JPH083064A - 単体インスリン類似体製剤 - Google Patents
単体インスリン類似体製剤Info
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- JPH083064A JPH083064A JP7147296A JP14729695A JPH083064A JP H083064 A JPH083064 A JP H083064A JP 7147296 A JP7147296 A JP 7147296A JP 14729695 A JP14729695 A JP 14729695A JP H083064 A JPH083064 A JP H083064A
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- A61K38/22—Hormones
- A61K38/28—Insulins
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、単体インスリン類似体、亜鉛、プ
ロタミン、およびフェノール誘導体を含む、非経口医薬
製剤を提供する。 【効果】 該類似体製剤は延長した作用期間を提供す
る。
ロタミン、およびフェノール誘導体を含む、非経口医薬
製剤を提供する。 【効果】 該類似体製剤は延長した作用期間を提供す
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒト・インスリンの単体
類似体に関する。特に本発明は、単体インスリン類似
体、亜鉛、プロタミン、およびフェノール誘導体を含む
種々の非経口製剤に関する。本製剤は延長された作用期
間を提供する。インスリン類似体−プロタミン製剤を調
製するための方法もまた記載する。
類似体に関する。特に本発明は、単体インスリン類似
体、亜鉛、プロタミン、およびフェノール誘導体を含む
種々の非経口製剤に関する。本製剤は延長された作用期
間を提供する。インスリン類似体−プロタミン製剤を調
製するための方法もまた記載する。
【０００２】
【従来の技術】１９２０年代のインスリン導入以来、耐
え間なしの進歩により真性糖尿病の治療が改善されてい
る。インスリンの精製および組換えＤＮＡ技術の発展に
伴う有効性において主に進歩がなされている。異なる時
間作用をもつ種々の製剤もまた開発されている。現在、
一般に７つの市販のインスリン製剤：規定インスリン、
セミレンテ・インスリン、グロビン・インスリン、イソフ
ァン・インスリン、インスリン亜鉛懸濁液、プロタミン
亜鉛インスリン、およびウルトラレンテ・インスリンが
ある。
え間なしの進歩により真性糖尿病の治療が改善されてい
る。インスリンの精製および組換えＤＮＡ技術の発展に
伴う有効性において主に進歩がなされている。異なる時
間作用をもつ種々の製剤もまた開発されている。現在、
一般に７つの市販のインスリン製剤：規定インスリン、
セミレンテ・インスリン、グロビン・インスリン、イソフ
ァン・インスリン、インスリン亜鉛懸濁液、プロタミン
亜鉛インスリン、およびウルトラレンテ・インスリンが
ある。
【０００３】利用可能な製剤が揃っているにもかかわら
ず、皮下注射治療によって患者に好都合な調整および正
常化された血糖調節を今なお提供するに及ばずにいる。
患者の生涯にわたる正常な血糖値からの頻繁な逸脱は、
高血糖または低血糖、および長期の余病、例えば、網膜
障害、神経障害、腎障害、ならびに細小血管障害および
大血管障害を導く。
ず、皮下注射治療によって患者に好都合な調整および正
常化された血糖調節を今なお提供するに及ばずにいる。
患者の生涯にわたる正常な血糖値からの頻繁な逸脱は、
高血糖または低血糖、および長期の余病、例えば、網膜
障害、神経障害、腎障害、ならびに細小血管障害および
大血管障害を導く。
【０００４】極端な血糖値の回避を助けるために、糖尿
病患者は、インスリンを食事毎に投与する複数回注射治
療を行なうことが多い。しかし、この治療はまだ最大限
に利用されていない。市販の最も迅速に作用するインス
リンは、注射後にピークに達するのが余りにも遅く、余
りにも長く持続するので、血糖値を調節するのに最適で
はない。故に、皮下吸収法の速度論を変えるインスリン
製剤およびインスリン類似体製剤の製作に、相当の努力
がなされている。
病患者は、インスリンを食事毎に投与する複数回注射治
療を行なうことが多い。しかし、この治療はまだ最大限
に利用されていない。市販の最も迅速に作用するインス
リンは、注射後にピークに達するのが余りにも遅く、余
りにも長く持続するので、血糖値を調節するのに最適で
はない。故に、皮下吸収法の速度論を変えるインスリン
製剤およびインスリン類似体製剤の製作に、相当の努力
がなされている。
【０００５】市販のインスリン医薬製剤の全部が、自己
会合状態で主にヘキサマー型であるインスリンを含有す
るので、皮下注射貯留物から血流へのインスリン吸収に
ついて速度を制限する手段は、自己凝集インスリン・ヘ
キサマーの解離であると考えられる。最近、ヒト・イン
スリンよりも会合して高分子量の形態になる傾向の少な
い単体インスリン類似体が開発されている。この自己会
合性の欠如は、二量体の形成を主に途絶えさせることに
よって会合を減少させる、ヒト・インスリンのアミノ酸
配列の修飾によるものである［例えば、Bremsら、Prote
in Engineering, 5:6, 527-533(1992) およびBrange
ら、Nature, 333:679-682(1988) を参照］。従って、単
体のインスリン類似体は比較的迅速に活性を開始する
が、天然ヒト・インスリンの生物学的活性を保持してい
る。これらインスリン類似体は、インスリンの注射時間
および作用ピークを食事への応答に伴う食後のグルコー
ス可動域と密接させるための迅速な吸収を提供する。
会合状態で主にヘキサマー型であるインスリンを含有す
るので、皮下注射貯留物から血流へのインスリン吸収に
ついて速度を制限する手段は、自己凝集インスリン・ヘ
キサマーの解離であると考えられる。最近、ヒト・イン
スリンよりも会合して高分子量の形態になる傾向の少な
い単体インスリン類似体が開発されている。この自己会
合性の欠如は、二量体の形成を主に途絶えさせることに
よって会合を減少させる、ヒト・インスリンのアミノ酸
配列の修飾によるものである［例えば、Bremsら、Prote
in Engineering, 5:6, 527-533(1992) およびBrange
ら、Nature, 333:679-682(1988) を参照］。従って、単
体のインスリン類似体は比較的迅速に活性を開始する
が、天然ヒト・インスリンの生物学的活性を保持してい
る。これらインスリン類似体は、インスリンの注射時間
および作用ピークを食事への応答に伴う食後のグルコー
ス可動域と密接させるための迅速な吸収を提供する。
【０００６】単体類似体の物理的性質および特徴はイン
スリンに類似していない。例えば、種々の単体類似体は
殆ど、または全く亜鉛によって誘導される会合をしない
ことをＢremsらが開示している。観察されたどの会合
も、多数の高分子量型に属する。これは、亜鉛の存在下
において殆ど専ら整列したヘキサマー・コンフォメーシ
ョンをとるインスリンと目覚ましく異なる［Brangeら、
Diabetes Care, 13:923-954(1990)］。この会合の欠如
が類似体の即作用性質の原因となる。類似体は会合する
傾向が低いので、単体インスリン類似体を製剤化して中
時間の作用期間を提供し得ることは、全く驚くべきこと
である。
スリンに類似していない。例えば、種々の単体類似体は
殆ど、または全く亜鉛によって誘導される会合をしない
ことをＢremsらが開示している。観察されたどの会合
も、多数の高分子量型に属する。これは、亜鉛の存在下
において殆ど専ら整列したヘキサマー・コンフォメーシ
ョンをとるインスリンと目覚ましく異なる［Brangeら、
Diabetes Care, 13:923-954(1990)］。この会合の欠如
が類似体の即作用性質の原因となる。類似体は会合する
傾向が低いので、単体インスリン類似体を製剤化して中
時間の作用期間を提供し得ることは、全く驚くべきこと
である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、使用の際に
中時間の作用期間をもたらす単体インスリン類似体製剤
を提供する。さらに本発明は、インスリン類似体−ＮＰ
Ｄと称される新規プロタミン結晶を提供する。また本発
明は、インスリン類似体−ＮＰＤおよび可溶性単体イン
スリン類似体の混合物を提供する。この混合物は迅速な
作用開始および中時間作用期間を提供する。従って、本
混合物はインスリンおよび単体類似体の両方に優れる利
点を有する。さらに本発明は、インスリン類似体−ＮＰ
Ｄの単一結晶を調製するための方法について定める。
中時間の作用期間をもたらす単体インスリン類似体製剤
を提供する。さらに本発明は、インスリン類似体−ＮＰ
Ｄと称される新規プロタミン結晶を提供する。また本発
明は、インスリン類似体−ＮＰＤおよび可溶性単体イン
スリン類似体の混合物を提供する。この混合物は迅速な
作用開始および中時間作用期間を提供する。従って、本
混合物はインスリンおよび単体類似体の両方に優れる利
点を有する。さらに本発明は、インスリン類似体−ＮＰ
Ｄの単一結晶を調製するための方法について定める。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、単体インスリ
ン類似体、プロタミン、亜鉛、およびフェノール誘導体
を含むインスリン類似体−プロタミン製剤を提供する。
さらに本発明は、結晶性インスリン類似体−プロタミン
複合体を提供する。この複合体はインスリン類似体−Ｎ
ＰＤと定義されている。ＬysB28ＰroB29−ヒト・インス
リン−ＮＰＤは、ＬysB28ＰroB29−ヒト・インスリン、
約０.２７〜０.３２mg/(１００Ｕ インスリン類似体)の
プロタミン、約０.３５〜０.９重量％の亜鉛、およびフ
ェノール誘導体を含む。
ン類似体、プロタミン、亜鉛、およびフェノール誘導体
を含むインスリン類似体−プロタミン製剤を提供する。
さらに本発明は、結晶性インスリン類似体−プロタミン
複合体を提供する。この複合体はインスリン類似体−Ｎ
ＰＤと定義されている。ＬysB28ＰroB29−ヒト・インス
リン−ＮＰＤは、ＬysB28ＰroB29−ヒト・インスリン、
約０.２７〜０.３２mg/(１００Ｕ インスリン類似体)の
プロタミン、約０.３５〜０.９重量％の亜鉛、およびフ
ェノール誘導体を含む。
【０００９】さらに本発明は、約８〜２２℃の温度で、
ヘキサマー会合状態のＬysB28ＰroB 29−ヒト・インスリ
ン水溶液とプロタミン溶液を混合することからなる、Ｌ
ysB28ＰroB29−ヒト・インスリン−ＮＰＤを調製するた
めの方法を提供し、該水溶液は、pＨ約７.１〜７.６
で、約０.３５〜０.９重量％の亜鉛、ＬysB28ＰroB29−
ヒト・インスリン、およびフェノール誘導体を含み；該
プロタミン溶液は、pＨ約７.１〜７.６でプロタミンを
含み、最終プロタミン濃度が約０.２７〜０.３２mg/(１
００Ｕ インスリン類似体)である］。また本発明は、迅
速かつ中時間作用をする製剤を提供する。該製剤は、重
量比が約１〜９９：９９〜１である単体インスリン類似
体および結晶性インスリン類似体−ＮＰＤの混合物であ
る。最後に本発明は、真性糖尿病を患う患者にインスリ
ン類似体−プロタミン結晶を含有する医薬組成物を投与
することからなる、該患者を治療する方法を提供する。
ヘキサマー会合状態のＬysB28ＰroB 29−ヒト・インスリ
ン水溶液とプロタミン溶液を混合することからなる、Ｌ
ysB28ＰroB29−ヒト・インスリン−ＮＰＤを調製するた
めの方法を提供し、該水溶液は、pＨ約７.１〜７.６
で、約０.３５〜０.９重量％の亜鉛、ＬysB28ＰroB29−
ヒト・インスリン、およびフェノール誘導体を含み；該
プロタミン溶液は、pＨ約７.１〜７.６でプロタミンを
含み、最終プロタミン濃度が約０.２７〜０.３２mg/(１
００Ｕ インスリン類似体)である］。また本発明は、迅
速かつ中時間作用をする製剤を提供する。該製剤は、重
量比が約１〜９９：９９〜１である単体インスリン類似
体および結晶性インスリン類似体−ＮＰＤの混合物であ
る。最後に本発明は、真性糖尿病を患う患者にインスリ
ン類似体−プロタミン結晶を含有する医薬組成物を投与
することからなる、該患者を治療する方法を提供する。
【００１０】上述のように、本発明は種々の単体インス
リン類似体製剤を提供する。明細書中に用いる用語「単
体インスリン類似体」または「インスリン類似体」は、
二量体化または自己会合する傾向の少ない即作用性イン
スリン類似体である。単体インスリン類似体は、Ｂ２８
位のＰroがＡsp、Ｌys、Ｌeu、Ｖal、もしくはＡlaと置
換されていて、かつＢ２９位のＬysがＬysもしくはＰro
であるヒト・インスリン、デス(Ｂ２８−Ｂ３０)−ヒト・
インスリン、またはデス(Ｂ２７)−ヒト・インスリンで
ある。単体インスリン類似体は、Ｃhanceら［欧州特許
公開第383472号］およびＢrangeら［欧州特許公開第214
826号］に記載されている（これらは本明細書の一部を
構成する）。
リン類似体製剤を提供する。明細書中に用いる用語「単
体インスリン類似体」または「インスリン類似体」は、
二量体化または自己会合する傾向の少ない即作用性イン
スリン類似体である。単体インスリン類似体は、Ｂ２８
位のＰroがＡsp、Ｌys、Ｌeu、Ｖal、もしくはＡlaと置
換されていて、かつＢ２９位のＬysがＬysもしくはＰro
であるヒト・インスリン、デス(Ｂ２８−Ｂ３０)−ヒト・
インスリン、またはデス(Ｂ２７)−ヒト・インスリンで
ある。単体インスリン類似体は、Ｃhanceら［欧州特許
公開第383472号］およびＢrangeら［欧州特許公開第214
826号］に記載されている（これらは本明細書の一部を
構成する）。
【００１１】当業者は、単体インスリン類似体への他の
修飾が可能であることを認識するであろう。これら修飾
は当分野において広く許容され、Ｂ１０位のヒスチジン
残基とアスパラギン酸の置換、Ｂ１位のフェニルアラニ
ン残基とアスパラギン酸の置換、Ｂ３０位のスレオニン
残基とアラニンの置換、Ｂ９位のセリン残基とアスパラ
ギン酸の置換、単独でかまたはＢ２位の欠失と組合せて
のＢ１位のアミノ酸欠失、およびＢ３０位からのスレオ
ニンの欠失が含まれる。本明細書中に用いる全アミノ酸
略語は、37 Ｃ.Ｆ.Ｒ. §1.822(b)(2)に示されているよ
うに、米国特許商標庁によって許容されているものであ
る。特に好ましい単体インスリン類似体は、ＬysB28Ｐr
oB29−ヒト・インスリン（Ｂ２８がＬysであり、Ｂ２９
がＰroである）およびＡspB28−ヒト・インスリン（Ｂ２
８がＡspである）である。
修飾が可能であることを認識するであろう。これら修飾
は当分野において広く許容され、Ｂ１０位のヒスチジン
残基とアスパラギン酸の置換、Ｂ１位のフェニルアラニ
ン残基とアスパラギン酸の置換、Ｂ３０位のスレオニン
残基とアラニンの置換、Ｂ９位のセリン残基とアスパラ
ギン酸の置換、単独でかまたはＢ２位の欠失と組合せて
のＢ１位のアミノ酸欠失、およびＢ３０位からのスレオ
ニンの欠失が含まれる。本明細書中に用いる全アミノ酸
略語は、37 Ｃ.Ｆ.Ｒ. §1.822(b)(2)に示されているよ
うに、米国特許商標庁によって許容されているものであ
る。特に好ましい単体インスリン類似体は、ＬysB28Ｐr
oB29−ヒト・インスリン（Ｂ２８がＬysであり、Ｂ２９
がＰroである）およびＡspB28−ヒト・インスリン（Ｂ２
８がＡspである）である。
【００１２】用語「単体インスリン類似体−ＮＰＤ」ま
たは「インスリン類似体−ＮＰＤ」は、製剤の結晶性イ
ンスリン類似体およびプロタミン懸濁液である。ＮＰＤ
はＤeＦelippisによる中性プロタミン製剤（Neutral Pr
otamine formulation according to DeFelippis）であ
る。本組成物は、本明細書に記載の特許請求する方法に
従って調製される。関連用語「インスリン類似体ＮＰＤ
結晶」、「結晶性インスリン類似体−ＮＰＤ」、または
「ＬysB28ＰroB29−ヒト・インスリン−プロタミン結
晶」は、ＮＰＤ製剤のインスリン類似体−プロタミン結
晶を指す。本明細書中に用いる用語「治療する」は、疾
患、症状、または障害に抵抗するための患者の処置およ
び看護を記述し、そして症状もしくは余病の開始を予防
し、症状もしくは余病を緩和し、または疾患、症状、も
しくは障害を排除するために本発明の化合物を投与する
ことを含む。
たは「インスリン類似体−ＮＰＤ」は、製剤の結晶性イ
ンスリン類似体およびプロタミン懸濁液である。ＮＰＤ
はＤeＦelippisによる中性プロタミン製剤（Neutral Pr
otamine formulation according to DeFelippis）であ
る。本組成物は、本明細書に記載の特許請求する方法に
従って調製される。関連用語「インスリン類似体ＮＰＤ
結晶」、「結晶性インスリン類似体−ＮＰＤ」、または
「ＬysB28ＰroB29−ヒト・インスリン−プロタミン結
晶」は、ＮＰＤ製剤のインスリン類似体−プロタミン結
晶を指す。本明細書中に用いる用語「治療する」は、疾
患、症状、または障害に抵抗するための患者の処置およ
び看護を記述し、そして症状もしくは余病の開始を予防
し、症状もしくは余病を緩和し、または疾患、症状、も
しくは障害を排除するために本発明の化合物を投与する
ことを含む。
【００１３】用語「等張剤」は、生理学的に寛容性であ
り、細胞膜を透過する水の正味の流動を防ぐために製剤
に適当な張度を与える物質を指す。グリセリンのような
化合物は、このような目的のために既知の濃度で一般に
用いられる。等張剤の濃度はインスリン製剤の分野にお
いて既知の範囲内にある。用語「フェノール誘導体」は
m−クレゾール、フェノール、または好ましくはm−クレ
ゾールおよびフェノールの混合物である。用語「遊離塩
基主成分」は製剤中のプロタミン量を指す。遊離塩基主
成分は、市販品で非経口製剤に一般に用いられるプロタ
ミン塩の、水および塩の含有量を調整する。好ましいプ
ロタミンである硫酸プロタミンは、約８０％プロタミン
である。
り、細胞膜を透過する水の正味の流動を防ぐために製剤
に適当な張度を与える物質を指す。グリセリンのような
化合物は、このような目的のために既知の濃度で一般に
用いられる。等張剤の濃度はインスリン製剤の分野にお
いて既知の範囲内にある。用語「フェノール誘導体」は
m−クレゾール、フェノール、または好ましくはm−クレ
ゾールおよびフェノールの混合物である。用語「遊離塩
基主成分」は製剤中のプロタミン量を指す。遊離塩基主
成分は、市販品で非経口製剤に一般に用いられるプロタ
ミン塩の、水および塩の含有量を調整する。好ましいプ
ロタミンである硫酸プロタミンは、約８０％プロタミン
である。
【００１４】用語「IＵ」または「Ｕ」は国際単位であ
る。用語「イソファン比」は、ＫrayenbuehlとＲosenbe
rg［Steno Memorial Hospital Report (Copenhagen),
1:60(1946)］によって教示されたような、類似体と複合
するのに必要なプロタミンの平衡量である。該イソファ
ン比は、当分野において周知であり、Ｋrayenbuehlらに
よって記載されている方法で滴定によって測定される。
る。用語「イソファン比」は、ＫrayenbuehlとＲosenbe
rg［Steno Memorial Hospital Report (Copenhagen),
1:60(1946)］によって教示されたような、類似体と複合
するのに必要なプロタミンの平衡量である。該イソファ
ン比は、当分野において周知であり、Ｋrayenbuehlらに
よって記載されている方法で滴定によって測定される。
【００１５】本発明は、単体インスリン類似体、プロタ
ミン、亜鉛、およびフェノール誘導体を含むインスリン
類似体−プロタミン製剤を提供する。プロタミン濃度
は、遊離塩基を基準にして１００Ｕのインスリン類似体
に対し約０.２〜１.５mgのプロタミンが好ましい。最も
好ましくは、プロタミン範囲が約０.２７〜０.３５mg/
１００Ｕである。亜鉛濃度は重量基準で約０.３５〜０.
９％である。好ましくは、亜鉛濃度が約０.７％であ
る。フェノール誘導体はm−クレゾール、フェノール、
またはm−クレゾールおよびフェノールの混合物であ
る。フェノール誘導体はm−クレゾールおよびフェノー
ルであるのが好ましい。フェノール誘導体濃度は当業者
に知られている。該濃度は保存効果（即ち、遅延微生物
増殖）を維持するのに十分でなければならない。一般
に、フェノール性濃度は、例えば１.０〜６.０mg/mlの
範囲内であり、約２.５mg/ml以上が好ましい。最も好ま
しい濃度は約３mg/mlである。フェノール誘導体はイン
スリン類似体、プロタミン、および亜鉛を複合するよう
作用し、さらに保存物質として働くので、フェノール誘
導体の存在は重要である。しかし、インスリン類似体１
分子につきフェノール１分子だけが結晶構造に結合する
と考えられている。
ミン、亜鉛、およびフェノール誘導体を含むインスリン
類似体−プロタミン製剤を提供する。プロタミン濃度
は、遊離塩基を基準にして１００Ｕのインスリン類似体
に対し約０.２〜１.５mgのプロタミンが好ましい。最も
好ましくは、プロタミン範囲が約０.２７〜０.３５mg/
１００Ｕである。亜鉛濃度は重量基準で約０.３５〜０.
９％である。好ましくは、亜鉛濃度が約０.７％であ
る。フェノール誘導体はm−クレゾール、フェノール、
またはm−クレゾールおよびフェノールの混合物であ
る。フェノール誘導体はm−クレゾールおよびフェノー
ルであるのが好ましい。フェノール誘導体濃度は当業者
に知られている。該濃度は保存効果（即ち、遅延微生物
増殖）を維持するのに十分でなければならない。一般
に、フェノール性濃度は、例えば１.０〜６.０mg/mlの
範囲内であり、約２.５mg/ml以上が好ましい。最も好ま
しい濃度は約３mg/mlである。フェノール誘導体はイン
スリン類似体、プロタミン、および亜鉛を複合するよう
作用し、さらに保存物質として働くので、フェノール誘
導体の存在は重要である。しかし、インスリン類似体１
分子につきフェノール１分子だけが結晶構造に結合する
と考えられている。
【００１６】好ましくは、等張剤を製剤に添加する。好
ましい等張剤はグリセリンである。等張剤濃度は、例え
ば１４〜１８mg/mlであり、好ましくは約１６mg/mlであ
る。製剤のpＨを、生理学的に寛容な緩衝液、好ましくは
二塩基性リン酸ナトリウムのようなリン酸緩衝液でもっ
て緩衝してよい。他の生理学的に寛容な緩衝液には、Ｔ
ＲＩＳ、酢酸ナトリウム、またはクエン酸ナトリウムが
含まれる。緩衝液の選択および濃度は当分野において知
られている。一般に、該濃度は、例えば約１.５〜５.０
mg/mlであり、好ましくは３.８mg/mlである。
ましい等張剤はグリセリンである。等張剤濃度は、例え
ば１４〜１８mg/mlであり、好ましくは約１６mg/mlであ
る。製剤のpＨを、生理学的に寛容な緩衝液、好ましくは
二塩基性リン酸ナトリウムのようなリン酸緩衝液でもっ
て緩衝してよい。他の生理学的に寛容な緩衝液には、Ｔ
ＲＩＳ、酢酸ナトリウム、またはクエン酸ナトリウムが
含まれる。緩衝液の選択および濃度は当分野において知
られている。一般に、該濃度は、例えば約１.５〜５.０
mg/mlであり、好ましくは３.８mg/mlである。
【００１７】さらに本発明は、インスリン類似体−プロ
タミンが安定な結晶として存在する特定の条件を提供す
る。これら結晶の製剤をインスリン類似体−ＮＰＤと定
義する。インスリン類似体−ＮＰＤは、製剤化されたイ
ンスリン類似体−ＮＰＤ結晶の懸濁液であり、使用にお
いて中時間作用期間を生じる。インスリン類似体−ＮＰ
Ｄ活性のプロフィールは、単体類似体の自己会合の欠如
を考えると全く驚くべきものである。
タミンが安定な結晶として存在する特定の条件を提供す
る。これら結晶の製剤をインスリン類似体−ＮＰＤと定
義する。インスリン類似体−ＮＰＤは、製剤化されたイ
ンスリン類似体−ＮＰＤ結晶の懸濁液であり、使用にお
いて中時間作用期間を生じる。インスリン類似体−ＮＰ
Ｄ活性のプロフィールは、単体類似体の自己会合の欠如
を考えると全く驚くべきものである。
【００１８】単体類似体を有する中時間作用する製剤を
形成する能力が図１において証明されている。図１は、
ＬysB28ＰroB29−hＩ−ＮＰＤおよびヒト・インスリン−
ＮＰＨについての作用のプロフィールを開示する。ＮＰ
Ｄプロフィールはインスリン−ＮＰＨと類似している。
ＮＰＤ製剤およびインスリン−ＮＰＨ製剤についての作
用期間はほぼ等しい。しかし、最も意味深いことには、
本製剤はインスリン−ＮＰＨより迅速に上昇し、より長
期間安定である。この相違は、単体類似体の即作用性プ
ロフィールを考えると全く思いがけないことである。特
に好ましいインスリン類似体−プロタミン製剤であるＬ
ysB28ＰroB29−ヒト・インスリン−ＮＰＤは、ＬysB28Ｐ
roB29−ヒト・インスリン、約０.２７〜０.３２mg/(１０
０Ｕ インスリン類似体)のプロタミン、約０.３５〜０.
９重量％の亜鉛、およびフェノール誘導体を含む。プロ
タミン濃度は、遊離塩基を基準にして０.３mg/１００Ｕ
が好ましい。
形成する能力が図１において証明されている。図１は、
ＬysB28ＰroB29−hＩ−ＮＰＤおよびヒト・インスリン−
ＮＰＨについての作用のプロフィールを開示する。ＮＰ
Ｄプロフィールはインスリン−ＮＰＨと類似している。
ＮＰＤ製剤およびインスリン−ＮＰＨ製剤についての作
用期間はほぼ等しい。しかし、最も意味深いことには、
本製剤はインスリン−ＮＰＨより迅速に上昇し、より長
期間安定である。この相違は、単体類似体の即作用性プ
ロフィールを考えると全く思いがけないことである。特
に好ましいインスリン類似体−プロタミン製剤であるＬ
ysB28ＰroB29−ヒト・インスリン−ＮＰＤは、ＬysB28Ｐ
roB29−ヒト・インスリン、約０.２７〜０.３２mg/(１０
０Ｕ インスリン類似体)のプロタミン、約０.３５〜０.
９重量％の亜鉛、およびフェノール誘導体を含む。プロ
タミン濃度は、遊離塩基を基準にして０.３mg/１００Ｕ
が好ましい。
【００１９】また本発明は、約８〜２２℃の温度で、ヘ
キサマー会合状態のＬysB28ＰroB29−ヒト・インスリン
水溶液とプロタミン溶液を混合することからなる、Ｌys
B28ＰroB29−ヒト・インスリン−プロタミン結晶を調製
するための方法を提供し、該水溶液は、pＨ約７.１〜
７.６で、約０.３５〜０.９重量％の亜鉛、ＬysB28Ｐro
B2 9−ヒト・インスリン、およびフェノール誘導体を含
み、該プロタミン溶液は、pＨ約７.１〜７.６でプロタ
ミンを含み、最終プロタミン濃度が約０.２７〜０.３２
mg/(１００Ｕ インスリン類似体)である。発明時に、単
体インスリン類似体は、会合してヘキサマーを形成する
傾向を殆どもたないことが知られていた。単体インスリ
ン類似体をプロタミンと会合させて結晶を形成させるの
に必要な条件は、当分野において以前は知られていなか
った。先行研究はインスリンに関する。インスリン−Ｎ
ＰＨ［Ｈagedornによる中性プロタミン製剤（Neutral P
rotamine formulation according to Hagedorn）］また
はイソファン・インスリン製剤の調製に関する教示［Ｋr
ayenbuehlとＲosenberg、Steno Memorial Hospital Rep
ort (Copenhagen), 1:60(1946)］は、単体インスリン類
似体の異なる特性を考えると関係がない。実際、Ｈumul
in−ＮTM（インスリン−ＮＰＨ）を調製する市販の方法
である酸性−中性法によって、結晶性インスリン類似体
−ＮＰＤを得ることはない。
キサマー会合状態のＬysB28ＰroB29−ヒト・インスリン
水溶液とプロタミン溶液を混合することからなる、Ｌys
B28ＰroB29−ヒト・インスリン−プロタミン結晶を調製
するための方法を提供し、該水溶液は、pＨ約７.１〜
７.６で、約０.３５〜０.９重量％の亜鉛、ＬysB28Ｐro
B2 9−ヒト・インスリン、およびフェノール誘導体を含
み、該プロタミン溶液は、pＨ約７.１〜７.６でプロタ
ミンを含み、最終プロタミン濃度が約０.２７〜０.３２
mg/(１００Ｕ インスリン類似体)である。発明時に、単
体インスリン類似体は、会合してヘキサマーを形成する
傾向を殆どもたないことが知られていた。単体インスリ
ン類似体をプロタミンと会合させて結晶を形成させるの
に必要な条件は、当分野において以前は知られていなか
った。先行研究はインスリンに関する。インスリン−Ｎ
ＰＨ［Ｈagedornによる中性プロタミン製剤（Neutral P
rotamine formulation according to Hagedorn）］また
はイソファン・インスリン製剤の調製に関する教示［Ｋr
ayenbuehlとＲosenberg、Steno Memorial Hospital Rep
ort (Copenhagen), 1:60(1946)］は、単体インスリン類
似体の異なる特性を考えると関係がない。実際、Ｈumul
in−ＮTM（インスリン−ＮＰＨ）を調製する市販の方法
である酸性−中性法によって、結晶性インスリン類似体
−ＮＰＤを得ることはない。
【００２０】最も意味深いことには、本方法のパラメー
ター、即ち、結晶化温度およびインスリン類似体、亜
鉛、およびフェノール誘導体のヘキサマー複合体形成
は、安定なＬysB28ＰroB29−hＩ−ＮＰＤ結晶の形成を
決定的に制限する。結晶化温度は約８〜２２℃、好まし
くは１３〜１７℃でなければなれない。もし温度がこの
範囲を逸脱するなら、大部分が非結晶のインスリン類似
体−プロタミン製剤を得る結果となる。インスリン類似
体が、結晶化に先立ってヘキサマー状態に変換されるこ
ともまた重要である。単体結合状態で該方法を実行する
と、結晶化によって非結晶性産物を得る結果となる。５
〜３６時間、振盪しないで結晶を形成させる。通例、２
４時間で良質の結晶を形成する。
ター、即ち、結晶化温度およびインスリン類似体、亜
鉛、およびフェノール誘導体のヘキサマー複合体形成
は、安定なＬysB28ＰroB29−hＩ−ＮＰＤ結晶の形成を
決定的に制限する。結晶化温度は約８〜２２℃、好まし
くは１３〜１７℃でなければなれない。もし温度がこの
範囲を逸脱するなら、大部分が非結晶のインスリン類似
体−プロタミン製剤を得る結果となる。インスリン類似
体が、結晶化に先立ってヘキサマー状態に変換されるこ
ともまた重要である。単体結合状態で該方法を実行する
と、結晶化によって非結晶性産物を得る結果となる。５
〜３６時間、振盪しないで結晶を形成させる。通例、２
４時間で良質の結晶を形成する。
【００２１】フェノール誘導体を含有し、濃度が重量基
準で約０.３５〜０.９％になるまで亜鉛を添加した希釈
剤に、固体単体類似体を懸濁することにより、可溶性単
体インスリン類似体を複合させてヘキサマー会合状態に
する。亜鉛を塩として添加するのが好ましい。亜鉛塩の
代表的な例には、酢酸亜鉛、臭化亜鉛、塩化亜鉛、フッ
化亜鉛、ヨウ化亜鉛、および硫酸亜鉛が含まれる。これ
もまた本発明の方法に用いることのできる多くの他の亜
鉛塩が存在することを、当業者は認識するであろう。好
ましくは、酢酸亜鉛または塩化亜鉛を用いる。インスリ
ン類似体の希釈剤への溶解を、酸性溶解として一般に知
られていることによって促進してもよい。酸性溶解にお
いては、生理学的に寛容な酸、好ましくはＨＣlでもっ
てpＨ約３.０〜３.５に下げて、類似体の可溶性を増大
させる。他の生理学的に寛容な酸には、酢酸、クエン
酸、およびリン酸が含まれる。次いで、結晶化のため
に、生理学的に寛容な塩基、好ましくはＮaＯＨでもっ
て、pＨ約７.１〜７.６に調節する。他の生理学的に寛
容な塩基には、ＫＯＨおよび水酸化アンモニウムが含ま
れる。
準で約０.３５〜０.９％になるまで亜鉛を添加した希釈
剤に、固体単体類似体を懸濁することにより、可溶性単
体インスリン類似体を複合させてヘキサマー会合状態に
する。亜鉛を塩として添加するのが好ましい。亜鉛塩の
代表的な例には、酢酸亜鉛、臭化亜鉛、塩化亜鉛、フッ
化亜鉛、ヨウ化亜鉛、および硫酸亜鉛が含まれる。これ
もまた本発明の方法に用いることのできる多くの他の亜
鉛塩が存在することを、当業者は認識するであろう。好
ましくは、酢酸亜鉛または塩化亜鉛を用いる。インスリ
ン類似体の希釈剤への溶解を、酸性溶解として一般に知
られていることによって促進してもよい。酸性溶解にお
いては、生理学的に寛容な酸、好ましくはＨＣlでもっ
てpＨ約３.０〜３.５に下げて、類似体の可溶性を増大
させる。他の生理学的に寛容な酸には、酢酸、クエン
酸、およびリン酸が含まれる。次いで、結晶化のため
に、生理学的に寛容な塩基、好ましくはＮaＯＨでもっ
て、pＨ約７.１〜７.６に調節する。他の生理学的に寛
容な塩基には、ＫＯＨおよび水酸化アンモニウムが含ま
れる。
【００２２】最も意味深いことには、ＬysB28ＰroB29−
hＩ−ＮＰＤ複合体を調製する方法はＮaＣl濃度に敏感
である。もし該濃度が約４mg/mlを超過するなら、イン
スリン類似体−ＮＰＤ結晶は非結晶性産物と混在するこ
とになる。従って、単体類似体を中性のpＨで溶解させ
て、塩イオンの形成を避けることが好ましい。別法とし
て、緩衝液の添加に先立って、酸性のpＨで希釈剤中に
類似体を溶解させる。これによって、pＨ調節によって
生じる塩の濃度を減少させる。しかし、成分を添加する
順序は、ヘキサマーまたは非結晶製剤の形成に決定的で
はない。前述のように、等張剤を本発明の製剤に添加し
てもよい。類似体溶液、プロタミン溶液、または最終的
なインスリン類似体−ＮＰＤ製剤に、等張剤を添加する
ことができる。同様に、類似体溶液、プロタミン溶液、
または最終的なインスリン類似体−ＮＰＤ製剤に、生理
学的に寛容な緩衝液を添加してもよい。しかし、水溶液
とプロタミンを混合するのに先立って、類似体溶液およ
びプロタミン溶液の両方が等張剤および緩衝液を含有し
ているのが好ましい。結晶性インスリン類似体−ＮＰＤ
を調製するための方法に及ぼすＮaＣlの影響のため、グ
リセリンが好ましい等張剤である。
hＩ−ＮＰＤ複合体を調製する方法はＮaＣl濃度に敏感
である。もし該濃度が約４mg/mlを超過するなら、イン
スリン類似体−ＮＰＤ結晶は非結晶性産物と混在するこ
とになる。従って、単体類似体を中性のpＨで溶解させ
て、塩イオンの形成を避けることが好ましい。別法とし
て、緩衝液の添加に先立って、酸性のpＨで希釈剤中に
類似体を溶解させる。これによって、pＨ調節によって
生じる塩の濃度を減少させる。しかし、成分を添加する
順序は、ヘキサマーまたは非結晶製剤の形成に決定的で
はない。前述のように、等張剤を本発明の製剤に添加し
てもよい。類似体溶液、プロタミン溶液、または最終的
なインスリン類似体−ＮＰＤ製剤に、等張剤を添加する
ことができる。同様に、類似体溶液、プロタミン溶液、
または最終的なインスリン類似体−ＮＰＤ製剤に、生理
学的に寛容な緩衝液を添加してもよい。しかし、水溶液
とプロタミンを混合するのに先立って、類似体溶液およ
びプロタミン溶液の両方が等張剤および緩衝液を含有し
ているのが好ましい。結晶性インスリン類似体−ＮＰＤ
を調製するための方法に及ぼすＮaＣlの影響のため、グ
リセリンが好ましい等張剤である。
【００２３】また本発明は、結晶性固体としてのインス
リン類似体−ＮＰＤおよび可溶性インスリン類似体の混
合物を含むインスリン類似体製剤を提供する。懸濁した
インスリン類似体−ＮＰＤ：可溶性インスリン類似体の
体積で約１：９９〜９９：１の範囲内で、これら混合物
を調製する。可溶性インスリン類似体は、亜鉛、フェノ
ール誘導体、等張剤、および緩衝液を含む水性希釈剤に
溶解させた単体インスリン類似体である。希釈剤中の記
載した濃度は、本明細書中に先に開示したものと同じで
ある。インスリン類似体−ＮＰＤ：可溶性インスリン類
似体の比は２５：７５〜７５：２５が好ましく、５０：
５０がより好ましい。個々の成分を混合することによっ
て、該混合物を調製することは容易である。本発明の混
合製剤は、作用の迅速な開始および延長された期間の組
み合わせのため、真性糖尿病の治療に特に適当である。
患者の必要性、飲食物、および肉体的活動に基づいて各
々個々の成分の量を変化させることにより、これら混合
物を「微調節」する。また、懸濁したインスリン類似体
−ＮＰＤおよび可溶性インスリン類似体は同質的であ
る、即ち、それらの間のどんな平衡交換も明瞭であるの
で、懸濁したインスリン類似体−ＮＰＤおよび可溶性イ
ンスリン類似体の混合物は好都合である。
リン類似体−ＮＰＤおよび可溶性インスリン類似体の混
合物を含むインスリン類似体製剤を提供する。懸濁した
インスリン類似体−ＮＰＤ：可溶性インスリン類似体の
体積で約１：９９〜９９：１の範囲内で、これら混合物
を調製する。可溶性インスリン類似体は、亜鉛、フェノ
ール誘導体、等張剤、および緩衝液を含む水性希釈剤に
溶解させた単体インスリン類似体である。希釈剤中の記
載した濃度は、本明細書中に先に開示したものと同じで
ある。インスリン類似体−ＮＰＤ：可溶性インスリン類
似体の比は２５：７５〜７５：２５が好ましく、５０：
５０がより好ましい。個々の成分を混合することによっ
て、該混合物を調製することは容易である。本発明の混
合製剤は、作用の迅速な開始および延長された期間の組
み合わせのため、真性糖尿病の治療に特に適当である。
患者の必要性、飲食物、および肉体的活動に基づいて各
々個々の成分の量を変化させることにより、これら混合
物を「微調節」する。また、懸濁したインスリン類似体
−ＮＰＤおよび可溶性インスリン類似体は同質的であ
る、即ち、それらの間のどんな平衡交換も明瞭であるの
で、懸濁したインスリン類似体−ＮＰＤおよび可溶性イ
ンスリン類似体の混合物は好都合である。
【００２４】多くの承認されたペプチド合成技術、例え
ば、古典的(溶液)方法、固相法、半合成法、およびより
最近の組換えＤＮＡ法のいずれかによって、本発明のイ
ンスリン類似体を調製することができる。例えば、Ｃha
nceら［欧州特許公開第383472号］およびＢrangeら［欧
州特許公開第214826号］によって、種々の単体類似体の
調製法が開示されている。
ば、古典的(溶液)方法、固相法、半合成法、およびより
最近の組換えＤＮＡ法のいずれかによって、本発明のイ
ンスリン類似体を調製することができる。例えば、Ｃha
nceら［欧州特許公開第383472号］およびＢrangeら［欧
州特許公開第214826号］によって、種々の単体類似体の
調製法が開示されている。
【００２５】
【実施例】以下の実施例はインスリン類似体の調製およ
び本発明をさらに説明するためだけのものであり、本発
明の範囲を限定しようとするものではない。実施例１ ＬysB28ＰroB29−hＩ−ＮＰＤの調製 濃度２００IＵ/ml（Ｕ２００）のＬysB28ＰroB29−ヒト
・インスリン（ＬysB28ＰroB29−hＩ）溶液を、以下に挙
げるものを含有する保存物質/緩衝液系にＬysB28Ｐro
B29−hＩ結晶を含有する亜鉛を溶解することによって調
製した：１.６mg/ml m−クレゾール、０.７３mg/ml フ
ェノール（８９％として算定されたフェノール０.６５m
g/mlと等量）、１６mg/ml グリセリン、および３.７８m
g/ml 二塩基性リン酸ナトリウム緩衝液。結晶中の外因
性亜鉛濃度を、適量の酸性ＺnＯ溶液（１０mg/ml）を加
えることによって補足し、最終濃度０.０２５mg/１００
IＵ（０.７％）にした。μl量の５Ｍ ＨＣlでもってpＨ
約３に下げることにより、周囲温度でＬysB28ＰroB29−
hＩを溶解させた。この溶液を清澄化した後、μl量の５
Ｍ ＮaＯＨでもってpＨ７.５に再調節した。遊離塩基を
基準として算定した最終濃度０.６mg/１００IＵにする
のに十分な固体硫酸プロタミンを保存物質/緩衝液溶液
に溶解することによって、プロタミン溶液を調製した。
この溶液をpＨ７.５に調節し、１５℃で平衡化させた。
両方の溶液を注射用水で最終濃度に希釈し、濾過した。
ＬysB28ＰroB29−hＩ部分のアリコート（５ml）を分離
清浄ガラスバイアル中に満たし、試料を水浴中１５℃で
インキュベートした。平衡化のための適当な時間（１５
分）の後、プロタミン溶液（５ml）をＬysB28ＰroB29−
hＩ試料に速やかに加えて沈澱させた。１５℃で約２４
時間結晶化を進行させた。
び本発明をさらに説明するためだけのものであり、本発
明の範囲を限定しようとするものではない。実施例１ ＬysB28ＰroB29−hＩ−ＮＰＤの調製 濃度２００IＵ/ml（Ｕ２００）のＬysB28ＰroB29−ヒト
・インスリン（ＬysB28ＰroB29−hＩ）溶液を、以下に挙
げるものを含有する保存物質/緩衝液系にＬysB28Ｐro
B29−hＩ結晶を含有する亜鉛を溶解することによって調
製した：１.６mg/ml m−クレゾール、０.７３mg/ml フ
ェノール（８９％として算定されたフェノール０.６５m
g/mlと等量）、１６mg/ml グリセリン、および３.７８m
g/ml 二塩基性リン酸ナトリウム緩衝液。結晶中の外因
性亜鉛濃度を、適量の酸性ＺnＯ溶液（１０mg/ml）を加
えることによって補足し、最終濃度０.０２５mg/１００
IＵ（０.７％）にした。μl量の５Ｍ ＨＣlでもってpＨ
約３に下げることにより、周囲温度でＬysB28ＰroB29−
hＩを溶解させた。この溶液を清澄化した後、μl量の５
Ｍ ＮaＯＨでもってpＨ７.５に再調節した。遊離塩基を
基準として算定した最終濃度０.６mg/１００IＵにする
のに十分な固体硫酸プロタミンを保存物質/緩衝液溶液
に溶解することによって、プロタミン溶液を調製した。
この溶液をpＨ７.５に調節し、１５℃で平衡化させた。
両方の溶液を注射用水で最終濃度に希釈し、濾過した。
ＬysB28ＰroB29−hＩ部分のアリコート（５ml）を分離
清浄ガラスバイアル中に満たし、試料を水浴中１５℃で
インキュベートした。平衡化のための適当な時間（１５
分）の後、プロタミン溶液（５ml）をＬysB28ＰroB29−
hＩ試料に速やかに加えて沈澱させた。１５℃で約２４
時間結晶化を進行させた。
【００２６】実施例２ ＬysB28ＰroB29−hＩ−ＮＰＤ
の調製 ＬysB28ＰroB29−hＩの溶解が中性のpＨで起きることを
除いて、実施例１と同一の方法である。最終pＨ７.４と
なるよう該方法を行った。
の調製 ＬysB28ＰroB29−hＩの溶解が中性のpＨで起きることを
除いて、実施例１と同一の方法である。最終pＨ７.４と
なるよう該方法を行った。
【００２７】実施例３ ＬysB28ＰroB29−hＩ−ＮＰＤ
の調製 インスリン類似体−ＮＰＤを実施例１に類似した方法で
調製したが、ＬysB28ＰroB29−hＩの酸性溶解を二塩基
性リン酸ナトリウム緩衝液を除く全賦形剤の存在下で行
なった。インスリン類似体溶液をpＨ７.４に戻した後、
固体二塩基性リン酸ナトリウムを加える。二塩基性リン
酸ナトリウムの添加によって該溶液を清澄化した。
の調製 インスリン類似体−ＮＰＤを実施例１に類似した方法で
調製したが、ＬysB28ＰroB29−hＩの酸性溶解を二塩基
性リン酸ナトリウム緩衝液を除く全賦形剤の存在下で行
なった。インスリン類似体溶液をpＨ７.４に戻した後、
固体二塩基性リン酸ナトリウムを加える。二塩基性リン
酸ナトリウムの添加によって該溶液を清澄化した。
【００２８】実施例４ インスリン類似体−ＮＰＤ混合
物製剤の調製 中時間および即作用するＬysB28ＰroB29−hＩ製剤の混
合物を以下のように調製する。中時間作用する懸濁調製
物を実施例３に記載の方法によって調製し、これは混合
物について中時間作用部分として働く。亜鉛含有Ｌys
B28ＰroB29−hＩ結晶を周囲温度で実施例１に記載の希
釈剤に溶解することによって、ＬysB28ＰroB29−hＩ
（１００IＵ）の別の溶液を調製する。懸濁液部分の濃
度［即ち、０.０２５mg/１００IＵ（０.７％）］と一致
させるために酸性ＺnＯ溶液を添加することによって、
この溶液中のＬysB28ＰroB29−hＩの外因性亜鉛濃度を
補足する。ＨＣlおよび/またはＮaＯＨの１０％溶液を
用いてpＨ７.４に調節した後、注射用水を用いて溶液を
最終濃度に希釈する。この溶液が混合物の即作用部分で
ある。所望の比率を得るよう適当な量の中時間および即
作用部分を混合することによって、最終混合物を調製す
る。中時間作用部分の１部（体積）を即作用部分の１部
（体積）と混合することによって、５０/５０混合物を
調製する。
物製剤の調製 中時間および即作用するＬysB28ＰroB29−hＩ製剤の混
合物を以下のように調製する。中時間作用する懸濁調製
物を実施例３に記載の方法によって調製し、これは混合
物について中時間作用部分として働く。亜鉛含有Ｌys
B28ＰroB29−hＩ結晶を周囲温度で実施例１に記載の希
釈剤に溶解することによって、ＬysB28ＰroB29−hＩ
（１００IＵ）の別の溶液を調製する。懸濁液部分の濃
度［即ち、０.０２５mg/１００IＵ（０.７％）］と一致
させるために酸性ＺnＯ溶液を添加することによって、
この溶液中のＬysB28ＰroB29−hＩの外因性亜鉛濃度を
補足する。ＨＣlおよび/またはＮaＯＨの１０％溶液を
用いてpＨ７.４に調節した後、注射用水を用いて溶液を
最終濃度に希釈する。この溶液が混合物の即作用部分で
ある。所望の比率を得るよう適当な量の中時間および即
作用部分を混合することによって、最終混合物を調製す
る。中時間作用部分の１部（体積）を即作用部分の１部
（体積）と混合することによって、５０/５０混合物を
調製する。
【００２９】実施例５ ＬysB28ＰroB29−hＩプロタミ
ン結晶化へのイオン強度の影響 プロタミンと混合するのに先立って、ＬysB28ＰroB29−
hＩ部分にＮaＣlを加えることにより、結晶化へのイオ
ン強度の影響を評価した。総濃度が２０、３０、および
４０mＭ（１.２、１.８、および２.３mg/ml）になるよ
うＮaＣlを加えた。ＮaＣl濃度が増加するにつれて、体
積粒子サイズが多様式の挙動を示した（小粒子サイズで
さらにピークに達する）。非結晶物質の増加を示しなが
らＮaＣl濃度が増加するにつれて、体積平均粒子サイズ
が減少した。粒子サイズ対ＮaＣl濃度の結果を以下に示
す：
ン結晶化へのイオン強度の影響 プロタミンと混合するのに先立って、ＬysB28ＰroB29−
hＩ部分にＮaＣlを加えることにより、結晶化へのイオ
ン強度の影響を評価した。総濃度が２０、３０、および
４０mＭ（１.２、１.８、および２.３mg/ml）になるよ
うＮaＣlを加えた。ＮaＣl濃度が増加するにつれて、体
積粒子サイズが多様式の挙動を示した（小粒子サイズで
さらにピークに達する）。非結晶物質の増加を示しなが
らＮaＣl濃度が増加するにつれて、体積平均粒子サイズ
が減少した。粒子サイズ対ＮaＣl濃度の結果を以下に示
す：
【００３０】
【表１】
【００３１】顕微鏡分析によって、全試料が非結晶およ
び結晶性物質の混合物を包含することが示された。４０
mＭ ＮaＣlを含有する試料は、非結晶物質を主に有し、
結晶を殆ど有さない。
び結晶性物質の混合物を包含することが示された。４０
mＭ ＮaＣlを含有する試料は、非結晶物質を主に有し、
結晶を殆ど有さない。
【００３２】実施例６ ＬysB28ＰroB29−hＩ−ＮＰＤ
およびヒト・インスリン−ＮＰＨの比較力学 この研究を知覚のあるイヌ・モデルで行なう。研究開始
に先立って、３つの基礎試料を採取した。ソマトスタチ
ンの注入（０.３μg/kg・分）を開始した。１０分おいた
後、ＮＰＤまたはＮＰＨのいずれかを皮下注射投与し
た。血漿グルコースを頻繁にモニターし始め、正常血糖
付近を維持するようにグルコース（２０％）を多様な量
で注入した。試料を残らず採取し、免疫反応性インスリ
ン（Linco抗体）およびグルコースについて分析した。
この結果を図１に示す。
およびヒト・インスリン−ＮＰＨの比較力学 この研究を知覚のあるイヌ・モデルで行なう。研究開始
に先立って、３つの基礎試料を採取した。ソマトスタチ
ンの注入（０.３μg/kg・分）を開始した。１０分おいた
後、ＮＰＤまたはＮＰＨのいずれかを皮下注射投与し
た。血漿グルコースを頻繁にモニターし始め、正常血糖
付近を維持するようにグルコース（２０％）を多様な量
で注入した。試料を残らず採取し、免疫反応性インスリ
ン（Linco抗体）およびグルコースについて分析した。
この結果を図１に示す。
【００３３】実施例７ Ａsp(Ｂ２８)類似体・プロタミ
ン結晶の調製 濃度２００IＵ/ml（Ｕ２００）のＡsp(Ｂ２８)−hＩ部
分を、以下に挙げるものを含有する保存物質/緩衝液系
に凍結乾燥物（９５％純度）を溶解することによって調
製した：１.６mg/ml m−クレゾール、０.７３mg/ml フ
ェノール（８９％と算定されたフェノールの０.６５mg/
mlと等量）、１６mg/ml グリセリン、および３.７８mg/
ml 二塩基性リン酸ナトリウム。適量の酸性ＺnＯ溶液
（１０mg/ml）を用いて亜鉛を該系に追加し、最終濃度
０.０２５mg/１００IＵを得た。周囲温度、中性のpＨで
Ａsp(Ｂ２８)を溶解させた。この部分の最終pＨは７.４
であった。実施例２に記載のように結晶化を行なった。
最終プロタミン濃度の０.３mg/１００Ｕ、０.３５mg/１
００Ｕ、および０.４mg/１００Ｕについて研究した。こ
れらプロタミン濃度は、重量/重量基準で２.９％、９.
３％、１０.５％に各々対応する。インキュベーション
温度には５℃（０.３mg/１００Ｕのみ）、１５℃、およ
び２２℃が含まれた。これらの温度で２４時間後、試料
を結晶構造について分析した。顕微鏡によって測定した
結果は、少数の結晶および非結晶産物の混合物を示す。
ン結晶の調製 濃度２００IＵ/ml（Ｕ２００）のＡsp(Ｂ２８)−hＩ部
分を、以下に挙げるものを含有する保存物質/緩衝液系
に凍結乾燥物（９５％純度）を溶解することによって調
製した：１.６mg/ml m−クレゾール、０.７３mg/ml フ
ェノール（８９％と算定されたフェノールの０.６５mg/
mlと等量）、１６mg/ml グリセリン、および３.７８mg/
ml 二塩基性リン酸ナトリウム。適量の酸性ＺnＯ溶液
（１０mg/ml）を用いて亜鉛を該系に追加し、最終濃度
０.０２５mg/１００IＵを得た。周囲温度、中性のpＨで
Ａsp(Ｂ２８)を溶解させた。この部分の最終pＨは７.４
であった。実施例２に記載のように結晶化を行なった。
最終プロタミン濃度の０.３mg/１００Ｕ、０.３５mg/１
００Ｕ、および０.４mg/１００Ｕについて研究した。こ
れらプロタミン濃度は、重量/重量基準で２.９％、９.
３％、１０.５％に各々対応する。インキュベーション
温度には５℃（０.３mg/１００Ｕのみ）、１５℃、およ
び２２℃が含まれた。これらの温度で２４時間後、試料
を結晶構造について分析した。顕微鏡によって測定した
結果は、少数の結晶および非結晶産物の混合物を示す。
【００３４】実施例８ Ａsp(Ｂ２８)類似体・プロタミ
ン結晶の調製 緩衝液を含まない希釈剤にタンパク質を最初に溶解する
ことを除いて、実施例７に記載のようにＡsp(Ｂ２８)プ
ロタミン結晶化を行なった。酸性ＺnＯ貯蔵物の添加に
よって、試料をpＨ２.０〜２.５に十分に酸性化した。
この溶液を清澄化した後、μl量の５Ｎ ＮaＯＨでもっ
てpＨ約７に再調節した。４７.２５mg/mlの濃厚貯蔵溶
液を用いてリン酸ナトリウム（二塩基性）を加え、最終
濃度３.７８mg/mlにした。この部分をμl量のＨＣlを用
いてpＨ７.４に調節した。先の実施例に記載したよう
に、Ａsp(Ｂ２８)およびプロタミン部分を混合すること
によって結晶化を開始した。最終プロタミン濃度の０.
３mg/１００Ｕ、０.３５mg/１００Ｕ、および０.４mg/
１００Ｕについて研究した。インキュベーション温度に
は１５℃および２２℃が含まれた。これらの温度で２４
時間後、試料を結晶生成について分析した。顕微鏡によ
って測定した結果は、結晶および非結晶産物の混合物を
示す。
ン結晶の調製 緩衝液を含まない希釈剤にタンパク質を最初に溶解する
ことを除いて、実施例７に記載のようにＡsp(Ｂ２８)プ
ロタミン結晶化を行なった。酸性ＺnＯ貯蔵物の添加に
よって、試料をpＨ２.０〜２.５に十分に酸性化した。
この溶液を清澄化した後、μl量の５Ｎ ＮaＯＨでもっ
てpＨ約７に再調節した。４７.２５mg/mlの濃厚貯蔵溶
液を用いてリン酸ナトリウム（二塩基性）を加え、最終
濃度３.７８mg/mlにした。この部分をμl量のＨＣlを用
いてpＨ７.４に調節した。先の実施例に記載したよう
に、Ａsp(Ｂ２８)およびプロタミン部分を混合すること
によって結晶化を開始した。最終プロタミン濃度の０.
３mg/１００Ｕ、０.３５mg/１００Ｕ、および０.４mg/
１００Ｕについて研究した。インキュベーション温度に
は１５℃および２２℃が含まれた。これらの温度で２４
時間後、試料を結晶生成について分析した。顕微鏡によ
って測定した結果は、結晶および非結晶産物の混合物を
示す。
【００３５】実施例９ Ｌeu(Ｂ２８)Ｐro(Ｂ２９)類似
体・プロタミン結晶の調製 実施例８に記載のように、バルクの酸性溶解についで５
Ｎ ＮaＯＨでもってpＨ７.４に調節して、濃度２００I
Ｕ/ml（Ｕ２００）のＬeu(Ｂ２８)Ｐro(Ｂ２９)部分
（９３％純度）を調製した。上記のように結晶化した。
最終プロタミン濃度の０.３mg/１００Ｕ、０.３５mg/１
００Ｕ、および０.４mg/１００Ｕについて研究した。イ
ンキュベーション温度には５℃、１５℃、および２２℃
が含まれた。これらの温度で２４時間後、顕微鏡によっ
て測定したところ、全試料は幾らか結晶を含むが、主に
非結晶であった。
体・プロタミン結晶の調製 実施例８に記載のように、バルクの酸性溶解についで５
Ｎ ＮaＯＨでもってpＨ７.４に調節して、濃度２００I
Ｕ/ml（Ｕ２００）のＬeu(Ｂ２８)Ｐro(Ｂ２９)部分
（９３％純度）を調製した。上記のように結晶化した。
最終プロタミン濃度の０.３mg/１００Ｕ、０.３５mg/１
００Ｕ、および０.４mg/１００Ｕについて研究した。イ
ンキュベーション温度には５℃、１５℃、および２２℃
が含まれた。これらの温度で２４時間後、顕微鏡によっ
て測定したところ、全試料は幾らか結晶を含むが、主に
非結晶であった。
【００３６】実施例１０ デス(Ｂ２７)hＩ−プロタミ
ン結晶 実施例８に記載のように、バルクの酸性溶解についで５
Ｎ ＮaＯＨでもってpＨ７.４に調節して、２００IＵ/ml
（Ｕ２００）濃度のデスＴhr(Ｂ２７)（９７.３７％純
度）部分を調製した。実施例８に記載のように結晶化を
行なった。最終プロタミン濃度の０.３mg/１００Ｕ、
０.３５mg/１００Ｕ、および０.４mg/１００Ｕについて
研究した。インキュベーション温度には１５℃および２
２℃が含まれた。これらの温度で２４時間後、顕微鏡に
よって測定したところ、全試料は主に非結晶であった。
定性的には、結晶が観察された。
ン結晶 実施例８に記載のように、バルクの酸性溶解についで５
Ｎ ＮaＯＨでもってpＨ７.４に調節して、２００IＵ/ml
（Ｕ２００）濃度のデスＴhr(Ｂ２７)（９７.３７％純
度）部分を調製した。実施例８に記載のように結晶化を
行なった。最終プロタミン濃度の０.３mg/１００Ｕ、
０.３５mg/１００Ｕ、および０.４mg/１００Ｕについて
研究した。インキュベーション温度には１５℃および２
２℃が含まれた。これらの温度で２４時間後、顕微鏡に
よって測定したところ、全試料は主に非結晶であった。
定性的には、結晶が観察された。
【００３７】実施例１１ デス(Ｂ２８−Ｂ３０)hＩ−
プロタミン 実施例８に記載のように、バルクの酸性溶解についで５
Ｎ ＮaＯＨでもってpＨ７.４に調節して、２００IＵ/ml
（Ｕ２００）濃度のデス(２８−３０)（９６.３％純
度）部分を調製した。上述のように、タンパク質および
プロタミン部分の中性/中性混合法を用いて結晶化を試
みた。最終プロタミン濃度の０.３mg/１００Ｕ、０.３
５mg/１００Ｕ、および０.４mg/１００Ｕについて研究
した。インキュベーション温度には１５℃および２２℃
が含まれた。これらの温度で２４時間後、顕微鏡によっ
て測定したところ、全試料は主に非結晶であった。定性
的には、結晶が観察された。この結晶を十分に定義し
た。
プロタミン 実施例８に記載のように、バルクの酸性溶解についで５
Ｎ ＮaＯＨでもってpＨ７.４に調節して、２００IＵ/ml
（Ｕ２００）濃度のデス(２８−３０)（９６.３％純
度）部分を調製した。上述のように、タンパク質および
プロタミン部分の中性/中性混合法を用いて結晶化を試
みた。最終プロタミン濃度の０.３mg/１００Ｕ、０.３
５mg/１００Ｕ、および０.４mg/１００Ｕについて研究
した。インキュベーション温度には１５℃および２２℃
が含まれた。これらの温度で２４時間後、顕微鏡によっ
て測定したところ、全試料は主に非結晶であった。定性
的には、結晶が観察された。この結晶を十分に定義し
た。
【００３８】実施例１２ Ａsp(Ｂ２８)類似体−プロタ
ミン インスリンＡsp(Ｂ２８)−ヒト・インスリン類似体溶液
を、以下に挙げるものを含有する溶液（１ml）にタンパ
ク質（１６.６mg）を溶解することによって調製した：
３.２mg/ml m−クレゾール、１.３mg/ml フェノール、
および３２mg/mlグリセリン。酸性亜鉛の貯蔵溶液［Ｚn
2+で１０mg/ml、酸化亜鉛（０.３１１g）を１０％ＨＣl
（５ml）に溶解し、水で希釈して２５mlにすることによ
り調製］のアリコート（１４.４μl）を加えた。タンパ
ク質を完全に溶解させるよう、この溶液はpＨ２.３であ
った。１０％ＮaＯＨのアリコート（１０μl）を加え
て、pＨ７.０６に調節した。この溶液に０.２８Ｍ 二塩
基性リン酸ナトリウム（１００μl、pＨ７.０）を加
え、これによって溶液をpＨ７.２７にした。注射用水の
アリコート（８７０μl）をこの溶液に加えた。さらに
１０％ＨＣl（１μl）およびＮaＯＨ（０.７μl）を加
え、溶液の最終容量を注射用水で２mlにし、その結果最
終pＨ７.２６になった。この溶液を０.２μm ＳuporRＡ
crodiscR13（Gelman Sciences）フィルターに通して使
用前に濾過した。以下に挙げるものを含有する溶液に硫
酸プロタミンを溶解することによって、プロタミン貯蔵
溶液を調製した：１.６mg/ml m−クレゾール、０.６５m
g/ml フェノール、１６mg/ml グリセリン、および１４m
Ｍ 二塩基性リン酸ナトリウム。この溶液を最終pＨ７.
３に調節した。遊離塩基を基準にして０.６０mg/１００
Ｕの最終プロタミン濃度を得た。両溶液を０.２２μm
（Millipore SterivexTM-GV）フィルター・ユニットでも
って使用前に濾過した。
ミン インスリンＡsp(Ｂ２８)−ヒト・インスリン類似体溶液
を、以下に挙げるものを含有する溶液（１ml）にタンパ
ク質（１６.６mg）を溶解することによって調製した：
３.２mg/ml m−クレゾール、１.３mg/ml フェノール、
および３２mg/mlグリセリン。酸性亜鉛の貯蔵溶液［Ｚn
2+で１０mg/ml、酸化亜鉛（０.３１１g）を１０％ＨＣl
（５ml）に溶解し、水で希釈して２５mlにすることによ
り調製］のアリコート（１４.４μl）を加えた。タンパ
ク質を完全に溶解させるよう、この溶液はpＨ２.３であ
った。１０％ＮaＯＨのアリコート（１０μl）を加え
て、pＨ７.０６に調節した。この溶液に０.２８Ｍ 二塩
基性リン酸ナトリウム（１００μl、pＨ７.０）を加
え、これによって溶液をpＨ７.２７にした。注射用水の
アリコート（８７０μl）をこの溶液に加えた。さらに
１０％ＨＣl（１μl）およびＮaＯＨ（０.７μl）を加
え、溶液の最終容量を注射用水で２mlにし、その結果最
終pＨ７.２６になった。この溶液を０.２μm ＳuporRＡ
crodiscR13（Gelman Sciences）フィルターに通して使
用前に濾過した。以下に挙げるものを含有する溶液に硫
酸プロタミンを溶解することによって、プロタミン貯蔵
溶液を調製した：１.６mg/ml m−クレゾール、０.６５m
g/ml フェノール、１６mg/ml グリセリン、および１４m
Ｍ 二塩基性リン酸ナトリウム。この溶液を最終pＨ７.
３に調節した。遊離塩基を基準にして０.６０mg/１００
Ｕの最終プロタミン濃度を得た。両溶液を０.２２μm
（Millipore SterivexTM-GV）フィルター・ユニットでも
って使用前に濾過した。
【００３９】表２に概要を示しているように、温度制御
下で比率１：１のＡsp(Ｂ２８)−ヒト・インスリン溶液
を混合することによって結晶化させた。最終混合物条件
は以下のとおりであった：３.９４mg/ml Ａsp(Ｂ２８)
−ヒト・インスリン、０.０３５９mg/ml (０.９％）亜鉛
イオン、１.６mg/ml m−クレゾール、０.６５mg/mlフェ
ノール、１６mg/ml グリセリン、１４mＭ 二塩基性リン
酸ナトリウム、および０.３０mg/１００Ｕ プロタミン
（pＨ７.３）。特に、ＡspB28−ヒト・インスリン溶液の
部分（５０〜２００μl）をガラス・バイアルに移し、こ
の試料を４、８、１５、または２３（周囲温度）℃に平
衡させた。両プロタミン溶液の部分もこれら温度で平衡
化させた。１５〜２０分後、当量のどちらかのプロタミ
ン溶液を、ピペットでＡsp(Ｂ２８)−ヒト・インスリン
試料に移した。この混合物を穏やかに撹拌し、蓋をし、
次いで結晶化期間中、温度制御下に静置した。全試料を
２４時間後に顕微鏡で調べたところ、主に非結晶である
ことが分かった。４８時間後、０.３０mg/１００Ｕ プ
ロタミンを含有し、１５℃でインキュベートした試料
は、多量の針状結晶および一部非結晶物質を示した。
下で比率１：１のＡsp(Ｂ２８)−ヒト・インスリン溶液
を混合することによって結晶化させた。最終混合物条件
は以下のとおりであった：３.９４mg/ml Ａsp(Ｂ２８)
−ヒト・インスリン、０.０３５９mg/ml (０.９％）亜鉛
イオン、１.６mg/ml m−クレゾール、０.６５mg/mlフェ
ノール、１６mg/ml グリセリン、１４mＭ 二塩基性リン
酸ナトリウム、および０.３０mg/１００Ｕ プロタミン
（pＨ７.３）。特に、ＡspB28−ヒト・インスリン溶液の
部分（５０〜２００μl）をガラス・バイアルに移し、こ
の試料を４、８、１５、または２３（周囲温度）℃に平
衡させた。両プロタミン溶液の部分もこれら温度で平衡
化させた。１５〜２０分後、当量のどちらかのプロタミ
ン溶液を、ピペットでＡsp(Ｂ２８)−ヒト・インスリン
試料に移した。この混合物を穏やかに撹拌し、蓋をし、
次いで結晶化期間中、温度制御下に静置した。全試料を
２４時間後に顕微鏡で調べたところ、主に非結晶である
ことが分かった。４８時間後、０.３０mg/１００Ｕ プ
ロタミンを含有し、１５℃でインキュベートした試料
は、多量の針状結晶および一部非結晶物質を示した。
【００４０】実施例１３ インスリンＡsp(Ｂ２８)−ヒト・インスリン類似体溶液
を、以下に挙げるものを含有する溶液（０.７１ml）に
タンパク質（１０.６２mg）を溶解することによって調
製した：３.２mg/ml m−クレゾール、１.３mg/ml フェ
ノール、および３２mg/ml グリセリン。酸性亜鉛の貯蔵
溶液［Ｚn2+で１０mg/ml、酸化亜鉛（０.３１１g）を１
０％ＨＣl（５ml）に溶解し、水で希釈して２５mlにす
ることにより調製］のアリコート（１０.２μl）を加え
た。タンパク質を完全に溶解させるよう、この溶液はp
Ｈ２.３であった。１０％ＮaＯＨのアリコート（６.５
μl）を加えて、pＨ７.００に調節した。この溶液に０.
２８Ｍ 二塩基性リン酸ナトリウム（７１μl、pＨ７.
０）を加え、これによって溶液をpＨ７.２６にした。注
射用水のアリコート（６２０μl）をこの溶液に加え
た。さらに１０％ＨＣl（０.２μl）およびＮaＯＨ
（０.６μl）を加え、溶液の最終容量を注射用水で１.
４２mlにし、結果最終pＨ７.４２になった。この溶液を
０.２μm ＳuporRＡcrodiscR13（Gelman Sciences）フ
ィルターに通して使用前に濾過した。以下に挙げるもの
を含有する溶液に硫酸プロタミンを溶解することによっ
て、プロタミン貯蔵溶液を調製した：１.６mg/ml m−ク
レゾール、０.６５mg/ml フェノール、１６mg/ml グリ
セリン、および１４mＭ 二塩基性リン酸ナトリウム。こ
の溶液を最終pＨ７.４に調節し、遊離塩基を基準にして
０.６０mg/１００Ｕの最終プロタミン濃度を得た。この
溶液を０.２２μm（Millipore SterivexTM-GV）フィル
ター・ユニットでもって使用前に濾過した。
を、以下に挙げるものを含有する溶液（０.７１ml）に
タンパク質（１０.６２mg）を溶解することによって調
製した：３.２mg/ml m−クレゾール、１.３mg/ml フェ
ノール、および３２mg/ml グリセリン。酸性亜鉛の貯蔵
溶液［Ｚn2+で１０mg/ml、酸化亜鉛（０.３１１g）を１
０％ＨＣl（５ml）に溶解し、水で希釈して２５mlにす
ることにより調製］のアリコート（１０.２μl）を加え
た。タンパク質を完全に溶解させるよう、この溶液はp
Ｈ２.３であった。１０％ＮaＯＨのアリコート（６.５
μl）を加えて、pＨ７.００に調節した。この溶液に０.
２８Ｍ 二塩基性リン酸ナトリウム（７１μl、pＨ７.
０）を加え、これによって溶液をpＨ７.２６にした。注
射用水のアリコート（６２０μl）をこの溶液に加え
た。さらに１０％ＨＣl（０.２μl）およびＮaＯＨ
（０.６μl）を加え、溶液の最終容量を注射用水で１.
４２mlにし、結果最終pＨ７.４２になった。この溶液を
０.２μm ＳuporRＡcrodiscR13（Gelman Sciences）フ
ィルターに通して使用前に濾過した。以下に挙げるもの
を含有する溶液に硫酸プロタミンを溶解することによっ
て、プロタミン貯蔵溶液を調製した：１.６mg/ml m−ク
レゾール、０.６５mg/ml フェノール、１６mg/ml グリ
セリン、および１４mＭ 二塩基性リン酸ナトリウム。こ
の溶液を最終pＨ７.４に調節し、遊離塩基を基準にして
０.６０mg/１００Ｕの最終プロタミン濃度を得た。この
溶液を０.２２μm（Millipore SterivexTM-GV）フィル
ター・ユニットでもって使用前に濾過した。
【００４１】温度制御下（１３℃、１５℃、１７℃、お
よび２３℃）で、実施例１２に記載のように比率１：１
でプロタミン溶液とＡsp(Ｂ２８)−ヒト・インスリン溶
液を混合することによって結晶化させた。この結果を表
２に示す。最終混合物条件は以下のとおりであった：
３.７４mg/ml Ａsp(Ｂ２８)−ヒト・インスリン、０.０
３５９mg/ml (０.９％）亜鉛イオン、１.６mg/ml m−ク
レゾール、０.６５mg/mlフェノール、１６mg/ml グリセ
リン、１４mＭ 二塩基性リン酸ナトリウム、および０.
３０mg/１００Ｕ プロタミン（pＨ７.４）。４つの異な
る結晶化温度について評価した。１５℃に平衡化したＡ
sp(Ｂ２８)−ヒト・インスリンのアリコート（１ml）
を、同じ温度に調節したプロタミン溶液（１ml）と混合
した。穏やかに撹拌した後、調製物を１５℃で静置し
た。Ａsp(Ｂ２８)−ヒト・インスリン溶液（１００μl）
を１３℃に平衡化し、次いで同じ温度に調節したプロタ
ミン溶液（１００μl）と混合することによって、別の
試料を調製した。最終混合物を１３℃でインキュベート
した。２つのアリコート（１００μl）を平衡化し、混
合し、次いで１７℃でインキュベートすることを除いて
同様の方法で、第３の試料を調製した。周囲温度に平衡
化したＡsp(Ｂ２８)−ヒト・インスリンおよびプロタミ
ン溶液のアリコート（８０μl）を混合し、周囲温度
（２３℃）でインキュベートすることによって、最終溶
液を調製した。以下の表２に挙げるように、２４時間後
およびさらに時間間隔をおいた後、顕微鏡によって全試
料を評価した。
よび２３℃）で、実施例１２に記載のように比率１：１
でプロタミン溶液とＡsp(Ｂ２８)−ヒト・インスリン溶
液を混合することによって結晶化させた。この結果を表
２に示す。最終混合物条件は以下のとおりであった：
３.７４mg/ml Ａsp(Ｂ２８)−ヒト・インスリン、０.０
３５９mg/ml (０.９％）亜鉛イオン、１.６mg/ml m−ク
レゾール、０.６５mg/mlフェノール、１６mg/ml グリセ
リン、１４mＭ 二塩基性リン酸ナトリウム、および０.
３０mg/１００Ｕ プロタミン（pＨ７.４）。４つの異な
る結晶化温度について評価した。１５℃に平衡化したＡ
sp(Ｂ２８)−ヒト・インスリンのアリコート（１ml）
を、同じ温度に調節したプロタミン溶液（１ml）と混合
した。穏やかに撹拌した後、調製物を１５℃で静置し
た。Ａsp(Ｂ２８)−ヒト・インスリン溶液（１００μl）
を１３℃に平衡化し、次いで同じ温度に調節したプロタ
ミン溶液（１００μl）と混合することによって、別の
試料を調製した。最終混合物を１３℃でインキュベート
した。２つのアリコート（１００μl）を平衡化し、混
合し、次いで１７℃でインキュベートすることを除いて
同様の方法で、第３の試料を調製した。周囲温度に平衡
化したＡsp(Ｂ２８)−ヒト・インスリンおよびプロタミ
ン溶液のアリコート（８０μl）を混合し、周囲温度
（２３℃）でインキュベートすることによって、最終溶
液を調製した。以下の表２に挙げるように、２４時間後
およびさらに時間間隔をおいた後、顕微鏡によって全試
料を評価した。
【００４２】
【表２】 結晶化条件 aおよび顕微鏡結果 ［ＡspB28］ ［プロタミン］ 温度 時間 顕微鏡結果b （mg/ml） （mg/１００Ｕ） （℃） （時間） ３.９４ ０.３０ １５ ２４ 非結晶 ４８ 結晶性 ７２ 結晶性 ９６ 結晶性 １２０ 結晶性 ３.９４ ０.３０ ２３ ２４ 非結晶 ４８ 非結晶 ７２ 非結晶 ３.７４ ０.３０ １３ ２４ 非結晶 ４０ 結晶性/非結晶 ４８ 結晶性/非結晶 ６９ 結晶性/非結晶 ３.７４ ０.３０ １５ ２４ 非結晶/結晶性 ４０ 結晶性 ４８ 結晶性 ６９ 結晶性 ３.７４ ０.３０ １７ ２４ 非結晶/少数の結晶 ４０ 結晶性/非結晶 ４８ 結晶性/非結晶 ６９ 結晶性/非結晶 ３.７４ ０.３０ ２３ ２４ 非結晶 ４０ 非結晶/少数の結晶 ４８ 非結晶/少数の結晶 ６９ 非結晶/少数の結晶 a 全溶液は以下に挙げるものもまた含有する：０.９％亜鉛イオン、１.６mg/ml m−クレゾール、０.６５mg/ml フェノール、１６mg/ml グリセリン、および１４ mＭ 二塩基性リン酸ナトリウム（pＨ７.４）。b ６００×（Nikon Optiphot 66顕微鏡）または１０００×（Zeiss Axioplan微 分界面差顕微鏡）倍率の顕微鏡によって、結晶化結果を評価した。両顕微鏡には 写真撮影のための付属品を装備した。
【００４３】上記実施例に従って調製した結晶を図２お
よび３に示す。
よび３に示す。
【００４４】
【図１】 図１は、ＬysB28ＰroB29−hＩ−ＮＰＤおよ
びヒト・インスリン−ＮＰＨの作用のプロフィールのグ
ラフ表示である。このグラフはμＵ/ml対注入時間であ
る。この図によって、本発明の有利性が証明される。
びヒト・インスリン−ＮＰＨの作用のプロフィールのグ
ラフ表示である。このグラフはμＵ/ml対注入時間であ
る。この図によって、本発明の有利性が証明される。
【図２】 図２は、本発明のＡspB28−ヒト・インスリン
−プロタミン結晶の結晶構造を示す写真である。この写
真は、微分位相差の１０００×倍率で撮影した。
−プロタミン結晶の結晶構造を示す写真である。この写
真は、微分位相差の１０００×倍率で撮影した。
【図３】 図３は、本発明のＬysB28ＰroB29−ヒト・イ
ンスリン−プロタミン結晶の結晶構造を示す写真であ
る。この写真は、微分位相差の１０００×倍率で撮影し
た。
ンスリン−プロタミン結晶の結晶構造を示す写真であ
る。この写真は、微分位相差の１０００×倍率で撮影し
た。
Claims (20)
- 【請求項１】 Ｂ２８位のＰroがＡsp、Ｌys、Ｌeu、Ｖ
al、もしくはＡlaと置換されていて、かつＢ２９位のＬ
ysがＬysもしくはＰroであるヒト・インスリン、デス(Ｂ
２８−Ｂ３０)−ヒト・インスリン、またはデス(Ｂ２７)
−ヒト・インスリン；プロタミン；亜鉛；およびフェノ
ール誘導体を含むインスリン類似体−プロタミン複合体
（但し、該インスリンがＡspB28−ヒト・インスリンであ
る時、プロタミン濃度は１０重量％未満である）。 - 【請求項２】 ＬysB28ＰroB29−ヒト・インスリン、約
０.２７〜０.３２mg/(１００IＵ インスリン類似体)の
プロタミン、約０.３５〜０.９重量％の亜鉛、およびフ
ェノール誘導体である請求項１に記載の複合体。 - 【請求項３】 ＡspB28−ヒト・インスリン、約０.２７
〜０.３５mg/(１００IＵ インスリン類似体)のプロタミ
ン、約０.３５〜０.９重量％の亜鉛、およびフェノール
誘導体である請求項１に記載の複合体。 - 【請求項４】 複合体が結晶性である請求項１、２、ま
たは３のいずれかに記載の複合体。 - 【請求項５】 請求項１、２、３、または４に記載の複
合体を含むインスリン類似体−プロタミン非経口医薬製
剤。 - 【請求項６】 約０.２〜１.５mg/(１００IＵ インスリ
ン類似体)のプロタミン、約０.３５〜０.９重量％の亜
鉛、およびフェノール誘導体をさらに含む請求項５に記
載の製剤。 - 【請求項７】 ＬysB28ＰroB29−ヒト・インスリン、約
０.２７〜０.３２mg/(１００IＵ インスリン類似体)の
プロタミン、および約０.３５〜０.９重量％の亜鉛を含
む請求項６に記載の非経口医薬製剤。 - 【請求項８】 ＡspB28−ヒト・インスリン、約０.２７
〜０.３５mg/(１００IＵ インスリン類似体)のプロタミ
ン、および約０.３５〜０.９重量％の亜鉛を含む請求項
６に記載の非経口医薬製剤。 - 【請求項９】 ＬysB28ＰroB29−ヒト・インスリン、約
０.３mg/(１００IＵインスリン類似体)のプロタミン、
約０.７重量％の亜鉛、約１.７mg/ml m−クレゾール、
約０.７mg/ml フェノール、約１６mg/ml グリセリン、
および３.７８mg/ml 二塩基性リン酸ナトリウムを含む
非経口医薬製剤。 - 【請求項１０】 可溶性インスリン類似体をさらに含む
請求項５〜９のいずれかに記載の非経口医薬製剤。 - 【請求項１１】 ２成分の重量比（インスリン類似体：
インスリン類似体−プロタミン結晶）が約１：９９〜９
９：１である可溶性インスリン類似体およびインスリン
類似体−プロタミン結晶の混合物を含む非経口医薬製剤
［該インスリン類似体は、Ｂ２８位のＰroがＡsp、Ｌy
s、Ｌeu、Ｖal、もしくはＡlaと置換されていて、かつ
Ｂ２９位のＬysがＬysもしくはＰroであるヒト・インス
リン、デス(Ｂ２８−Ｂ３０)−ヒト・インスリン、また
はデス(Ｂ２７)−ヒト・インスリンである（但し、該イ
ンスリンがＡspB28−ヒト・インスリンである時、プロタ
ミン濃度は１０重量％未満である）］。 - 【請求項１２】 ２成分の重量比が約７５：２５〜２
５：７５である請求項１１に記載の非経口医薬製剤。 - 【請求項１３】 ＬysB28ＰroB29−ヒト・インスリンお
よびＬysB28ＰroB29−ヒト・インスリン−プロタミン結
晶を含む請求項１２に記載の非経口医薬製剤。 - 【請求項１４】 ２成分の重量比が５０：５０、７５：
２５、または２５：７５である請求項１３に記載の非経
口医薬製剤。 - 【請求項１５】 真性糖尿病の治療に用いるための請求
項５〜１４のいずれかに記載の非経口医薬製剤。 - 【請求項１６】 水性溶媒中で単体インスリン類似体、
プロタミン、亜鉛、およびフェノール誘導体を混合し、
複合体を形成させることからなる請求項１〜４のいずれ
かに記載の複合体を調製するための方法。 - 【請求項１７】 約８〜２２℃の温度で、ヘキサマー会
合状態のＬysB28ＰroB29−ヒト・インスリン水溶液とプ
ロタミン溶液を混合することからなる、ＬysB28ＰroB29
−ヒト・インスリン−プロタミン結晶を調製するための
方法であって、該水溶液は、pＨ約７.１〜７.６で、約
０.３５〜０.９重量％の亜鉛、ＬysB28ＰroB29−ヒト・
インスリン、およびフェノール誘導体を含み、該プロタ
ミン溶液は、pＨ約７.１〜７.６でプロタミンを含み、
最終プロタミン濃度が約０.２７〜０.３２mg/(１００I
Ｕ インスリン類似体)である方法。 - 【請求項１８】 温度が１５℃であり、亜鉛濃度が０.
７〜０.９％であり、プロタミン濃度が０.３mg/１００I
Ｕ インスリン類似体である請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 約１３〜１７℃の温度で、ヘキサマー
会合状態のＡspB28−ヒト・インスリン水溶液とプロタミ
ン溶液を混合することからなる、ＡspB28−ヒト・インス
リン−プロタミン結晶を調製するための方法であって、
該水溶液は、pＨ約７.１〜７.６で、約０.３５〜０.９
重量％の亜鉛、ＡspB28−ヒト・インスリン、およびフェ
ノール誘導体を含み、該プロタミン溶液は、pＨ約７.１
〜７.６でプロタミンを含み、最終プロタミン濃度が約
０.２７〜０.３２mg/(１００IＵ インスリン類似体)で
ある方法。 - 【請求項２０】 薬学的に許容し得る希釈剤にインスリ
ン類似体−プロタミン結晶を懸濁することからなる、請
求項５〜１４のいずれかに記載の非経口医薬製剤を調製
する方法。
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