DE69829982T2

DE69829982T2 - Mittel und therapieverfahren für auf igf-i ansprechende erkrankungen

Info

Publication number: DE69829982T2
Application number: DE69829982T
Authority: DE
Inventors: F. Bruce SCHARSCHMIDT; Alfredo Gorio; E. Eugenio MÜLLER
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1997-05-06
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2018-05-07
Also published as: EP1015019A1; ITMI971042A0; ITMI971042A1; EP1015019B1; AU7370798A; DE69829982D1; WO1998050062A1; IT1291307B1; ATE293990T1; JP2002507193A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Behandlung von Zuständen bei Säugern, die auf eine Therapie mit einem insulinartigen Wachstumsfaktor oder einer Variante davon ansprechen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Insulinartiger Wachstumsfaktor I (IGF-I) ist ein 70 Aminosäure-Polypeptid-Hormon, das biologische insulinartige und mitogene Wachstums-Aktivität hat. Dieses Hormon verstärkt das Wachstum und/oder das Überleben von Zellen in einer Vielzahl von Geweben, einschließlich Skelettmuskelsystemen, Leber, Niere, Darm, Nervensystemgewebe, Herz und Lunge.
Eine Unterbrechung der IGF-I-Wirkung kann zu einer Vielzahl physiologischer Störungen beitragen, einschließlich zu neurodegenerativen Störungen, z.B. Motorneuronenerkrankung, Muskeldystrophie, multiple Sklerose, Knorpelstörungen, wie Osteoarthritis, Knochenkrankheit, wie Osteoporose, Entzündungsstörungen, wie rheumatoide Arthritis, ischämische Verletzungen an Organen, wie dem Herz, dem Gehirn, der Leber usw. Berichte über die Verwendung von äußerlich zugeführten IGF-I zur therapeutischen Behandlung solcher Störungen in Tiermodellen geben unterschiedliche Resultate an.
Beispielsweise berichten eine Reihe von Studien über die Verwendung von IGF-I als potentielles therapeutisches Mittel zur Behandlung von neurodegenerativen Zuständen. Siehe z.B. Kanje et al. (1989) Brain Res. 486: 396–398; Hantai et al. (1995) J. Neurol. Sci. 129: 122–126; Contreras et al. (1995) Pharmac. Exp. Therap. 274: 1443–1499; Di Giulio et al. (1996) Society for Neuroscience 22: 1960; Di Giulio et al. (1997) Society for Neuroscience 23: 849; Hsu et al. (1997) Biochem. Mol. Med. 60(2): 142–148; Gorio et al. (1998) Neuroscience 82: 1029–1037. Eine IGF-I-Therapie war bei zahlreichen neurologischen Zuständen, einschließlich ALS, Schlaganfall, Epilepsie, Parkinson-Erkrankung, Alzheimer-Erkrankung, akuter traumatischer Verletzung und anderen Störungen, die mit Trauma, Alterung, Krankheit oder Verletzung assoziiert sind, indiziert. Siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5,093,137; 5,652,214; 5,703,045; Internationale Publikationen Nrn. WO 90/1483 und WO 93/02695.
Die Anwendung einer IGF-I-Therapie für eine Vielzahl anderer Zustände wurde in einer Reihe von Publikationen beschrieben. Siehe z.B. Schalch et al. (1991) in Modern Concepts of Insulin-Like Growth Factors, Herausg. Spencer (Elsevier, New York), S. 705–714; Clemmons und Underwood (1994), J. Clin. Endocrinol. Metab. 79(1): 4–6 und Langford et al. (1993) Eur. J. Clin. Invest. 23(9): 503–516) (betreffend z.B. insulinresistente Zustände und Diabetes); und O'Shea et al. (1993) Am. J. Physiol. 264: F917–F922 (bezüglich z.B. reduzierter Nierenfunktion). Siehe auch die U.S.-Patente Nr. 5,110,604 und 5,427,778 (betreffend z.B. Wundheilung); 5,126,324 (betreffend z.B. Herzerkrankungen und Wachstumsverzögerung); 5,368,858 (betreffend z.B. Knorpel-Defekte oder -Läsionen); 5,543,441/5,550,188 (betreffend z.B. Gewebezu nahme); 5,686,425 (betreffend z.B. Narbengewebe, lokalisierte Muskeldysfunktion und Harninkontinenz); und 5,656,598 (betreffend z.B. Knochenwachstum). Siehe auch die Internationalen Publikationen WO 91/12018 (betreffend z.B. intestinale Störungen); WO 92/09301 und WO 92/14480 (betreffend z.B. Wundheilung); WO 93/08828 (betreffend z.B. neuronale Schädigung, assoziiert mit Ischämie, Hypoxie oder Neurodegeneration); WO 94/16722 (betreffend z.B. Insulinresistenz); WO 96/02565A1 (betrifft z.B. IGF/IGFBP-Komplex zur Förderung der Knochenbildung und zur Regulierung der Knochenneubildung); und die Europäische Patentanmeldung NR. 560 723 (betrifft z.B. Osteoporose).
Obgleich eine IGF-I-Therapie für eine Reihe physiologischer Indikationen beschrieben wurde, waren die Resultate manchmal nicht voraussagbar, kurzzeitige günstige Wirkungen halten manchmal nicht an (siehe z.B. Miller et al. (1994) Kidney International 46: 201–207) und es können unerwünschte Nebenwirkungen resultieren, insbesondere aus einer Verabreichung hoher Dosen und/oder einer Langzeitverabreichung (siehe z.B. Jabri et al. (1994) Diabetes 43: 369–374; Wilton (1992) Acta Paediatr. 393: 137–141). Es wurde auch berichtet, dass hohe Level an IGF-I mit einem erhöhten Risiko für Prostatakrebs in Korrelation stehen (Chan et al. (1998) Science 278: 563–566).
Glycosaminoglycane (GAGs) sind komplexe Heteropolysaccharide, die in erster Linie aus Repetiereinheiten aus Disacchariden aufgebaut sind, in denen ein Zucker ein Hexosamin ist und der andere eine Uronsäure ist. GAGs, z.B. Hyaluronsäure und Heparin, wurden in einigen Protein-enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen als Zusatz eingesetzt und waren auch als Chemoattractants und Strukturkomponenten bestimmter pharmazeutischer Zusammensetzungen, Gelformulierungen und biologisch abbaubarer Matrices enthalten (siehe z.B. U.S.-Patente Nrn. 5,510,121/5,510,418; 5,656,598; 5,686,425; und 5,368,858; und die Internationalen Publikationen Nrn. WO 92/14480 und WO 93/08828). Prisell et al. (1992) beurteilte die Verwendung von Hyaluronsäure als Vehikel mit langsamer Freisetzung für bestimmte Peptid-Wachstumsfaktoren, die subkutan gegeben werden (Int. J. Pharmaceutics 85: 51–56).
Von GAGs wurde gezeigt, dass sie die Bildung des IGF-I-IGFBP-Komplexes in in vitro-Ansätzen zerstören (siehe z.B. Baxter (1990) Biochem. J. 271: 773–777; Arai et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 20388–20393; Arai et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 6099–6106). Es wird auch berichtet, dass sie die Proteolyse der Bindungsproteine modulieren (siehe Arai et al. (1994) Endocrinology 135: 2358–2363) und die Aktivität bestimmter Wachstumsfaktoren in in vitro-Testsystemen modulieren (siehe z.B. Moscatelli (1998) J. Cell Biol. 107: 753–759; und Damon et al. (1989) J Cell. Physiol. 138: 221–226).
In mehreren Artikeln wurde die Verwendung von GAGs allein als therapeutische Mittel in Tierversuchen beschrieben. Siehe z.B. Di Giulio et al. (1996) Society for Neuroscience 22: 1960; Di Giulio et al. (1997) Society for Neuroscience 23: 894; Vergani et al. (1997) Neuroscience Letters 228: 41–44; und Gorio et al. (1998) Neuroscience 92: 1029–1037.
Es ist klar, dass bessere Verfahren zur Therapie mit IGF-I und Varianten davon benötigt werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß ist die Verwendung von IGF-I oder einer Variante davon, die biologische IGF-I-Aktivität hat und sich von der Aminosäuresequenz von IGF-I um 10 Aminosäuren oder weniger unterscheidet, in Kombination mit wenigstens einem Glycosaminoglycan bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines auf IGF-I ansprechenden Zustands bei einem Säuger vorgesehen, ausgewählt aus neurodegenerativen Störungen, chronischer Lungenkrankheit akuter oder chronischer Nierenerkrankung, akutem oder chronischem Leberversagen, Leberzirrhose, ischämischer Verletzung von Herz, Leber oder Gehirn, Wundheilung und Organabstoßung nach Transplantation, wobei eine gleichzeitige Therapie unter Verwendung der Kombination eine gewünschte therapeutische Reaktion bezüglich des auf IGF-I ansprechenden Zustands begünstigt.
Bereitgestellt wird auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Kombination aus IGF-I oder einer Variante davon und wenigstens einem Glycosaminoglycan umfasst; hierbei hat der genannte IGF-I oder dessen Variante biologische IGF-I-Aktivität und unterscheidet sich von der Aminosäuresequenz von IGF-I um 10 oder weniger Aminosäuren und wenigstens ein Glycosaminoglycan, wobei der IGF-I oder die Variante davon und das Glycosaminoglycan in Mengen vorliegen, die in Kombination eine gewünschte therapeutische Reaktion bezüglich eines auf IGF-I ansprechenden Zustands begünstigen, wenn diese einem Säuger verabreicht wird, der eine Therapie für diesen auf IGF-I ansprechenden Zustand durchmacht, wobei der auf IGF-I ansprechende Zustand aus neurodegenerativen Störungen, chronischer Lungenkrankheit, akuter oder chronischer Nierenstörung, akutem oder chronischem Leberversagen, Leberzirrhose, ischämischer Verletzung von Herz, Leber oder Gehirn, Wundheilung und Organabstoßung nach Transplantation ausgewählt ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die histometrische Analyse der Bizepsmuskel-Fasergröße, die als Prozentwert der Gesamtfaserzahl ausgedrückt wird, die gemessen wurde und die in einem bestimmten Bereich des Muskelfaserbereichs von Wobbler-Mäusen vorliegen, die verschiedene Arzneimittelbehandlungen durchmachen. 1a stellt die Kontrollgruppe von heterozygoten Mäusen dar, denen täglich nur Kochsalzlösung injiziert wurde. Die 1b–f stellen Gruppen von Wobbler-Mäusen dar, denen täglich nur Kochsalzlösung (1b), IGF-I mit 20 μg/kg (1c), IGF-I mit 1 mg/kg (1d), GAGs mit 5 mg/kg (1e) und IGF-I mit 20 μg/kg plus GAGs mit 1 mg/kg (1f) injiziert wurde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine Therapie mit einer Kombination aus IGF-I (oder einer Variante davon) und mindestens einem GAG bewirkt eine physiologische Reaktion, die bezüglich eines Zustands bei dem Säuger günstig ist. Eine Therapie mit einer Kombination aus IGF-I (oder einer Varianten davon) und wenigstens einem GAG ist für Zustände wünschenswert, die auf IGF-I ansprechen und die im Folgenden als auf IGF-I ansprechende Zustände bezeichnet werden. Mit „auf IGF-I ansprechender Zustand" sind Zustände gemeint, die in kurzer Zeit oder in langer Zeit entweder positiv oder negativ auf IGF-I oder eine Variante davon reagieren.
Zustände, die auf IGF-I ansprechen, umfassen chronische Lungenkrankheit, akute und chronische Nierenerkrankung, akutes oder chronisches Leberversagen, Leberzirrhose, ischämische Verletzungen, die das Herz, die Leber oder das Gehirn betreffen; Organabstoßung nach Transplantation; neurodegenerative Störungen, z.B. Motorneuronerkrankung, multiple Sklerose, Muskeldistrophie, diabetische Neuropathie, demyelierende periphere Neuropathien, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit und Folgeerscheinungen traumatischer Rückenmarksläsionen. Ein beliebiger dieser auf IGF-I ansprechenden Zustände kann durch die IGF-I- und GAG-Therapie der vorliegenden Erfindung eine Besserung erfahren.
Mit „Therapie" ist eine Behandlung eines existierenden, auf IGF-I ansprechenden Zustands sowie präventive oder prophylaktische Verfahren, die vor Auftreten eines abnormalen, auf IGF-I ansprechenden Zustands durchgeführt werden, gemeint. Demnach kann der Säuger, der eine Therapie erhält, in einem gesunden physiologischen Zustand sein oder kann bereits ein abnormales, auf IGF-I ansprechendes Krankheitsbild haben oder kann für einen abnormalen, auf IGF-I ansprechenden Zustand anfällig sein. Risikofaktoren, von denen bekannt ist, dass sie eine Person für einen abnormalen, auf IGF-I ansprechenden Zustand prädisponiert machen, können berücksichtigt werden, wenn festgelegt wird, ob eine präventive Therapie wünschenswert ist. Ein besonderer, abnormaler, auf IGF-I ansprechender Zustand kann sich z.B. mit Alter, Fettsucht, kongenitalen Defekten oder Entwicklungsdefekten, metabolischen oder endokrinen Störungen usw. verstärken. Es kann somit wünschenswert sein, das erfindungsgemäße Verfahren in Abhängigkeit von dem auf IGF-I ansprechenden Zustand, dessen Behandlung in Betracht gezogen wird, für präventive Zwecke anzuwenden.
Die vorliegende Erfindung kann bei einem beliebigen Säuger eingesetzt werden. Beispiele für Säuger umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Katzen, Hunde, Pferde, Kühe, Schafe, Schweine und insbesondere Menschen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden IGF-I (oder eine Variante davon) und GAG in Kombination verwendet, um eine gewünschte therapeutische Antwort bezüglich des auf IGF-I ansprechenden Zustands zu begünstigen. Mit „gewünschte therapeutische Antwort" ist eine Verbesserung des Zustands oder der mit dem Zustand verbundenen Symptome gemeint. Wenn z.B. der Zustand, der einer Therapie unterliegt, unzureichende Muskelmasse war, wäre eine gewünschte therapeutische Reaktion Zunahme der Muskelmasse. Wenn der Zustand, der einer Therapie unterliegt, eine neurologische Störung, die durch Neuronendegeneration charakterisiert ist, war, wäre eine gewünschte therapeutische Antwort die Inhibierung der Degeneration und/oder die Förderung der Neuronenregeneration. Wenn der Zustand, der einer Therapie unterliegt, eine Herz-, Leber- oder Nierenstörung war, so wäre eine gewünschte therapeutische Ant wort eine Verbesserung der Herz-, Leber- oder Nierenfunktion. Demnach wird die gewünschte therapeutische Reaktion von dem auf IGF-I ansprechenden Zustand, der einer Therapie unterliegt, abhängen.
Eine Förderung einer gewünschten therapeutischen Antwort bezüglich eines besonderen auf IGF-I ansprechenden Zustands bei einem Säuger wird über gleichzeitige Therapie mit IGF-I (oder einer Varianten davon) mit mindestens einem GAG erreicht. Mit „gleichzeitiger Therapie" ist die Darreichung von IGF-I (oder einer Varianten davon) und wenigstens eines GAG an einen Säuger gemeint, derart, dass die therapeutische Wirkung der Kombination beider Substanzen bei einem Säuger hervorgerufen wird, der eine Therapie durchmacht. Eine gleichzeitige Therapie kann erreicht werden, indem eine einzelne pharmazeutische Zusammensetzung, die IGF-I (oder eine Variante davon) und wenigstens ein GAG enthält, nach einem besonderen Dosierungsplan verabreicht wird. Alternativ können IGF-I (oder eine Variante davon) und wenigstens ein GAG als Teil von zwei getrennten pharmazeutischen Zusammensetzungen, von denen eine IGF-I (oder eine Variante davon) enthält, die andere wenigstens ein GAG enthält, verabreicht werden. Eine Verabreichung der getrennten pharmazeutischen Zusammensetzungen kann zur gleichen Zeit oder zu verschiedenen Zeiten erfolgen, solange die therapeutische Wirkung der Kombination der beiden Substanzen in dem Säuger, der eine Therapie durchmacht, bewirkt wird. Die einzelnen pharmazeutischen Zusammensetzungen oder die getrennten pharmazeutischen Zusammensetzungen können intravenös, subkutan, intramuskulär, intraluminal, intraartikulär oder intraventrikulär oder intraperikardial verabreicht werden, und zwar in Abhängigkeit von dem auf IGF-I ansprechenden Zustand, der einer Therapie unterliegt. Alternativ kann eine Verabreichung mit einem Abgabesystem, wie einem mit verzögerter Freisetzung, aus einer biologisch abbaubaren Matrix, das in der Nähe einer physiologischen Stelle, die den IGF-I-Zustand zeigt, implantiert ist, erreicht werden. Dieser Verabreichungstyp kann insbesondere bei der Therapie für Knorpel- oder Knochenstörungen nützlich sein, wo eine biologisch abbaubare Matrix als Form zur Knochenneubildung oder als Knorpelersatz dient.
Eine gleichzeitige Therapie mit einer wirksamen Menge der Kombination aus IGF-I (oder einer Varianten davon) und wenigstens einem GAG fördert eine erwünschte therapeutische Reaktion bezüglich eines bestimmten, auf IGF-I ansprechenden Zustands. Die jeweiligen Mengen an IGF-I (oder einer Varianten davon) und wenigstens einem GAG, die in Kombination die gewünschte therapeutische Antwort begünstigen, sind eine Funktion voneinander. Somit ist die Menge (oder Dosis) an IGF-I (oder einer Varianten davon), die während der gleichzeitigen Therapie zu verwenden ist, eine Funktion der Menge (oder Dosis) wenigstens eines GAG, das in Kombination mit einer gegebenen Dosis an IGF-I (oder einer Varianten davon) verwendet wird. Entsprechend ist die Menge wenigstens eines GAG, das während einer gleichzeitigen Therapie zu verwenden ist, eine Funktion der Menge an IGF-I (oder einer Varianten davon), die in Kombination mit einer gegebenen Dosis wenigstens eines GAG verwendet wird. Eine Verabreichung wenigstens eines GAG gleichzeitig mit IGF-I (oder einer Varianten davon) verstärkt die Wirk samkeit von IGF-I (oder einer Varianten davon). Somit führt die Kombination wenigstens eines GAG mit IGF-I (oder einer Varianten davon) zu einer gewünschten therapeutischen Antwort, die bezüglich der, die mit Verabreichung von IGF-I (oder einer Varianten davon) allein oder wenigstens eines GAG allein beobachtet wird, eine Verbesserung darstellt. Eine Verbesserung der gewünschten therapeutischen Antwort kann additiver Natur oder synergistischer Natur sein. Bei synergistischer Natur resultiert eine gleichzeitige Natur mit IGF-I (oder einer Varianten davon) und wenigstens einem GAG in einer gewünschten therapeutischen Antwort, die größer ist als die Summe der gewünschten therapeutischen Antworten, die mit den getrennten IGF-I (oder einer Varianten davon)- und GAG-Komponenten erreicht werden. Da der Zusatz wenigstens eines GAG die Wirksamkeit von IGF-I (oder einer Varianten davon) verstärkt, kann eine gewünschte therapeutische Reaktion erreicht werden, die mit einer bestimmten Dosis an IGF-I (oder einer Varianten davon) alleine, ähnlich der mit niedrigeren Dosen an IGF-I (oder einer Varianten davon), die in Kombination mit wenigstens einem GAG verabreicht wird, ist. Demnach kann eine Dosis an IGF-I allein, die normalerweise nicht-therapeutisch wirksam ist, therapeutisch wirksam sein, wenn sie mit wenigestens einem GAG verabreicht wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Menge wenigstens eines GAG, die in der Therapie mit IGF-I verabreicht wird, eine Menge, die fähig ist, nach Verabreichung an einen Säuger eine potentielle biologische Wirkung zu verursachen. Dies steht im Gegensatz zu Mengen an GAG, die als Träger, Stabilisatoren, Chemoattractants oder strukturelle Komponenten von pharmazeutischen Zusammensetzungen, Gelformulierungen und biologisch abbaubaren Matrices eingearbeitet sind. Somit bewirkt die Verabreichung wenigstens eines GAG eine biologische Wirkung, die die gewünschte therapeutische Antwort, die mit IGF-I allein erhalten wird, bezüglich einer Therapie für den bestimmten, auf IGF-I ansprechenden Zustand verstärkt.
Nach der Erfindung der Anmelder werden die Menge an IGF-I (oder einer Varianten davon), wenn diese in Kombination mit einer Menge wenigstens eines GAG verabreicht wird, und die Menge wenigstens eines GAG, die benötigt wird, um die Wirksamkeit einer gegebenen Menge an IGF-I (oder einer Varianten davon) zu verstärken, in einfacher Weise durch einen Fachmann auf diesem Gebiet, ohne unnötiges Experimentieren bestimmt. Faktoren, die den Verabreichungsmodus und die entsprechende Menge an IGF-I (oder einer Varianten davon), die in Kombination mit einer gegebenen Menge an wenigstens einem GAG verabreicht wird, beeinflussen, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, den bestimmten, auf IGF-I ansprechenden Zustand, der eine Therapie erfährt, die Schwere des Zustands und das Alter, Größe, Gewicht, Gesundheit und physischen Zustand der Person, die die Therapie durchmacht. Im Allgemeinen ist eine höhere Dosierung mit zunehmendem Gewicht des Säugers, der eine Therapie erfährt, bevorzugt.
Die Menge an IGF-I (oder einer Varianten davon) ist eine Funktion der Menge wenigstens eines GAG, das in Kombination mit dem IGF-I (oder einer Varianten davon) verabreicht wird, und umgekehrt. In einer Ausführungsform liegt die Menge an IGF-I (oder einer Varianten davon) im Bereich von etwa 1 μg/kg/Dosis bis etwa 60 μg/kg/Dosis, vorzugsweise von etwa 2,5 μg/kg/Dosis bis etwa 45 μg/kg/Dosis, bevorzugter von etwa 5 μg/kg/Dosis bis etwa 30 μg/kg/Dosis, während die Menge wenigstens eines GAG im Bereich von etwa 10 μg/kg/Dosis bis etwa 15 mg/kg/Dosis, vorzugsweise von etwa 50 μg/kg/Dosis bis etwa 10 mg/kg/Dosis, bevorzugter von etwa 0,1 mg/kg/Dosis bis etwa 5 mg/kg/Dosis reicht. Wenn die Menge an IGF-I (oder einer Varianten davon) im Bereich von 5 μg/kg/Dosis bis etwa 30 μg/kg/Dosis liegt, liegt die gesamte Menge an GAG, die wenigstens ein GAG umfasst, im Bereich von etwa 0,1 mg/kg/Dosis bis etwa 5 mg/kg/Dosis. So könnte beispielsweise die Menge an IGF-I (oder einer Varianten davon), 10, 15, 20 oder 25 μg/kg/Dosis sein und die Gesamtmenge an GAG könnte 0,1, 0,5, 1 oder 2 mg/kg/Dosis sein. Wenn die Gesamtmenge an IGF-I (oder einer Varianten davon) 20 μg/kg/Dosis ist, ist die Gesamtmenge an GAG 0,5, 1 oder 2 mg/kg/Dosis, beträgt vorzugsweise 1 mg/Dosis. Im Allgemeinen wird das Verhältnis von Gesamt-GAG zu IGF-I (oder einer Varianten davon) auf Gewicht-zu-Gewicht-Basis größer als etwa 10:1, typischerweise größer als etwa 15:1, vorzugsweise größer als etwa 20:1, bevorzugter größer als etwa 30:1, noch bevorzugter größer als etwa 50:1, noch bevorzugter größer als etwa 100:1, sogar noch bevorzugter größer als etwa 500:1 und am vorteilhaftesten größer als etwa 1000:1 sein. In einer Ausführungsform ist das Verhältnis von Gesamt-GAG zu IGF-I (oder einer Varianten davon) etwa 50:1. Wie vorher angegebenen wurde, werden die entsprechenden Mengen an IGF-I (oder einer Varianten davon) und wenigstens einem GAG von den auf IGF-I ansprechenden Zustand, der eine gleichzeitige Therapie erfährt, wie auch vom Verabreichungsmodus abhängen. Beispielsweise beinhaltet eine intrathekale oder eine andere lokale Verabreichung von IGF-I (oder einer Varianten davon) typischerweise niedrigere Dosen an IGF-I (oder einer Varianten davon), z.B. 0,1 bis 1 μg/kg/Dosis.
Der Ausdruck „IGF-I", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf den insulinartigen Wachstumsfaktor I (IGF-I), ein einkettiges Peptid mit 70 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von etwa 7600 Dalton. IGF-I stimuliert Metose- und Wachstumsprozesse, die mit der Zellentwicklung verbunden sind.
Zu verabreichendes IGF-I kann aus einer beliebigen Tierspezies, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Vögel, Hund, Rind, Schwein, Pferd und Mensch, kommen. Vorzugsweise stammt das IGF-I aus einer Säugerspezies und bevorzugter aus einem Säuger derselben Spezies, wie der Säuger, der die Therapie macht. Der IGF-I kann in nativer, rekombinant produzierter oder chemisch synthetisierter Form vorliegen, wie es nachfolgend ausgeführt wird.
Biologisch aktive Varianten von IGF-I werden von dem erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls umfasst. Solche Varianten sollten IGF-I-Aktivitäten, insbesondere die Fähigkeit, an IGF-I-Rezeptorstellen zu binden, beibehalten. Die IGF-I-Aktivität kann unter Verwendung von IGF-I-Bioassays gemessen werden. Repräsentative Assays umfassen bekannte Radiorezeptorassays unter Verwendung von Plazentamembranen (siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5,324,639; Hall et al. (1974) J. Clin. Endocrinol. and Metab. 39: 973–976; und Marshall et al. (1974) J. Clin.
Endocrinol. and Metab. 39: 283–292), einen Bioassay, der die Fähigkeit des Moleküls zur Verstärkung des Einbaus von tritiiertem Thymidin in dosisabhängiger Weise in die DNA von BALB/c-3T3-Fibroblasten misst (siehe z.B. Tamura et al. (1989) J. Biol. Chem. 262: 5616–5621) und dergleichen. Vorzugsweise hat die Variante wenigstens dieselbe Aktivität wie das native Molekül.
Geeignete biologisch aktive Varianten können IGF-I-Fragmente, -Analoga und -Derivate sein. Mit „IGF-I-Fragment" ist ein Protein gemeint, das nur aus einem Teil der intakten IGF-I-Sequenz und -Struktur besteht und kann eine C-terminale Deletion oder eine N-terminale Deletion von IGF-I sein. Mit „Analoga" sind Analoga entweder von IGF-I oder einem IGF-I-Fragment gemeint, die eine native IGF-I-Sequenz und -Struktur umfassen, die eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -insertionen oder -deletionen hat. Peptide, die ein oder mehrere Peptoide (Peptidmimemika) haben, werden durch den Ausdruck Analogon auch mit umfasst (siehe Internationale Publikation Nr. WO 91/04282). Mit „Derivaten" ist eine geeignete Modifikation von IGF-I, IGF-I-Fragmenten oder ihren entsprechenden Analoga gemeint, z.B. Glycosylierung, Phosphorylierung oder eine andere Addition von Fremdgruppierungen, solange die IGF-I-Aktivität beibehalten wird. Verfahren zur Herstellung von IGF-I-Fragmenten, -Analoga und -Derivaten sind auf dem Fachgebiet verfügbar. Siehe allgemein U.S.-Patente Nrn. 4,738,921, 5,158,875 und 5,077,276; Internationale Veröffentlichungs-Nrn. WO 85/00831, WO 92/04363, WO 87/01038 und WO 89/05822; und die Europäischen Patente Nrn. EP 135094 , EP 123228 und EP 128733 .
IGF-I-Varianten werden im Allgemeinen eine Aminosäuresequenz-Identität von wenigstens 70%, vorzugsweise wenigstens 80%, bevorzugter etwa 90 bis 95% oder mehr und am bevorzugtesten etwa 98% oder mehr bezüglich der Aminosäuresequenz des Referenz-IGF-I-Moleküls haben. Mit „Sequenzidentität" ist gemeint, dass dieselben Aminosäurereste innerhalb der IGF-I-Variante und dem Referenz-IGF-I-Molekül gefunden werden, wenn ein spezifiziertes, fortlaufendes Segment der Aminosäuresequenz der Variante an die Aminosäuresequenz des Referenzmoleküls angeordnet und damit verglichen wird. Methoden zur Bestimmung der Identität zwischen Sequenzen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe z.B. das ALIGN-Programm (Dayhoff (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure, 5. Erg. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C.). Zu Zwecken einer optimalen Anordnung der zwei Sequenzen kann das fortlaufende Segment der Aminosäuresequenz der Variante zusätzlich Aminosäurereste oder deletierte Aminosäurereste bezüglich der Aminosäuresequenz des Referenzmoleküls haben. Die Anzahl der Aminosäureveränderungen wird 10 oder weniger, vorzugsweise 5 oder weniger, bevorzugter 4 oder weniger, noch bevorzugter 3 oder weniger, sogar noch bevorzugter 2 oder weniger, am vorteilhaftesten 1 sein. Das fortlaufende Segment, das zum Vergleich mit der Referenz-Aminosäuresequenz verwendet wird, wird wenigstens zwanzig (20) aufeinanderfolgende Nucleotide umfassen und kann 30, 40, 50, 100 oder mehr Nucleotide sein. Korrekturen für eine erhöhte Sequenzidentität, die mit dem Einschluss von "Gaps" (Lücken) in einer Aminosäuresequenz einer Variante verbunden ist, kann hergestellt werden, indem Lücken Strafen ("gap penalties") zugeordnet werden. Methoden zur Sequenzanordnung sind im Fachgebiet gut bekannt.
Wenn der Prozentwert der Aminosäuresequenzidentität in Betracht gezogen wird, können einige Aminosäurerestpositionen als Resultat konservativer Aminosäuresubstitutionen differieren, wobei diese die Eigenschaften der Proteinfunktion nicht beeinträchtigen. In diesen Fällen kann die prozentuale Sequenzidentität nach oben eingestellt werden, um der Ähnlichkeit bei den konservativ substituierten Aminosäuren Rechnung zu tragen. Solche Einstellungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe z.B. Meyers & Miller (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4: 11–17.
Das Fachgebiet stellt eine substantielle Anleitung bezüglich der Herstellung und Verwendung solcher IGF-I-Varianten, wie sie weiter unten diskutiert werden, bereit. Ein Fragment von IGF-I wird im Allgemeinen wenigstens zehn fortlaufende Aminosäurereste des Volllängenmoleküls, vorzugsweise 15 fortlaufende Aminosäurereste des Volllängenmoleküls und am vorteilhaftesten 25 oder mehr fortlaufende Aminosäurereste des Volllängen-IGF-I enthalten.
Es sind mehrere IGF-I-Varianten auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen die, die z.B. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 4904–4907; Biochem. Biophys. Res. Commun. 149 (1987) 398–404; J. Biol. Chem. 263 (1988) 6233–623); Biochem. Biophys. Res. Commun. 165 (1989) 766–771; Forsbert et al. (1990) Biochem. J. 271: 357–363; U.S.-Patent Nrn. 4,876,242 und 5,077,276; und den Internationalen Publikationen Nrn. WO 87/01038 und WO 89/05822 beschrieben sind. Repräsentative Varianten umfassen eine mit einer Deletion von Glu-3 des reifen Moleküls, Varianten mit bis zu 5 Aminosäure-Verkürzungen ab dem N-Terminus, eine Variante mit einer Verkürzung der ersten 3 N-terminalen Aminosäuren (bezeichnet als des(1–3)-IGF-I, des-IGF-I, tIGF-I oder Gehirn-IGF) und einer Variante, die die ersten 17 Aminosäuren der B-Kette von humanem Insulin anstelle der ersten 16 Aminosäuren von humanem IGF-I enthält.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete IGF-I kann in seiner im Wesentlichen reinen, nativen, rekombinanten produzierten oder chemisch synthetisierten Form vorliegen. IGF-I kann aus Serum oder Plasma isoliert und gereinigt werden (siehe Philipps (1980) New Eng. J. Med. 302: 371–380 und das Europäische Patent Nr. EP 123 228 ). IGF-I kann auch durch das Festphasenverfahren chemisch synthetisiert werden (siehe Li et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2216–2220).
Gentechnologie durch DNA-Rekombinationstechniken kann der effizienteste Weg zur Herstellung von IGF-I sein. Die humane DNA-Sequenz, die für IGF-I codiert, ist bekannt und kann zur Extraktion in Wirtszellen eingeführt werden. IGF-I kann durch DNA-Rekombinationstechniken in E. coli, Hefe, Insekten und Säugerzellen produziert werden. Sezerniertes IGF-I kann durch Addieren einer Signalsequenz an die DNA-Sequenz, die für IGF-I codiert, hergestellt werden. Außerdem kann die DNA-Sequenz, die für IGF-I codiert, unter Herstellung von IGF-I-Fragmenten, -Analoga oder -Derivaten manipuliert werden. Solche DNA-Rekombinationstechniken sind im Allgemeinen auf dem Fachgebiet verfügbar. Siehe z.B. die Internationale Publikation Nr. WO 96/07424, wo rekombinantes humanes IGF-I-Protein in Hefe produziert wird.
Der Ausdruck „Glycosaminoglycan (GAG)", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Gruppe von komplexen Heteropolysacchariden, die in erster Linie aus Disaccharid-Repetiereinheiten, in denen ein Zucker ein Hexosamin ist und der andere eine Uronsäure ist, aufgebaut werden. Glycosaminoglycane werden im Allgemeinen in sechs verschiedene Klassen eingeteilt; diese umfassen Hyaluronat, Chondroitinsulfate, Dermatansulfat, Keratansulfat, Heparin und Heparansulfat.
Disaccharid-Repetiereinheiten aus 1,4-verknüpftem N-Acetylglucosamin und Glucuronsäure bilden die Basisstruktur von Hyaluronat, in dem die Anzahl der Repetiereinheiten im Bereich von etwa 1 bis etwa 5000 liegt. Chondroitinsulfate, welche Chondroitinsulfat A und C umfassen, bestehen aus Disaccharid-Repetiereinheiten aus N-Acetylgalactosamin und Glucuronsäure, wobei die Zahl der Repetiereinheiten von etwa 10 bis etwa 300 für Chondroitinsulfat A und von etwa 20 bis etwa 200 für Chondroitinsulfat C reicht. Chondroitinsulfat A ist in der 4-Position von N-Acetylgalactosamin sulfatiert, während Chondroitinsulfat C in der 6-Position von N-Acetylgalactosamin sulfatiert ist. Dermatansulfat (auch bekannt als Chondroitinsulfat B) unterscheidet sich von Chondroitinsulfat A dahingehend, dass es L-Iduronsäure als vorherrschende Uronsäure hat, obgleich D-Glucuronsäure in variablen Mengen vorliegen kann; die Zahl der Disaccharid-Repetiereinheiten liegt im Bereich von etwa 10 bis etwa 300. Keratansulfat besteht in erster Linie aus Disaccharid-Repetiereinheiten aus N-Acetylglucosamin und Galactose und hat keine Uronsäure im Molekül. Der Sulfatgehalt variiert, wobei Estersulfat am C-6 sowohl von Galactose als auch von Hexosamin vorliegt; die Anzahl der Repetiereinheiten liegt im Bereich von etwa 10 bis etwa 100.
Heparin wird aus Repetiereinheiten von sulfatiertem Glycocyamin und sulfatierter D-Glucuronsäure oder L-Iduronsäure gebildet. Anders als die vorherigen GAG-Klassen enthält Heparin α-glycosidische Bindungen. Die meisten Glycocyaminreste enthalten Sulfamidverknüpfungen und eine kleine Zahl von Glycocyaminresten ist N-acetyliert. Heparin hat im Allgemeinen einen Sulfatgehalt, der annähernd 2,5 Sulfatreste pro Disaccharideinheit ist. Zusätzlich zu N-Sulfat am C-3 und O-Sulfat am C-6 von Glycocyamin kann Heparin am C-3 von Glycocyamin und am C-2 der Uronsäure sulfatiert sein. Die Zahl der Disaccharid-Repetiereinheiten liegt im Bereich von etwa 2 bis etwa 3000. Heparansulfat unterscheidet sich von Heparin dadurch, dass es mehr N-Acetylgruppen, weniger N-Sulfatgruppen und weniger O-Sulfatgruppen hat.
Die in hohem Maße geladene polyanionische Natur und makromolekulare Struktur von GAGs sind für ihre biologischen Funktionen als Gleitmittel und Trägerelemente in Bindegeweben vorteilhaft. Sie dienen als Anker für zellspezifische Wachstumsfaktoren und Enzyme, die in der extrazellulären Matrix und an der Zelloberfläche enthalten sind. Außerdem spielen sie eine Rolle bei der Zelladhäsion, -migration, -proliferation, Proteinsekretion und Genexpression.
Die in der gleichzeitigen Therapie mit IGF-I zu verwendende GAG-Menge kann eine beliebige einer dieser sechs Klassen sein, vorzugsweise Dermatansulfat, Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat C, Heparin oder Heparansulfat, bevorzugter ist es Heparin mit einem Molekulargewicht im Bereich von 35.000 bis 45.000 D. Alternativ kann die Menge an GAG ein Gemisch aus wenigstens zwei GAGs, ausgewählt aus den sechs Klassen, umfassen. Im Allgemeinen umfassen die GAGs die natürlich auftretenden und synthetischen Formen. Sie können aus einer natürlichen Quelle extrahiert und gereinigt und derivatisiert werden. Alternativ können sie synthetisch produziert werden oder durch modifizierte Mikroorganismen, z.B. Bakterien, synthetisiert werden. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten GAGs werden pharmazeutische Qualität haben, d.h. sie werden im Wesentlichen frei von toxischen Verbindungen oder Substanzen sein.
Die IGF-I und GAG, wie sie vorstehend beschrieben wurden, werden in der gleichzeitigen Therapie bei dem Säuger eingesetzt, der eine Therapie für den auf IGF-I ansprechenden Zustand durchmacht. Eine gleichzeitige Therapie kann erreicht werden, indem eine einzelne pharmazeutische Zusammensetzung, die sowohl IGF-I als auch GAG umfasst, verabreicht wird, oder indem zwei getrennte pharmazeutische Zusammensetzungen, von denen eine IGF-I umfasst und die andere wenigstens ein GAG umfasst, verabreicht werden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung, die sowohl IGF-I als auch GAG umfasst, kann andere Komponenten enthalten, die die IGF-I- und GAG-Therapie modulieren. Solche Komponenten umfassen ein beliebiges der IGF-I-bindenden Proteine, IGF-I-Rezeptoren und die säurelabile Untereinheit des IGF-I-Bindungskomplexes. Bis jetzt wurden wenigstens sechs dieser IGFBP-1 bis IGFBP-6 genannt isoliert (siehe z.B. Holly und Martin (1994) Growth Regul. 4 (Erg. 1): 20–30; Langford et al. (1993 Eur. J. Clin. Invest. 23(9): 503–16). Es wird angenommen, dass IGFBPs den Zugang von IGF-I zu seinem Rezeptor modulieren und daher mit IGF-I in Verbindung stehende Antworten stören. Die Verwendung von Ligandeninhibitoren, spezifischerweise von Analoga von IGF-I, erhöhten den Level an freiem, biologisch aktivem IGF-I, was in in vivo- und ex vivo-Explantatstudien gemessen wurde (siehe Internationale Publikation Nr. WO 97/39032). IGFBP-3 kann die stimulatorische Wirkung von IGF-I auf die Proteoglycansynthese verstärken (siehe Chevalier et al. (1996) British J. Rheumat. 35: 515–522). Außerdem wurde auch gezeigt, dass ein säurelabiles Glycoprotein mit dem Proteinkomplex, der durch IGF-I und seine Bindungsproteine gebildet wird, assoziiert ist. Demnach kann die therapeutisch wirksame pharmazeutische Zusammensetzung solches säurelabiles Glycoprotein und IGF-I-Bindungsproteine enthalten, wenn dies erwiesenermaßen die gewünschte therapeutische Wirkung auf den auf IGF-I ansprechenden Zustand, der einer Therapie unterliegt, erleichtert. Die Menge an IGFBPs, die mit IGF-I zu verabreichen ist, kann entsprechend dem Molverhältnis zwischen IGF-I und IGFBPs bestimmt werden. Dieses Molverhältnis kann im Bereich von etwa 0,5:1 bis etwa 3:1 liegen, vorzugsweise etwa 1:1 sein (siehe U.S. Patent Nr. 5,187,151). Alternativ kann die pharmazeutische Zusammensetzung Mittel umfassen, die die IGF-I-Bindung an IGFBPs zerstören und die bei der Verstärkung der IGF-I- und GAG-Therapie wirksam sein können.
Zusätzlich zu diesen Komponenten kann die pharmazeutische Zusammensetzung, die IGF-I und GAG umfasst, einen oder mehrere Proteaseinhibitoren enthalten. Ein Beispiel für einen Proteaseinhibitor ist Natriumpentosanpolysulfat (PPS), ein polysulfatiertes Polysaccharid. Dieser Proteaseinhibitor besitzt Wirksamkeit bei der Behandlung von Osteoarthritis in Kombination mit niedrigen Dosen an IGF-I (1 μg IGF-I intraartikulär 3-mal pro Woche) (Rogachefsky et al. (1993) Osteoarthritis and Cartilage 1: 105–114). Ein solcher Proteaseinhibitor kann auf anderen Wegen, wie intramuskulär, während der gleichzeitigen Verabreichung der wirksamen Dosen an IGF-I und GAG verabreicht werden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann außerdem ein anderes therapeutisches Mittel oder mehrere andere therapeutische Mittel, die bei der Behandlung anderer Zustände bei dem Individuum wirksam sind, umfassen, solange wie die biochemischen Wirkungen der zusätzlichen therapeutischen Mittel die Effizienz der angestrebten Wirkung der IGF-I- und GAG-Therapie nicht stören. Beispiele für solche Mittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Antibiotika, antiinflammatorische Mittel und dergleichen.
Ein pharmazeutisch akzeptabler Träger sollte mit dem IGF-I, GAG und anderen Komponenten in der pharmazeutischen Zusammensetzung vermischt werden. Mit „pharmazeutisch akzeptablem Träger" ist ein Träger gemeint, der herkömmlicherweise auf dem Fachgebiet verwendet wird, um die Lagerung, Verabreichung und/oder die heilende Wirkung der therapeutischen Ingredientien zu erleichtern. Ein Träger kann auch unerwünschte Nebenwirkungen des IGF-I reduzieren. Ein geeigneter Träger sollte stabil sein, d.h. unfähig sein, mit anderen Ingredientien in der Formulierung zu reagieren. Er sollte bei den Dosierungen und Konzentrationen, die zur Therapie eingesetzt werden, keine signifikante lokale oder systemische Nebenwirkung bei Empfängern erzeugen. Solche Träger sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Geeignete Träger für diese Erfindung sind solche, die herkömmlicherweise große stabile Makromoleküle verwenden, z.B. Albumin, Gelatine, Collagen, Polysaccharid, Monosaccharide, Polyvinylpyrrolidon, Polymilchsäure, Polyglykolsäure, polymere Aminosäuren, fixierte Öle, Ethyloleat, Liposome, Glucose, Saccharose, Lactose, Mannose, Dextrose, Dextran, Cellulose, Mannit, Sorbit, Polyethylenglykol (PEG) und dergleichen. Träger mit langsamer Freisetzung, z.B. Hyaluronsäure, können geeignet sein. Siehe insbesondere Prisell et al. (1992) Int. J. Pharmaceu. 85: 51–56 und U.S. Patent Nr. 5,166,331. Ein Einschluss von Hyaluronsäure und anderen Polymeren kann eine zusätzliche günstige Wirkung auf die auf IGF-I ansprechende Krankheit Osteoarthritis haben. Siehe insbesondere Bragantini (1987) Clin. Trials J. 24(4): 333–340; Dougados et al. (1993) Osteoarthritis and Cartilage 1: 97–103 ; und Lussier et al. (1996) J. Rheum. 23: 1579–1585. Andere akzeptable Komponenten in der Zusammensetzung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Puffer, die die Isotonität verstärken, z.B. Wasser, Salzlösung, Phosphat, Citrat, Succinat, Essigsäure und andere organische Säuren oder deren Salze.
Bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzungen können Puffer einarbeiten, die verringerte lokale Schmerzen und Irritation aufweisen, die aus einer Injektion von IGF-I-Zusammensetzung resultieren. Solche Puffer umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Puffer mit niedrigem Phosphatgehalt und Succinatpuffer. Die Internationale Publikation Nr. WO 94/15584 beschreibt eine isotonische IGF-I-Lösung mit pH 5,5 bis 6,5, wobei Phosphatpuffer in einer Menge von weniger als 50 mmol/l vorliegt; es wird berichtet, dass dies zu reduzierten Schmerzen bei Injektion führt. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann außerdem eine solubilisierende Verbindung umfassen, die fähig ist, die Löslichkeit von IGF-I oder einer IGF-I-Variante zu erhöhen.
Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung sollte die pharmazeutische Zusammensetzung, die IGF-I und GAG umfasst, in einer Einheitsdosierung und in einer injizierbaren Form oder in Infusionsform, z.B. Lösung, Suspension oder Emulsion, formuliert sein. Sie kann auch in Form von lyophilisiertem Pulver vorliegen, das zur Verabreichung in eine Lösung, Suspension oder Emulsion überführt werden kann. Die pharmazeutische Zusammensetzung, die IGF-I und GAG enthält, wird vorzugsweise durch Membranfiltration sterilisiert und wird in Einheitsdosis- oder Mehrfachdosis-Behältern, wie versiegelten Phiolen oder Ampullen, gelagert.
Das Verfahren zur Formulierung einer pharmazeutischen Zusammensetzung ist auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Eine umfassende Diskussion zur Formulierung und Selektion pharmazeutisch annehmbarer Träger, Stabilisatoren und Isomolyte kann in Remington's Pharmaceutical Sciences (18. Ausgabe, Mack Pub. Co.: Eaton, Pennsylvania, 1990) gefunden werden.
Der IGF-I der vorliegenden Erfindung kann auch in einer Form mit verzögerter Freisetzung formuliert sein, um das Vorliegen des pharmazeutisch aktiven IGF-I im behandelten Säuger zu verlängern, im Allgemeinen für länger als einen Tag. Die therapeutisch wirksame Dosis von GAG kann in die Formulierung mit verzögerter Freisetzung eingearbeitet sein oder als Teil einer getrennten pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden. Auf dem Fachgebiet sind viele Verfahren zur Herstellung einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung bekannt und sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (18. Ausgabe; Mack Pub. Co.: Eaton, Pennsylvania, 1990) offenbart. Im Allgemeinen kann der IGF-I in semipermeablen Matrices aus festen hydrophoben Polymeren eingeschlossen sein. Die Matrices können zu Filmen oder Mikrokapseln geformt sein. Beispiele für solche Matrices umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Polyester, Copolymere aus L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat (Sidman et al. (1983) Biopolymers 22: 547–556); Polyactide (U.S. Patent Nr. 3,773,919 und EP 58 481 ), Polyactatpolyglycolat (PLGA), Hydrogele (siehe z.B. Langer et al. (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15: 167–277; Langer (1982) Chem. Tech. 12: 98–105), nicht-abbaubares Ethylen-Vinylacetat, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, z.B. Lupron Depot und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133 988 ). Geeignete Mikrokapseln können auch Hydroxymethylcellulose- oder Gelatinemikrokapseln und Polymethylmethacrylat-Mikrokapseln umfassen, die durch Coazervati onstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden. Außerdem können auch Mikroemulsionen oder kolloidale Arzneimittelabgabesysteme, z.B. Liposomen und Albuminmikrokügelchen, eingesetzt werden. Siehe Remington's Pharmaceutical Sciences (18. Ausgabe; Mack Pub. Co.: Eaton, Pennsylvania, 1990). Eine derartige Formulierung mit verzögerter Freisetzung ist Depot IGF-I (Depofoam), bei der rekombinantes humanes IGF-I in multivesikuläre Liposomen eingekapselt ist, wie es in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung mit dem Titel „High and Low Load Formulations of IGF-I in Multivesicular Liposomes", U.S. Patentanmeldungs-Eingangsnummer 08/925531, eingereicht am 8. September 1997, beschrieben wird. Die mittlere Verweilzeit im Gelenk ist bei Depot IGF-I etwa zweimal länger als mit freiem IGF-I (8,4 Stunden gegenüber 4,1 Stunden). Mit „Verweilzeit" ist die Zeit gemeint, während der die Konzentration an IGF-I innerhalb des Säugers, der eine Behandlung für einen auf IGF-I ansprechenden Zustand durchmacht, ausreichend hoch über der Basislinie bleibt, um therapeutisch wirksam zu sein.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die gleichzeitige Therapie mit IGF-I und wenigstens einem GAG intermittierend erreicht. Mit „intermittierende gleichzeitige Therapie" ist ein Zeitraum einer gleichzeitigen Therapie mit IGF-I und wenigstens einem GAG, gefolgt von einem Unterbrechungszeitraum, dem dann ein weiterer Zeitraum der gleichzeitigen Therapie mit IGF-I und wenigstens einem GAG folgt usw., gemeint. Gleichzeitige Therapie, in der IGF-I und GAG in Kombination einem Säuger präsentiert werden, kann in kontinuierlicher Weise wie z.B. mit einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung erreicht werden oder kann nach einem gewünschten täglichen Dosierungsplan, wie z.B. mit einer, zwei oder drei oder mehr Injektionen pro Tag einer einzelnen pharmazeutischen Zusammensetzung, die IGF-I und wenigstens ein GAG enthält, oder von zwei getrennten pharmazeutischen Zusammensetzungen, von denen eine IGF-I enthält, die andere wenigstens ein GAG enthält, erreicht werden. Ungeachtet des Verabreichungsmodus werden IGF-I und wenigstens ein GAG in ihren entsprechenden Mengen verabreicht, die in Kombination eine gewünschte therapeutische Antwort bezüglich eines bestimmten, auf IGF-I ansprechenden Zustands begünstigen. Mit „Absetzungszeitraum" bzw. „Unterbrechungszeitraum" soll eine Unterbrechung der kontinuierlichen Verabreichung mit verzögerter Freisetzung oder der täglichen Verabreichung von IGF-I in Kombination mit wenigstens einem GAG gemeint sein. Der Unterbrechungszeitraum kann länger oder kürzer sein als der Zeitraum der kontinuierlichen Verabreichung unter verzögerter Freisetzung oder der täglichen Verabreichung. Während des Unterbrechungszeitraums werden die IGF-I- und GAG-Level im Säuger, der eine Therapie für einen auf IGF-I ansprechenden Zustand durchmacht, wesentlich niedriger sein als die maximalen Level, die während einer Therapie erreicht werden. Die bevorzugte Länge des Unterbrechungszeitraums hängt von den Mengen an IGF-I und Gesamt-GAG, die in Kombination verwendet werden, der verwendeten IGF-I-Form und dem verwendeten Verabreichungstyp ab. Wenn z.B. eine Formulierung mit verzögerter Freisetzung verwendet wird, muss der Unterbrechungszeitraum ausgedehnt werden, um die längere Verweil zeit von IGF-I in dem Säuger, der die Therapie macht, zu berücksichtigen. Alternativ kann die Verabreichungsfrequenz der wirksamen Menge der Formulierung mit verzögerter Freisetzung, die sowohl IGF-I und wenigstens ein GAG enthält, entsprechend verringert werden.
Beispielsweise könnte eine gleichzeitige Therapie mit IGF-I und wenigstens einem GAG einem intermittierenden Schema folgen, bei dem eine wirksame Menge der Kombination aus IGF-I und wenigstens einem GAG nach einem täglichen Dosierungsplan, z.B. einmal am Tag, zweimal am Tag oder dreimal oder mehrere Male am Tag, verabreicht wird, wobei der tägliche Dosierungsplan jeden Tag, alle zwei Tage, dreimal pro Woche, zweimal pro Woche, einmal pro Woche, jede zweite Woche, einmal im Monat, jeden zweiten Monat, jeden dritten Monat, zweimal im Jahr usw. in Kraft ist. Ein intermittierender Plan einer gleichzeitigen Therapie mit IGF-I und GAG kann bei einem Säuger, der eine Therapie macht, fortgesetzt werden, bis die gewünschte therapeutische Antwort bezüglich eines besonderen, auf IGF-I ansprechenden Zustands erhalten wird.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine intermittierende gleichzeitige Therapie mit IGF-I und wenigstens einem GAG zyklisch. Mit „zyklisch" ist eine intermittierende gleichzeitige Therapie gemeint, die von Pausen in der gleichzeitigen Therapie begleitet ist, wobei Zyklen im Bereich von etwa 1 Monat, bis etwa 2, 3, 4, 5 oder 6 Monaten, bevorzugter etwa 3 Monaten bis etwa 6 Monaten, liegen. Beispielsweise kann der Plan der gleichzeitigen Therapie eine intermittierende gleichzeitige Therapie mit IGF-I und wenigstens einem GAG sein, wobei eine wirksame Menge der Kombination aus IGF-I und wenigstens einem GAG einmal pro Woche über vier Wochen verabreicht wird, worauf eine Pause in der intermittierenden gleichzeitigen Therapie über einen Zeitraum von 3 Monaten folgt, worauf eine intermittierende gleichzeitige Therapie mit IGF-I und wenigstens einem GAG folgt, wobei eine wirksame Menge der Kombination aus IGF-I und wenigstens einem GAG einmal pro Woche über vier Wochen verabreicht wird, worauf eine Pause bei der intermittierenden gleichzeitigen Therapie über einen Zeitraum von drei Monaten folgt, usw. Als weiteres Beispiel kann eine wirksame Menge der Kombination der zwei Substanzen einmal pro Woche über 2 Wochen verabreicht werden, worauf eine Pause bei der intermittierenden gleichzeitigen Therapie für einen Zeitraum von einem Monat folgt, worauf dann eine Verabreichung einer wirksamen Menge der Kombination der zwei Substanzen einmal pro Woche über 2 Wochen folgt, wonach eine Pause bei der intermittierenden gleichzeitigen Therapie über einen Zeitraum von 1 Monat folgt usw. Ein zyklischer intermittierender Plan der gleichzeitigen Therapie mit IGF-I und wenigstens einem GAG kann fortgesetzt werden, bis die gewünschte therapeutische Antwort bezüglich eines bestimmten, auf IGF-I ansprechenden Zustands erreicht ist. Eine intermittierende Therapie mit IGF-I ist im U.S. Patent Nr. 5,741,776 beschrieben.
Alternativ kann eine gleichzeitige Therapie mit IGF-I und wenigstens einem GAG direkt an der Stelle mit einer Vorrichtung zur verzögerten Freisetzung oder einem Abgabesystem erreicht werden. Solche Vorrichtungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (siehe z.B. U.S. Pa tent 5206023). Beispielsweise kann eine biologisch abbaubare Matrix, die eine wirksame Menge der Kombination aus IGF-I und wenigstens einem GAG in einer Form zur verzögerten Freisetzung umfasst, einem Säuger implantiert werden. Eine solche Vorrichtung würde eine verzögerte Freisetzung einer wirksamen Menge der Kombination beider Substanzen ermöglichen. Wenn die Matrix abgebaut wird, begünstigt die wirksame Menge der Kombination aus IGF-I und wenigstens einem GAG eine gewünschte therapeutische Antwort bezüglich des bestimmten auf IGF-I ansprechenden Zustands.
Es sollte einem Fachmann klar sein, dass bezüglich der wirksamen Menge der Kombination aus IGF-I und wenigstens einem GAG und der Frequenz der Verabreichung dieser wirksamen Menge in dieser Ausführungsform der Erfindung Variationen akzeptabel sind. Ein geringes Ausmaß an Experimentieren kann erforderlich sein, um die entsprechenden Mengen an IGF-I und GAG, die in der gleichzeitigen Therapie zu verwenden sind, zu bestimmen, was im Rahmen der Fähigkeiten eines Fachmanns auf diesem Gebiet liegt, wenn der die vorliegende Erfindung kennt.
Somit kann eine Förderung einer gewünschten therapeutischen Antwort bezüglich eines bestimmten auf IGF-I ansprechenden Zustands, der einer Therapie unterliegt, über eine gleichzeitige Therapie mit IGF-I und wenigstens einem GAG erreicht werden. Außerdem sind auch Verfahren zur Manipulierung des Levels an natürlich produziertem IGF-I in Kombination mit einer gleichzeitigen Therapie mit IGF-I und GAG von der vorliegenden Erfindung mit umfasst. Somit könnte der Level an natürlich produziertem IGF-I zusätzlich zu einer gleichzeitigen Verabreichung wenigstens eines GAG allein oder in Kombination mit IGF-I genetisch manipuliert sein.
Das Interesse an der Gentherapie als Mittel zur Behandlung vererbter oder erworbener Krankheiten hat zur Entwicklung von Verfahren zur Übertragung genetischer Information, insbesondere der Abgabe von Nucleotidsequenzen, die humane Gene codieren, unter Verwendung Virus-vermittelter Gentransfersysteme geführt. Solche Virus-vermittelten Gentransfersysteme ermöglichen die Abgabe gewünschter genetischer Information, in diesem Falle eine Nucleotidsequenz, die für IGF-I codiert, an eine ausgewählte Zelle oder ein ausgewähltes Gewebe und ihre anschließende Expression dort unter der Steuerung eines viralen Promotors. Virus-vermittelte Gentransfersysteme bzw. Genübertragungssysteme sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. U.S. Patent Nr. 5,707,618; 5,714,343; und 5,672,344. Auf diese Weise können Erhöhungen bei der Menge an IGF-I teilweise in vivo durch Erhöhung der Produktion an IGF-I erreicht werden.
Die Wirksamkeit einer bestimmten Menge der Kombination aus IGF-I und wenigstens einem GAG und der beste Verabreichungsmodus können gemäß ihrer Fähigkeit, die gewünschte therapeutische Antwort bezüglich des bestimmten auf IGF-I ansprechenden Zustands, der einer Therapie unterliegt, gemessen werden.
Die folgenden Beispiele werden lediglich zur Erläuterung und keineswegs zur Beschränkung aufgeführt.
EXPERIMENTELLES
Die folgenden Beispiele erläutern die Wirksamkeit der Verwendung sowohl von IGF-I als auch wenigstens einem Glycosaminoglycan als Therapie für eine neurodegenerative Störung.
Beispiel 1
Verfahren
Diese pharmakologische Untersuchung wurde unter Verwendung von Wobbler-Mäusen, einem genetischen Tiermodell für ALS (amyotrophe Lateralsklerose), das durch einen frühen Verlust von Motorneuronen und eine verminderte Vorderbein-Muskelfunktion charakterisiert ist, durchgeführt.
Heterozygote Wobbler-Mäuse wurden unter Standard-Haltungsbedingungen (22 ± 2°C, 65% Feuchtigkeit, künstliches Licht von 06.00–20.00 h) gezüchtet. Während des Experiments waren ein Standard-Trockenfutter und Wasser ad libitum verfügbar. Alle experimentellen Protokolle waren von Review Committee of the Department of Pharmacology zugelassen und erfüllten die italienischen Richtlinien für Labortiere, die mit the European Communities Directive of November 1986 (86/609/EEC) konform sind.
Nach klarer Diagnose im Alter von drei Wochen wurden homozygote Tiere statistisch fünf Behandlungsgruppen zugeteilt, die jeweils die folgenden täglichen Dosen durch subkutane Injektion erhielten:

–– Vehikel (Kochsalzlösung)
–– rhIGF-I (20 μg/kg)
–– rhIGF-I (1 mg/kg)
–– GAGs (1 mg/kg)
–– rhIGF-I (20 μg/kg) + GAGs (1 mg/kg)

Das humane IGF-I wurde rekombinant in E. coli produziert und von einem Lieferanten (INALCO (Mailand, Italien), ein Handelsvertreter von PeproTech., Inc. (Princeton Business Park, Rock Hill, New Jersey), Katalog Nr. 100-11) nur zu Forschungszwecken erhalten. GAGs waren Bestandteile des folgenden Gemisches:

–– Sich langsam bewegendes Heparin 19,6%

–– Sich schnell bewegendes Heparin 44,9%

–– Dermatansulfat 28,8%

–– Chondroitinsulfat A und C 6,7%
Resultate und Diskussion
Tabelle 1 zeigt die Zahl der Triceps-Motorneuronen, die in Wobbler-Mäusen mit einem Alter von 9 Wochen überlebten, wie sie durch retrograde Markierung von Meerrettichperoxidase bestimmt wurden, wie es von Baulac et al. (1983) Neurosci. Letters 37: 99–104 beschrieben worden war. Die Anzahl von Triceps-Motorneuronen im Alter von 3 Wochen war 160–180.
Tabelle 2 zeigt das Mäusekörpergewicht (Gramm) im Alter von 9 Wochen und das durchschnittliche wöchentliche Körpergewichtswachstum (Δ/Woche).
Tabelle 3 zeigt die Grifffestigkeit (g) bei Wobbler-Mäusen, die bestimmt wurde, wie es bei Mitsumoto et al. (1994) Ann. Neurol. 36: 142–148 beschrieben ist.
Tabelle 4 zeigt die Haltezeit (s) bei Wobbler-Mäusen, wie sie mit dem von Mitsumoto et al. (1994) Ann. Neurol. 36: 142–148 beschriebenen Verfahren beurteilt wurde.
Tabelle 5 beschreibt die mittlere Zeit (s), die zur Überwindung einer 10 cm-Strecke benötigt wird, was gemäß Mitsumoto et al. (1994) Ann. Neurol. 36: 142–148 bestimmt wurde.
Zusätzlich zu den in den Tabellen 1–5 angegebenen Daten zeigt 1 die histometrische Analyse der Bizepsmuskelfasergröße, ausgedrückt als %-Wert der Gesamtfaserzahl, die in einem bestimmten Bereich von Muskelfaserbereichen gemessen wurde und vorliegt. Zum Vergleich ist auch die Bizepsfasergrößenverteilung der Heterozygoten gezeigt, die die Krankheit nicht entwickeln. Die rhIGF-I + GAGs-Behandlung verhinderte eine Bizepsmuskelfaseratrophie, so dass eine Größenverteilung ähnlich der von Bizepsmuskeln aus Heterozygoten erhalten wird.
Alle Parameter, die wir untersucht haben, zeigen, dass die pharmazeutische Zusammensetzung aus rhIGF-I und GAG bei der Begünstigung erwünschter therapeutischer Behandlungseffekte im Tiermodell von ALS und SMA (spinale Muskelatrophie) überraschend wirksam ist. Es ist besonders bemerkenswert, dass die Behandlung von Wobbler-Mäusen mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung die Blockade von Motorneuronentod ermöglicht, was durch die Daten von Tabelle 1 deutlich gezeigt wird. Ein derartiger Effekt kann durch eine einzelne Verabreichung von rhIGF-I allein oder GAGs allein nicht erzielt werden. Außerdem ermöglichen diese Zusammensetzungen eine Behandlung mit niedrigeren Dosen an rhIGF-I, wodurch mögliche unerwünschte Nebenwirkungen vermieden werden.
Beispiel 2
Verfahren
Eine Motorneuronenkrankheit (MND) ist eine autosomale dominante neurologische Erkrankung, die bei C57b1/6-Mäusen beiderlei Geschlechts auftritt (Messer et al. (1992) Genomics 18: 797–802). Diese Mäuse entwickeln motorische Abnormalitäten, zuerst in den Hinterbeinen, dann zeigen die Tiere eine stark reduzierte spontane Bewegung und sterben, bevor sie 1 Jahr alt sind. Da die Tiere eine reduzierte Mobilität aufweisen, wurde die Krankheit als Modell für ALS vorgeschlagen (Messer et al. (1993) Neuromusc. Disorder 3: 129–134). Die Anzahl der überlebenden Motorneuronen und die isometrische Spannung, die durch die peronealen Muskeln nach 10 Monaten Leben entwickelt wurde, wurden unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Behandlungsgruppen mit wenigstens 6 Mäusen pro Versuchsgruppe beurteilt. Die folgenden täglichen Dosen wurden subkutan ab 120 Lebenstagen bis zum Tod injiziert: rhIGF-I mit 20 μg/kg oder 1 mg/kg; GAGs mit 1 mg/kg; und GAGs mit 1 mg/kg + rhIGF-I mit 20 μg/kg. Isometrische Spannung wurde in vitro unter Verwendung des Ischiadikus-peronealen Muskels als seziertes Präparat beurteilt, wie es früher beschrieben worden war (Gorio et al. (1997) Eur. J. Neurosci. 9: 1748–1753).
Resultate und Diskussion
Bei MND-Mäusen gab es nur einen geringen nicht-signifikanten Verlust an Motorneuronen und es wurde keine Wirkung der Arzneimittelbehandlungen beobachtet.
Allerdings war die Wirkung der Arzneimittelbehandlung für die isometrische Spannung deutlich. Die peroneale Muskelspannung nach Stimulation des Ischiadikus mit 1 Hertz oder 50 Hertz war wie in Tabelle 6 gezeigt:
Diese Daten legen eine höhere Stärke der peronealen Nerven-Muskel-Präparation von MND-Mäusen nach einer beliebigen der angewendeten Behandlungen nahe. Allerdings bewirkte die Hochfrequenz-Nervenstimulation (50 Hertz), die normalerweise eine höhere (titanische) Spannung im Muskel normaler Tiere verursacht, einen Verlust der Festigkeit bzw. Kraft bei den nicht-behandelten MND-Tieren (Vehikelgruppe). Mit anderen Worten, Muskeln von MND-Mäusen ermüden unverzüglich. Eine solche Abnahme war bei einzeln behandelten (rhIGF-I oder GAGs)-MND-Mäusen deutlich kleiner, wurde aber vollständig durch die Co-Behandlung mit rhIGF-I und GAGs verhindert. Diese Daten legen nahe, dass eine Co-Behandlung den Abfall der neuromuskulären Funktion bei MND-Mäusen verhindert. Diese Schlussfolgerung wird durch das Fehlen von Motorneuronenverlust bei dieser Krankheit diktiert.
Obgleich die vorstehende Erfindung detailliert durch Erläuterungen und Beispiele zum Zwecke der Klarheit und des Verständnisses beschrieben wurde, wird klar sein, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen innerhalb des Rahmens der beigefügten Ansprüche erfolgen können.
Alle in der Beschreibung genannten Publikationen und Patentanmeldungen sind für den Level des Fachmanns auf dem Gebiet, das die vorliegende Erfindung betrifft, Indikativ.

Claims

Verwendung von IGF-I oder einer Variante davon, die biologische IGF-I-Aktivität hat und sich von der Aminosäuresequenz von IGF-I um 10 Aminosäuren oder weniger unterscheidet, in Kombination mit wenigstens einem Glycosaminoglycan bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines auf IGF-I ansprechenden Zustands bei einem Säuger, ausgewählt aus neurodegenerativen Störungen, chronischer Lungenkrankheit, akuter oder chronischer Nierenerkrankung, akutem oder chronischem Leberversagen, Leberzirrhose, ischämischer Verletzung von Herz, Leber oder Gehirn, Wundheilung und Organabstoßung nach Transplantation, wobei eine gleichzeitige Therapie unter Verwendung der Kombination eine gewünschte therapeutische Reaktion bezüglich des auf IGF-I ansprechenden Zustands begünstigt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Säuger ein Mensch ist und wobei humaner IGF-I bei der Herstellung des Medikaments eingesetzt wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die gewünschte therapeutische Reaktion stärker ist als eine Reaktion, die mit dem IGF-I oder einer Variante davon allein oder dem Glycosaminoglycan allein beobachtet würde.
Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die gleichzeitige Therapie eine Verabreichung des IGF-I oder einer Variante davon und des Glycosaminoglycans zusammen in einer einzigen pharmazeutischen Zusammensetzung an den Säuger umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die gleichzeitige Therapie Verabreichung des IGF-I oder einer Variante davon und des Glycosaminoglycans in zwei getrennten pharmazeutischen Zusammensetzungen an den Säuger umfasst, wobei eine der Zusammensetzungen den IGF-I oder eine Variante davon umfasst, und wobei die andere der Zusammensetzungen das Glycosaminoglycan umfasst.
Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, wobei das Glycosaminoglycan Heparin mit 35 000 bis 45 000 D, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat C oder Heparansulfat ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der auf IGF-I ansprechende Zustand eine neurodegenerative Störung ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die neurodegenerative Störung eine Motoneuronen-Krankheit, Multiple Sklerose, Muskeldystrophie, diabetische Neuropathie, demyelinisierende periphere Neuropathien, Parkinsonerkrankung, Alzheimererkrankung oder eine Folge traumatischer Rückenmarksläsionen ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Menge an IGF-I oder einer Variante davon, die verabreicht wird, etwa 5 μg/kg/Dosis bis etwa 30 μg/kg/Dosis ist und die verabreichte Menge an Glycosaminoglycan etwa 0,1 mg/kg/Dosis bis etwa 5 mg/kg/Dosis ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Verhältnis von Glycosaminoglycan zu IGF-I oder einer Variante davon etwa 50:1 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die IGF-I oder eine Variante davon, die biologische IGF-I-Aktivität hat und sich von der Aminosäuresequenz von IGF-I um 10 Aminosäuren oder weniger unterscheidet, und wenigstens ein Glycosaminoglycan umfasst, wobei der IGF-I oder die Variante davon und das Glycosaminoglycan in Mengen vorliegen, die in Kombination eine gewünschte therapeutische Reaktion bezüglich eines auf IGF-I ansprechenden Zustandes begünstigen, wenn diese einem Säuger verabreicht wird, der eine Therapie für diesen auf IGF-I ansprechenden Zustand durchmacht, wobei der auf IGF-I ansprechende Zustand aus neurodegenerativen Störungen, chronischer Lungenkrankheit, akuter oder chronischer Nierenstörung, akutem oder chronischem Leberversagen, Leberzirrhose, ischämischer Verletzung von Herz, Leber oder Gehirn, Wundheilung und Organabstoßung nach Transplantation ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei der IGF-I oder eine Variante davon in einer Konzentration von etwa 15 μg/l bis etwa 2 000 μg/ml vorliegt und das Glycosaminoglycan in einer Konzentration von etwa 0,3 mg/ml bis etwa 350 mg/ml vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 12, wobei der IGF-I humaner IGF-I ist.