DE19521753A1

DE19521753A1 - Monomere Insulinanalogonformulierungen

Info

Publication number: DE19521753A1
Application number: DE19521753A
Authority: DE
Inventors: Michael Rosario De Felippis
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-14
Publication date: 1995-12-21
Anticipated expiration: 2015-06-15
Also published as: SI9500199A; NL1000565C2; GB2290294B; JP3812962B2; IL114153A0; CO4410204A1; DK67695A; PL183284B1; ATA101795A; PL309100A1; GB9512105D0; KR100386038B1; CA2151564A1; IT1276722B1; TW347334B; LU88627A1; ES2091728A1; ITMI951277A0; NO320808B1; GR1002494B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft monomere Human insulinanaloga. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung verschiedene parenterale Formulierungen, die ein monomeres Insu linanalogon, Zink, Protamin und ein Phenolderivat umfassen. Die Formulierungen liefern eine verlängerte Wirkdauer. Ein Verfahren zur Herstellung von Insulinanalogon-Protaminformulierungen wird ebenfalls beschrieben.

Seit der Einführung von Insulin in den zwanziger Jahren wurden laufend Fortschritte erzielt, um die Behandlung von Diabe tes mellitus zu verbessern. Die hauptsächlichen Fortschritte wur den in der Insulinreinheit und Verfügbarkeit durch die Entwicklung der rekombinanten DNA Technologie erzielt. Verschiedene Formulie rungen mit unterschiedlichen Wirkzeiten wurden ebenfalls entwic kelt. Derzeit gibt es im allgemeinen sieben im Handel erhältliche Insulinformulierungen: Reguläres Insulin, semilentes Insulin, Glo bininsulin, Isophaninsulin, Insulin-Zink-Suspension, Protamin-Zink-Insulin und ultralentes Insulin.

Trotz dieses Spektrums an verfügbaren Formulierungen kann die subkutane Injektionstherapie dem Patienten immer noch keine bequeme Regulierung und normalisierte glykämische Kontrolle bie ten. Häufige Abweichungen von den normalen glykämischen Spiegeln während des Lebens des Patienten führen zu Hyper- oder Hypoglyk ämie und Langzeitkomplikationen, die Retinopathie, Neuropathie, Nephropathie und Mikro- und Makroangiopathie beinhalten.

Um zur Vermeidung von extremen glykämischen Spiegeln bei zu tragen, praktizieren Diabetiker oft eine Mehrfachinjektionsthera pie, wobei Insulin mit jeder Mahlzeit verabreicht wird. Jedoch wurde diese Therapie bis jetzt nicht optimiert. Das am schnellsten wirksame, im Handel erhältliche Insulin hat seine maximale Wirkung zu spät nach der Injektion und hält zu lange vor, um den Glukose spiegel optimal zu kontrollieren. Daher wurde ein beträchtlicher Aufwand unternommen, um Insulinformulierungen und Insulinanalogon formulierungen zu entwickeln, die die Kinetik des subkutanen Ab sorptionsprozesses verändern.

Da alle im Handel erhältlichen pharmazeutischen Insulinfor mulierungen Insulin im selbstassoziierten Zustand und vorwiegend in der Hexamerform enthalten, dürfte der geschwindigkeitsbe schränkende Schritt für die Absorption des Insulins aus dem subku tanen Injektionsdepot in den Blutstrom die Dissoziation des selbstaggregierten Insulinhexamers sein. Kürzlich wurden monomere Insulinanaloga entwickelt, die weniger zur Assoziation zu hochmo lekularen Formen neigen als Humaninsulin. Diese fehlende Selbstassoziation beruht auf Modifikationen in der Aminosäurese quenz von Humaninsulin, die die Assoziation primär durch die Zer störung der Dimerbildung verringern. Brems et al. Protein Engeneering, 5 : 6 527-533 (1992) und Brange et al., Nature 333: 679-682 (1988). Demnach besitzen monomere Insulinanaloga ein ver gleichsweise schnelles Einsetzen der Aktivität, während sie die biologische Aktivität von nativem Humaninsulin behalten. Diese In sulinanaloga stellen eine schnelle Absorption bereit, um die In jektionszeit und die maximale Wirkung von Insulin näher zur post grandialen Glukoseabweichung zu bringen, die mit der Reaktion auf die Mahlzeit zusammenhängt.

Die physikalischen Eigenschaften und Charakteristiken von monomeren Analoga sind nicht zu Insulin analog. Beispielsweise be schreiben Brems et al., daß verschiedene monomere Analoga eine ge ringe oder keine Zink-induzierte Assoziation aufweisen. Die beob achtete Assoziation führt zu einer Vielzahl an Formen mit hohem Molekulargewicht. Dies unterscheidet sich dramatisch vom Insulin, das in Gegenwart von Zink fast ausschließlich in einer geordneten, hexameren Konformation vorliegt. Brange et al. Diabetes Care 13: 923-954 (1990). Das Fehlen der Assoziation führt zu den schnell wirkenden Eigenschaften der Analoga. Da die Analoga eine geringere Assoziationstendenz haben, ist es ziemlich überraschend, daß ein monomeres Insulinanalogon formuliert werden kann, um eine mittlere Wirkdauer aufzuweisen.

Die vorliegende Erfindung liefert eine monomere Insulinana logonformulierung, die bei Verwendung eine mittlere Wirkdauer er gibt. Die Erfindung liefert ferner einen neuen Protaminkristall, der Insulinanalogon-NPD genannt wird. Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Gemisch aus Insulinanalogon-NPD und löslichem monomeren Insulinanalogon. Dieses Gemisch liefert ein rasches Einsetzen der Wirkung und eine mittlere Wirkdauer. Demnach besitzt das Gemisch Vorteile sowohl gegenüber Insulin als auch dem monome ren Analogon. Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein Verfah ren zur Herstellung von einheitlichen Kristallen aus Insulinanalo gon-NPD.

Die Erfindung liefert eine Insulinanalogon-Protamin-Formu lierung, die umfaßt: Ein monomeres Insulinanalogon, Protamin, Zink und ein Phenolderivat.

Die Erfindung liefert ferner einen kristallinen Insulinana logon-Protaminkomplex. Dieser Komplex wurde als Insulinanalogon-NPD definiert. Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-NPD umfaßt: Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, etwa 0,27 bis etwa 0,32 mg Protamin/100 E Insulin analogon, etwa 0,35 bis etwa 0,9 Gewichtsprozent Zink und ein Phe nolderivat.

Die Erfindung liefert zusätzlich ein Verfahren zur Herstel lung von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-NPD, das umfaßt:
Die Kombination einer wäßrigen Lösung von Lys^B28Pro^B29-Hu maninsulin in einem hexameren Assoziationszustand und einer Protaminlösung bei einer Temperatur von etwa 8°C bis etwa 22°C, wobei diese wäßrige Lösung etwa 0,35 bis etwa 0,9 Gewichts prozent Zink, Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin und ein Phenolderivat bei einem pH von etwa 7,1 bis etwa 7,6 enthält, und diese Protaminlösung Protamin bei einem pH von etwa 7,1 bis 7,6 enthält, so daß die Protaminendkonzentration etwa 0,27 bis etwa 0,32 mg Protamin/100 E Insulinanalogon beträgt.

Die Erfindung liefert auch Formulierungen, die sowohl schnell als auch etwas länger wirken. Die Formulierungen sind Gemische aus monomerem Insulinanalogon und kristallinem Insulinanalogon-NPD, worin das Gewichtsverhältnis der zwei Kompo nenten etwa 1-99 : 99-1 beträgt.

Schließlich liefert die Erfindung ein Verfahren zur Behand lung eines Patienten, der an Diabetes mellitus leidet, das die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung an diesen Pa tienten umfaßt, die Insulinanalogon-Protaminkristalle enthält.

Die Fig. 1 ist eine graphische Darstellung des Wirkprofils von Lys^B28Pro^B29-hI-NPD und Humaninsulin-NPH. Die Kurve ist µE/ml gegen die Infusionszeit. Die Figur zeigt die Vorteile der vorlie genden Erfindung.

Die Fig. 2 zeigt ein Bild von erfindungsgemäßen Asp^B28-Hu maninsulin-Protamin-Kristallen. Das Bild wurde bei einer 1000fachen Vergrößerung mit Differentialphasenkontrast aufgenom men.

Die Fig. 3 zeigt ein Bild von erfindungsgemäßen Lys^B28- Pro^B29-Humaninsulin-protamin-Kristallen. Das Bild wurde bei einer 1000fachen Vergrößerung mit Differentialphasenkontrast aufgenom men.

Wie oben erwähnt liefert die Erfindung verschiedene Formu lierungen eines monomeren Insulinanalogons. Der Ausdruck "monomeres Insulinanalogon" oder "Insulinanalogon", wie er hierin verwendet wird, ist ein schnell wirkendes Insulinanalogon, daß we niger zur Dimerisierung oder Selbstassoziation neigt. Monomeres Insulinanalogon ist Humaninsulin, worin Pro an der Position B28 durch Asp, Lys, Leu, Val oder Ala ersetzt ist und Lys an der Posi tion B29 Lysin oder Prolin ist, Des(B28-B30) oder Des(B27). Mono mere Insulinanaloga sind in Chance et al., EP-A 383 472 und Brange et al., EP-A 214 826 beschrieben und werden hiermit eingeführt.

Der Fachmann erkennt, daß andere Modifizierungen des mono meren Insulinanalogons möglich sind. Diese Modifizierungen sind in der Technik bekannt und beinhalten den Austausch des Histidinrests an der Position B10 durch Asparaginsäure, den Austausch des Phe nylalanintests an der Position B1 durch Asparaginsäure, den Aus tausch des Threoninrests an der Position B30 durch Alanin, den Austausch des Serinrests an der Position B9 durch Asparaginsäure, die Deletion von Aminosäuren an der Position B1 alleine oder in Kombination mit einer Deletion an der Position B2 und die Deletion des Threonins an Position B30.

Alle Aminosäureabkürzungen, die in der Beschreibung verwen det werden, sind die, die vom United States Patent & Trademark Of fice akzeptiert werden, wie dies in 37 C.F.R 1.822 (b) (2) be schrieben ist. Besonders bevorzugte monomere Insulinanaloga sind Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin (B28 ist Lys, B29 ist Pro) und Asp^B28- Humaninsulin (B28 ist Asp).

Der Ausdruck "monomeres Insulinanalogon-NPD" oder "Insulinanalogon-NPD" ist eine Suspension eines kristallinen Insu linanalogons und Protamin in einer Formulierung. NPD ist nach DeFelippis eine neutrale Protaminformulierung. Die Zusammensetzung wird gemäß dem hierin beschriebenen und beanspruchten Verfahren hergestellt. Der ähnliche Ausdruck "Insulinanalogon-NPD-Kri stalle", "kristallines Insulinanalogon-NPD" oder "Lys^B28Pro^B29-Hu maninsulin-Protamin-Kristalle" bezieht sich auf Insulinanalogon-Protaminkristalle in der NPD Formulierung.

Der Ausdruck "behandeln" beschreibt, wie er hierin verwen det wird, die Handhabung und die Pflege eines Patienten zur Bekämpfung der Krankheit, des Zustands oder der Störung und bein haltet die Verabreichung einer erfindungsgemäßen Verbindung, um das Einsetzen der Symptome oder Komplikationen zu verhindern, die Symptome oder Komplikationen zu lindern oder die Krankheit, den Zustand oder die Störung zu beheben.

Der Ausdruck "isotonisches Mittel" betrifft ein Agens, das physiologisch toleriert wird und der Formulierung eine geeignete Tonizität verleiht, um den Nettofluß des Wassers durch die Zellmembran zu verhindern. Verbindungen, wie Glycerin, werden ge wöhnlich für solche Zwecke in bekannten Konzentrationen verwendet. Die Konzentration des isotonischen Mittels liegt in dem Bereich, der in der Technik für Insulinformulierungen bekannt ist.

Der Ausdruck "Phenolderivat" meint m-Kresol, Phenol oder vorzugsweise ein Gemisch aus m-Kresol und Phenol.

Der Ausdruck "auf der Grundlage der freien Base" deutet die Menge an Protamin in der Formulierung an. Die Grundlage der freien Base wird um den Gehalt an Wasser und Salz der Protaminsalze korrigiert, die im Handel erhältlich sind und gewöhnlich in paren teralen Formulierungen verwendet werden. Das bevorzugte Protamin, Protaminsulfat, enthält etwa 80% Protamin.

Der Ausdruck "IE" oder "E" ist eine internationale Einheit. Der Ausdruck "Isophanverhältnis" ist die Gleichgewichts menge an Protamin, die zur Komplexbildung mit dem Analogon erfor derlich ist, wie dies von Krayenbühl und Rosenberg, Steno Memorial Hospital Report (Kopenhagen), 1 : 60 (1946) beschrieben wurde. Das Isophanverhältnis wird durch Titration auf eine Weise bestimmt, wie sie in der Technik gut bekannt ist und in Krayenbühl et al. beschrieben ist.

Die vorliegende Erfindung liefert eine Insulinanalogon-Protamin-Formulierung, die umfaßt: Ein monomeres Insulinanalogon, Protamin, Zink und ein Phenolderivat. Die Protaminkonzentration beträgt vorzugsweise etwa 0,2 bis etwa 1,5 mg Protamin auf 100 E Insulinanalogon auf der Grundlage der freien Base. Noch bevorzug ter beträgt die Protaminmenge etwa 0,27 mg/100 E bis etwa 0,35 mg/100 E. Die Konzentration an Zink beträgt etwa 0,35 bis etwa 0,9% auf Gewichtsbasis. Vorzugsweise beträgt die Zinkkonzentration etwa 0,7%.

Das Phenolderivat ist m-Kresol, Phenol oder ein Gemisch aus m-Kresol und Phenol. Vorzugsweise ist das Phenolderivat m-Kresol und Phenol. Die Konzentration des Phenolderivats ist einem Fach mann bekannt. Die Konzentrationen müssen ausreichen, um eine Kon servierungswirkung aufrechtzuerhalten, das heißt mikrobielles Wachstum verzögern. Im allgemeinen liegt die Konzentration der phenolischen Substanz im Bereich von 1,0 mg/ml bis 6,0 mg/ml, vor zugsweise bei mehr als etwa 2,5 mg/ml. Die am meisten bevorzugte Konzentration liegt bei etwa 3 mg/ml. Das Vorkommen eines Phenolderivats ist entscheidend, da es die Komplexierung des Ana logons, Protamins und des Zinks bewirkt und zusätzlich als Konservierungsmittel dient. Jedoch dürfte nur ein Molekül Phenol pro Molekül Insulinanalogon an die Kristallstruktur gebunden sein.

Vorzugsweise wird ein isotonisches Mittel zur Formulierung gegeben. Das bevorzugte isotonische Mittel ist Glycerin. Die Kon zentration des isotonischen Mittels beträgt beispielsweise 14 mg/ml bis 18 mg/ml, vorzugsweise etwa 16 mg/ml.

Der pH der Formulierung kann mit einem physiologisch tole rierten Puffer, vorzugsweise einem Phosphatpuffer, wie dibasi schem Natriumphosphat, gepuffert werden. Andere physiologisch to lerierte Puffer sind unter anderem TRIS, Natriumacetat oder Natri umcitrat. Die Auswahl und die Konzentration des Puffers sind in der Technik bekannt. Im allgemeinen beträgt die Konzentration bei spielsweise etwa 1,5 mg/ml bis 5,0 mg/ml, vorzugsweise 3,8 mg/ml.

Die vorliegende Erfindung liefert ferner bestimmte Bedin gungen, unter denen das Insulinanalogon-Protamin als stabiler Kri stall existiert. Formulierungen dieser Kristalle werden als Insu linanalogon-NPD definiert. Insulinanalogon-NPD ist eine formu lierte Suspension aus Insulinanalogon-NPD-Kristallen und ergibt bei Verwendung eine mittlere Wirkdauer. Das Wirkprofil des Insu linanalogon-NPD ist in Anbetracht der fehlenden Selbstassoziierung des monomeren Analogons ziemlich überraschend.

Die Fähigkeit zur Bildung einer Formulierung mit mittlerer Wirkdauer mit einem monomeren Analogon ist in Fig. 1 gezeigt. Die Fig. 1 zeigt ein Wirkprofil für Lys^B28Pro^B29-hI-NPD und Humanin sulin-NPH. Das NPD Profil ist dem von Insulin-NPH ähnlich. Die Wirkdauer für die NPD Formulierung und die Insulin-NPH Formulie rung sind etwa gleich. Jedoch ist am signifikantesten, daß die vorliegende Formulierung schneller ansteigt und für einen längeren Zeitraum stabil bleibt als Insulin-NPH. Dieser Unterschied ist in Anbetracht des schnell-wirkenden Profils des monomeren Analogons unerwartet.

Eine besonders bevorzugte Insulinanalogon-Protamin-Formu lierung, Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-NPD umfaßt: Lys^B28Pro^B29-Human insulin, etwa 0,27 bis etwa 0,32 mg Protamin/100IE Insulinanalo gon, etwa 0,35 bis etwa 0,9 Gewichtsprozent Zink und ein Phenol derivat. Die Protaminkonzentration beträgt vorzugsweise 0,3 mg/100 E auf der Grundlage der freien Base.

Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-Protaminkristallen, das umfaßt: Die Kombination einer wäßrigen Lösung von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin in einem hexameren Assoziationszustand und einer Protaminlösung bei einer Temperatur von etwa 8°C bis etwa 22°C, wobei diese wäßrige Lösung etwa 0,35 bis etwa 0,9 Gewichtsprozent Zink, Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin und ein Phenolderivat bei einem pH von etwa 7,1 bis etwa 7,6 enthält, und diese Protaminlösung Protamin bei einem pH von etwa 7,1 bis 7,6 enthält, so daß die Protaminendkonzentration etwa 0,27 bis etwa 0,32 mg Protamin/100 E Insulinanalogon beträgt.

Zur Zeit der Erfindung war bekannt, daß monomere Insulinanaloga eine geringere Tendenz zur Assoziation und Hexamer bildung aufweisen. Die Bedingungen, die notwendig sind, um die mo nomeren Insulinanaloga zur Assoziation mit Protamin unter Bildung von Kristallen zu veranlassen, waren vorher in der Technik unbe kannt. Frühere Untersuchungen betreffen Insulin. Die Beschreibun gen, die die Herstellung von Insulin-NPH (neutrale Protaminformu lierung gemäß Hagedorn) oder Isophaninsulinformulierungen von Krayenbühl und Rosenberg, Steno Memorial Hospital Report (Kopenhagen), 1 : 60 (1946) in Betracht ziehen, sind nicht in Anbe tracht der distinkten Eigenschaften der monomeren Insulinanaloga relevant. Tatsächlich stellt das kommerzielle Verfahren zur Her stellung von HumulinN^R (Insulin-NPH), ein sauer-neutrales Verfah ren, kein kristallines Insulinanalogon-NPD her.

Am signifikantesten ist die Feststellung, daß die Parameter im vorliegenden Verfahren - nämlich die Temperatur der Kristalli sation und die Bildung eines Hexamerkomplexes des Insu linanalogons, des Zinks und des Phenolderivats entscheidende Be schränkungen für die Bildung von stabilen Lys^B28Pro^B29-hI-NPD Kri stallen sind.

Die Kristallisationstemperatur muß etwa 8°C bis etwa 22°C, vorzugsweise 13°C bis 17°C betragen. Falls die Temperatur außer halb dieses Bereichs liegt, resultieren daraus hauptsächlich amor phe Insulinanalogon-Protamin-Formulierungen.

Es ist ebenfalls entscheidend, daß das Insulinanalogon vor der Kristallisation in einen hexameren Zustand umgewandelt wird. Die Kristallisation führt zu einem amorphen Produkt, wenn das Ver fahren mit einem monomeren Assoziationszustand durchgeführt wird. Die Kristalle bilden sich ohne Schütteln in fünf bis sechsunddrei ßig Stunden. Kristalle mit guter Qualität bilden sich im allgemei nen innerhalb von 24 Stunden.

Das lösliche monomere Insulinanalogon wird zu einem Hexa merassoziationszustand komplexiert, indem man das feste monomere Analogon in einem Verdünnungsmittel suspendiert, das das Phenolde rivat enthält, und Zink zugibt, bis die Konzentration etwa 0,35% bis 0,9% auf Gewichtsbasis beträgt. Zink wird vorzugsweise als Salz zugegeben. Repräsentative Beispiele von Zinksalzen beinhalten Zinkacetat, Zinkbromid, Zinkchlorid, Zinkfluorid, Zinkiodid und Zinksulfat. Der Fachmann erkennt, daß viele andere Zinksalze exi stieren, die ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden könnten. Vorzugsweise werden Zinkacetat oder Zinkchlorid verwendet.

Das Lösen des Insulinanalogons im Verdünnungsmittel kann damit erleichtert werden, was gewöhnlich als Säurelösung bekannt ist. Bei einer Säurelösung wird der pH auf etwa 3,0 bis 3,5 mit einer physiologisch tolerierten Säure erniedrigt, vorzugsweise HCl, um die Löslichkeit des Analogons zu erhöhen. Andere physiolo gisch tolerierte Säuren sind unter anderem Essigsäure, Citronen säure und Phosphorsäure. Der pH wird dann mit einer physiologisch tolerierten Base, vorzugsweise Natriumhydroxid, auf etwa 7,1 bis 7,6 zur Kristallisation eingestellt. Andere physiologisch tole rierte Basen sind Kaliumhydroxid und Ammoniumhydroxid.

Am signifikantesten ist, daß das Verfahren zur Herstellung des Lys^B28Pro^B29-hI-NPD-Komplexes gegenüber der NaCl Konzentration empfindlich ist. Falls die Konzentration etwa 4 mg/ml übersteigt, werden die Insulinanalogon-NPD-Kristalle mit einem amorphen Pro dukt gemischt. Demnach ist es bevorzugt, daß das monomere Analogon bei neutralem pH gelöst wird, um die Bildung von Salzionen zu ver meiden. Alternativ dazu kann das Analogon im Diluenten bei einem sauren pH vor der Zugabe des Puffers gelöst werden. Dies reduziert die Konzentration an Salzen, welche aufgrund der pH Einstellung erzeugt werden. Jedoch ist die Reihenfolge, in der die Bestand teile zugegeben werden, für die Bildung des Hexamers oder der amorphen Formulierung nicht entscheidend.

Wie vorher beschrieben, kann ein isotonisches Mittel zu den erfindungsgemäßen Formulierungen gegeben werden. Die Zugabe des isotonischen Mittels kann zur Lösung des Analogons, zur Protamin lösung oder zur schließlichen Insulinanalogon-NPD-Formulierung er folgen. Ähnlich kann die Zugabe des physiologisch tolerierten Puf fers zur Lösung des Analogons, zur Protaminlösung oder zur schließlichen Insulinanalogon-NPD-Formulierung erfolgen. Jedoch ist es bevorzugt, daß sowohl die Lösung des Analogons als auch die Protaminlösung das isotonische Mittel und den Puffer vor der Kom bination der wäßrigen Lösung mit dem Protamin enthalten. Aufgrund der NaCl Wirkungen auf das Verfahren zur Herstellung des kristal linen Insulinanalogon-NPD ist Glycerin das bevorzugte isotonische Mittel.

Die Erfindung liefert auch Insulinanalogonformulierungen, die Gemische aus Insulinanalogon-NPD als kristallinen Feststoff und löslichem Insulinanalogon umfassen. Diese Gemische werden in einem Bereich von etwa 1 : 99 bis 99 : 1 bezogen auf das Volumen des suspendierten Insulinanalogon-NPD zu löslichem Insulinanalogon hergestellt. Das lösliche Insulinanalogon ist ein monomeres Insu linanalogon, das in einem wäßrigen Verdünnungsmittel gelöst wird, das umfaßt: Zink, ein Phenolderivat, ein isotonisches Mittel und Puffer. Die im Verdünnungsmittel beschriebenen Konzentration sind dieselben, wie sie vorher beschrieben wurden. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis an Insulinanalogon-NPD zu löslichem Insulinanalogon 25 : 75 bis 75 : 25 und vor allem 50 : 50. Diese Gemische werden leicht durch Mischen der einzelnen Bestandteile hergestellt.

Die gemischten Formulierungen der vorliegenden Erfindung sind aufgrund der Kombination aus schnellem Einsetzen der Wirkung und verlängerter Wirkdauer speziell zur Behandlung von Diabetes mellitus geeignet. Diese Gemische erlauben eine "feine Kontrolle" durch die Variation der Menge jedes einzelnen Bestandteils auf der Grundlage der Bedürfnisse, der Nahrung und der physischen Aktivi tät des Patienten. Das Gemisch an suspendiertem Insulinanalogon- NPD und löslichem Insulinanalogon ist ebenfalls vorteilhaft, da es homogen ist, das heißt jede Gleichgewichtsveränderung zwischen den suspendierten Kristallen und dem löslichen Insulinanalogon ersichtlich ist.

Die erfindungsgemäßen Insulinanaloga können auf eine Viel zahl an bekannten Peptidsynthesetechniken hergestellt werden, ein schließlich klassischer Verfahren (Verfahren in Lösung), Festphasenverfahren, halbsynthetischer Verfahren und kürzlich auch rekombinanter DNA Verfahren. Beispielsweise beschreiben Chance et al., EP-A 383 472 und Brange et al., EP-A 214 826 die Herstellung von verschiedenen Monomeranaloga.

Die folgenden Beispiele werden lediglich zur weiteren Er läuterung der Herstellung der Insulinanaloga und der Erfindung be reitgestellt. Der Schutzumfang der Erfindung besteht nicht nur aus den folgenden Beispielen.

Beispiel 1 Herstellung von Lys^B28Pro^B29-hI-NPD

Eine Lösung des Lys^B28Pro^B29-Humaninsulins (Lys^B28Pro^B29-hI) mit einer Konzentration von 200IE/ml (U200) wird durch Lösen von Zink enthaltenden Kristallen des Lys^B28Pro^B29-hI in einem Kon servierungsmittel/Puffer-System hergestellt, das enthält: 1,6 mg/ml m-Kresol, 0,73 mg/ml Phenol (äquivalent zu 0,65 mg/ml Phe nol, das mit 89% verrechnet wird), 16 mg/ml Glycerin und 3,78 mg/ml dibasischer Natriumphosphatpuffer. Die endogene Zinkmenge in den Kristallen wird durch Zugabe eines geeigneten Volumens einer sauren ZnO Lösung (10 mg/ml) zur Erlangung einer Endkonzentration von 0,025 mg/100 IE (0,7%) bereitgestellt. Das Lösen von Lys^B28Pro^B29-hI wird bei Umgebungstemperatur durch Erniedrigung des pH auf etwa 3 mit µl Volumina 5 M HCl erreicht. Nachdem sich die Lösung geklärt hat wird der pH mit µl Volumina 5 M NaOH wieder auf 7,5 eingestellt.

Es wird eine Protaminlösung durch Lösen von ausreichend fe stem Protaminsulfat in der Konservierungsstoff/Puffer-Lösung her gestellt, um eine Endkonzentration von 0,6 mg/100 IE berechnet auf der Grundlage der freien Base zu erreichen. Der pH dieser Lösung wird auf 7,5 eingestellt und auf 15°C äquilibriert.

Beide Lösungen werden auf eine Endkonzentration mit Wasser für Injektionszwecke verdünnt und filtriert. 5 ml Aliquots des Lys^B28Pro^B29-hI Teils werden in getrennte saubere Gläschen gefüllt und die Proben werden in einem Wasserbad bei 15°C inkubiert. Nach einer ausreichenden Zeit zur Äquilibrierung (15 Minuten) wird die Fällung durch die schnelle Zugabe von 5 ml der Protaminlösung zu den Lys^B28Pro^B29-hI Proben induziert. Die Kristallisation kann für 24 Stunden bei 15°C weiterlaufen.

Beispiel 2 Herstellung von Lys^B28Pro^B29-hI-NPD

Das Verfahren ist zu Beispiel 1 identisch, außer daß die Lösung des Lys^B28Pro^B29-hI bei neutralem pH erfolgt. Das Verfahren wird so ausgeführt, daß der schließliche pH 7,4 beträgt.

Beispiel 3 Herstellung von Lys^B28Pro^B29-hI-NPD

Insulinanalogon-NPD wird auf eine zu Beispiel 1 analoge Weise hergestellt, aber die Säurelösung von Lys^B28Pro^B29-hI wird in Gegenwart aller Hilfsstoffe außer dem dibasischen Natriumphos phatpuffer durchgeführt. Festes dibasisches Natriumphosphat wird zugegeben, nachdem die Insulinanalogonlösung wieder pH 7,4 hat. Die Zugabe des dibasischen Natriumphosphats klärt die Lösung.

Beispiel 4 Herstellung von Insulinanalogon-NPD Mischformulierungen

Gemische von mittellang und schnell wirkenden Lys^B28Pro^B29-hI Formulierungen werden folgendermaßen hergestellt. Das Suspensionspräparation mit mittlerer Wirkdauer wird durch die in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren hergestellt und dient als Anteil mit mittlerer Wirkdauer für das Gemisch. Es wird eine ge trennte Lösung des Lys^B28Pro^B29-hI (100IE) durch Lösen von Zink enthaltenden Lys^B28Pro^B29-hI Kristallen bei Umgebungstemperatur in dem in Beispiel 1 beschriebenen Verdünnungsmittel hergestellt. Die endogene Zinkmenge des Lys^B28Pro^B29-hI in dieser Lösung wird durch die Zugabe von saurer ZnO-Lösung bereitgestellt, um die Menge im Suspensionsteil anzupassen (das heißt 0,025 mg/100 IE (0,7%). Was ser für Injektionszwecke wird zur Verdünnung der Lösung auf eine Endkonzentration verwendet, nachdem der pH unter Verwendung von 10 e%igen HCl und/oder NaOH Lösungen auf 7,4 eingestellt wurde. Diese Lösung ist der schnell wirkende Teil der Gemische. Das schließli che Gemisch wird durch Kombination von geeigneten Volumina der mittellang und schnell wirkenden Anteile hergestellt, um das ge wünschte Verhältnis zu erreichen. Ein 50/50 Gemisch wird durch Kombination von einem Volumenteil des Anteils mit mittlerer Wirk dauer mit einem Volumenteil des Anteils mit schneller Wirkung her gestellt.

Beispiel 5 Auswirkung der Ionenstärke auf die Lys^B28Pro^B29-hI-Protamin-Kristallisation

Die Auswirkungen der Ionenstärke auf die Kristallisation werden durch die Zugabe von NaCl zu dem Lys^B28Pro^B29-hI Anteil vor dem Mischen mit Protamin ausgetestet. NaCl wird so zugegeben, daß die Gesamtkonzentration 20, 30 und 40 mM (1,2, 1,8 und 2,3 mg/ml) beträgt. Die Volumenpartikelgröße zeigt ein multimodulares Verhal ten (zusätzliche Peaks mit kleinen Partikelgrößen), wenn die NaCl Konzentration erhöht wird. Die mittlere Volumenpartikelgröße nimmt ab, wenn die NaCl Konzentration erhöht wird, was eine Zunahme an amorphem Material anzeigt. Die Ergebnisse der Partikelgröße in Ab hängigkeit von der NaCl Konzentration sind folgende:

Die Analyse mit dem Mikroskop zeigt, daß alle Proben ein Gemisch aus amorphem und kristallinem Material enthalten. Die 40 mM NaCl enthaltende Probe hat das meiste amorphe Material und sehr wenig Kristalle.

Beispiel 6 Dynamik von Lys^B28Pro^B29-hI-NPD und Humaninsulin-NPH im Vergleich

Diese Untersuchung wird an einem Hundemodell ohne Betäubung durchgeführt. Vor dem Beginn der Untersuchung werden drei Grund proben entnommen. Eine Infusion von Somatostatin (0,3 µg/kg-min) wird eingeleitet. Nach einem 10 Minutenintervall wird eine subku tane Injektion entweder von NPD oder NPH verabreicht. Ein häufiges Überwachen der Plasmaglucose wird veranlaßt und eine variable Glu coseinfusion (20%) wird verabreicht, um eine nahezu normale Glykämie aufrechtzuerhalten. Dabei werden Proben entnommen und auf immunreaktives Insulin (Linco-Antikörper) und Glucose untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt.

Beispiel 7 Herstellung von Asp(B28)-Analogon-Protamin-Kristallen

Es wird ein Teil Asp(B28)-hI mit einer Konzentration von 200 IE/ml (U200) hergestellt, indem man den lyophilisierten Roh stoff (95% Reinheit) in einem Konservierungsstoff/Puffersystem löst, das enthält: 1,6 mg/ml m-Kresol, 0,73 mg/ml Phenol (äquivalent zu 0,65 mg/ml Phenol, das mit 89% verrechnet wird), 16 mg/ml Glycerin und 3,78 mg/ml dibasisches Natriumphosphat. Das Zink wird zum System unter Verwendung eines geeigneten Volumens einer sauren ZnO Lösung (10 mg/ml) zur Erlangung einer Endkonzen tration von 0,025 mg/100 IE gegeben. Das Lösen von Asp(B28) wird bei Umgebungstemperatur bei neutralem pH erreicht. Der schließli che pH des Teils beträgt 7,4.

Es wird eine Kristallisation ausgeführt, wie sie in Bei spiel 2 beschrieben ist. Es werden Protaminendkonzentrationen von 0,3 mg/100 E, 0,35 mg/100 E und 0,4 mg/100 E untersucht. Diese Protaminkonzentrationen entsprechen jeweils 2,9%, 9,3% und 10,5% auf einer Gewicht/Gewicht Grundlage. Die Inkubationstempe raturen beinhalten 5°C (nur bei 0,3 mg/100 U), 15°C und 22°C. Nach 24 Stunden bei diesen Temperaturen werden die Proben auf Kristallbildung analysiert. Die Ergebnisse, wie sie durch Mikro skopie ermittelt werden, zeigen ein Gemisch aus einigen Kristallen und amorphem Produkt.

Beispiel 8 Herstellung von Asp(B28)-Analogon-Protamin-Kristallen

Die Kristallisation von Asp(B28)-Protamin wird durchge führt, wie dies in Beispiel 7 beschrieben ist, außer daß das Pro tein zuerst in einem Puffer-freien Verdünnungsmittel gelöst wird. Die Zugabe der sauren ZnO Stammlösung ist ausreichend, um die Probe auf pH 2,0-2,5 anzusäuern. Nachdem sich die Lösung geklärt hat, wird der pH zurück auf etwa pH 7 mit µl Volumina 5 N NaOH ein gestellt. Dibasisches Natriumphosphat wird mittels einer konzen trierten Stammlösung mit 47,25 mg/ml bis zum Erreichen einer End konzentration von 3,78 mg/ml zugegeben. Der Anteil wird auf pH 7,4 mit µl Mengen HCl eingestellt.

Die Kristallisation wird durch Vereinigen der Asp(B28)- und Protaminanteile ausgelöst, wie dies in vorhergehenden Beispielen beschrieben ist. Protaminendkonzentrationen von 0,3 mg/100 E, 0,35 mg/100 E und 0,4 mg/100 E werden untersucht. Die Inkubationstemperaturen beinhalten 15°C und 22°C. Nach 24 Stunden bei diesen Temperaturen werden die Proben auf Kristallbildung un tersucht. Die durch Mikroskopie ermittelten Ergebnisse zeigen ein Gemisch aus Kristallen und amorphem Material.

Beispiel 9 Herstellung von Leu (B28) Pro(B29)-Analogon-Protaminkristallen

Ein Teil Leu(B28)Pro(B29) (93% Reinheit) mit einer Konzen tration von 200 IE/ml (U200) wird wie in Beispiel 8 mittels einer Säurelösung des Rohmaterials gefolgt von einer pH Einstellung mit 5 N NaOH auf pH 7,4 hergestellt. Die Kristallisation läuft wie oben beschrieben. Es werden Protaminendkonzentrationen von 0,3 mg/100 E, 0,35 mg/100 E und 0,4 mg/100 E untersucht. Die Inkubationstemperaturen beinhalten 5°C, 15°C und 22°C. Nach 24 Stunden bei diesen Temperaturen enthalten alle Proben einige Kri stalle, aber sind primär amorph, wie dies durch Mikroskopie be stimmt wird.

Beispiel 10 Des (B27)-hI-Protaminkristalle

Ein Teil DesThr(B27) (97,37% Reinheit) mit einer Konzen tration von 200 IE/ml (U200) wird wie in Beispiel 8 mittels einer Säurelösung des Rohmaterials gefolgt von einer pH Einstellung mit 5 N NaOH auf pH 7,4 hergestellt. Die Kristallisation wird durchge führt, wie sie in Beispiel 8 beschrieben ist. Es werden Protamin endkonzentrationen von 0,3 mg/100 E, 0,35 mg/100 E und 0,4 mg/100 E untersucht. Die Inkubationstemperaturen beinhalten 15°C und 22°C. Nach 24 Stunden bei diesen Temperaturen sind alle Proben primär amorph, wie dies durch Mikroskopie bestimmt wird. Qualitativ werden Kristalle beobachtet.

Beispiel 11 Des (B28-B30)-hI-Protamin

Ein Teil Des(B28-B30) (96,3% Reinheit) mit einer Konzentration von 200 IE/ml (U200) wird wie in Beispiel 8 mittels einer Säurelösung des Rohmaterials gefolgt von einer pH Einstel lung mit 5 N NaOH auf PH 7,4 hergestellt. Die Kristallisation wird unter Verwendung des neutral/neutral Kombinationsverfahrens der Protein- und Protaminteile durchgeführt, wie dies oben beschrieben ist. Es werden Protaminendkonzentrationen von 0,3 mg/100 E, 0,35 mg/100 E und 0,4 mg/100 E untersucht. Die Inkubationstemperaturen beinhalten 15°C und 22°C. Nach 24 Stunden bei diesen Temperaturen sind alle Proben primär amorph, wie dies durch Mikroskopie be stimmt wird. Qualitativ werden Kristalle beobachtet. Die Kristalle sind gut definiert.

Beispiel 12 Asp (B28)-Analogon-Protamin

Es wird eine Insulin-Asp(B28)-Humaninsulinanalogonlösung hergestellt, indem man 16,6 mg des Proteins in 1 ml Lösung löst, die 3,2 mg/ml m-Kresol, 1,3 mg/ml Phenol und 32 mg/ml Glycerin enthält. Ein 14,4 µl Aliquot einer sauren Zinkstammlösung (10 mg/ml Zn²⁺, hergestellt durch Auflösen von 0,311 g Zinkoxid in 5 ml 10% HCl und Verdünnung auf 25 ml mit Wasser) wird zugegeben. Der Lösungs-pH beträgt 2,3, was die vollständige Lösung des Proteins erlaubt. Ein 10 µl Aliquot 10% NaOH wird zugegeben, um den pH auf 7,06 einzu stellen. Zur Lösung werden 100 µl 0,28 M dibasisches Natriumphos phat pH 7,0 gegeben, was die Lösung auf pH 7,27 bringt. Ein 870 µl Aliquot aus Wasser für Injektionszwecke wird zur Lösung gegeben.

Zusätzlich werden 10% HCl (1 µl) und NaOH (0,7 µl) zugegeben und das Endvolumen der Lösung wird mit Wasser für Injektionszwecke auf 2 ml gebracht, was schließlich zu einem pH von 7,26 führt. Die Lö sung wird durch ein 0,2 µm Filter (Supor® Acrodisc® 13, Gelman Sciences) vor der Verwendung filtriert.

Es werden Protaminstammlösungen durch Lösen von Protamin sulfat in einer Lösung hergestellt, die 1,6 mg/ml m-Kresol, 0,65 mg/ml Phenol, 16 mg/ml Glycerin und 14 mM dibasisches Natriumphosphat enthält. Der schließliche pH der Lösung wird auf 7,3 eingestellt. Die Protaminendkonzentration beträgt 0,60 mg/100 E auf der Grundlage der freien Base. Beide Lösungen werden durch ein 0,22 µm Filter (Millipore Sterivex®-GV) vor der Verwendung filtriert.

Die Kristallisation wird durch Mischen der Asp(B28)-Human insulinlösung in einem 1 : 1 Verhältnis bei kontrollierter Tempera tur erreicht, wie dies in Tabelle 1 gezeigt ist. Die schließlichen Mischbedingungen sind 3,94 mg/ml Asp(B28)-Humaninsulin, 0,0359 mg/ml (0,9%) Zinkionen, 1,6 mg/ml m-Kresol, 0,65 mg/ml Phenol, 16 mg/ml Glycerin, 14 mM dibasisches Natriumphosphat und 0,30 mg/100 E Protamin bei pH 7,3. Genauer gesagt werden 50-200 µl Teile der Asp^B28-Humaninsulinlösung in Gläschen überführt und die Proben werden auf 4, 8, 15 oder 23°C (Umgebungstemperatur) äquilibriert. Teile der beiden Protaminlösungen werden ebenfalls bei diesen Temperaturen äquilibriert. Nach 15-20 Minuten wird ein Äquivalentvolumen jeder Protaminlösung in die Asp(B28)-Humaninsu linproben pipettiert. Das Gemisch wird sanft gemischt, verschlos sen und dann still bei kontrollierter Temperatur während der Kristallisationsperiode stehengelassen. Alle Proben werden durch Mikroskopie nach 24 Stunden untersucht und vorwiegend als amorph befunden. Nach 48 Stunden zeigt die 0,30 mg/100 E Protamin enthal tende und bei 15°C inkubierte Probe extensive Mengen an Nadel-ähn lichen Kristallen und etwas amorphes Material.

Beispiel 13

Eine Insulin Asp(B28)-Humaninsulinanalogonlösung wird hergestellt, indem man 10,62 mg des Proteins in 0,71 ml einer Lö sung löst, die 3,2 mg/ml m-Kresol, 1,3 mg/ml Phenol und 32 mg/ml Glycerin enthält. 10,2 µl einer sauren Zinkstammlösung (10 mg/ml Zn²⁺, hergestellt durch Auflösen von 0,311 g Zinkoxid in 5 ml 10% HCl und Verdünnung auf 25 ml mit Wasser) werden zugegeben. Der pH der Lösung beträgt 2,3, was die vollständige Lösung des Proteins erlaubt. Ein 6,5 µl Aliquot einer 10%igen NaOH wird zugegeben, um den pH auf 7,00 einzustellen. Zur Lösung werden 71 µl 0,28 M dibasisches Natriumphosphat pH 7,0 gegeben, was die Lösung auf pH 7,26 bringt. Ein 620 µl Aliquot aus Wasser für Injektionszwecke wird zur Lösung gegeben. Zusätzlich werden 10% HCl (0,2 µl) und NaOH (0,6 µl) zugegeben und das Endvolumen der Lösung wird mit Wasser für Injektionszwecke auf 1,42 ml gebracht, was schließlich zu einem pH von 7,42 führt. Die Lösung wird durch ein 0,2 µm Filter (Supor® Acrodisc® 13, Gelman Sciences) vor der Verwendung filtriert.

Es wird eine Protaminstammlösung durch Lösen von Protamin sulfat in einer Lösung hergestellt, die 1,6 mg/ml m-Kresol, 0,65 mg/ml Phenol, 16 mg/ml Glycerin und 14 mM dibasisches Natriumphosphat enthält. Der schließliche pH der Lösung wird auf 7,4 eingestellt und die Protaminendkonzentration beträgt 0,60 mg/100 E auf der Grundlage der freien Base. Die Lösung wird durch ein 0,22 µm Filter (Millipore Sterivex®-GV) vor der Verwen dung filtriert.

Die Kristallisation wird durch Mischen der Asp(B28)-Human insulinlösung in einem 1 : 1 Verhältnis mit einer Protaminlösung bei kontrollierten Temperaturen von 13°C, 15°C, 17°C und 23°C er reicht, wie dies in Beispiel 12 beschrieben ist. Die schließlichen Mischbedingungen sind 3,74 mg/ml Asp(B28)-Humaninsulin, 0,0359 mg/ml (0,9%) Zinkionen, 1,6 mg/ml m-Kresol, 0,65 mg/ml Phenol, 16 mg/ml Glycerin, 14 mM dibasisches Natriumphosphat und 0,30 mg/100 E Protamin bei pH 7,4. Vier verschiedene Kristallisationstempera turen werden untersucht. Ein 1 ml Aliquot des bei 15°C äquili brierten Asp^B28-Humaninsulins wird mit 1 ml der Protaminlösung ge mischt, die auf dieselbe Temperatur eingestellt ist. Nach einem sanften Mischen läßt man die Präparation still bei 15°C stehen. Es wird eine weitere Probe durch die Äquilibrierung von 100 µl der Asp(B28)-Humaninsulinlösung auf 13°C und einer anschließenden Kom bination mit 100 µl der auf dieselbe Temperatur eingestellten Protaminlösung hergestellt. Das schließliche Gemisch wird bei 13°C inkubiert. Die dritte Probe wird auf ähnliche Weise hergestellt, außer daß die zwei 100 µl Aliquots bei 17°C äquilibriert, kombi niert und inkubiert werden. Die letzte Lösung wird durch Mischen von 80 µl Teilen der auf Umgebungstemperatur äquilibrierten Asp(B28)-Humaninsulin- und Protaminlösung und einer Inkubation bei Umgebungstemperatur (23°C) hergestellt. Alle Proben werden durch Mikroskopie nach 24 Stunden und anderen Zeitintervallen hiernach ausgewertet, wie dies in Tabelle 1 aufgelistet ist.

Tabelle 1

Kristallisationsbedingungena und Ergebnisse aus der Mikroskopie

Die gemäß den obigen Beispielen hergestellten Kristalle sind in Fig. 2 und Fig. 3 gezeigt.

Claims

1. Insulinanalogonprotaminkomplex, der umfaßt: Humaninsulin, worin Pro an der Position B28 durch Asp, Lys, Leu, Val oder Ala er setzt ist und Lys an der Position B29 Lys oder Pro ist, Des (B28-B30)-Humaninsulin oder Des (B27)-Humaninsulin, Protamin, Zink und ein Phenolderivat, mit der Maßgabe, daß wenn das Insu lin Asp^B28-Humaninsulin ist, die Konzentration an Protamin we niger als 10 Gewichtsprozent beträgt.

2. Komplex nach Anspruch 1, der besteht aus Lys^B28Pro^B29-Humanin sulin, etwa 0,27 bis etwa 0,32 mg Protamin/100IE Insulinanalo gon, etwa 0,35 bis etwa 0,9 Gewichtsprozent Zink und einem Phenolderivat.

3. Komplex nach Anspruch 1, der besteht aus Asp^B28-Humaninsulin, etwa 0,27 bis etwa 0,35 mg Protamin/100IE Insulinanalogon, etwa 0,35 bis etwa 0,9 Gewichtsprozent Zink und einem Phenolderivat.

4. Komplex nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin der Komplex kristallin ist.

5. Parenterale pharmazeutische Insulin-Protamin-Formulierung, die den Komplex nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 umfaßt.

6. Formulierung nach Anspruch 5, die ferner etwa 0,2 bis etwa 1,5 mg Protamin/100IE Insulinanalogon, etwa 0,35 bis etwa 0,9 Ge wichtsprozent Zink und ein Phenolderivat umfaßt.

7. Parenterale pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 6, die umfaßt: Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, etwa 0,27 bis etwa 0,32 mg Protamin/100IE Insulinanalogon und etwa 0,35 bis etwa 0,9 Ge wichtsprozent Zink.

8. Parenterale pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 6, die umfaßt: Asp^B28-Humaninsulin, etwa 0,27 bis etwa 0,35 mg Protamin/100IE Insulinanalogon und etwa 0,35 bis etwa 0,9 Ge wichtsprozent Zink.

9. Parenterale pharmazeutische Formulierung, die umfaßt:
Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, etwa 0,3 mg Protamin/100IE Insulinanalogon, etwa 0,7 Gewichtsprozent Zink, etwa 1,7 mg/ml m-Kresol, etwa 0,7 mg/ml Phenol, etwa 16 mg/ml Glycerin und etwa 3,78 mg/ml dibasisches Natriumphosphat.

10. Parenterale pharmazeutische Formulierung nach einem der An sprüche 5 bis 9, die ferner ein lösliches Insulinanalogon um faßt.

11. Parenterale pharmazeutische Formulierung, die umfaßt: Ein Ge misch aus löslichem Insulinanalogon und Insulinanalogon-Protamin-Kristallen, worin das Gewichtsverhältnis der zwei Komponenten etwa 1 : 99 bis 99 : 1 Insulinanalogon zu Insulinanalogon-Protamin-Kristallen beträgt, wobei dieses Insulinanalogon Humaninsulin ist, worin Pro an der Position B28 durch Asp, Lys, Leu, Val oder Ala ersetzt ist und Lys an der Position B29 Lys oder Pro ist, Des(B28-B30)-Humaninsulin oder Des(B27)-Humaninsulin, mit der Maßgabe, daß wenn das Insulin Asp^B28-Humaninsulin ist, die Konzentration an Protamin weniger als 10 Gewichtsprozent beträgt.

12. Parenterale pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 11, worin das Gewichtsverhältnis der zwei Komponenten etwa 75 : 25 bis 25 : 75 beträgt.

13. Parenterale pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 12, die umfaßt: Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin und Lys^B28Pro^B29-Humaninsu lin-Protamin-Kristalle.

14. Parenterale pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 13, worin das Gewichtsverhältnis der zwei Komponenten 50 : 50, 75 : 25 oder 25 : 75 beträgt.

15. Parenterale pharmazeutische Formulierung nach einem der An sprüche 5 bis 14 zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes mellitus.

16. Verfahren zur Herstellung des Komplexes nach einem der Ansprü che 1 bis 4, das umfaßt: Die Kombination von monomerem Insulinanalogon, Protamin, Zink und einem Phenolderivat in ei nem wäßrigen Lösemittel und das Ausbildenlassen des Komplexes.

17. Verfahren zur Herstellung von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-Protamin-Kristallen, das umfaßt: Die Kombination einer wäßrigen Lösung von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin in einem hexameren Assoziationszustand und einer Protaminlösung bei einer Temperatur von etwa 8°C bis etwa 22°C, wobei diese wäßrige Lösung etwa 0,35 bis etwa 0,9 Gewichtspro zent Zink, Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin und ein Phenolderivat bei einem pH von etwa 7,1 bis etwa 7,6 enthält, und diese Protaminlösung Protamin bei einem pH von etwa 7,1 bis etwa 7,6 enthält, so daß die Protaminendkonzentration etwa 0,27 bis etwa 0,32 mg Protamin/100IE Insulinanalogon beträgt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin die Temperatur 15°C, die Zinkkonzentration 0,7% bis 0,9% und die Protaminkonzentration 0,3 mg/100IE Insulinanalogon beträgt.

19. Verfahren zur Herstellung von Asp^B28-Humaninsulin-Protaminkri stallen, das umfaßt: Die Kombination einer wäßrigen Lösung von Asp^B28-Humaninsulin in einem hexameren Assoziationszustand und einer Protaminlösung bei einer Temperatur von etwa 13°C bis 17°C, wobei die wäßrige Lösung etwa 0,35 bis etwa 0,9 Gewichtsprozent Zink, Asp^B28-Humaninsulin und ein Phenolderivat bei einem pH von etwa 7,1 bis etwa 7,6 enthält, und diese Protaminlösung Protamin bei einem pH von etwa 7,1 bis etwa 7,6 enthält, so daß die Protaminendkonzentration etwa 0,27 bis etwa 0,32 mg Protamin/100 IE Insulinanalogon beträgt.

20. Verfahren zur Herstellung einer parenteralen pharmazeutischen Formulierung nach einem der Ansprüche 5 bis 14, das umfaßt:
Die Suspendierung der Insulinanalogon-Protamin-Kristalle in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel.