HU218943B

HU218943B - Inzulin-analóg-protamin komplexek, az azokat tartalmazó gyógyászati készítmények és eljárás ezek előállítására

Info

Publication number: HU218943B
Application number: HU9501717A
Authority: HU
Inventors: Michael Rosario De Felippis
Original assignee: Eli Lilly And Co.
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-13
Publication date: 2001-01-29
Also published as: FI952932A; GB2290294B; SE9502168D0; US5461031A; IL114153A; PT101723A; US5650486A; NO952356D0; FI118208B; KR960000923A; CH693019A5; NO320808B1; CA2151564C; NL1000565A1; HU9501717D0; IL114153A0; GB9512105D0; MY116831A; YU39795A; DK176213B1

Abstract

A jelen találmány tárgyát humán inzulinanalóg-protamin komplexek, azazokat tartalmazó gyógyászati készítmények képezik, valamint eljárásezek előállítására. A készítmények meghosszabbított hatásidőtbiztosítanak. A találmány szerinti inzulinanalóg-protamin komplex akövetkező alkotóelemeket tartalmazza: humán inzulinanalóg, ahol a B28-as pozícióban Pro, Asp, Lys, Leu, Val vagy Ala és a B29-es pozícióbanLys vagy Pro áll; des(B28–B30)-humán inzulin vagy des(B27)-humáninzulin; 100 NE fenti inzulinanalóghoz viszonyítva 0,2–1,5 mgprotamin, a szabad bázisra számítva; a komplex össztömegére számítva0,35–0,9 tömeg% cink; és fenolszármazék, ahol a fenolszármazékjelentése m-krezol, fenol vagy az m-krezol és a fenol keveréke, azzala feltétellel, hogy amennyiben a humán inzulinanalóg (AspB28)-humáninzulin, a protamin mennyisége a komplex össztömegére viszonyítva 10tömeg%-nál kisebb. ŕ

Description

A jelen találmány tárgyát humán inzulinanalóg-protamin komplexek, az azokat tartalmazó gyógyászati készítmények képezik, valamint eljárás ezek előállítására. Pontosabban a jelen találmány tárgyát különböző parenterális készítmények képezik, amelyek inzulinanalógot, cinket, protamint és egy fenolszármazékot tartalmaznak. A készítmények meghosszabbított hatásidőt biztosítanak. A találmány tárgya továbbá eljárás inzulinanalóg-protamin készítmények előállítására, valamint inzulinanalóg-protamin komplexek.

Az inzulinnak az 1920-as években történt bevezetése óta nagy előrehaladás történt a cukorbetegség kezelésének javításában. Nagy előrelépés történt az inzulin tisztaságának fokozásában és elérhetőségében, a rekombináns DNS-technológia bevezetésével. Kifejlesztettek különböző készítményeket, amelyek különböző ideig hatnak. Jelenleg általában hét különböző inzulinkészítmény van kereskedelmi forgalomban: szabványos inzulin, Semilente inzulin, globininzulin, isophane-inzulin, inzulin-cink szuszpenzió, protamin-cink-inzulin és Ultralente inzulin.

Az elérhető készítmények nagy száma ellenére a szubkután injekciós terápia még mindig nem tudja a betegnek biztosítani a kényelmes szabályozást és a normalizált glikémiás kontrollt. Egy beteg életében a normál cukorszinttől való gyakori eltérés hiper- vagy hipoglikémiához vezet, valamint hosszú ideig tartó komplikációkhoz, mint például retinopátiához, neuropátiához, neffopátiához, valamint mikro- és makroangiopátiához.

A szélsőséges cukorszintek elkerülésére a cukorbetegek gyakran többszöri injekciózáson alapuló terápiát alkalmaznak, mikor is minden egyes étkezésnél inzulint adnak be maguknak. Ezt a terápiát azonban még nem optimalizálták. A kereskedelmi forgalomban levő, leggyorsabban ható inzulin az injekciózás után túl későn éri el a csúcsértéket, és túl sokáig hat ahhoz, hogy optimálisan szabályozza a glükózszinteket. Ennélfogva jelentős erőfeszítéseket tettek olyan inzulinkészítmények és inzulinanalóg-készítmények előállítására, amelyek megváltoztatják a szubkután abszorpciós folyamat kinetikáját.

Mivel az összes kereskedelmi forgalomban levő inzulinkészítmény az inzulint önmagával asszociálódott állapotban tartalmazza, főleg hexamer formában, ezért az a vélemény alakult ki, hogy az inzulinnak a szubkután injekciós depóból a véráramba való abszorpciójában a sebességmeghatározó lépés az önmagával aggregálódott inzulin hexamer disszociációja. Nemrég monomer inzulinanalógokat fejlesztettek ki, amelyek kevésbé asszociálódnak a humán inzulin magasabb molekulasúlyú formáivá. A saját magával való asszociálódásra való képtelenség a humán inzulin aminosavszekvenciájának módosításából ered, ami csökkenti az asszociációt, oly módon, hogy elsődlegesen a dimerek képződését akadályozza meg [Brems és munkatársai: Protein Engineering 5(6), 527-533 (1992); Brange és munkatársai: Natúré 333, 679-682 (1988)]. Ennek megfelelően a monomer inzulinanalógok viszonylag gyorsabban fejtik ki az aktivitásukat, míg megtartják a természetes humán inzulin biológiai aktivitását. Ezek az inzulinanalógok gyors abszorpciót biztosítanak, ezzel az injekciózás idejét és az inzulin csúcshatását sokkal közelebb hozzák az egy étkezéssel kapcsolatban kialakuló posztprandiális glükózeltéréssel.

A monomer analógok fizikai tulajdonságai és jellemzői nem analógok az inzulinéval. Például Brems és munkatársai leíqák, hogy a különböző monomeranalógoknak kicsi vagy egyáltalán nem létezik a Zn-indukált asszociációja. Bármely megfigyelt asszociáció a magasabb molekulasúlyú formáknak a többszöröse. Ez drasztikusan eltér az inzulintól, amely cink jelenlétében szinte kizárólag a rendezett, hexamer konformációban fordul elő [Brange és munkatársai: Diabetes Care 13, 923-954 (1990)]. Az asszociáció hiánya hozzájárul ahhoz, hogy az analógokat az jellemzi, hogy gyorsan hatnak. Mivel az analógokban kisebb a hajlam arra, hogy asszociálódjanak, ezért eléggé meglepő, hogy egy olyan monomer inzulinanalóg-készítmény állítható elő, amely közepes időtartamú hatást biztosít.

A jelen találmány tárgya egy új, monomer inzulinanalógot tartalmazó készítmény, amelynek alkalmazása közepes hosszúságú hatást biztosít. A találmány tárgya továbbá egy új inzulinanalóg-protamin kristály, amelyet inzulinanalóg-NPD-nek neveznek. A jelen találmány tárgya továbbá egy keverék, amely inzulinanalóg NPD-t és oldható monomer inzulinanalógot tartalmaz. Ez a keverék a hatás gyors fellépését és közepes időtartamát biztosítja. Ennek megfelelően a keverék mind az inzulinnál, mind a monomer inzulinanalógnál előnyösebb. A jelen találmány tárgya továbbá eljárás inzulinanalóg-NPD egynemű kristályainak előállítására.

A jelen találmány tárgya továbbá egy inzulinanalóg-protamin készítmény, amelynek összetétele: egy monomer inzulinanalóg, protamin, cink és egy fenolszármazék.

A találmány tárgya továbbá egy kristályos inzulinanalóg-protamin komplex. Ezt a komplexet inzulinanalóg-NPD-nek definiáltuk. A (Lys^B28Pro^B29)-humán inzulin-NPD összetétele: egy (Lys^B28Pro^B29)-humán inzulin, 0,27-0,32 mg protamin/100 egység (NE) inzulinanalóg, 0,35-0,9 tömeg% cink és egy fenolszármazék.

A találmány tárgya továbbá eljárás (Lys^B28Pro^B29)humán inzulin-NPD előállítására, melynek során hexamer asszociációs állapotban levő (Lys^B28Pro^B29)-humán inzulin vizes oldatát és egy protaminoldatot 8-22 °C-on összekeverünk; ahol az említett vizes oldat 0,35-0,9 tömeg% cinket, (Lys^B28Pro^B29)-humán inzulint és egy fenolszármazékot tartalmaz pH=7,1-7,6 értéken; és az említett protaminoldat pH=7,1 -7,6 mellett tartalmaz protamint, oly módon, hogy a protamin végkoncentrációja 0,27-0,32 mg protamin/100 egység inzulinanalóg.

A találmány szerinti készítmények mind rövid, mind közepes időtartamú hatással rendelkeznek. A készítmények monomer inzulinanalóg és kristályos inzulinanalóg-NPD keverékei, amelyekben a két komponens tömegaránya körülbelül 1 -99:99-1.

HU 218 943 Β

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrák leírását.

Az 1. ábra a (Lys^B28Pro^B29)-humán inzulin-NPD és a humán inzulin-NPH hatásprofilját mutatja be. A grafikonon a μΕ/ml-t ábrázoljuk az infúzió idejével szemben. Az ábrán láthatók a találmány előnyei.

A 2. ábrán a jelen találmány szerinti (Asp^B28)-humán inzulin-protamin kristályok képe látható. A képet 1000-szeres nagyítással vettük fel, differenciális fáziskontraszttal.

A 3. ábrán a jelen találmány szerinti (Asp^B28)-humán inzulin-protamin kristályok láthatók. A képet 1000-szeres nagyítással vettük fel, differenciális fáziskontraszttal.

Amint az előzőkben megjegyeztük, a találmány tárgyát egy monomer inzulinanalóg különböző készítményei képezik. A „monomer inzulinanalóg” vagy „inzulinanalóg” szakkifejezést a továbbiakban egy gyorsan ható inzulinanalógra használjuk, amely kevésbé hajlamos a dimerizációra vagy az önmagával való asszociációra. Az inzulinanalóg egy humán inzulin, amelyben a B28-as pozícióban Pro, Asp, Lys, Leu, Val vagy Alá, és a B29-es pozícióban Lys vagy Pro áll; des(B28-B30)-humán inzulin; vagy des(B27)-humán inzulin. A monomer inzulinanalógokat Chance és munkatársai [EPO 383,427] és Brange és munkatársai írták le [EPO 214,826], amely publikációkat a továbbiakban referenciának tekintjük.

Az ebben a leírásban alkalmazott összes aminosavrövidítés a szakember számára jól ismert. Különösen előnyös monomer inzulinanalóg a (Lys^B28Pro^B29)-humán inzulin (a B28 Lys, a B29 Pro) és az (Asp^B28)-humán inzulin (a B28 Asp).

A „monomer inzulinanalóg-NPD” vagy „inzulinanalóg-NPD” egy fenti kristályos humán inzulinanalóg és protamin szuszpenziója egy készítményben. Az NPD jelentése Neutral Protamin készítmény, DeFelippis szerint. A készítményt az alábbiakban ismertetett, igénypontokkal védett eljárással állítjuk elő. Az „inzulinanalóg-NPD kristályok”, „kristályos inzulinanalóg-NPD” vagy a „(Lys^B28Pro^B29)-humán inzulin-protamin kristályok” rokon kifejezések az NPD-készítményben levő inzulinanalóg-protamin kristályokra vonatkoznak.

Az „izotonicitási ágens” szakkifejezés egy olyan ágenst jelent, amely fiziológiásán elfogadható, és megfelelő tonicitást biztosít a készítménynek, hogy megakadályozzuk a víznek a sejtmembránon keresztül való áramlását. Az olyan vegyületeket, mint például a glicerint, gyakran használják ilyen célokra, ismert koncentrációban. Az izotonicitási ágens koncentrációja az inzulinkészítmények körében elfogadott tartományba esik.

Az előzőekben és továbbiakban, így a leírásban és igénypontokban a „fenolszármazék” kifejezés jelentése m-krezol, maga a fenol, vagy m-krezol és fenol keveréke, előnyösen m-krezol vagy fenol.

A „szabad bázis alap” szakkifejezés a készítményben levő protamin tényleges mennyiségére utal. A szabad bázis alap korrigálja a kereskedelmi forgalomban levő és a parenterális készítményekben általában használt protaminsók víz- és sótartalmát. Az előnyös protamin, a protamin-szulfát körülbelül 80% protamint tartalmaz.

A „NE” vagy „E” szakkifejezés jelentése nemzetközi egység.

Az „isophane-arány” szakkifejezés jelentése a protaminnak az az egyensúlyi mennyisége, ami ahhoz szükséges, hogy komplexet képezzen az analóggal [Kreyenbühl és Rosenberg, STENO MEMORIAL HOSPITAL REPORT (KOPPENHÁGA) 1, 60 (1946)]. Az isophane-arányt titrálással határozzuk meg, a szakterületen jól ismert módszerrel, Kreyenbühl és munkatársai leírása szerint [Kreyenbühl és Rosenberg, STENO MEMORIAL HOSPITAL REPORT (KOPPENHÁGA) 1,60 (1946)].

A találmány tárgya egy inzulinanalóg-protamin komplex, amelynek összetétele: monomer inzulinanalóg, protamin, cink és egy fenolszármazék. A protamin koncentrációja 0,2-1,5 mg protamin/100 NE inzulinanalóg, szabad bázis alapján számítva. A legelőnyösebb, ha a protamin aránya 0,27 mg/100 E és 0,35 mg/100 E között van. A cink koncentrációja tömegszázalékban számítva körülbelül 0,35-0,9%. A cink koncentrációja előnyösen 0,7%.

A „fenolszármazék” előnyösen m-krezol és fenol. A fenolszármazék koncentrációja jól ismert a szakterületen jártas szakember számára. A koncentrációnak elegendőnek kell lennie ahhoz, hogy megtartsa a konzerválóhatását, azaz tartsa vissza a mikroorganizmusok növekedését. Általában a fenolszármazék koncentrációja 1,0 mg/ml és 6,0 mg/ml között van, előnyösen nagyobb mint 2,5 mg/ml. A legelőnyösebb koncentráció 3 mg/ml. A fenolszármazék jelenléte fontos, mivel amellett, hogy konzerválószerként működik, az inzulinanalóg, a protamin és a cink komplexének kialakításában is részt vesz. Véleményünk szerint azonban egy molekula inzulinanalóghoz csak egy molekula fenolszármazék kötődik a kristályszerkezetben.

Előnyösen egy izotonicitási ágenst is adunk a találmány szerinti készítményhez. Az előnyös izotonicitási ágens a glicerin. Az izotonicitási ágens koncentrációja például 14 mg/ml és 18 mg/ml között változik, előnyösen 16 mg/ml.

A készítmény pH-ját egy fiziológiásán tolerált pufferrel lehet pufferelni, előnyösen egy foszfátpuíferrel, azaz például dibázisos nátrium-foszfáttal. Más, fiziológiásán elfogadható puffer lehet például a TRIS, a nátrium-acetát vagy a nátrium-citrát. A puffer kiválasztása és koncentrációja a szakterületen jól ismert. A koncentráció általában például 1,5 mg/ml és 5,0 mg/ml között lehet, előnyösen 3,8 mg/ml.

A jelen találmány kidolgozása során olyan specifikus körülményeket állapítottunk meg, amelyek mellett az inzulinanalóg-protamin stabil kristályként létezik. Ezeket a kristályokat nevezzük inzulinanalóg-NPD-nek. Az inzulinanalóg-NPD az inzulinanalóg-NPD kristályok formált szuszpenziója, és használatakor a közepes hatás időtartamát eredményezi. Az inzulinanalóg-NPD aktivitásprofilja meglepő a monomer inzulinanalóg önmagával való asszociálódása hiányának ismeretében.

HU 218 943 Β

Azt a lehetőséget, hogy egy közepes időtartamig ható készítményt lehet előállítani monomer inzulinanalóggal, az 1. ábrán mutatjuk be. Az 1. ábrán a (Lys^B28Pro^B29)-humán inzulin-NPD és a humán inzulin-NPH hatásprofilját mutatjuk be. Az NPD profilja hasonlít az inzulin-NPH-hoz. Az NPD-készítmény és az inzulin-NPH készítmény hatásának időtartama körülbelül egyforma. A legjelentősebb azonban, hogy a találmány szerinti készítmény hatása gyorsabban jelenik meg, és hosszabb ideig marad stabil, mint az inzulinNPH. Ez az eltérés egészen váratlan a monomer inzulinanalóg gyors hatásprofiljának ismeretében.

Egy különösen előnyös inzulinanalóg-protamin készítmény, a (Lys^B28Pro^B29)-humán inzulin-NPD összetétele a következő: (Lys^B28Pro^B29)humán inzulin, 0,27-0,32 mg protamin/100 NE inzulinanalóg, 0,35-0,9 tömeg% cink és egy fenolszármazék. A protamin koncentrációja előnyösen 0,3 mg/100 NE, szabad bázisra számítva.

A találmány tárgya továbbá eljárás (Lys^B28Pro^B29)humán inzulin-protamin kristályok előállítására, amelynek során hexamer állapotban levő (Lys^B28Pro^B29)humán inzulin vizes oldatát és egy protaminoldatot 8-22 °C-on elegyítünk; ahol az említett vizes oldat 0,35-0,9 tömeg% cinket, (Lys^B28Pro^B29)-humán inzulint és egy fenolszármazékot tartalmaz, pH=7,1-7,6 közötti értéken; és az említett protaminoldat a protamint 7,1-7,6-es pH-η tartalmazza, oly módon, hogy a protamin végkoncentrációja 0,27-0,32 mg protamin/100 E inzulinanalóg.

A találmány bejelentésének időpontjában ismert volt, hogy a monomer inzulinanalógoknak kisebb a hajlamuk az asszociálódásra és hexamerek képzésére. A szakirodalomban azonban korábban nem voltak ismertek azok a körülmények, amelyek között a monomer inzulinanalógok protaminnal asszociálódnak és kristályokat képeznek. A korábbi vizsgálatok az inzulinra vonatkoztak. Az inzulin-NPH készítésére (semleges protaminkészítmény Hagedom szerint) vagy az isophane-inzulin készítmények készítésére [Krayenbühl és Rosenberg, STENO MEMORIAL HOSPITAL REPORT (KOPPENHÁGA) 1, 60 (1946)] vonatkozó leírások nem relevánsak a monomer inzulinanalógok eltérő tulajdonságai miatt. Tény, hogy a Humulin-N™ (inzulin-NPH) ipari méretű előállítása, ami egy savsemleges eljárás, nem eredményez inzulinanalóg-NPD-t.

A legjelentősebb felismerés, hogy a találmány szerinti eljárás paraméterei, nevezetesen a kristályosítás hőmérséklete és az inzulinanalóg, a cink és a fenolszármazék hexamer komplexe képződése kritikus korlátjai a stabil, (Lys^B28Pro^B29)-humán inzulin-NPD kristályok képződésének.

A kristályosítás hőmérsékletét 8 °C és 22 °C között kell tartani, előnyösen 13-17 °C között. Ha a hőmérséklet ezen a tartományon kívülre kerül, akkor főleg amorf inzulinanalóg-protamin készítmények jönnek létre.

Az is kritikus, hogy az inzulinanalóg a kristályosítás előtt hexamer formává alakuljon át. A kristályosítás egy amorf terméket eredményez, ha az eljárást monomerasszociációs állapotban hajtjuk végre. A kristályok kevertetés nélkül képződnek öt-harminchat óra alatt.

A jó minőségű kristályok általában 24 órán belül képződnek.

Az oldható monomer inzulinanalógot úgy visszük hexamerasszociációs állapotba, hogy a szilárd monomer analógot egy fenolszármazékot tartalmazó hígítószerben szuszpendáljuk, majd addig adunk hozzá cinkforrást, amíg koncentrációja a 0,35-0,9 tömeg%-ot el nem éri. A cinket előnyösen só formájában adjuk a rendszerhez. A használható cinksók közé tartozik a cinkacetát, cink-bromid, cink-klorid, cink-fluorid, cink-jodid és cink-szulfát. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy vannak még egyéb cinksók is, amelyeket a jelen találmány szerinti eljárásban használni lehet. Előnyösen a cink-acetátot és a cink-kloridot használjuk.

Az inzulinanalógnak a hígítószerben való oldódását egy olyan módszerrel segíthetjük, amely savas oldás néven ismert. A savas oldás során a pH-t körülbelül 3,0-3,5-re állítjuk egy fiziológiásán elfogadható savval, előnyösen sósavval, hogy fokozzuk az inzulinanalóg oldhatóságát. Más, fiziológiailag elfogadható sav lehet az ecetsav, citromsav és a foszforsav. A pH-t azután egy fiziológiásán elfogadható bázissal, nevezetesen nátrium-hidroxiddal körülbelül 7,1-7,6-re állítjuk a kristályosításhoz. Egyéb, fiziológiásán elfogadható bázis lehet a KOH és az ammónium-hidroxid.

A legfontosabb, hogy a (Lys^B28Pro^B29)-humán inzulin-NPD komplex érzékeny a nátrium-klorid koncentrációjára. Ha a nátrium-klorid koncentrációja meghaladja a 4 mg/ml-t, akkor az inzulinanalóg-NPD kristályok amorf termékkel kevertek lesznek. Ennek megfelelően az az előnyös, ha a monomer inzulinanalógot semleges pH-η oldjuk fel, hogy elkerüljük a sóionok képződését. Egy másik módszer szerint az inzulinanalógot savas pH-η oldhatjuk a hígítószerben, mielőtt a puffért hozzáadjuk. Ez csökkenti a pH állítása miatt képződött sók koncentrációját. Azonban az egyes komponensek hozzáadásának sorrendje nem kritikus a hexamer vagy az amorf termék képződése szempontjából.

Amint azt az előzőkben ismertettük, egy izotonicitási ágenst is hozzá lehet adni a jelen találmány szerinti készítményekhez. Az izotonicitási ágenst hozzáadhatjuk az inzulinanalóg oldatához, a protamin oldatához, vagy a végső inzulinanalóg-NPD készítményhez. Hasonlóképpen, a fiziológiásán elfogadható puffért hozzáadhatjuk az inzulinanalóg oldatához, a protamin oldatához vagy a végső inzulinanalóg-NPD készítményhez. Azonban előnyös, ha mind az inzulinanalóg-oldat, mind a protaminoldat tartalmazza az izotonicitási ágenst és a puffért, mielőtt a vizes oldatot és a protamint egyesítjük. Mivel a nátrium-klorid befolyásolja a kristályos inzulinanalógNPD előállítási eljárását, ezért az előnyben részesített izotonicitási ágens a glicerin.

A találmány tárgyát képezik továbbá az inzulinanalóg készítmények, amelyek az inzulinanalóg-NPD-t tartalmazzák kristályos szilárd anyag formájában, valamint egy oldható inzulinanalógot. Ezeket a keverékeket körülbelül 1:99-99:1 arányban készítjük, a szuszpen4

HU 218 943 Β dalt inzulinanalóg-NPD és az oldható inzulinanalóg térfogata alapján számítva. Az oldható inzulinanalóg egy monomer fenti inzulinanalóg, vizes hígítószerben oldva, amelynek összetétele: cink, egy fenolszármazék, egy izotonicitási ágens és puffer. A hígítószer komponenseinek koncentrációja ugyanaz, mint amit az előzőekben ismertettünk. Az inzulinanalóg-NPD-nek és az oldható inzulinanalógnak az aránya 25:75 és 75:25 között változhat, legelőnyösebb, ha 50:50. A keverékeket könnyen előállíthatjuk az egyes komponensek összekeverésével.

A jelen találmány szerinti kevert készítmények különösen alkalmasak cukorbetegség kezelésére, mivel egyszerre biztosítják a hatás gyors fellépését és hosszabb időtartamát. Ezek a keverékek lehetővé teszik a „finomszabályozást”, az egyes alkotóelemek mennyiségének változtatásával, a beteg szükségleteitől, étrendjétől és fizikai aktivitásától függően. A szuszpendált inzulinanalóg-NPD és oldható inzulinanalóg keveréke azért is előnyös, mert homogén, azaz bármely egyensúlyi kicserélődés a szuszpendált kristályok és az oldható inzulinanalógok között transzparens.

A találmány szerint alkalmazott inzulinanalógokat a számos ismert peptidszintézis-módszer egyikével állíthatjuk elő, beleértve a klasszikus (oldatban végzett) módszereket, a szilárd fázisú módszereket, a félszintetikus módszereket, és legújabban a rekombináns DNS-módszereket. Például Chance és munkatársai [383 472 EPO publikációs számú bejelentés], valamint Brange és munkatársai [214 826 EPO számú bejelentés] számos különböző monomer inzulinanalóg szintézisét írják le.

Az alábbi példákat csak az inzulinanalóg előállításának és a találmánynak az illusztrálására adjuk meg. A találmány oltalmi köre nem csak az alábbi példákra teljed ki. Az alábbiakban a ,Jri” rövidítés humán inzulint jelent.

1. példa

A (Lys^B28Pro^B29)-hi-NPD készítése

200 NE/ml (E200) koncentrációjú (Lys^B28Pro^B29)hi oldatát úgy készítjük el, hogy (Lys^B28Pro^B29)-hi cinktartalmú kristályait konzerváló/puffer rendszerben oldjuk fel, amelynek összetétele az alábbi: 1,6 mg/ml mkrezol, 0,73 mg/ml fenol (megfelel 0,65 mg/ml 89%-os fenolnak), 16 mg/ml glicerin és 3,78 mg/ml kétbázisos nátrium-foszfát-puffer (Na₂HPO₄). A kristályok endogén cinktartalmát megfelelő térfogatú savas ZnO-oldat (10 mg/ml) hozzáadásával egészítjük ki, hogy elérje a 0,025 mg/100 NE (0,7%) végkoncentrációt. A (Lys^B28Pro^B29)-hi feloldását szobahőmérsékleten végezzük, pH-értékét körülbelül 3-ra csökkentve, mikrolitemyi térfogatú, 5 mol/1 koncentrációjú sósavval. Miután az oldat kitisztult, a pH-t újra 7,5-re állítjuk, mikrolitemyi térfogatú 5 mol/1 NaOH-dal.

Protaminoldatot készítünk oly módon, hogy elegendő mennyiségű protamin-szulfátot oldunk a konzerváló/puffer oldatban, hogy 0,6 mg/100 NE végkoncentrációt érjünk el szabad bázisra számítva. Ennek az oldatnak a pH-ját 7,5-re állítjuk, majd 15 °C-ra állítjuk a hőmérsékletét.

Mindkét oldatot az injekciózáshoz szükséges végkoncentrációra hígítjuk vízzel, majd megszűrjük. A (Lys^B28Pro^B29)-hi alszekcióból 5 ml-es alikvot részeket külön tiszta üvegampullákba töltünk, majd a mintákat 15 °C-os vízfürdőben inkubáljuk. Miután elegendő idő (15 perc) eltelt ahhoz, hogy az oldat hőmérséklete beálljon, megkezdjük a kicsapást, oly módon, hogy gyorsan hozzáadunk 5 ml protaminoldatot a (Lys^B28Pro^B29)-hi mintákhoz. A kristályosodást körülbelül 24 óra hosszat hagyjuk lejátszódni 15 °C-on.

2. példa (Lys^B28Pro^B29)-hi-NPD készítése

Az eljárás megegyezik az 1. példában leírttal, azzal a különbséggel, hogy a (Lys^B28Pro^B29)-hi feloldását semleges pH-η végezzük. Az eljárást úgy hajtjuk végre, hogy a pH végső értéke 7,4 legyen.

3. példa

ÍLys^B28Pro^B29)-hi-NPD készítése

Az inzulinanalóg-NPD készítése megegyezik az

1. példában leírtakkal, azzal a különbséggel, hogy a (Lys^B28Pro^B29)-hi savas oldását az összes töltőanyag jelenlétében hajtjuk végre, kivéve a kétbázisos nátrium-foszfát-puffert. A szilárd kétbázisos nátrium-foszfátot azután adjuk az oldathoz, miután az inzulinanalóg oldat pH-ját 7,4-re állítottuk vissza. A kétbázisos nátrium-foszfát hozzáadása feltisztítja az oldatot.

4. példa

Az inzulinanalóg-NPD keverékkészítmények készítése

A közepes hosszúságú ideig és gyorsan ható (Lys^B28Pro^B29)-hi készítményeket az alábbiak szerint állítjuk elő. A közepes hatásidejű szuszpenziós készítményt a 3. példában leírtak alapján készítjük el, és ez szolgál a keverék közepes hatásidejű részeként. A (Lys^B28Pro^B29)-hi (100 NE) külön oldatát úgy készítjük el, hogy cinktartalmú Lys^B28Pro^B29-hi kristályokat oldunk szobahőmérsékleten az 1. példában ismertetett hígítószerben. A (Lys^B28Pro^B29)-hi endogén cinktartalmát ebben az oldatban savas ZnO-oldat hozzáadásával állítjuk be úgy, hogy elélje a szuszpenziós rész cinktartalmát [azaz 0,025 mg/100 NE (0,7%)]. Injekciózáshoz alkalmas vizet használunk az oldat végkoncentrációra való hígításához, miután pH-értékét 7,4-re állítottuk, sósav és/vagy nátrium-hidroxid 10%-os oldatának alkalmazásával. A végső elegyet úgy állítjuk elő, hogy a közepes hatásidejű és a gyorsan ható alszekciókból megfelelő mennyiségeket kombinálunk, hogy ezzel eléljük a megfelelő arányt. 50:50 arányú keveréket úgy állítunk elő, hogy a közepes hatásidejű részből és a gyorsan ható részből is 1-1 térfogatrészt veszünk.

5. példa

Az ionerősség hatása a (Lys^B28Pro^B29)-hi-protamin kristályosodására

Az ionerősség hatását a kristályosodásra úgy határozzuk meg, hogy nátrium-kloridot adunk a (Lys^B28Pro^B29)-hi részhez, mielőtt protaminnal kever5

HU 218 943 Β nénk. A nátrium-kloridot úgy adjuk hozzá, hogy a végkoncentráció 20, 30 és 40 mmol/1 (1,2, 1,8 és

2,3 mg/ml) legyen. A térfogat részecskeméret multimodális viselkedésű (további csúcsok a kis részecskeméreteknél), ahogy a nátrium-klorid-koncentrációt növeljük. A térfogat átlagos részecskeméret csökken, ahogy a nátrium-klorid-koncentráció nő, jelezve egy amorf anyag mennyiségének növekedését. A részecskeméretnek a nátrium-klorid-koncentrációval való változását az alábbi táblázatban mutatjuk be:

NaCl-koncentráció Tétfogat átlagos részecskeméret (pm) mmol/1 3,9 mmol/1 3,5 mmol/1 3,3 mmol/1 3,2

A mikroszkópos elemzés azt mutatja, hogy mindegyik minta amorf és kristályos anyagok keverékét tartalmazza. A 40 mmol/1 NaCl-ot tartalmazó mintában főleg amorf anyag található és nagyon kevés kristály.

6. példa

A (Lys^B28Pro^B29)-hi-NPD és a humán inzulin-NPH összehasonlító dinamikája

Ezt a vizsgálatot éberkutya-modellen végeztük. A vizsgálat elkezdése előtt három alapmintát veszünk. Szomatosztatin (0,3 pg/kg perc) infúziót kezdünk. Tíz perc elteltével vagy NPD-, vagy NPH-injekciót adunk be az állatnak. A plazma glükózszintjét gyakran ellenőrizzük, és különböző glükóz- (20%) infúziót adunk, hogy fenntartsuk a közel normál glikémiát. Végig mintákat veszünk, és mérjük benne az immunreaktív inzulin (Linco ellenanyag) és a glükóz szintjét. Az eredményeket az 1. ábrán mutatjuk be.

7. példa (Asp^B28)-hi-protamin kristályok készítése

200 NE/ml (E200) koncentrációjú (Asp⁸²⁸)-!!! oldatot készítünk oly módon, hogy liofilezett búik (nagy mennyiségben vásárolt) (95%-os tisztaságú) anyagot konzerváló/puffer rendszerben oldunk, amelynek összetétele az alábbi: 1,6 mg/ml m-krezol, 0,73 mg/ml fenol (megfelel 0,65 mg/ml 89%-os fenolnak), 16 mg/ml glicerin és 3,78 mg/ml kétbázisos nátrium-foszfát-puffer. A rendszerhez cinket a megfelelő koncentrációjú (10 mg/ml) savas ZnO-oldattal adjuk, annyit, hogy a végkoncentráció 0,025 mg/100 NE legyen. Az (AspB²⁸)-hi feloldódását szobahőmérsékleten semleges pH-η éljük el. A szekció végső pH-ja 7,4.

A kristályosítást a 2. példában leírtak alapján hajtjuk végre. A 0,3 mg/100 NE, 0,35 mg/100 NE és 0,4 mg/100 NE végső protaminkoncentrációkat vizsgáljuk. Ezek a protamin-koncentrációk megfelelnek 2,9%nak, 9,3%-nak és 10,5%-nak, tömeg/tömeg alapon. Az inkubálás hőmérséklete 5 °C (csak 0,3 mg/100 E-nél), 15 °C és 22 °C. Ezeken a hőmérsékleteken töltött 24 óra múlva a mintákban meghatározzuk a kristályképződést. A mikroszkóppal kapott eredmények azt mutatják, hogy amorf terméket kaptunk és néhány kristályt.

8. példa

Az (Asp^B28)-hi-protamin kristályok készítése

Az (Asp^B28)-hi-protamin kristályosítását a 7. példában leírtak alapján végezzük, azzal a különbséggel, hogy a fehérjét először puffermentes hígítószerben oldjuk. A savas ZnO-törzsoldat elegendő volt ahhoz, hogy a minta pH-ját 2,0-2,5-re állítsuk. Miután az oldat feltisztult, a pH-t újra beállítjuk, ezúttal 7-re, pl-nyi mennyiségű 5 mol/1 NaOH alkalmazásával. 47,25 mg/ml koncentrációjú kétbázisú nátrium-foszfát-törzsoldatot adunk az oldathoz, annyit, hogy a végkoncentráció 3,78 mg/ml legyen. Az alszekció pH-ját 7,4-re állítjuk, pl-nyi mennyiségű HCl alkalmazásával.

A kristályosítást úgy indítjuk be, hogy egyesítjük az (Asp^B28)-hi- és protaminszekciókat, az előzők példákban leírt módon. A vizsgált végső protaminkoncentrációk értéke 0,3 mg/100 E, 0,35 mg/100 E és 0,4 mg/100 E. Az inkubálás hőmérséklete 15 °C és 22 °C. Az ezeken a hőmérsékleteken eltelt 24 óra után a mintákban ellenőrizzük a kristályképződést. A mikroszkóppal kapott eredmények szerint kristályok és amorf anyag keverékét kaptuk.

9. példa (Leu^B28Pro^B29)-hi-protamin kristályok készítése

A 200 NE/ml koncentrációjú és 93%-os tisztaságú (Leu^B28Pro^B29)-hi alszekciót a 8. példában leírtak alapján készítjük el, a nyersanyagot savas körülmények között oldva fel, majd a pH-t 5 mol/1 NaOH-dal 7,4-re állítva. A kristályosítást az előzőkben leírt módon hajtjuk végre. A vizsgált végső protaminkoncentrációk: 0,3 mg/100 E, 0,35 mg/100 E és 0,4 mg/100 E. Az inkubálás hőmérséklete 5 °C, 15 °C és 22 °C volt. Az ezeken a hőmérsékleteken töltött 24 óra múlva mindegyik mintában van valamennyi kristály, de főleg amorf anyag, amit mikroszkópos vizsgálattal lehet meghatározni.

10. példa

Des(B²⁷)-hi-protamin kristályok

Egy 200 NE/ml (E200) koncentrációjú, 97,37% tisztaságú Des(B²⁷)-hi alszekciót a 8. példában leírtak alapján készítünk el, az alapanyagot savas körülmények között oldva, majd a pH-t 5 mol/1 NaOH-dal 7,4-re állítva. A kristályosítást a 8. példában leírtak alapján hajtjuk végre. A 0,3 mg/100 E, 0,35 mg/100 E és 0,4 mg/100 E végső protaminkoncentrációkat vizsgáljuk. Az inkubálás hőmérséklete 15° C és 22 °C volt. Az ezeken a hőmérsékleteken töltött 24 óra múlva mindegyik minta, a mikroszkópos vizsgálatok alapján elsődlegesen amorf szerkezetű volt. Megfigyelhetők voltak azonban kristályok is.

11. példa

Des(B²⁸-B³⁰)-hi-protamin

Egy 200 NE/ml (E200) koncentrációjú, 96,3%-os tisztaságú Des(B²⁸-B³⁰)-hi alszekciót a 8. példában leírtak alapján állítunk elő, az alapanyagot savas körülmények között oldva, majd a pH-ját 5 mol/1 NaOH-dal

7,4-re állítva. A kristályosítást a fehéije- és a protamin6

HU 218 943 Β szekciók semleges/semleges kombinációjának módszerével kíséreltük meg, az előzőkben leírt módon. A vizsgált végső protaminkoncentrációk: 0,3 mg/100 NE, 0,35 mg/100 NE és 0,4 mg/100 NE. Az inkubálás hőmérséklete 15 °C és 22 °C volt. Az ezeken a hőmérsékleteken töltött 24 óra elteltével mindegyik minta elsődlegesen amorf szerkezetű volt, a mikroszkópos vizsgálatok alapján. Kristályok megfigyelhetők voltak. A kristályok jól meghatározottak voltak.

12. példa (Asp^B28)-hi-protamin

Egy (Asp^B28)-hi oldatot úgy állítunk elő, hogy

16,6 mg (AspB²⁸)-hi fehérjét oldunk 1 ml oldatban, amelynek összetétele: 3,2 mg/ml krezol, 1,3 mg/ml fenol és 32 mg/ml glicerin. 14,4 μΐ savas cinktörzsoldatot adunk az oldathoz (10 mg/ml Zn²⁺-ra nézve, amelyet úgy állítunk elő, hogy 0,311 g cink-oxidot oldunk 5 ml 10%-os sósavban, majd 25 ml-re hígítjuk vízzel). Az oldat pH-ja 2,3, ami lehetővé teszi a fehérje teljes feloldódását. 10 μΐ 10%-os NaOH-oldatot adunk hozzá a pH 7,06-ra való állításához. Az oldathoz 100 pl, 0,28 mol/1 koncentrációjú kétbázisos nátriumfoszfátot adunk (pH=7,0), ami az oldat pH-ját 7,27-ra növeli. Az oldathoz 870 μΐ injekció készítésére alkalmas vizet adunk. További 1 μΐ 10%-os sósavat és 0,7 μΐ nátriumhidroxidot adunk az oldathoz, majd az oldat végtérfogatát 2 ml-re állítjuk, injekció készítésére alkalmas víz hozzáadásával, így kapunk egy 7,26-os végső pH-értéket. Az oldatot egy 0,2 pm-es Supor® Acrodisc® 13-on (Gelman Sciences) szüljük át felhasználás előtt.

A protamin-törzsoldatokat úgy állítjuk elő, hogy protamin-szulfátot oldunk egy következő összetételű oldatban: 1,6 mg/ml krezol, 0,65 mg/ml fenol, 16 mg/ml glicerin és 14 mmol/1 kétbázisos nátrium-foszfát. A végső protaminkoncentráció 0,60 mg/100 E, szabad bázisra számítva. Mindkét oldatot 0,22 pm-es szűrőegységen (Millipore Sterivex™-GV) szűrjük át felhasználás előtt.

A kristályosítást úgy érjük el, hogy az (Asp^B28)-hi oldattal 1:1 arányban összekeverjük szabályozott hőmérsékleten, az 1. táblázatban ismertetett módon. A keverék végső paraméterei: 3,94 mg/ml (Asp^B28)-hi, 0,0359 mg/ml (0,9%) cinkion, 1,6 mg/ml m-krezol, 0,65 mg/ml fenol, 16 mg/ml glicerin, 14 mmol/1 kétbázisos nátrium-foszfát és 0,30 mg/100 E protamin, pH=7,3. Pontosabban, az (Asp^B28)-hi oldatból 50-200 μΐ-es aliquot részeket viszünk át üvegampullákba, majd a minták hőmérsékletét 4, 8, 15 vagy °C-ra (szobahőmérséklet) állítjuk. Mindkét protaminoldatból egy-egy részt szintén ezen a hőmérsékleten inkubálunk. 15-20 perc elteltével mindkét protaminoldatból azonos térfogatot pipettázunk az (Asp^B28)-hi mintákhoz. Az elegyet óvatosan megforgatjuk, lezárjuk, majd a kristályosítás alatt szabályozott hőmérsékleten állni hagyjuk. Mindegyik mintát óra elteltével mikroszkóppal megvizsgálva mindegyik főleg amorf anyagot tartalmaz. 48 óra elteltével a 0,30 mg/100 NE protamint tartalmazó, 15 °C-on inkubált mintában sok tűszerű kristály keletkezik, és valamennyi amorf anyag.

13. példa (Asp^B28)-hi oldatot készítünk oly módon, hogy

10,62 mg (Asp^B28)-hi fehérjét oldunk 0,71 ml oldatban, amelynek összetétele: 3,2 mg/ml m-krezol,

1,3 mg/ml fenol és 32 mg/ml glicerin. 10,2 pl savas cinktörzsoldatot adunk az oldathoz (összetétele: 10 mg/ml Zn²+, amelyet úgy állítunk elő, hogy 0,311 g cink-oxidot oldunk 5 ml 10%-os sósavban, majd vízzel 25 ml-re hígítjuk). Az oldat pH-ja 2,3, ami lehetővé teszi a fehérje teljes feloldódását. 10%-os nátriumhidroxidból 6,5 pl-t adunk hozzá, ezzel pH-értékét 7,00-re állítjuk. Ehhez az oldathoz 71 pl 0,28 mol/1 koncentrációjú kétbázisos nátrium-foszfátot adunk (pH=7,0), ami az oldat pH-ját 7,26-ra emeli. Az oldathoz 620 pl injekció készítésére alkalmas vizet adunk. További 10%-os sósavat (0,2 pl) és nátrium-hidroxidot (0,6 pl) adunk hozzá, majd az oldat végtérfogatát 1,42 ml-re állítjuk, injekció készítésére alkalmas vízzel, az így kapott pH értéke 7,42. Az oldatot egy 0,2 pm-es Supor®Acrodisc® 13 (Gelman Sciences) szűrjük át felhasználás előtt.

Protamin törzsoldatot készítünk oly módon, hogy protamin-szulfátot oldunk olyan oldatban, amelynek összetétele 1,6 mg/ml m-krezol, 0,65 mg/ml fenol, 16 mg/ml glicerin és 14 mmol/1 kétbázisos nátriumfoszfát. Az oldat végső pH-ját 7,4-re állítjuk, majd a végső protaminkoncentrációt 0,69 mg/100 E-re állítjuk, szabad bázisra számítva. Az oldatot egy 0,22 pm-es szűrőegységen szűrjük át (Millipore Sterivex™-GV) felhasználás előtt.

A kristályosítást úgy érjük el, hogy az (Asp^B28)-hi oldatot 1:1 arányban keveijük a protaminoldattal, a 12. példában leírtak alapján, szabályozott hőmérsékleten, azaz 13 °C-on, 15 °C-on, 17 °C-on és 23 °C-on. Az eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be. A keverék végső összetétele: 3,74 mg/ml (Asp^B28)-hi, 0,0359 mg/ml (0,9%) cinkion, 1,6 mg/ml m-krezol, 0,65 mg/ml fenol, 16 mg/ml glicerin, 14 mmol/1 kétbázisos nátrium-foszfát és 0,30 mg/100 NE protamin, pH-ja 7,4. Négy különböző kristályosítási hőmérsékletet értékeltünk ki. Az (Asp^B28)-hi 15 °C-ra beállított 1 ml térfogatú oldatát 1 ml azonos hőmérsékletre állított protaminoldattal keverjük össze. Enyhe rázatás után a készítményt 15 °C-on hagyjuk állni. Egy másik mintát készítünk, oly módon, hogy 100 pl (Asp^B28)-hi oldatot 13 °C-on inkubálunk majd ugyanilyen hőmérsékletű protaminoldattal keverjük össze. A végső keveréket 13 °C-on inkubáljuk. A harmadik mintát hasonló módon készítjük el, azzal a különbséggel, hogy két 100 pl-es aliquot részt keverünk össze, majd inkubáljuk 17 °C-on. A végső oldatot úgy állítjuk elő, hogy 80 pl térfogatú, szobahőmérsékletű (Asp^B28)-hi és protaminoldatot keverünk össze, majd szobahőmérsékleten (23 °C) hagyjuk állni. 24 óra elteltével (illetve utána különböző időpontokban) mindegyik mintát mikroszkóppal értékeljük ki, az 1. táblázatban listázva az eredményeket.

i

HU 218 943 Β

1. táblázat

A különböző kristályosítási körülmények³ és ezek eredményei mikroszkóppal kiértékelve

(Asp^B28)-hi (mg/ml)	Protamin (mg/100 E)	Hőmérséklet (°C)	Idő (óra)	Mikroszkópos eredmények⁸
3,94	0,30	15	24 48 72 96 120	amorf kristályos kristályos kristályos kristályos
3,94	0,30	23	24 48 72	amorf amorf amorf
3,74	0,30	13	24 40 48 69	amorf kristályos/amorf kristályos/amorf kristályos/amorf
3,74	0,30	15	24 40 48 69	amorf/kristályos kristályos kristályos kristályos
3,74	0,30	17	24 40 48 69	amorf/néhány kristály kristályos/amorf kristályos/amorf kristályos/amorf
3,74	0,30	23	24 40 48 69	amorf amorf/néhány kristály amorf/néhány kristály amorf/néhány kristály

³ Mindegyik oldat tartalmaz még 0,9% cinkiont, 1,6 mg/ml m-krezolt, 0,65 mg/ml fenolt, 16 mg/ml glicerint és 14 mmol/1 kétbázisos nátrium-foszfátot (pH=7,4).

^b A kristályosítás eredményét mikroszkóppal ellenőrizzük 600 χ -os nagyítással (Nikon Optiphot 66 mikroszkóp) vagy 1000 χ -es nagyítással (Zeiss Axioplan mikroszkóp differenciál interface kontraszttal). Mindkét mikroszkópot mikroszkópos fényképezésre alkalmas berendezéssel láttuk el.

A fenti példák alapján készített kristályokat a 2. és

3. ábrákon mutatjuk be.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Inzulinanalóg-protamin komplex, mely a következő alkotóelemeket tartalmazza:

- humán inzulinanalóg, ahol a B28-as pozícióban Pro, Asp, Lys, Leu, Val vagy Alá és a B29-es pozícióban Lys vagy Pro áll; des(B²⁸-B³⁰)-humán inzulin vagy des(B²⁷)-humán inzulin;

-100 NE fenti inzulinanalóghoz viszonyítva 0,2-1,5 mg protamin, a szabad bázisra számítva;

- a komplex össztömegére számítva 0,35-0,9 tömeg% cink; és

- fenolszármazék, ahol a fenolszármazék jelentése mkrezol, fenol vagy az m-krezol és a fenol keveréke;

azzal a feltétellel, hogy amennyiben a humán inzulinanalóg (Asp^B28)-humán inzulin, a protamin mennyisége a komplex össztömegére viszonyítva 10 tömeg%-nál kisebb.
2. Az 1. igénypont szerinti komplex, melyben (Lys^B28Pro^B29)-humán inzulin, 0,27-0,32 mg protamin/100 NE inzulinanalóg, 0,9 tömeg% cink és egy fenolszármazék van jelen.
3. Az 1. igénypont szerinti komplex, melyben (Asp^B28)-humán inzulin, 0,27-0,32 mg protamin/100 NE inzulinanalóg, 0,9 tömeg% cink és egy fenolszármazék van jelen.
4. Az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti komplex, mely kristályos szerkezetű.
5. Parenterális inzulinanalóg- és protamintartalmú gyógyászati készítmény, mely az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti komplexet tartalmazza.
6. Az 5. igénypont szerinti parenterális gyógyászati készítmény, mely hatóanyagként a 2. igénypont szerinti komplexet tartalmazza.
7. Az 5. igénypont szerinti parenterális gyógyászati készítmény, mely hatóanyagként a 3. igénypont szerinti komplexet tartalmazza.

HU 218 943 Β
8. Az 5. igénypont szerinti parenterális gyógyászati készítmény, mely hatóanyagként a 4. igénypont szerinti komplexet tartalmazza.
9. Parenterális gyógyászati készítmény, mely az alábbi komponenseket tartalmazza: (Lys⁸²⁸?^²⁹)^mán inzulin, kívánt esetben valamely oldható, 1. igénypont szerinti inzulinanalóg, 0,3 mg protamin/100 NE inzulinanalóg, 0,7 tömeg% cink, 1,7 mg/ml m-krezol, 0,7 mg/ml fenol, 16 mg/ml glicerin és 3,78 mg/ml kétbázisú nátrium-foszfát.
10. A 9. igénypont szerinti parenterális gyógyászati készítmény, mely oldható inzulinanalógot is tartalmaz.
11. Parenterális gyógyászati készítmény, mely valamely 1. igénypont szerinti oldható inzulinanalóg és

4. igénypont szerinti inzulinanalóg-protamin kristályok keverékét tartalmazza, ahol a két komponens tömegaránya 1:99 és 99:1 között változik.
12. A 11. igénypont szerinti parenterális gyógyászati készítmény, melyben az oldható inzulinanalóg és az inzulinanalóg-protamin kristály komponens tömegaránya 75:25 és 25:75 között változik.
13. A 12. igénypont szerinti parenterális gyógyászati készítmény, mely (Lys^B28Pro^B29)-humán inzulint és (Lys^B28Pro^B29)-humán inzulin-protamin kristályokat tartalmaz.
14. A 13. igénypont szerinti parenterális gyógyászati készítmény, melyben az oldható inzulinanalóg és az inzulinanalóg-protamin kristály komponens tömegaránya 50:50, 75:25 vagy 25:75.
15. Az 5-14. igénypontok bármelyike szerinti, cukorbetegség kezelésére alkalmas parenterális gyógyászati készítmény.
16. Eljárás az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti komplex előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypontban megadott tömegarányokban vizes oldatban egyesítünk egy monomer formájú, 1. igénypontban meghatározott inzulinanalógot, protamint, cinkforrást és egy fenolszármazékot, majd hagyjuk a komplexet kialakulni.
17. Eljárás a (Lys^B28Pro^B29)-humán inzulin-protamin kristályok előállítására, azzal jellemezve, hogy hexamerasszociációs állapotban levő (Lys^B28Pro^B29)humán inzulin vizes oldatát és egy protaminoldatot 8-22 °C hőmérsékleten egyesítünk;

ahol az említett vizes oldat tartalma 0,35-0,9 tömeg% cink, (Lys^B28Pro^B29)-humán inzulin és egy 1. igénypont szerinti fenolszármazék, pH-ja 7,1-7,6 között van; és az említett protaminoldat pH-ja 7,1-7,6, oly módon, hogy a protamin végkoncentrációja 0,27-0,32 mg protamin/100 NE inzulinanalóg.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 15 °C hőmérsékleten végezzük; a cink koncentrációja 0,7-0,9 tömeg% és a protamin koncentrációja 0,3 mg/100 NE inzulinanalóg.
19. Eljárás (Asp^B28)-humán inzulin-protamin kristályok előállítására, azzal jellemezve, hogy hexamerasszociációs állapotban levő (Asp^B28)-humán inzulin vizes oldatát és egy protaminoldatot 13-17 °C hőmérsékleten egyesítünk;

ahol az említett vizes oldat összetétele 0,35-0,9 tömeg% cink, (Asp^B28)-humán inzulin és egy fenolszármazék, pH-ja 7,1-7,6 között van; és az említett protaminoldat pH-ja 7,1-7,6, oly módon, hogy a protamin végkoncentrációja 0,27-0,32 mg protamin/100 NE inzulinanalóg.
20. Eljárás az 5-8. igénypontok bármelyike szerinti parenterális gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az inzulinanalóg-protamin kristályokat gyógyászatilag elfogadható hígítószerben szuszpendáljuk.
21. Eljárás a 9-14. igénypontok bármelyike szerinti parenterális gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az inzulinanalóg-protamin kristályokat gyógyászatilag elfogadható hígítószerben szuszpendáljuk.
22. Parenterális inzulinanalóg-protamin gyógyászati készítmény, mely egy 1. igénypontban megadott inzulinanalógot, 0,35-0,9 tömeg% cinket és 1. igénypontban megadott fenolszármazékot tartalmazó oldható humán inzulinanalóg-oldat és egy 1. igénypontban megadott humán inzulinanalóg-protamin komplex keverékét tartalmazza, ahol a két komponens aránya 1:99-99:1 oldható humán inzulinanalóg:humán inzulinanalóg-protamin komplex aránynak felel meg.
23. A 22. igénypont szerinti parenterális gyógyászati készítmény, ahol a két komponens tömegaránya 75:25 és 25:75 közötti.
24. A 22. igénypont szerinti parenterális gyógyászati készítmény, ahol a humán inzulinanalóg (Asp^B28)humán inzulin.
25. A 22. igénypont szerinti parenterális gyógyászati készítmény, ahol a humán inzulinanalóg (Lys^B28Pro^B29)-humán inzulin.