CN100371346C - 人工合成胰岛素模拟肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种多肽有机化合物，为人工合成胰岛素模拟肽，由9个氨基酸组成，包括a、b二种，能于胰岛素抗体结合，溶于水，各氨基酸之间通过肽键相连。本发明提供的多肽有机化合物由于肽链较短仅为单链9肽结构，故可以用人工化学合成的方法大量合成；比双链的胰岛素更容易合成，而且不存在双链的正确配对问题，因而制备成本低，产品纯度高；能与人体内的胰岛素受体特异性结合，可以产生与胰岛素类似的降血糖作用，在制备降血糖药物中应用，可以代替胰岛素，用于糖尿病的治疗。

Description

人工合成胰岛素模拟肽及其应用
技术领域
本发明属有机化合物，涉及化学合成多肽，尤其涉及人工合成胰岛素模拟肽及其应用。
背景技术
蛋白质是机体内的一类重要的生物大分子，但作为药物用于疾病的治疗有其固有的缺点，比如蛋白质分子量大、制备困难、具有较大抗原性等。而研究保留蛋白质生物活性位点的小肽现已成为一个热点，这些小肽可以一定程度上克服生产和使用上存在的问题，不失为开发药物的又一途径。
早在1986年Geysen就认为，含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的决定簇；多数情况下，蛋白质之间的相互作用或识别是通过局部肽段间的相互作用来实现的。而胰岛素与其受体的结合以及其功能的发挥可能主要依靠几个氨基酸来实现，少数几个氨基酸就能起到结合活性并发挥相应的生物学活性。由于胰岛素分子含A、B双链结构(A链由21个氨基酸组成，B链由30个氨基酸组成)，存在双链之间的二硫键正确配对问题，通常合成较为困难，合成成本较高。自Smith 1985年建立噬菌体展示技术以来，此技术已在各个方面得到了广泛的应用，并且成功的筛选到了很多功能性的多肽。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种人工合成胰岛素模拟肽，由9个氨基酸组成，选自a、b二种中的一种，能于胰岛素抗体结合，溶于水，各氨基酸之间通过肽键相连，本发明提供的胰岛素模拟肽a的氨基酸序列为：CPTSQANSC，分子量为910；胰岛素模拟肽b的氨基酸序列为：
Figure C20051006200000031
其中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键，分子量为908。
本发明的另一个目的是提供该人工合成胰岛素模拟肽在制备降血糖药物中的应用。
本发明具有以下优点：
①本发明的多肽有机化合物，由于肽链较短，故可以用人工化学合成的方法大量合成。以前者为例，可以得到大量较纯的小肽。
②本发明的胰岛素模拟肽仅为单链9肽结构，比双链的胰岛素更容易合成，而且不存在双链的正确配对问题，因而制备成本低，产品纯度高。
③本发明的多肽有机化合物能与人体内的胰岛素受体特异性结合，可以产生与胰岛素类似的降血糖作用，可用于糖尿病的治疗。
附图说明
图1为细胞竞争性ELISA测定结果。
图2为胰岛素模拟肽对正常ICR小鼠血糖水平的影响。
图3为胰岛素模拟肽对糖尿病小鼠模型血糖浓度的影响。
具体实施方式
本发明结合以下实施例和附图作进一步的说明。
实施例1：用抗胰岛素多克隆抗体作为靶蛋白，用噬菌体展示的方法筛选噬菌体9肽库(Ph.D.-C7CTM)得到阳性噬菌体克隆
噬菌体展示方法利用基因工程手段将合成的一组一定长度的随机序列寡核苷酸片段克隆到特定表达载体中，使其表达产物以融合蛋白的形式呈现在丝状噬菌体表面。由于肽库中包含了该长度小肽的所有可能的氨基酸排列顺序或其中的绝大部分，每一个噬菌体呈现其中的一种肽段，因而库容量极大，易于筛选和扩增。用噬菌体肽库感染大肠杆菌，使重组入噬菌体的随机的寡核苷酸片段在大肠杆菌内复制，并在噬菌体的外壳蛋白中表达出来。然后，把靶蛋白包被在酶标板上。用此噬菌体肽库与靶蛋白混合后，洗板。如果噬菌体上的外壳蛋白能与靶蛋白结合，就不会被洗掉。最后用酸性洗脱液(0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液，pH 2.2)把噬菌体洗脱下来。连续这样筛3-4轮，就能筛出与靶蛋白结合力较强的噬菌体。
测此噬菌体的DNA序列得到重组寡核苷酸的序列，亦知道了相应小肽的序列。然后可通过人工化学合成的方法得到该9肽。本发明提供的胰岛素模拟肽包括a、b两种，能与胰岛素抗体特异性结合，溶于水，各氨基酸之间通过肽键相连。
本发明提供的胰岛素模拟肽a的氨基酸序列为：CPTSQANSC，分子量为910；胰岛素模拟肽b的氨基酸序列为：
Figure C20051006200000041
(其中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键)，分子量为908。
实施例2：细胞竞争性ELISA试验
试验方法：培养HepG2细胞至对数生长期，等量接种到96孔细胞培养板。24小时后PBS洗涤2次，用10％Formalin-PBS固定15min，PBS洗涤3次后用3％H2O2处理10min。PBS洗涤3次，2％BSA 37℃封闭1小时后PBST洗涤3次，加入10-9M胰岛素，37℃作用90min。PBST洗涤3次后加入不同浓度的小肽，37℃竞争90min。PBST洗涤3次，一抗37℃孵育1小时后PBST洗涤5次，加入二抗37℃孵育1小时。PBST洗涤5次，PBS洗涤1次后显色，酶标仪读取波长在450nm处的吸光度(OD450)。实验中同时设立空白孔和阳性孔，各个浓度都重复3孔。
试验结果：结果参见图1，胰岛素模拟肽能够竞争抑制胰岛素与其受体的结合，并且抑制作用呈剂量依赖性。当小肽剂量到达10-7M时，其能够完全抑制胰岛素与其受体的结合，半数抑制率大约在10-9M水平。这些都表明我们筛选到了具有胰岛素相似表位的小肽，具体见图1。图1是胰岛素模拟肽的细胞竞争性ELISA结果，横坐标表示的小肽剂量(10-12～10-6M)，纵坐标表示的是抑制率。其中抑制率(％)＝(阳性对照孔OD450-多肽处理孔OD450)/阳性对照孔OD450×100％。
实施例3：模拟肽对正常ICR小鼠血糖的影响
试验方法：正常ICR小鼠30只，随机分为正常对照组(10只)，胰岛素对照组(10只)和胰岛素模拟肽处理组(10只)。各实验组小鼠分别标记，测禁食12h空腹血糖后，胰岛素模拟肽处理组小鼠给予注射1mg/ml的多肽溶液100μl(0.9％生理盐水配制)，胰岛素对照组以2U/kg剂量注射人胰岛素，正常对照组予以等体积0.9％生理盐水注射。注射45分钟后分别取血，用邻甲苯胺法测定血糖值，比较注射前后血糖的变化。
试验结果：结果参见图2，图2为胰岛素模拟肽对正常ICR小鼠血糖水平的影响。结果显示，对正常ICR小鼠，胰岛素模拟肽有良好的降血糖作用。胰岛素和胰岛素模拟肽注射前后的数据统计分析，两者都有明显的降血糖作用(P＜0.05)，而对照组小鼠处理前后血糖变化没有显著意义。具体的数据见表1和图2。图2表示的是胰岛素模拟肽对正常ICR小鼠血糖的影响，其中柱形图中第一个表示的是注射等体积的生理盐水后的小鼠血糖变化，第二个表示的是注射胰岛素后的小鼠血糖变化，第三个表示的是注射胰岛素模拟肽后的小鼠血糖变化。
表1实验前后正常ICR小鼠血糖水平的比较
Figure C20051006200000061
  组别   n   注射前血糖值   注射后血糖值
  正常对照胰岛素胰岛素模拟肽   101010   7.09±1.187.46±1.807.26±1.23   6.76±1.333.59±1.164.97±1.39
实施例4：胰岛素模拟肽对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖的影响
试验方法1：四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的建立
将ICR雄性小鼠禁食12h后，自由饮水，四氧嘧啶用0.9％生理盐水配制成1％的溶液，以200mg/kg体重剂量给小鼠腹腔注射。注射后第7天测定空腹血糖，空腹血糖≥11.1mM确定为糖尿病小鼠。
试验方法2：动物分组及处理
将糖尿病小鼠按空腹血糖和体重随机分为模型对照组和实验组(每组各8只)。将各组小鼠禁食12h后，实验组小鼠予以注射1mg/ml的胰岛素模拟肽溶液100μl(0.9％生理盐水配制)；模型对照组给予等体积0.9％生理盐水。注射前及注射45分钟后各取血一次，用邻甲苯胺法测定血糖值，比较注射前后的血糖变化。
试验结果：结果参见图3，胰岛素模拟肽对正常小鼠有降血糖作用，我们复制了四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠模型。根据实验结果，这些糖尿病模型小鼠注射多肽前后血糖变化有显著差异(P＜0.05)，说明该小肽有明显降血糖作用，而糖尿病对照组血糖变化前后无显著差异(P＞0.05)。具体结果见表2和图3。图3表示的是胰岛素模拟肽对四氧嘧啶性糖尿病小鼠的血糖影响，柱形图中第一个表示的是注射等体积生理盐水后糖尿病小鼠的血糖变化，第二个表示的是注射胰岛素模拟肽后糖尿病小鼠的血糖变化。
表2实验前后糖尿病小鼠血糖水平的比较
Figure C20051006200000062
  组别   n   注射前血糖值   注射后血糖值
  生理盐水组胰岛素模拟肽   88   14.21±2.2215.04±2.62   14.04±2.7211.59±2.65
通过上面给出的部分实施例，说明了本发明提供的胰岛素模拟肽可以与胰岛素受体结合，在正常和糖尿病小鼠模型中产生明显的降血糖作用。由于胰岛素模拟肽的结构简单，合成方便和经济，可用于降血糖药物的开发。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
<110>浙江大学
<120>人工合成胰岛素模拟肽及其应片
<160>2
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>根据核苷酸序列设计，用于降血糖药物制备
<400>1
Cys-Pro-Thr-Ser-Gln-Ala-Asn-Ser-Cys
1 5
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>根据核苷酸序列设计，用于降血糖药物制备
<400>2
Cys-Pro-Thr-Ser-Gln-Ala-Asn-Ser-Cys
1 5
(其中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键)

Claims (2)

1.人工合成胰岛素模拟肽，其特征是：由9个氨基酸组成，选自a、b二种中的一种，能与胰岛素抗体结合，溶于水，各氨基酸之间通过肽键相连，其中胰岛素模拟肽a的氨基酸序列为：CPTSQANSC，分子量为910；胰岛素模拟肽b的氨基酸序列为：
Figure C2005100620000002C1
分子量为908，其中胰岛素模拟肽b的氨基酸序列中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键。
2.根据权利要求1所述的人工合成胰岛素模拟肽在制备降血糖药物中的应用。
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