DE69737995T2

DE69737995T2 - INSULINPREPARATION MIT MAnnitol

Info

Publication number: DE69737995T2
Application number: DE69737995T
Authority: DE
Inventors: Lone Loegstrup Kimer; Per Balschmidt; Steen Jensen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-06-20
Filing date: 1997-06-19
Publication date: 2008-04-24
Anticipated expiration: 2017-06-20
Also published as: PL188736B1; ES2292189T3; NO985978L; KR20000022030A; EP0910402B1; NO985978D0; JP2009242400A; CN1198643C; AU719361B2; WO1997048413A1; CZ395798A3; HUP9904156A3; DE69737995D1; JP2000513343A; CA2258099A1; ATE369146T1; IL127365A0; NO324276B1; CZ297682B6; HUP9904156A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft wässrige Insulinpräparate, die Humaninsulin oder ein Analogon oder Derivat davon umfassen, wobei die Präparate eine hervorragende physikalische Stabilität aufweisen. Die Erfindung betrifft weiterhin parenterale Formulierungen, die derartige Insulinpräparate umfassen, und ein Verfahren zur Verbesserung der physikalischen Stabilität von Insulinpräparaten.
Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diabetes ist ein allgemeiner Begriff für Störungen beim Menschen mit übermäßiger Harnausscheidung wie bei Diabetes mellitus und Diabetes insipidus. Diabetes mellitus ist eine Stoffwechselstörung, in welcher das vermögen, Glucose auszunutzen, mehr oder weniger verloren gegangen ist. Etwa 2% der Menschheit leiden an Diabetes.
Seit der Einführung von Insulin in den 1920er Jahren wurden kontinuierliche Schritte unternommen, die Behandlung von Diabetes mellitus zu verbessern. Um die Vermeidung von extremen Blutzuckergehalten zu unterstützen, praktizieren Diabetiker eine Therapie mit mehrfachen Injektionen, durch welche Insulin mit jeder Mahlzeit verabreicht wird.
Bei der Behandlung von Diabetes mellitus sind bisher viele verschiedenartige Insulinpräparate vorgeschlagen und verwendet wurden, wie reguläres Insulin, Semilente^®-Insulin, Isophaninsulin, Insulin-Zink-Suspensionen, Proamin-Zink-Suspensionen und Ultralente^®-Insulin. Da Diabetiker für eine Dauer von mehreren Jahrzehnten mit Insulin behandelt werden, besteht großer Bedarf nach sicheren und die Lebensqualität verbessernden Insulinpräparaten. Einige der im Handel erhältlichen Insulinpräparate sind durch einen Schnellen Wirkungseinsatz gekennzeichnet, und andere Präparate weisen einen relativ langsamen Einsatz auf, zeigen aber eine mehr oder weniger längere Wirkung. Bei schnell wirkenden Insulinpräparaten handelt es sich gewöhnlich um Insulinlösungen, während es sich bei verzögert wirkenden Insulinpräparaten um Suspensionen handeln kann, die Insulin in kristalliner und/oder amorpher Form enthalten, das durch Zugabe von Zinksalzen allein oder durch Zugabe von Protamin oder durch eine Kombination von beidem ausgefällt wird.
Zudem verwenden einige Patienten Präparate mit sowohl schnellem Wirkungseinsatz als auch einer längeren Wirkung. Bei einem derartigen Präparat kann es sich um eine Insulinlösung handeln, in welcher Protamininsulinkristalle suspendiert sind. Einige Patienten stellen durch Mischen einer Insulinlösung mit einem Suspensionspräparat im vom fraglichen Patienten gewünschten Verhältnis sich selbst das endgültige Präparat her.
Normalerweise werden Insulinpräparate durch subkutane Injektion verabreicht. Wichtig für den Patienten ist das Wirkungsprofil des Insulinpräparats, wobei es sich hierbei um die Wirkung von Insulin auf den Glucosestoffwechsel als Funktion der Zeit von der Injektion an handelt. Bei diesem Profil sind u.a. die Zeitdauer für den Einsatz, der Maximalwert und die Gesamtwirkungsdauer wichtig. Eine Vielfalt an Insulinpräparaten mit unterschiedlichen Wirkungsprofilen ist von den Patienten erwünscht und gefragt. Ein Patient kann am selben Tag Insulinpräparate mit sehr unterschiedlichen Wirkungsprofilen verwenden. Das gefragte Wirkungsprofil hängt z.B. von der Tageszeit und der menge und Zusammensetzung von jeglicher vom Patienten eingenommener Mahlzeit ab.
Gleichermaßen wichtig ist allerdings die physikalische Stabilität der Insulinpräparate aufgrund der reichlichen Verwendung von penförmigen Injektionsvorrichtungen wie Vorrichtungen, die Penfill^®-Patronen enthalten, in welchen ein Insulinpräparat aufbewahrt wird, bis die gesamte Patrone leer ist. Dies kann bei Vorrichtungen, die Patronen mit 1,5–3,0 ml enthalten, mindestens 1 bis 2 Wochen dauern.
Beschreibung des Stands der Technik
Die erste stabile neutrale Insulinsuspension wurde von Scott und Fischer (J. Pharmacol. Exp. Ther. 58(1936) 78) entwickelt, die entdeckten, dass die Gegenwart eines Überschusses an Protamin und eines Zinksalzes (2 μg Zink pro IU (international unit, internationale Einheit) Insulin das Protamininsulinpräparat, beschrieben von Hagedorn et al., J. Am. med. Assn. 106(1936) 177–180) stabilisieren könnte.
Protamin-Zink-Insulin, das gemäß den amerikanischen oder europäischen Arzneibüchern hergestellt ist, enthält amorphes Protamin-Zink-Insulin, sowie kristallines Protamin-Zink-Insulin. Frisch hergestelltes Protamin-Zink-Insulin enthält hauptsächlich amorphen Niederschlag, der bei Lagerung teilweise zu kristallinen Teilchen umgewandelt wird, was zu einer stärker hinausgezögerten Wirkung führt.
Eine völlig kristalline Protamin-Zink-Insulinmodifikation, bezeichnet als NPH-Insulin oder Isophaninsulin wurde von Krayenbühl und Rosenberg (siehe Rep. Steno Mem. Hosp. Nord. Insulinab. 1(1946) 60; und das Dänische Patent Nr. 64,708) entwickelt. Sie fanden heraus, dass Insulin und Protamin, die in Isophananteilen bei einem neutralen pH-Wert in Gegenwart einer kleinen Menge Zink und Phenol oder Phenolderivaten oder vorzugsweise m-Cresol zusammengebracht werden, einen amorphen Niederschlag bilden, der beim Stehenlassen allmählich aber vollständig zu länglichen tetragonalen Kristallen umgewandelt wird, die an den Enden durch pyramidale Flächen eingegrenzt sind. Insulin und Lachs-Protamin kristallisieren gemeinsam in einem Gewichtsverhältnis, entsprechend etwa 0,09 mg Protaminsulfat pro mg Insulin, aus. Zink in einer Menge von mindestens 0,15 μg pro IU und eine phenolische Verbindung in einer Konzentration von höher als 0,1% ist zur Herstellung der tetragonalen Kristalle nötig.
In den frühen Tagen wurde diese Art von Kristallen unter Verwendung von Schweine- und Rinderinsulin von natürlichen Quellen hergestellt, jedoch wird seit den 1980er Jahren auch durch Gentechnik oder durch Halbsynthese hergestelltes Humaninsulin verwendet.
Humaninsulin besteht aus zwei Polypeptidketten, den so genannten A- und B-Ketten, die 21 bzw. 30 Aminosäuren enthalten. Die A- und B-Ketten sind durch Cysteindisulfidbrücken miteinander verbunden. Insulin von den meisten anderen Spezies weist eine ähnliche Konstruktion auf, kann aber nicht die gleichen Aminosäuren an den Positionen, die denjenigen in den Ketten von Humaninsulin entsprechen, enthalten.
Die Entwicklung des als Gentechnik bekannten Verfahrens machte es möglich, eine große Vielfalt von zu Humaninsulin analogen Insulinverbindungen leicht herzustellen. In diesen Insulinanaloga wurden eine oder mehrere der Aminosäuren mit anderen Aminosäuren, die durch die Nukleotidsequenz kodiert werden können, substituiert. Da Humaninsulin, wie vorstehend erklärt, 51 Aminosäurereste enthält, ist es einleuchtend, dass eine große Anzahl von Insulinanaloga möglich ist, und tatsächlich wurde bisher eine große Vielfalt von Analoga mit interessanten Eigenschaften hergestellt. In Humaninsulinlösungen mit einer Konzentration von Interesse für Injektionspräparate liegt das Insulinmolekül in assoziierter Form als Hexamer vor (Brange et al., Diabetes Care 13 (1990) 923–954). Es wird angenommen, dass nach einer subkutanen Injektion die Geschwindigkeit der Absorption durch den Blutstrom von der Größe des Moleküls abhängt, und es wurde heraus gefunden, dass Insulinanaloga mit Aminosäuresubstitutionen, die diese Hexamerbildung hemmen oder ihr entgegenwirken, einen unüblichen schnellen Wirkungseinsatz aufweisen (Brange et al., ebd.). Dies ist für Diabetiker von großem therapeutischem Wert. In den Kristallen von länger wirkenden Protamin-Insulinpräparaten ist das Insulin ebenfalls in hexamerer Form zu finden (Balschmidt et al., Acta Chryst. B47(1991) 975–986).
Pharmazeutische Präparate auf der Basis von Humaninsulinanaloga sind z.B. aus den folgenden Dokumenten bekannt:
WO 95/00550 betrifft pharmazeutische Präparate auf der Basis von Insulinkristallen, die Asp^B28-Insulin und Protamin umfassen, die einen schnellen Einsatz und eine längere Aktivität zeigen, wenn sie in vivo verabreicht werden. Die Kristalle können weiterhin Zinkionen und Phenol und/oder m-Cresol enthalten. Glycerin wird den Präparaten als isotonisches Mittel zugesetzt.
In US 5 461 031 sind verschiedene parenterale pharmazeutische Formulierungen offenbart, die ein schnell wirkendes monomeres Insulinanalogon, Zink, Protamin und ein Phenolderivat umfassen. Die Formulierungen enthalten weiterhin Glycerin, das als Isotonizitätsmittel wirkt.
US 5 474 978 offenbart eine schnell wirkende parenterale Formulierung, die einen aus sechs monomeren Insulinanaloga bestehenden Humaninsulinanalogonhexamerkomplex, Zinkionen und mindestens drei Moleküle eines Phenolderivats umfasst. Das bevorzugte Isotonizitätsmittel ist Glycerin.
Unglücklicherweise bildet Insulin durch nicht-kovalente Polymerisation tendenziell unlösliche und biologisch inaktive Fibrille (vgl. z.B. Jens Brange, Galenics of Insulin, Springer-Verlag, 1987 und darin zitierte Literaturangaben). Die Fibrillbildung wird durch erhöhte Temperaturen, z.B. über 30°C, und gleichzeitige Bewegungen gefördert. Der Fibrillierungsprozess, der sehr schwierig zu vermeiden ist, setzt der Dauer, für welche das Insulinpräparat gelagert werden kann, und damit dem Patronenvolumen von Penfills^® eine obere Grenze.
Die Wirkung von Zuckern und Polyolen auf die Wärmestabilität von Rinderinsulin wurde ebenfalls untersucht (V. Gupta, R. Bhat, Centre for Biotechnology, Bd. 70, S. 209–212).
Da die Bildung von Fibrillen im Allgemeinen eine Monomerisierung von Insulin erfordert, führen Insulinanaloga, die nur ungern D- und Hexamere bilden, aufgrund der Fibrillierung zu Präparaten mit einer geringeren physikalischen Stabilitat.
So ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Insulinpräparat, das Humaninsulin oder ein Analogon umfasst, mit verbesserter physikalischer Stabilität bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wurde diese Aufgabe durch Folgendes erzielt: Ein wässriges Insulinpräparat, umfassend:

a) gelöstes Insulinanalogon, und Insulinanalogon und Protamin umfassende Kristalle,
b) 100 bis 400 mM Mannit,
sc) 5 bis 40 mM eines Chlorids,
d) einen physiologisch verträglichen Puffer, vorzugsweise einen Phosphatpuffer, wobei die Konzentration an Insulinanalogon 60 bis 3000 nmol/ml beträgt; das Gewichtsverhältnis zwischen gelöstem und kristallinem Insulinanalogon 30:70 bis 70:30 beträgt; die Kristalle Zink und eine phenolische Verbindung umfassen; und das Humaninsulinanalogon eines ist, in welchem die Position B28 Asp, Lys, Leu, Val oder Ala ist und die Position B29 Lys oder Pro ist, oder des(B28-B30)-, des(B27)- oder des(B30)-Humaninsulin ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 ist ein Fotomikrogramm (1000fache Vergrößerung) einer Formulierung der Erfindung, die Asp^B28-Humaninsulin-Protamin-Kristalle und Mannit umfasst.
2 ist ein Fotomikrogramm (1000fache Vergrößerung) einer Formulierung der Erfindung, die Humaninsulin-Protamin-Kristalle und Mannit umfasst.
3 ist eine grafische Darstellung des Wirkungsprofils eines Präparats der Erfindung, das sowohl gelöstes als auch kristallines Asp^B28-Humaninsulin enthält, und eines Präparats, das sowohl gelöstes als auch kristallines Humaninsulin enthält. Beide Präparate enthalten weiterhin Mannit. Das Diagramm ist die Blutglucoseantwort nach einer Injektion in Schweine. Die Figur zeigt, dass der schnelle Wirkungseinsatz für das hochstabile Asp^B28-Humaninsulinpräparat bewahrt wird.
Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Der Ausdruck „Humaninsulinanalogon" bedeutet wie hier verwendet Humaninsulin, in welchem eine oder mehrere Aminosäuren deletiert und/oder durch andere Aminosäuren, einschließlich nicht-kodierbarer Aminosäuren ersetzt worden sind, oder Humaninsulin, das zusätzliche Aminosäuren, d.h. mehr als 51 Aminosäuren umfasst.
Im vorliegenden Zusammenhang entspricht der Begriff „wasserlöslich" einer Löslichkeit in Wasser von mindestens etwa 10 mmol/l, vorzugsweise mindestens 50 mmol/l, bei einer Temperatur von 20°C.
Die Begriffe Kohlenhydrat, reduziertes Kohlenhydrat, Monosaccharid, Disaccharid und Ester- und Etherderivate derartiger Verbindungen werden gemäß den Lehren von K.A. Jensen in „Grundrids af den organiske kemi, Almen Kemi III, 1. Aufl., Jul. Gjellerups forlag, 1969, S. 299–316, verwendet.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Ausdruck „nicht-reduzierendes Kohlenhydrat" ein Kohlenhydrat, das im Wesentlichen unfähig ist, mit den Aminogruppen von Insulin im Präparat der Erfindung unter Bildung von glyciniertem Insulin zur reagieren. Dierse Definition schließt Kohlenhydrat ein, in welchen die Carbonylgruppe(n) z.B. durch Anhydridbildung oder Derivatisierung inaktiviert oder blockiert wurde(n).
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein wässriges Insulinpräparat, umfassend:

a) gelöstes Insulinanalogon, und Insulinanalogon und Protamin umfassende Kristalle,
b) 100 bis 400 mM Mannit,
c) 5 bis 40 mM eines Chlorids,
d) einen physiologisch verträglichen Puffer, vorzugsweise einen Phosphatpuffer, wobei die Konzentration an Insulinanalogon 60 bis 3000 nmol/ml beträgt; das Gewichtsverhältnis zwischen gelöstem und kristallinem Insulinanalogon 30:70 bis 70:30 beträgt; die Kristalle Zink und eine phenolische Verbindung umfassen; und das Humaninsulinanalogon eines ist, in welchem die Position B28 Asp, Lys, Leu, Val oder Ala ist und die Position B29 Lys oder Pro ist, oder des(B28-B30)-, des(B27)- oder des(B30)-Humaninsulin ist.

Bevorzugte Ausführungsformen
Da schnell wirkende Humaninsulinanaloga umfassende Insulinpräparate im Allgemeinen eine eher geringe physikalische Stabilität zeigen, ist die vorliegende Erfindung in Verbindung mit derartige Analoga umfassenden Präparaten besonders vorteilhaft. So umfasst das erfindungsgemäße Insulinpriparat vorzugsweise ein oder mehrere schnell wirkende Humaninsulinanaloga, insbesondere Analoga, in welchen Position B28 Asp, Lys, Leu, Val oder Ala ist und Position B29 Lys oder Pro ist; oder des(B28-B30)-, des (B27)- oder des(B30)-Humaninsulin. Das Insulinanalogon ist vorzugsweise ausgewählt aus Humaninsulinanaloga, in welchen Position B28 Asp oder Lys ist und Position B29 Lys oder Pro ist. Die besonders bevorzugten Analoga sind Asp^B28-Humaninsulin oder Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Insulinpräparat sowohl gelöstes als auch ausgefälltes, vorzugsweise kristallines Insulinanalogon in einem Gewichtsverhältnis von 30:70 bis 70:30.
In dieser Ausführungsform der Erfindung umfasst das Insulinpräparat vorteilhafterweise Kristalle, umfassend: Insulinanalogon und Protamin und Zink, und eine phenolische Verbindung wie Phenol, m-Cresol oder ein Gemisch davon. Die Menge an Protamin in den Kristallen entspricht vorzugsweise 0,20 bis 0,40 mg Protaminbase/100 IU Insulin oder Insulinanalogon. Das Verhältnis von Protamin zu Insulin in den Kristallen entspricht stärker bevorzugt dem Isophanverhältnis. Zink liegt vorzugsweise in einer Menge von 10 bis 40 μg Zn(100 IU Insulin, stärker bevorzugt 15 bis 35 μg Zn/100 IU Insulin vor. Phenol bzw. m-Cresol liegt vorzugsweise in einer Menge, entsprechend 0 bis 4 mg/ml vor. Jedoch ist ein gemisch von 1,4 bis 2,0 mg/ml m-Cresol und 0,6 bis 2,0 mg/ml Phenol besonders bevorzugt.
Ein besonders bevorzugtes Insulinpräparat der Erfindung umfasst:

a) 60 bis 3000 nmol/ml, vorzugsweise 240 bis 1200 nmol/m Humaninsulin oder -insulinanalogon und/oder Insulinderivat;
b) Mannit in einer Konzentration von 100 bis 400 mM, vorzugsweise 150 bis 250 mM, stärker bevorzugt 180 bis 230 mM;
c) Natriumchlorid in einer Konzentration von 0 bis 100 mM, vorzugsweise 5 bis 40 mM, stärker bevorzugt 5 bis 20 mM, und
d) einen physiologisch verträglichen Puffer, vorzugsweise einen Phosphatpuffer wie Dinatriumphosphatdihydrat in einer Menge von 1 bis 4 mg/ml.

Das Präparat der Erfindung kann weiterhin eine oder mehrere gewöhnlich als Isotonizitätsmittel verwendete Verbindungen wie Glycerin enthalten.
Der pH-Wert des Insulinpräparats liegt vorzugsweise im Bereich von 7,0 bis 7,8.
Ein Verfahren zur Herstellung eines sowohl gelöstes als auch ausgefälltes Insulinanalogon enthaltenden Insulinpräparats ist bereitgestellt, jedoch nicht beansprucht, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Bereitstellen einer sauren Lösung, umfassend ein Humaninsulinanalogon, Zink und eine subisophane Menge Protamin;
b) bereitstellen einer alkalischen Lösung, umfassend eine Substanz, die bei physiologischem pH-Wert als Puffer wirkt; wobei mindestens eine der vorstehenden Lösungen ferner eine phenolische Verbindung umfasst;
c) Mischen der sauren und alkalischen Lösung und wahlweise Einstellen des pH-Werts auf einen Wert im Bereich von 6,5 bis 8,0, vorzugsweise 7,0 bis 7,8; und
d) Stehenlassen der erhaltenen Suspension zur Ausfällung.

Durch dieses Verfahren kann ein sowohl gelöstes als auch ausgefälltes Insulinanalogon enthaltendes Insulinpräparat in einer sehr einfachen Weise erhalten werden. Weiterhin besteht der Niederschlag der erhaltenen Suspension gewöhnlich aus stäbchenförmigen Kristallen, die in so genannten PräMix-Insulinpräparaten vorteilhaft sind.
Das Gewichtsverhältnis von Insulinanalogon zu Protamin in der Lösung von Schritt a) wird vorzugsweise derart ausgewählt, dass im Endprodukt ein Gewichtsverhältnis von gelöstem zu ausgefälltem Insulinanalogon im Bereich von 1:99 bis 99:1, vorzugsweise 20:80 bis 80:20, stärker bevorzugt 30:70 bis 70:30 erhalten wird. Spezieller umfasst die Lösung von Schritt a) vorzugsweise 120 bis 6000 nmol/ml Insulinanalogon und 0,01 bis 5,0 mg/ml Protamin.
Die Lösung von Schritt a) umfasst ferner Zink, vorzugsweise in einer Menge, entsprechend 10–40 μg Zink/100 IU Insulin, stärker bevorzugt 15–35 μg Zink/100 IU Insulin.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst Lösung a) und/oder Lösung b) Chlorid, vorzugsweise Natriumchlorid in einer Menge, entsprechend 0 bis 100 mM, vorzugsweise 5 bis 40 mM, stärker bevorzugt 5 bis 20 mM, im Endprodukt.
Der pH-Wert der sauren Lösung von Schritt a) liegt vorzugsweise unter 5, stärker bevorzugt im Bereich von 2 bis 3,5.
Das Insulinanalogon ist vorzugsweise Humaninsulin, in welchem Position b28 Asp, Lys, Leu, Val oder Ala ist und Position B29 Lys oder Pro ist; oder des(B28-B30)-, des(B27)- oder des(B30)-Humaninsulin, stärker bevorzugt Asp^B28-Humaninsulin oder Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, noch stärker bevorzugt Asp^B28-Humaninsulin.
Die phenolische Verbindung, die in der Lösung von Schritt a) und/oder Schritt b) verwendet wird, ist vorzugsweise Phenol, m-Cresol oder ein Gemisch davon.
Vorteilhafterweise umfasst die Lösung von Schritt a) und/oder Schritt b) ferner ein wasserlösliches reduziertes oder nicht-reduzierendes Kohlenhydrat, das mindestens 4 Kohlenstoffatome in der Kohlenhydrathauptstruktur enthält, oder ein wasserlösliches nicht reduzierendes Ester- und/oder Etherderivat eines Kohlenhydrats oder reduzierten Kohlenhydrats, das mindestens 4 Kohlenstoffatome in der Kohlenhydrathauptstruktur enthält, oder Gemische davon.
Das Kohlenhydrat oder Kohlenhydratderivat enthält vorzugsweise 5 bis 18 Kohlenstoffatome in der Kohlenhydrathauptstruktur.
In einer besonders bevorzugten Ausfürungsform umfasst die Lösung von Schritt a) und/oder Schritt b Mannit, Sorbit, Xylit, Inosit, Trehalose, Saccharose oder ein beliebiges Gemisch davon, vorzugsweise Mannit und/oder Sorbit, stärker bevorzugt Mannit.
Die Puffersubstanz, die in der alkalischen Lösung von Schritt b) eingesetzt wird, ist vorzugsweise ein physiologisch verträglicher Puffer, vorzugsweise ein Phosphatpuffer, stärker bevorzugt Dinatriumphosphatdihydrat.
Das ausgefällte Insulinanalogon liegt vorzugsweise in Form von Kristallen vor, die Insulinanalogon und Protamin umfassen.
Die in Schritt d) erhaltene Suspension wird vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 5 bis 40°C, stärker bevorzugt 20 bis 36°C, noch stärker bevorzugt 30 bis 34°C zur Ausfällung stehen gelassen.
Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.
BEISPIEL I
Präparat 1
Ein Insulinpräparat, enthaltend sowohl gelöstes als auch kristallines As^B28-Humaninsulin, wurde in der folgenden Weise hergestellt:
Lösung A:
Eine Lösung von Asp^B28-Humaninsulin mit einer Konzentration von 200 IU/ml wurde durch Lösen von 76,5 mg Asp^B28-Humaninsulin in Wasser durch Zugabe dazu von 326 μl 0,2 N Salzsäure und 163 μl Zinkchloridlösung (0,4 mg/ml) hergestellt. Dann wurden der Insulinlösung unter Mischen 6,35 mg Protaminsulfat in Lösung zugesetzt, und ein Gemisch, bestehend aus 17,2 mg m-Cresol, 15 mg Phenol und 455 mg Mannit, wurde dieser Lösung unter Mischen zugesetzt. Der pH-Wert der erhaltenen klaren Lösung wurde als pH = 2,6–2,9 gemessen, und Wasser wurde auf 10 ml zugesetzt. Die Lösung wurde bei 28–32°C äquilibriert.
Lösung B:
25 mg Dinatriumphosphatdihydrat wurden in Wasser zur Injektion gelöst. 17,2 mg m-Cresol, 15 mg Phenol und 455 mg Mannit wurden unter Mischen zugesetzt. Der pH-Wert der erhaltenen klaren Lösung wurde als 9 gemessen, und Wasser auf 10 ml wurde zugesetzt. Die Lösung wurde bei 28–32°C äquilibriert.
Mischen von Lösung A und B:
Lösung B wurde Lösung A zugesetzt, und der pH-Wert wurde erneut auf 7,30 eingestellt. Die erhaltene Suspension wurde bei 30°C für eine Dauer von 6 Tagen zur Kristallisation stehen gelassen.
Im erhaltenen Präparat betrug das Gewichtsverhältnis von ausgefälltem zu gelöstem Insulin 70:30.
Das Präparat wurde in Penfill^®-Patronen mit einem Volumen von 1,5 ml eingebracht.
BEISPIEL II
Präparat 2
Ein Insulinpräparat, enthaltend sowohl gelöstes als auch kristallines Asp^B28-Humaninsulin, wurde in der folgenden Weise hergestellt.
i) Kristalline Fraktion
Lösung A:
Eine Lösung von Asp^B28-Humaninsulin mit einer Konzentration von 200 IU/ml wurde durch Lösen von 190,3 mg Asp^B28-Humaninsulin in Wasser durch Zugabe dazu von 813 μl 0,2 N Salzsäure und 410 μl Zinkchloridlösung (0,4 mg/ml) hergestellt. Dann wurden der Insulinlösung unter Mischen 16,1 mg Protaminsulfat in Lösung zugesetzt, und ein Gemisch, bestehend aus 43,0 mg m-Cresol, 37,5 mg Phenol und 909 mg Mannit, und 14,6 mg Natriumchlorid wurden dieser Lösung unter Mischen zugesetzt. Der pH-Wert der erhaltenen klaren Lösung wurde als pH = 2,6–2,9 gemessen, und Wasser wurde auf 22 ml zugesetzt. Die Lösung wurde bei 32°C äquilibriert.
Lösung B:
62,4 mg Dinatriumphosphatdihydrat wurden in Wasser gelöst. 43,0 mg m-Cresol, 37,5 mg Phenol, 909 mg Mannit und 14,6 mg Natriumchlorid wurden unter Mischen zugesetzt. Der pH-Wert der erhaltenen klaren Lösung wurde als 9 gemessen, und Wasser auf 22 ml wurde zugesetzt. Die Lösung wurde bei 32°C äquilibriert.
Mischen von Lösung A und B:
Lösung B wurde Lösung A zugesetzt, und der pH-Wert wurde erneut auf 7,30 eingestellt, und Wasser auf 50 ml wurde zugesetzt. Die erhaltene Suspension wurde bei 32°C für eine Dauer von 4 Tagen zur Kristallisation stehen gelassen.
Im erhaltenen Präparat betrug das Gewichtsverhältnis von ausgefälltem zu gelöstem Insulin 70:30.
Das Präparat wurde in Penfill^®-Patronen mit einem Volumen von 1,5 ml eingebracht.
BEISPIELE III–VI
Präparate 3 bis 6
Insulinpräparate, enthaltend sowohl gelöstes als auch kristallines Asp^B28-Humaninsulin, wurden wie in Beispiel II beschrieben hergestellt, außer dass die in Lösung A und B verwendete Menge an Mannit 818 mg, 1005 mg, 1047 mg bzw. 1137 mg betrug.
Die Präparate wurden in Penfill^®-Patronen mit einem Volumen von 1,5 ml eingebracht.
BEISPIEL VII
Präparat 7
Ein Insulinpräparat, enthaltend sowohl gelöstes als auch kristallines Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, wurde in der folgenden Weise hergestellt:
i) Kristalline Fraktion
Lösung A:
Eine Lösung von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin mit einer Konzentration von 200 IU/ml wurde durch Suspendieren von 69,7 mg Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin in Wasser hergestellt. Ein Gemisch, bestehend aus 16,0 mg m-Cresol, 6,5 mg Phenol, 364 mg Mannit und 25,1 mg Dinatriumdiphosphatdihydrat wurde dieser Lösung unter Mischen zugesetzt. Dann wurden 50 μl Zinkchloridlösung (10 mg/ml) zugesetzt. Der pH-Wert der erhaltenen klaren Lösung wurde erneut auf 7,40 eingestellt, und Wasser wurde auf 10 ml zugesetzt. Die Lösung wurde bei 15°C äquilibriert.
Lösung B:
Eine Lösung von Protaminsulfat wurde durch Lösen von 7,61 mg Protaminsulfat und 25,1 mg Dinatriumphosphatdihydrat in Wasser hergestellt. 16,0 mg m-Cresol, 6,5 mg Phenol und 364 mg Mannit wurden dieser Lösung unter Mischen zugesetzt. Diese Lösung wurde der Protaminsulfatlösung unter Mischen zugesetzt. Der pH-Wert der erhaltenen klaren Lösung wurde erneut auf 7,40 eingestellt, und Wasser wurde auf 10 ml zugesetzt. Die Lösung wurde bei 15°C äquilibriert.
Mischen von Lösung A und B:
Lösung B wurde Lösung A zugesetzt, und der pH-Wert wurde erneut auf 7,30 eingestellt. Die erhaltene Suspension wurde bei 15°C für eine Dauer von 3 Tagen zur Kristallisation stehen gelassen.
ii) Gelöste Fraktion
Eine Lösung von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin wurde durch Lösen von 34,9 mg
Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin in Wasser durch Zugabe dazu von 33 μl 0,2 N Salzsäure und 25 μl Zinkchloridlösung (10 mg/ml) hergestellt. Dann wurden der Insulinlösung unter Mischen ein Gemisch, bestehend aus 26,1 mg Natriumphosphatdihydrat, 6,5 mg Phenol, 16,0 mg m-Cresol und 364 mg Mannit zugesetzt. Der pH-Wert der erhaltenen klaren Lösung wurde als pH = 7,3 gemessen, und Wasser wurde auf 10 ml zugesetzt.
6 ml der gelösten Fraktion wurden zu 14 ml der kristallinen Fraktion zugesetzt, und der pH-Wert wurde auf 7,30 eingestellt.
Im erhaltenen Präparat betrug das Gewichtsverhältnis von ausgefälltem zu gelöstem Insulin 70:30.
Das Präparat wurde in Penfill^®-Patronen mit einem Volumen von 1,5 ml eingebracht.
BEISPIEL VIII
Präparat 8
Ein Insulinpräparat, enthaltend sowohl gelöstes als auch kristallines Humaninsulin, wurde in der folgenden Weise hergestellt:
i) Kristalline Fraktion
Lösung A:
Eine Lösung von Humaninsulin wurde durch Lösen von 69,7 mg Humaninsulin in Wasser durch Zugabe dazu von 65 μl 1 N Salzsäure und 26 μl Zinkchloridlösung (10 mg/ml) hergestellt. Darm wurden 6,0 mg Protaminsulfat in Lösung der Insulinlösung unter Mischen zugesetzt, und ein Gemisch, bestehend aus 15,0 mg Phenol und 17,2 mg m-Cresol wurde der Lösung unter Mischen zugesetzt. Der pH-Wert der erhaltenen klaren Lösung wurde als pH = 2,7–3,2 gemessen, und Wasser wurde auf 10 ml zugesetzt.
Lösung B:
24,9 mg Natriumphosphatdihydrat wurden in Wasser gelöst. 15 mg Phenol, 17,2 mg m-Cresol, 728 mg Mannit und 11,7 mg Natriumchlorid wurden unter Mischen zugesetzt. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung wurde auf pH = 9 eingestellt, und Wasser wurde auf 10 ml zugesetzt.
Lösung B wurde Lösung A zugesetzt, und der pH-Wert wurde auf 7,30 eingestellt. Die erhaltene Suspension wurde bei 22–24°C bis zum nächsten Tag stehen gelassen.
ii) Gelöste Fraktion
Eine Lösung von Humaninsulin wurde durch Lösen von 34,9 mg Humaninsulin in Wasser durch Zugabe dazu von 33 μl 1 N Salzsäure und 13 μl Zinkchloridlösung (10 mg/ml) hergestellt. Dann wurde ein Gemisch, bestehend aus 12,5 mg Natriumphosphatdihydrat, 15 mg Phenol, 17,2 mg m-Cresol, 364 mg Mannit und 5,8 mg Natriumchlorid der Insulinlösung unter Mischen zugesetzt. Der pH-Wert der erhaltenen klaren Lösung wurde als pH = 7,3 gemessen, und Wasser wurde auf 10 ml zugesetzt.
6 ml der gelösten Fraktion wurden zu 14 ml der kristallinen Fraktion zugesetzt, und der pH-Wert wurde auf 7,30 eingestellt.
Im erhaltenen Präparat betrug das Gewichtsverhältnis von ausgefälltem zu gelöstem Insulin 70:30.
Das Präparat wurde in Penfill^®-Patronen mit einem Volumen von 1,5 ml eingebracht.
BEISPIEL IX
Präparat 9
Ein Insulinpräparat, enthaltend sowohl gelöstes als auch kristallines Asp^B28-Humaninsulin, wurde in der folgenden Weise hergestellt:
Lösung A:
Eine Lösung von Asp^B28-Humaninsulin mit einer Konzentration von 200 IU/ml wurde durch Lösen von 189,9 mg Asp^B28-Humaninsulin in Wasser durch Zugabe dazu von 163 μl 1 N Salzsäure und 163,5 μl Zinkchloridlösung (10 mg/ml) hergestellt. Dann wurden 11,5 mg Protaminsulfat in Lösung der Insulinlösung unter Mischen zugesetzt, und ein Gemisch, bestehend aus 44,3 mg m-Cresol, 38,6 mg Phenol und 1048 mg Mannit, und 7,3 mg Natriumchlorid wurden dieser Lösung unter Mischen zugesetzt. Der pH-Wert der erhaltenen klaren Lösung wurde als pH = 2,6–2,9 gemessen, und Wasser wurde auf 25 ml zugesetzt. Die Lösung wurde bei 22–24°C äqulibriert.
Lösung B:
62,3 mg Dinatriumphosphatdihydrat wurden in Wasser gelöst. 44,3 mg m-Cresol, 38,6 mg Phenol, 1048 mg Mannit und 7,3 mg Natriumchlorid wurden unter Mischen zugesetzt. Der pH-Wert der erhaltenen klaren Lösung wurde als 9 gemessen, und Wasser wurde auf 25 ml zugesetzt. Die Lösung wurde bei 22–24°C äquilibriert.
Mischen von Lösung A und B:
Lösung B wurde Lösung A zugesetzt, und der pH-Wert wurde erneut auf 7,30 eingestellt. Die erhaltene Suspension wurde bei 32°C für eine Dauer von 2 Tagen zur Kristallisation stehen gelassen.
Im erhaltenen Präparat betrug das Gewichtsverhältnis von ausgefälltem zu gelöstem Insulin 50:50.
Das Präparat wurde in Penfill^®-Patronen mit einem Volumen von 1,5 ml eingebracht.
BEISPIEL X (Vergleich)
Präparat 10
Ein Insulinpräparat, enthaltend sowohl gelöstes als auch kristallines Asp^B28-Humaninsulin, wurde in der folgenden Weise hergestellt:
Lösung A:
Eine Lösung von Asp^B28-Humaninsulin mit einer Konzentration von 200 IU/ml wurde durch Lösen von 76,5 mg Asp^B28-Humaninsulin in Wasser durch Zugabe dazu von 326 μl 0,2 N Salzsäure und 163 μl Zinkchloridlösung (0,4 mg/ml) hergestellt. Dann wurden 6,35 mg Protaminsulfat in Lösung der Insulinlösung unter Mischen zugesetzt, und ein Gemisch, bestehend aus 17,2 mg m-Cresol, 15,0 mg Phenol und 160 mg Glycerin, wurde dieser Lösung unter Mischen zugesetzt. Der pH-Wert der erhaltenen klaren Lösung wurde als pH = 2,6–2,9 gemessen, und Wasser wurde auf 10 ml zugesetzt. Die Lösung wurde bei 28–32°C äquilibriert.
Lösung B:
25 mg Dinatriumphosphatdihydrat wurden in Wasser zur Injektion gelöst. 17,2 mg m-Cresol, 15,0 mg Phenol und 160 mg Glycerin wurden unter Mischen zugesetzt. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung wurde als pH = 9 gemessen, und Wasser wurde auf 10 ml zugesetzt. Die Lösung wurde bei 28–32°C äquilibriert.
Lösung B wurde Lösung A zugesetzt, und der pH-Wert wurde erneut auf 7,30 eingestellt. Die erhaltene Suspension wurde bei 28–32°C für eine Dauer von 2 Tagen zur Kristallisation stehen gelassen.
Im erhaltenen Präparat betrug das Gewichtsverhältnis von ausgefälltem zu gelöstem Insulin 70:30.
Das Präparat wurde in Penfill^®-Patronen mit einem Volumen von 1,5 ml eingebracht.
BEISPIEL XI
PHYSIKALISCHER BELASTUNGSTEST
5 Proben von jedem Insulinpräparat wurden in Penfill^®-Patronen eingebracht und dem folgenden physikalischen Belastungstest unterzogen:
Die Penfill^®-Patronen wurden an einer in einem Inkubator eingesetzten Dreheinrichtung befestigt und mit 360° für eine Dauer von vier Stunden pro Tag mit einer Frequenz von 30 Drehungen pro Minute und bei einer konstanten Temperatur von 37±2°C gedreht. Die Penfill^®-Patronen wurden bei einer Temperatur von 37±2°C aufbewahrt, wenn sie nicht gedreht wurden.
Die Penfill^®-Patronen wurden makroskopisch 5 Mal die Woche untersucht und Veränderungen des Erscheinungsbildes der Formulierung wurden gemäß den folgenden Grundlagen notiert:

i) Patronen, die eine weiße durch Bewegung wieder suspendierbare Suspension enthielten und frei von Klumpen und Granulat waren, wurden als „nicht fibrilliert" eingestuft.
ii) Patronen, die eine Suspension mit Klumpen und/oder Granulat enthielten, die durch Bewegung nicht wieder suspendierbar waren und/oder sich an der Patronenwand abschieden wurden als „fibrilliert" vermutet. Dies wurde durch Zugabe von 6 μl 6 N HCl zu der Patrone bestätigt: Fibrillierte Patronen sind nach Säurezugabe nicht sichtbar klar.

Die Drehung der Patronen wurde fortgesetzt, bis sämtliche Proben fibrilliert waren.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengefasst. TABELLE I

Präparat Nr.	Zusammensetzung	Durchschnittliche Anzahl von Tagen zur Fibrillierung	Erster Tag der Fibrillierung
1	Asp^B28-Insulin 30/70 7 mM Phosphat 250 mM Mannit	20	20
2	Asp^B28-Insu1in 30/70 7 mM Phosphat 200 mM Mannit 10 mM Natriumchlorid	23	23
3	Asp^B28-Insulin 30/70 7 mM Phosphat 180 mM Mannit 10 mM Natriumchlorid	21	17
4	Asp^B28-Insulin 30/70 7 mM Phosphat 220 mM Mannit 10 mM Natriumchlorid	19	17
5	Asp^B28-Insulin 30/70 7 mM Phosphat 230 mM Mannit 10 mM Natriumchlorid	21	18
6	Asp^B28-Insulin 30/70 7 mM Phosphat 250 mM Mannit 10 mM Natriumchlorid	22	22
9	Asp^B28-Insulin 50/50 7 mM Phosphat 230 mM Mannit 10 mM Natriumchlorid	>30	>30
10 (Vergleich)	Asp^B28-Insulin 30/70 7 mM Phosphat 174 mM Glycerin	11	9

Claims

Wässriges Insulinpräparat, umfassend: a) gelöstes Humaninsulinanalogon, und Insulinanalogon und Protamin umfassende Kristalle, b) 100 bis 400 mM Mannit, c) 5 bis 40 mM eines Chlorids, d) einen physiologisch verträglichen Puffer, vorzugsweise einen Phosphatpuffer, wobei die Konzentration an Insulinanalogon 60 bis 3000 nmol/ml beträgt; das Gewichtsverhältnis zwischen gelöstem und kristallinem Insulinanalogon 30:70 bis 70:30 beträgt; die Kristalle Zink und eine phenolische Verbindung umfassen; und das Humaninsulinanalogon eines ist, in welchem die Position B28 Asp, Lys, Leu, Val oder Ala ist und die Position B29 Lys oder Pro ist, oder des(B28-B30)-, des(B27)- oder des(B30)-Humaninsulin ist.
Insulinpräparat nach Anspruch 1, wobei das Humaninsulinanalogon Asp^B28-Humaninsulin oder Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin ist.