Dem Auflösen des Insulin-Analogons in dem Verdünnungsmittel kann durch einen Vorgang nachgeholfen werden, der normalerweise als Auflösung in einem sauren Medium bekannt ist. Bei einer Auflösung in einem sauren Medium wird der pH-Wert mit einer physiologisch tolerierten Säure, vorzugsweise HCI, auf etwa 3,0 bis 3,5 abgesenkt, um die Löslichkeit des Analogons zu erhöhen. Andere, physiologisch tolerierte Säuren umfassen Essig-, Zitronen- und Phosphorsäure. Für die Kristallisation wird der pH-Wert dann mit einer physiologisch tolerierten Base, vorzugsweise Natriumhydroxid, auf etwa 7,1 bis 7,6 eingestellt. Andere physiologisch tolerierte Basen umfassen Kaliumhydroxid und Ammoniumhydroxid. YSB28
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NPD-Komplexes auf die Konzentration des NaCI empfindlich reagiert.
Beträgt dessen Konzentra- tion mehr als etwa 4 mg/ml, dann werden die Insulin-Analogon-NPD-Kristalle mit amorphem Pro- dukt vermischt. Demgemäss wird es bevorzugt, dass das monomere Analogon bei einem neutralen pH-Wert aufgelöst wird, um die Bildung von Salzionen zu vermeiden. Alternativ kann das Analogon in dem Verdünnungsmittel bei einem sauren pH-Wert vor der Zugabe des Puffers aufgelöst wer- den. Dadurch wird die Konzentration der Salze verringert, welche aufgrund der Einstellung des pH-
Wertes entstanden sind. Die Reihenfolge, in der die Bestandteile zugegeben werden, ist jedoch für die Bildung des Hexamers oder der amorphen Formulierung nicht kritisch.
Wie oben bereits erwähnt worden ist, kann zu den Formulierungen gemäss der vorliegenden Erfindung ein isotonisch machendes Mittel zugegeben werden. Die Zugabe des isotonisch machen- den Mittels kann zu der Lösung des Analogons, zu der Protaminlösung oder zu der schliesslich erhaltenen Insulin-Analogon-NPD-Formulierung vorgenommen werden. Ebenso kann die Zugabe des physiologisch tolerierten Puffers zu der Lösung des Analogons, zu der Protaminlösung oder zu der schliesslich erhaltenen Insulin-Analogon-NPD-Formulierung vorgenommen werden. Es wird jedoch bevorzugt, dass sowohl die Lösung des Analogons als auch die Protaminlösung das isoto- nisch machende Mittel und den Puffer enthalten, bevor die wässrige Lösung und das Protamin miteinander vereinigt werden.
Wegen der Wirkungen des NaCI auf das Verfahren zur Erzeugung von kristalliner Insulin-Analogon-NPD ist Glycerin das bevorzugte, isotonisch machende Mittel.
Durch die Erfindung werden auch Insulin-Analogon-Formulierungen geschaffen, welche Gemische aus der Insulin-Analogon-NPD als kristallinem Feststoff und löslichem Insulin-Analogon ent- halten. Diese Gemische werden in einem Bereich von etwa 1 :99 bis99 1, für das Verhältnis des Volumens der suspendierten Insulin-Analogon-NPD zu jenem des löslichen Insulin-Analogons, hergestellt. Das lösliche Insulin-Analogon ist ein monomeres Insulin-Analogon, das in einem wässrigen Verdünnungsmittel gelöst ist, welches enthält : Zink, ein Phenolderivat, ein isotonisch machendes Mittel und einen Puffer. Die in dem Verdünnungsmittel vorliegenden Konzentrationen sind die gleichen wie die vorstehend hierin beschriebenen.
Vorzugsweise beträgt das Verhältnis der Insulin- Analogon-NPD zu dem löslichen Insulin-Analogon 25 :75 bis 75 :25; in höherem Masse bevorzugt 50 :50. Gemische werden leicht durch Vermischen der einzelnen Bestandteile hergestellt.
Die vermischten Formulierungen der vorliegenden Erfindung sind zur Behandlung des Diabetes mellitus wegen der Kombination eines raschen Einsetzens der Wirkung und einer längeren Wirkungsdauer besonders gut geeignet. Diese Gemische ermöglichen dadurch eine "Feinregelung", dass man die Menge jedes einzelnen Bestandteiles auf der Basis der Bedürfnisse, der Diät und der körperlichen Betätigungen des Patienten variiert. Die Gemische aus der suspendierten InsulinAnalogon-NPD und aus dem löslichen Insulin-Analogon sind auch vorteilhaft, weil sie homogen sind, was bedeutet, dass ein jeglicher Austausch in dem Gleichgewicht zwischen den suspendierten Kristallen und dem löslichen Insulin-Analogon ein durchsichtiges Gemisch ergibt.
Die Insulin-Analoga der vorliegenden Erfindung können nach irgendeiner aus einer Vielfalt von anerkannten Peptidsynthesetechniken hergestellt werden, einschliesslich der klassischen (Lösungs)verfahren, der Festphasenverfahren, der halbsynthetischen Verfahren und der Verfahren jungeren Datums unter Verwendung von rekombinanter DNA. Beispielsweise beschreiben Chance et al., EP 383 472 A, und Brange et al., EP 214 826 A, die Herstellung verschiedener monomerer Analoga.
Die nachstehenden Beispiele werden bloss zur weiteren Veranschaulichung der Herstellung der Insulin-Analoga und der Erfindung angeführt.
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Beispiel 1
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Eine Lösung von LysB28ProB29- Humaninsulin (LysB28ProB29-hl) mit einer Konzentration von
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System aus Konservierungsmitteln und Puffern aufgelöst wurden, welches enthielt : 1,6 mg/mi m-Kresol, 0,73 mg/mi Phenol (was einem Gehalt von 0,65 mg/ml an Phenol äquivalent ist, welches als 89%ig berechnet wird), 16 mglml Glycerin und 3,78 mg/ml an zweibasigem Natriumphosphatpuffer.
Die endogene Zinkmenge in den Kristallen wurde durch Zugabe eines entsprechenden Volumens einer sauren ZnO-Lösung (10 mg/ml) ergänzt, um eine Endkonzentration von
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peratur bewirkt, indem der pH-Wert mit I-Volumensanteilen von 5M HCI auf etwa 3 abgesenkt
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5M NaOH wieder auf 7,5 eingestellt.
Eine Protaminlösung wurde dadurch hergestellt, dass eine genügende Menge an festem Protaminsulfat in der Lösung aus Konservierungsmitteln und Puffern zur Erzielung einer Endkonzentration von 0,6 mg/100 IE, berechnet mit Bezug auf die freien Basen, aufgelöst wurde. Der pH-Wert dieser Lösung wurde auf 7,5 eingestellt, und es wird bei 15 C äquilibriert.
Beide Lösungen wurden auf die Endkonzentration mit Wasser für Injektionszwecke verdünnt und filtriert. Aliquote Anteile des LysB28ProB29-hl-Unterabschnittes von jeweils 5 ml wurden in getrennte, saubere Glasfläschchen gefüllt, und die Proben wurden in einem Wasserbad von 15 C inkubiert. Nach einer entsprechenden Zeit für die Äquilibrierung, (15 min) wurde die Fällung durch rasche Zugabe von 5 ml der Protaminlösung zu den LysB28Pro 29-hl-Proben induziert. Die Kristalli- sation wurde während etwa 24 h bei 15 C fortschreiten gelassen.
Beispiel 2 Herstellung von Lys ProB29-hl-NPD
Dieses Verfahren ist mit jenem des Beispiels 1 identisch, jedoch mit der Ausnahme, dass die
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derart durchgeführt, dass der End-pH-Wert 7,4 betrug.
Beispiel
Herstellung von Lys ProB29-hl-NPD
Eine Insulin-Analogon-NPD wurde analog zu Beispiel 1 hergestellt, wobei aber die Auflösung
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Puffers aus zweibasigem Natriumphosphat durchgeführt wurde. Das feste, zweibasige Natriumphosphat wird zugesetzt, nachdem die Lösung des Insulin-Analogons wieder auf den pH-Wert von 7,4 zurückgebracht worden ist. Durch die Zugabe des zweibasigen Natriumphosphates wurde die Lösung geklärt.
Beispiel 4
Herstellung von Gemisch-Formulierungen mit einem Gehalt an
B28 B29 Insulin-Analogon-NPD
Gemische von LysB28ProB29-hl-Formulierungen mit mittlerer Wirkungsdauer bzw. mit einem raschen Wirkungsbeginn werden wie folgt hergestellt. Die Suspension des Präparates mit mittlerer Wirkungsdauer wird nach den in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren hergestellt und dient als jener Abschnitt des Gemisches, der eine mittlere Wirkungsdauer hat. Eine getrennte Lösung von
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temperatur in dem in Beispiel 1 beschriebenen Verdünnungsmittel hergestellt. Der Gehalt des Lys 28ProB29-hl an endogenem Zink in dieser Lösung wird durch Zugabe von saurer ZnO-Lösung derart ergänzt, dass dieser Gehalt jenem in dem Suspensionsabschnitt (nämlich 0,025 mg/100 IE (0,7%)) gleichkommt.
Zum Verdünnen der Lösung auf die Endkonzentration, nachdem der pH-Wert unter Verwendung von 10%igen Lösungen von HCI und/oder NaOH auf 7,4 eingestellt worden ist, wird Wasser für Injektionszwecke verwendet. Diese Lösung stellt den Abschnitt der Gemische mit raschem Wirkungsbeginn dar. Das endgültige Gemisch wird durch Vereinigen entsprechender Volumensanteile der Unterabschnitte mit mittlerer Wirkungsdauer bzw. mit raschem Wirkungsbeginn, zur Erzielung des gewünschten Verhältnisses, hergestellt. Ein 50/50-Gemisch wird durch Vereinigen von 1 Vol.-Teil des Abschnittes mit mittlerer Wirkungsdauer mit 1 Vol.-Teil des Abschnittes mit raschem Wirkungsbeginn hergestellt.
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Beispiel 5
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derart zugegeben, dass die Gesamtkonzentration 20,30 bzw. 40 mM (1,2,1,8 bzw. 2,3 mg/mi) betrug.
Die volumensmässige Teilchengrössenverteilung zeigte ein multimodales Verhalten (zusätzliche Spitzen bei kleinen Teilchengrössen) in dem Masse, wie die NaCI-Konzentration erhöht wurde Die volumensmässige, mittlere Teilchengrösse nahm in dem Masse ab, wie die NaCI-Konzentration erhöht wurde, was eine Zunahme an amorphem Material anzeigt. Die Ergebnisse der Bestimmungen der Teilchengrösse gegenüber der NaCI-Konzentration waren die folgenden: [NaCl] Volumensmässige, mittlere Teilchengrösse m
13 mM 3,9
20 mM 3,5
30 mM 3,3
40 mM 3,2
Die mikroskopische Analyse zeigte, dass alle Proben ein Gemisch aus amorphem und kristallinem Material enthielten. Die Probe mit einem Gehalt von 40 mM NaCI bestand hauptsächlich aus amorphem Material und nur sehr wenigen Kristallen.
Beispiel 6
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einer Humaninsulin-NPH
Diese Untersuchung wurde gemäss einem Modell mit sich bei Bewusstsein befindlichen Hunden durchgeführt. Vor dem Beginn der Untersuchung wurden drei Grundproben entnommen. Eine Somatostatin-Infusion (0,3 g/kg/min) wurde in Gang gesetzt. Nach einem Abstand von 10 min wurde eine subkutane Injektion von entweder NPD oder NPH verabreicht. Ein häufiges Überwachen des Plasma-Glukosespiegels wurde eingeleitet, und es wurde eine variable Infusion von (20%iger) Glukose gegeben, um den Blutzuckerspiegel nahe beim normalen Wert zu halten.
Während des gesamten Versuches wurden Proben entnommen und auf immunreaktives Insulin (den Linco-Antikörper) und auf Glukose analysiert. Die Ergebnisse sind in der Fig. 1 dargestellt.
Beispiel 7
Herstellung von Asp(B28)-Analogon-Protamin-Kristallen
Ein Unterabschnitt von Asp(B28)-hl mit einer Konzentration von 200 IE/ml (E200) wurde hergestellt, indem eine lyophilisierte Menge (mit einem Reinheitsgrad von 95%) in einem System aus Konservierungsmitteln und Puffern aufgelöst wurde, welches enthielt : 1,6 mg/ml m-Kresol, 0,73 mg/ml Phenol (was einem Gehalt von 0,65 mg/mi an Phenol äquivalent ist, welches als 89%ig berechnet wird), 16 mg/ml Glycerin und 3,78 mg/ml an zweibasigem Natriumphosphatpuffer. Zu dem System wurde unter Verwendung eines entsprechenden Volumens einer sauren ZnO-Lösung (10 mg/mi) Zink zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,025 mg/100 IE zu erzielen. Die Auflösung des Asp(B28) wurde bei Umgebungstemperatur bei einem neutralen pH-Wert bewirkt.
Der End-pH-Wert des Abschnittes betrug 7,4.
Eine Kristallisation wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Die End-Protaminkonzentrationen von 0,3 mg/100E, 0,35 mg/100E und 0,4 mg/100E wurden untersucht. Diese Protaminkonzentrationen entsprechen 2,9%, 9,3% bzw. 10,5%, bezogen auf Gew./Gew.-Werte.
Die Inkubationstemperaturen umfassten 5 C (nur 0,3 mg/100E), 15 C und 22 C. Nach 24 h bei diesen Temperaturen wurden die Proben auf Kristallbildung analysiert. Die durch Mikroskopie bestimmten Ergebnisse zeigen ein Gemisch aus einigen wenigen Kristallen und einem amorphen Produkt.
Beispiel 8
Herstellung von Asp(B28)-Analogon-Protamin-Kristallen
Die Kristallisation des Asp(B28)-Protamins wurde wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, dass das Protein zuerst in einem pufferfreien Verdünnungsmittel aufgelöst wurde. Die Zugabe des sauren ZnO-Vorratsmaterials reichte aus, um die Probe auf einen pHWert von 2,0 bis 2,5 anzusäuern. Nachdem sich die Lösung geklärt hatte, wurde der pH-Wert mit Ill-Volumensanteilen von 5N NaOH wieder auf einen pH-Wert von etwa 7 eingestellt. Zweibasiges
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Natriumphosphat wurde unter Verwendung einer konzentrierten Vorratslösung mit einer Konzentration von 47,25 mg/ml zugegeben, um eine Endkonzentration von 3,78 mg/ml zu erzielen. Unter
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eingestellt.
Die Kristallisation wurde durch Vereinigen des Asp (B28)-Abschnittes dem Protamm- Abschnitt, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben, eingeleitet. Die End-Protaminkonzentrationen von 0,3 mg/100E, 0,35 mg/100E und 0,4 mg/100E wurden untersucht. Die Inkubationstemperaturen umfassten 15 C und 22 C. Nach 24 h bei diesen Temperaturen wurden die Proben auf Kristallbildung analysiert. Die durch Mikroskopie bestimmten Ergebnisse zeigen ein Gemisch aus einigen wenigen Kristallen und einem amorphen Material.
Beispiel 9
Herstellung von Leu(B28)Pro(B29)-Analogon-Protamin-Kristallen Ein Unterabschnitt von Leu (B28)Pro(B29) einem Reinheitsgrad von 93%) und mit einer Konzentration von 200 IE/ml (E200) wurde wie in Beispiel 8 beschrieben unter Verwendung eines sauren Mediums zum Auflösen der Masse und anschliessendem Einstellen des pH-Wertes mit 5N NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 hergestellt. Die Kristallisation war wie oben beschrieben. Die End-Protaminkonzentrationen von 0,3 mg/100E, 0,35 mg/100E und 0,4 mg/100E wurden untersucht. Die Inkubationstemperaturen umfassten 5 C, 15 C und 22 C. Nach 24 h bei diesen Temperaturen enthalten alle Proben einige Kristalle, doch waren sie in erster Linie amorph, wie durch Mikroskopie festgestellt wurde.
Beispiel 10
Des(B27)hl-Protamin-Kristalle
Ein Unterabschnitt von DesThr(B27)hl (mit einem Reinheitsgrad von 97,37%) und mit einer Konzentration von 200 IE/ml (E200) wurde wie in Beispiel 8 beschrieben unter Verwendung eines sauren Mediums zum Auflösen der Masse und anschliessendem Einstellen des pH-Wertes mit 5N NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 hergestellt. Eine Kristallisation wurde wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt. Die End-Protaminkonzentrationen von 0,3 mg/100E, 0,35 mg/100E und 0,4 mg/100E wurden untersucht. Die Inkubationstemperaturen umfassten 15 C und 22 C. Nach 24 h bei diesen Temperaturen waren alle Proben in erster Linie amorph, wie durch Mikroskopie festgestellt wurde. Qualitativ wurden Kristalle beobachtet.
Beispiel 11 Des(B28-B30)hl-Protamin
Ein Unterabschnitt von Des(28-30)hl (mit einem Reinheitsgrad von 96,3%) und mit einer Konzentration von 200 IE/ml (E200) wurde wie in Beispiel 8 beschrieben unter Verwendung eines sauren Mediums zum Auflösen der Masse und anschliessendem Einstellen des pH-Wertes mit 5N NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 hergestellt. Unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens mit Verwendung einer Kombination eines neutralen Proteinabschnittes und eines neutralen Protaminabschnittes wurde eine Kristallisation versucht. Die End-Protaminkonzentrationen von 0,3 mg/100E, 0,35 mg/100E und 0,4 mg/100E wurden untersucht. Die Inkubationstemperaturen umfassten 15 C und 22 C. Nach 24 h bei diesen Temperaturen waren alle Proben in erster Linie amorph, wie durch Mikroskopie festgestellt wurde. Qualitativ wurden Kristalle beobachtet.
Die Kristalle waren wohldefiniert.
Beispiel 12
Asp(B28)-Analogon-Protamin
Es wurde eine Lösung eines Insulin-Asp(B28)-Humaninsulin-Analogons durch Auflösen von 16,6 mg des Proteins in 1 ml einer Lösung, welche 3,2 mg/ml m-Kresol, 1,3 mg/ml Phenol und 32 mg/ml Glycerin enthielt, hergestellt. Es wurde ein aliquoter 14,4 pl-Anteil einer sauren Zinkvorratslösung (10 mg/ml an Zn2+, welche durch Auflösen von 0,311 g Zinkoxid in 5 ml einer 10%igen HCI-Lösung und Verdünnen mit Wasser auf 25 ml hergestellt worden war) zugegeben.
Der pH-Wert der Lösung betrug 2,3, was eine vollständige Auflösung des Proteins ermöglichte. Ein aliquoter 10 l-Anteil einer 10%igen NaOH-Lösung wurde zugegeben, um den pH-Wert auf 7,06 einzustellen. Zu der Lösung wurden 100 l eines 0,28 M zweibasigen Natriumphosphates vom pH 7,0 zugegeben, wodurch der pH-Wert der Lösung auf 7,27 erhöht wurde. Zu der Lösung wurde ein aliquoter 870 l-Anteil von Wasser für Injektionszwecke zugegeben. Es wurden weitere 10%ige HCI (1 l) und 10%iges NaOH (0,7 l) zugegeben, und das endgültige Volumen der Lösung wurde
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mit Wasser für Injektionszwecke auf 2 ml gebracht, was zu einem endgültigen pH-Wert von 7,26
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Sciences-Filter filtriert.
Die Protaminvorratslösungen wurden durch Auflösen des Protaminsulfates in einer Lösung hergestellt, welche 1,6 mg/ml m-Kresol, 0,65 mg/mi Phenol, 16 mg/ml Glycerin und 14 mM zweibasiges Natriumphosphat enthielt. Der End-pH-Wert der Lösung wurde auf 7,3 eingestellt. Die Endkonzentration des Protamins betrug 0,60 mg/100 E, bezogen auf die freien Basen. Beide Lösungen
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Die Kristallisation wurde durch Vermischen mit der Lösung des Asp(B28)-Humaninsulins in ei- nem Verhältnis von 1 :1 bei einer geregelten Temperatur, wie dies in der Tabelle 1 angeführt ist, bewirkt. Die Bedingungen des Endgemisches waren 3,94 mg/ml Asp(B28)-Humaninsulin, 0,0359 mg/ml (0,9%) Zinkionen, 1,6 mg/ml m-Kresol, 0,65 mg/ml Phenol, 16 mg/ml Glycerin, 14 mM zweibasiges Natriumphosphat und 0,30 mg/100E Protamin vom pH 7,3. Spezifisch wurden 50 bis 200 l-Anteile der Lösung des AspB28-Humaninsulins in Glasfläschchen transferiert, und die Proben wurden bei 4,8, 15 oder 23 C (Umgebungstemperatur) äquilibriert. Teile beider Protaminlösungen wurden ebenfalls bei diesen Temperaturen äquilibriert.
Nach 15 bis 20 min wurde ein äquivalentes Volumen von einer der beiden Protaminlösungen in die Asp(B28)-Humaninsulinproben pipettiert. Die Gemische wurden leicht verwirbelt, mit einer Kappe versehen und dann während der Kristallisationsperiode bei einer geregelten Temperatur ruhiggestellt belassen. Alle Proben wurden nach 24 h durch Mikroskopie geprüft, wobei festgestellt wurde, dass sie überwiegend amorph sind. Nach 48 h zeigte die Probe, welche 0,30 mg/100 E des Protamins enthielt und die bei 15 C inkubiert worden war, ausgedehnte Mengen von nadelartigen Kristallen und etwas amorphes Material.
Beispiel 13
Eine Lösung eines Insulin-Asp(B28)-Humaninsulin-Analogons wurde durch Auflösen von 10,62 mg des Proteins in 0,71 ml einer Lösung hergestellt, welche 3,2 mg/ml m-Kresol, 1,3 mg/ml Phenol und 32 mg/ml Glycerin enthielt. Es wurde ein aliquoter 10,2 l-Anteil einer sauren Zinkvorratslösung (10 mg/ml an Zn2+, welche durch Auflösen von 0,311 g Zinkoxid in 5 ml einer 10%igen HCI-Lösung und Verdünnen mit Wasser auf 25 ml hergestellt worden war) zugegeben. Der pH-Wert der Lösung betrug 2,3, was eine vollständige Auflösung des Proteins ermöglichte. Ein aliquoter 6,5 ml-Anteil einer 10%igen NaOH-Lösung wurde zugegeben, um den pH-Wert auf 7,00 einzustellen. Zu der Lösung wurden 71 l eines 0,28 M zweibasigen Natnumphosphates vom pH 7,0 zugegeben, wodurch der pH-Wert der Lösung auf 7,26 erhöht wurde.
Zu der Lösung wurde ein aliquoter 620 I-Anteil von Wasser für Injektionszwecke zugegeben. Es wurden weitere 10%ige HCI (0,2 l) und 10%iges NaOH (0,6 l) zugegeben, und das endgültige Volumen der Lösung wurde mit Wasser für Injektionszwecke auf 1,42 ml gebracht, was zu einem endgültigen pH-Wert
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Gelman Sciences-Filter filtriert.
Eine Protaminvorratslösung wurde durch Auflösen des Protaminsulfates in einer Lösung hergestellt, welche 1,6 mg/mi m-Kresol, 0,65 mg/ml Phenol, 16 mg/ml Glycerin und 14 mM zweibasi- ges Natriumphosphat enthielt. Der End-pH-Wert der Lösung wurde auf 7,4 eingestellt ; die Endkonzentration des Protamins betrug 0,60 mg/100 E, bezogen auf die freien Basen. Die Lösung
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Die Kristallisation wurde durch Vermischen der Lösung des Asp(B28)-Humaninsulins mit der Protaminlösung in einem Verhältnis von 1:1 und bei geregelten Temperaturen von 13 C, 15 C, 17 C und 23 C, wie in Beispiel 12 beschrieben, bewirkt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 dargestellt. Die Bedingungen des Endgemisches waren 3,74 mg/ml Asp(B28)-Humaninsulin, 0,0359 mg/ml (0,9%) Zinkionen, 1,6 mg/ml m-Kresol, 0,65 mg/ml Phenol, 16 mg/ml Glycerin, 14 mM zweibasiges Natriumphosphat und 0,30 mg/100E an Protamin vom pH 7,4. Es wurden vier verschiedene Kristallisationstemperaturen bewertet. Ein aliquoter 1 ml-Anteil des bei 15 C äquilibrierten AspB28-Humaninsulins wurde mit 1 ml der auf die gleiche Temperatur eingestellten Protaminlösung vermischt. Nach einem leichten Verwirbeln wurde das Präparat bei 15 C ruhiggestellt belassen.
Eine andere Probe wurde durch Äquilibrieren von 100 l der Lösung des Asp(B28)Humaninsulins bei 13 C und anschliessendes Vereinigen mit 100 l der auf die gleiche Temperatur eingestellten Protaminlösung hergestellt. Das Endgemisch wurde bei 13 C inkubiert. Die dritte
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Probe wurde in ähnlicher Weise hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, dass die zwei aliquoten 100 l-Anteile äquilibriert, miteinander vereinigt und dann bei 17 C inkubiert wurden. Die als Endprodukt dienende Lösung wurde durch Vermischen von bei Umgebungstemperatur äquilibrierten, aliquoten 80 l-Anteilen des Asp(B28)-Humaninsulins mit den ebenfalls bei Umgebungstemperatur äquilibrierten, aliquoten 80 I-Anteilen der Protaminlösung und Inkubieren bei Umgebungstemperatur (23 C) hergestellt.
Alle Proben wurden nach 24 h und zu anderen Zeitintervallen danach, wie in Tabelle 1 angeführt, durch Mikroskopie bewertet.
Tabelle 1
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[AspB28] [Protamin] Temperatur Zeit Ergebnisse aus (mg/ml) (mg/100E) ( C) (h) der Mikroskopieb)
3,94 0,30 15 24 amorph
48 kristallin
72 kristallin
96 kristallin
120 kristallin
3,94 0,30 23 24 amorph
48 amorph
72 amorph
3,74 0,30 13 24 amorph
40 kristallin/amorph
48 kristallin/amorph
69 kristallin/amorph
3,74 0,30 15 24 amorph/kristallin
40 kristallin
48 kristallin
69 kristallin
3,74 0,30 17 24 amorph/wenige
Kristalle
40 kristallin/amorph
48 kristallin/amorph
69 kristallin/amorph
3,74 0,30 23 24 amorph
40 amorph/wenige
Kristalle
48 amorph/wenige
Kristalle
69 amorph/wenige
Kristalle a) Alle Lösungen enthielten auch 0,9% Zinkionen, 1,6 mg/mi m-Kresol, 0,65 mg/ml Phenol,
16 mg/ml Glycerin und 14 mM zweibasiges Natriumphosphat, pH 7,4.
b) Die Ergebnisse hinsichtlich der Kristallisation wurden durch Mikroskopie bei 600-facher Ver- grösserung (mit einem Mikroskop vom Typus "Nikon Optiphot 66 Microscope") oder bei
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1000-facher Vergrösserung (mit einem Mikroskop vom Typus "Zeiss Axioplan Mikroskop" mit
Differentialgrenzflächenkontrast) bewertet. Beide Mikroskope waren mit Zusatzgeräten zum
Photographieren ausgestattet.
Kristalle, die nach den obigen Beispielen hergestellt worden sind, sind in den Fig. 2 und 3 dargestellt.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Insulinanalogon-Protamin-Komplex, dadurch gekennzeichnet dass er enthält: Humaninsu- lin, worin Pro in der Position B28 durch Asp, Lys, Leu, Val oder Ala ersetzt ist und Lys in der Position B29 Lys oder Pro ist, Des(B28-B30)-Humaninsulin oder Des(B27)-Human- insulin; sowie Protamin, Zink und ein Phenolderivat; mit der Massgabe, dass dann, wenn
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10 Gew.-% beträgt.