UA72427C2

UA72427C2 - Water-soluble insulin preparation containing mannite, method for manufacturing composition containing soluble insulin or crystalline insulin

Info

Publication number: UA72427C2
Application number: UA98126687A
Authority: UA
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1996-06-20
Filing date: 1997-06-19
Publication date: 2005-03-15
Also published as: ZA975469B; RU2204411C2

Abstract

Insulin preparations of superior physical stability, comprising dissolved and/or precipitated human insulin or an analogue or derivative thereof, and a water-soluble reduced or non-reducing carbohydrate containing at least 4 carbon atoms in the main carbohydrate structure, or a water-soluble non-reducing ester and/or ether derivative of a carbohydrate or reduced carbohydrate containing at least 4 carbon atoms in the main carbohydrate structure, or mixtures thereof are disclosed.

Description

Даний винахід стосується водних інсулінових композицій, що містять інсулін людини, або його аналог, або похідну, ці композиції мають надзвичайну фізичну стабільність. Крім того, винахід стосується композицій для парентерального призначення, які включають такі інсулінові композиції, та способу поліпшення фізичної стабільності інсулінових препаратів.The present invention relates to aqueous insulin compositions containing human insulin, or its analog, or derivative, these compositions have extraordinary physical stability. In addition, the invention relates to compositions for parenteral administration, which include such insulin compositions, and to a method of improving the physical stability of insulin preparations.

Діабет - загальний термін, який позначає порушення у людини, що має надмірне виділення сечі, як при цукровому, так і нецукровому діабеті. Цукровий діабет є метаболічним порушенням, при якому повністю або частково втрачається здатність до засвоєння глюкози. Від діабету страждають близько 295 усіх людей.Diabetes is a general term that refers to a disorder in a person with excessive urine output, both in diabetes mellitus and indiabetes. Diabetes mellitus is a metabolic disorder in which the ability to assimilate glucose is completely or partially lost. About 295% of all people suffer from diabetes.

З часу першого введення інсуліну у 1920-х роках постійно робляться кроки у напрямку поліпшення лікування цукрового діабету. Щоб запобігти виникнення критичного рівня глікемії пацієнти-діабетики часто практикують багаторазові ін'єкції, при яких при кожному вживанні їжі вводиться інсулін.Since the first introduction of insulin in the 1920s, continuous steps have been taken to improve the treatment of diabetes. To prevent the occurrence of a critical level of glycemia, diabetic patients often practice multiple injections, in which insulin is administered with each meal.

Для лікування цукрового діабету пропонують і застосовують багато різноманітних інсулінових препаратів, таких як звичайний інсулін, інсулін Зетііепіеб), ізофановий інсулін, інсуліно-цинкові суспензії, протаміно- цинковий інсулін та інсулін ОйгаіепіеФ. Оскільки пацієнти-діабетики лікуються інсуліном протягом кількох десятиліть, існує велика потреба в інсулінових препаратах, які були б безпечними та якісними. Деякі з наявних у торгівлі інсулінових препаратів характеризуються швидким початком дії, інші композиції починають діяти відносно пізно, але виявляють більш або менш тривалу дію. Інсулінові композиції, що діють швидко, зазвичай являють собою розчини інсуліну, тоді як інсулінові композиції, що діють із затримкою, можуть бути суспензіями, що містять інсулін у кристалічній та/або аморфній формі, осаджений через додавання тільки солей, або через додавання протаміну, або комбінації того й іншого. Крім того, деякі пацієнти використовують композиції, які і починають швидко діяти, і мають більш тривалу дію. Таким препаратом може бути розчин інсуліну, у якому суспендовані кристали протамінового інсуліну. Деякі пацієнти самі приготовляють готовий препарат шляхом перемішування розчину інсуліну з суспензійним препаратом у співвідношенні, потрібному для даного пацієнта.Many different insulin preparations are offered and used for the treatment of diabetes, such as regular insulin, insulin Zetiepieb), isophane insulin, insulin-zinc suspensions, protamino-zinc insulin, and insulin OigaipieF. Since diabetic patients have been treated with insulin for several decades, there is a great need for insulin preparations that are safe and of good quality. Some of the commercially available insulin preparations are characterized by a rapid onset of action, other compositions begin to act relatively late, but have a more or less long-lasting effect. Rapid-acting insulin compositions are usually insulin solutions, while delayed-acting insulin compositions may be suspensions containing insulin in crystalline and/or amorphous form, precipitated by the addition of salts alone, or by the addition of protamine, or combinations of both. In addition, some patients use compositions that both begin to act quickly and have a longer effect. Such a drug can be an insulin solution in which protamine insulin crystals are suspended. Some patients themselves prepare a ready-made drug by mixing an insulin solution with a suspension drug in the ratio required for a given patient.

Як правило, інсулінові композиції вводять шляхом підшкірної ін'єкції. Для пацієнта важливим є графік дії інсулінового препарату, який відображає дію інсуліну на метаболізм глюкози як функцію часу з моменту ін'єкції. У цьому графіку, крім інших даних, важливе значення мають час початку дії, максимальне значення та загальна тривалість дії. Пацієнти потребують різних інсулінових препаратів з різними графіками дії. Один пацієнт може в один і той же день використовувати інсулінові композиції з дуже різними графіками дії.As a rule, insulin compositions are administered by subcutaneous injection. For the patient, the action schedule of the insulin drug is important, which reflects the effect of insulin on glucose metabolism as a function of time from the moment of injection. In this graph, among other data, the start time of the action, the maximum value and the total duration of the action are important. Patients require different insulin preparations with different schedules of action. One patient can use insulin compositions with very different schedules of action on the same day.

Потрібний графік дії залежить, наприклад, від години дня, кількості та складу будь-якої їжі, спожитої пацієнтом.The required schedule of action depends, for example, on the time of day, the amount and composition of any food consumed by the patient.

Однак, так само важливою є фізична стабільність інсулінових препаратів з причини широкого використання шприців типу "авторучка" для ін'єкцій, таких як пристрої, що містять картриджі Реп, у яких інсуліновий препарат зберігається до повного спорожнення картриджу. Це може тривати щонайменше 1 -2 тижні для пристроїв місткістю 1,5-3,0 мл.However, the physical stability of insulin preparations is also important due to the widespread use of pen-type syringes for injections, such as devices containing Rep cartridges, in which the insulin preparation is stored until the cartridge is completely empty. This can take at least 1-2 weeks for 1.5-3.0ml capacity devices.

Перша стабільна нейтральна інсулінова суспензія була розроблена Скоттом та Фішером (9. Рпаптасої.The first stable neutral insulin suspension was developed by Scott and Fisher (9. Rpaptasoi.

Ехр. Тег. 58 (1936), 78), які виявили, що присутність надлишку протаміну та цинкової солі (2 мкг цинку на міжнародну одиницю інсуліну) може стабілізувати протаміно-інсуліновий препарат, описаний у роботіEx. Tag. 58 (1936), 78), who found that the presence of an excess of protamine and a zinc salt (2 μg of zinc per international unit of insulin) could stabilize the protamine-insulin preparation described in

Надедотт е! а/!.: У.Ат.Меа.Авзп. 106(1936), 177-180.It's over! a/!.: U.At.Mea.Avzp. 106(1936), 177-180.

Протаміно-цинковий інсулін, виготовлений згідно з американською або європейськими фармакопеями містить аморфний протаміно-цинковий інсулін, а також кристалічний протаміно-цинковий інсулін. Щойно виготовлений протаміно-цинковий інсулін містить здебільшого аморфний осад, який при зберіганні частково трансформується у кристалічні частинки, що веде до більш тривалої дії.Protamino-zinc insulin manufactured according to the American or European pharmacopoeias contains amorphous protamino-zinc insulin, as well as crystalline protamino-zinc insulin. Freshly produced protamino-zinc insulin contains mostly an amorphous precipitate, which partially transforms into crystalline particles during storage, leading to a longer duration of action.

Повністю кристалічний різновид протаміно-цинкового інсуліну, що має назву МРН-інсулін або Ізофановий інсулін, був розроблений Крайєнбюлем та Розенбергом (Ктауеприй! апа Розепрего) (див. Вер. бієпо Мет.A completely crystalline variety of protamino-zinc insulin, called MRN-insulin or Isophane insulin, was developed by Kraienbuhl and Rosenberg (Ktauepriy! apa Roseprego) (see Ver. biepo Met.

Нозр. Мога. Іпзиїпіаб. 1 (1946), 60 та Датський патент Ме 64 708). Вони виявили, що інсулін разом з протаміном в ізофанових пропорціях при нейтральному рівні рН у присутності невеликої кількості цинку та фенолу або похідних фенолу або, краще, м-крезолу, утворює аморфний осад, який при відстоюванні поступово але повністю трансформується у видовжені чотирикутні кристали, обмежені на кінцях пірамідальними торцями.Nozr. I can Ipsiipiab. 1 (1946), 60 and Danish patent Me 64 708). They found that insulin together with protamine in isophane proportions at neutral pH in the presence of a small amount of zinc and phenol or derivatives of phenol or, better, m-cresol, forms an amorphous precipitate, which on settling is gradually but completely transformed into elongated tetragonal crystals, limited at the ends with pyramidal ends.

Інсулін та протамін лосося спільно кристалізуються у ваговому співвідношенні приблизно 0,09 мг протамінсульфату на 1 мг інсуліну. Для приготування чотирикутних кристалів необхідними є цинк у кількості принаймні 0,15 мкг на ІШ та фенольна сполука у концентрації понад 0,195.Insulin and salmon protamine co-crystallize in a weight ratio of approximately 0.09 mg of protamine sulfate per 1 mg of insulin. Zinc in the amount of at least 0.15 μg per IS and a phenolic compound in a concentration of more than 0.195 are necessary for the preparation of tetragonal crystals.

Раніше кристали такого типу приготовляли з використанням інсуліну свині та великої рогатої худоби з натуральних джерел, але з вісімдесятих років використовують також інсулін людини, вироблений шляхом генної інженерії або напівсинтезу.Previously, crystals of this type were prepared using pig and cattle insulin from natural sources, but since the eighties, human insulin produced by genetic engineering or semi-synthesis has also been used.

Інсулін людини складається з двох поліпептидних ланцюгів, так званих ланцюгів А та В, які містять відповідно 21 та 30 амінокислот. Ланцюги А та В з'єднані між собою двома цистиндисульфідними мостами.Human insulin consists of two polypeptide chains, the so-called chains A and B, which contain 21 and 30 amino acids, respectively. Chains A and B are connected by two cystine disulfide bridges.

Більшість інших видів інсуліну має подібну будову, але може не містити у відповідних позиціях ланцюгів таких самих амінокислот, як в інсуліні людини.Most other types of insulin have a similar structure, but may not contain the same amino acids in the corresponding chain positions as in human insulin.

Розвиток процесу, відомого як генна інженерія, зробив можливим легке приготування найрізноманітніших інсулінових сполук, аналогічних інсуліну людини. У цих аналогах інсуліну одна або кілька амінокислот заміщені іншими амінокислотами, які можуть бути кодовані нуклеотидними послідовностями. Оскільки інсулін людини, як зазначено вище, містить 51 амінокислотний залишок, зрозуміло, що може існувати велика кількість аналогів інсуліну, Її фактично було виготовлено велику кількість різних аналогів з цікавими властивостями. У розчинах інсуліну людини з потрібною концентрацією для приготування препаратів для ін'єкцій молекула інсуліну присутня в асоційованій формі як гексамер (Вгапде еї а!. Оіареїез Саге 13, (1990), 923 - 954). Після підшкірної ін'єкції швидкість абсорбції потоком крові має залежати від розміру молекули, і було виявлено, що аналоги інсуліну з амінокислотними замінами, які протидіють утворенню цього гексамеру або інгібують це утворення, мають надзвичайно швидкий початок дії (Вгапде еї а)ї.: Ірід). Цей факт є дуже важливим з терапевтичної точки зору для пацієнта-діабетика. У кристалах протаміно-інсулінових препаратів тривалої дії інсулін також виявлено у формі гексамеру (ВаІзсптіаї єї а!.: Ада Спгузі В47,(1991), 975 - 986).The development of a process known as genetic engineering has made possible the easy preparation of a wide variety of insulin compounds similar to human insulin. In these insulin analogs, one or more amino acids are replaced by other amino acids that can be encoded by nucleotide sequences. Since human insulin, as stated above, contains 51 amino acid residues, it is clear that a large number of insulin analogs can exist. In fact, a large number of different analogs with interesting properties have been produced. In solutions of human insulin with the required concentration for the preparation of preparations for injections, the insulin molecule is present in an associated form as a hexamer (Vgapde ei a!. Oiareyez Sage 13, (1990), 923 - 954). After subcutaneous injection, the rate of absorption into the bloodstream should depend on the size of the molecule, and insulin analogs with amino acid substitutions that counteract or inhibit the formation of this hexamer have been found to have an extremely rapid onset of action (Vgapde ei a)i.: Irid ). This fact is very important from a therapeutic point of view for a diabetic patient. In the crystals of long-acting protamino-insulin preparations, insulin was also found in the form of a hexamer (VaIzsptiai eyi a!.: Ada Spguzi B47, (1991), 975 - 986).

Фармацевтичні композиції, в основі яких лежать аналоги інсуліну людини, відомі, наприклад, з таких документів:Pharmaceutical compositions based on human insulin analogs are known, for example, from the following documents:

МО 95/00550 стосується фармацевтичних препаратів на основі кристалів інсуліну, які містять Авре28 інсулін та протамін, які мають швидкий початок дії та тривалу активність при введенні іп мімо. Кристали можуть, крім того, містити іони цинку та фенол та/або м-крезол. Як ізотонічний агент до препаратів додають гліцерин.MO 95/00550 relates to pharmaceutical preparations based on insulin crystals containing Avre28 insulin and protamine, which have a rapid onset of action and prolonged activity when administered ip mimo. The crystals may, in addition, contain zinc ions and phenol and/or m-cresol. Glycerin is added to the preparations as an isotonic agent.

У Патенті США Мо 5 461 031 описуються різні фармацевтичні композиції для парентерального введення, які включають швидкодіючий мономерний аналог інсуліну, цинк, протамін та похідну фенольної сполуки. Ці сполуки, до того ж, містять гліцерин, який діє як ізотонічний агент.US Patent No. 5,461,031 describes various pharmaceutical compositions for parenteral administration that include a fast-acting monomeric insulin analog, zinc, protamine, and a phenolic compound derivative. These compounds, in addition, contain glycerin, which acts as an isotonic agent.

У Патенті США Мо 5 474 978 описано швидкодіючу сполуку для парентерального введення, яка включає гексамерний комплекс аналогу інсуліну людини, що складається з шести мономерних аналогів інсуліну, іонів цинку та принаймні трьох молекул похідної фенольної сполуки. Оптимальним ізотонічним агентом є гліцерин.US Patent No. 5,474,978 describes a fast-acting compound for parenteral administration that includes a human insulin analog hexameric complex consisting of six monomeric insulin analogs, zinc ions, and at least three molecules of a phenolic compound derivative. The optimal isotonic agent is glycerin.

На жаль, інсулін має схильність до утворення нерозчинних біологічно неактивних фібрил через нековалентну полімеризацію (пор., наприклад, деп5 Вгапде, Саїєпісв ої Іпвийп, Зрііпдег/-Мепад, 1987 та посилання, що містяться у цій роботі). Утворенню фібрил сприяє підвищена температура, наприклад, понад 30"С, та супровідні рухи. Цей процес фібриляції, якого дуже важко уникнути, обмежує період, протягом якого може зберігатися інсуліновий препарат, а, отже, й об'єм картриджу РепійїЇ5Ф).Unfortunately, insulin has a propensity to form insoluble, biologically inactive fibrils through noncovalent polymerization (cf., e.g., dep5 Vgapde, Saiepisvoi Ipvyip, Zriipdeg/-Mepad, 1987 and references contained herein). The formation of fibrils is facilitated by elevated temperature, for example, above 30"C, and the accompanying movements. This process of fibrillation, which is very difficult to avoid, limits the period during which the insulin preparation can be stored, and therefore the volume of the cartridge (Repiyi5F).

Оскільки утворення фібрил в цілому вимагає мономеризації інсуліну, аналоги інсуліну, які не так легко утворюють ди- та гексамери, в результаті дають композиції, що мають меншу фізичну стабільність, зумовлену фібриляцією.Since the formation of fibrils generally requires monomerization of insulin, insulin analogs that do not readily form di- and hexamers result in compositions that have less physical stability due to fibrillation.

Таким чином, задачею даного винаходу є створення інсулінового препарату, який включає інсулін людини, або його аналог, або похідну з поліпшеною фізичною стабільністю.Thus, the task of this invention is to create an insulin preparation that includes human insulin, or its analog, or a derivative with improved physical stability.

Згідно з винаходом, ця задача досягається шляхом створення водного інсулінового препарату, який включає розчинений та/або осаджений інсулін людини, або його аналог, або похідну та розчинний у воді відновлений або невідновлюючий вуглевод, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній структурі, або розчинну у воді невідновлюючу естерну та/або ефірну похідну вуглеводу або відновленого вуглеводу, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній структурі, або їхню суміш. фіг. 1 є фотомікрографією (х1000 збільшення) сполуки даного винаходу, яка включає кристали Аврег8 інсулін-протаміну людини та маніт.According to the invention, this task is achieved by creating an aqueous insulin preparation that includes dissolved and/or precipitated human insulin, or its analogue, or a derivative and water-soluble reduced or non-reduced carbohydrate containing at least 4 carbon atoms in the main carbohydrate structure, or a water-soluble non-reducing ester and/or ether derivative of a carbohydrate or a reduced carbohydrate containing at least 4 carbon atoms in the main carbohydrate structure, or a mixture thereof. fig. 1 is a photomicrograph (x1000 magnification) of a compound of the present invention that includes Avreg8 crystals of human insulin-protamine and mannitol.

Фіг. 2 є фотомікрографією (х1000 збільшення) сполуки даного винаходу, яка включає кристали інсулін- протаміну людини та маніт.Fig. 2 is a photomicrograph (x1000 magnification) of a compound of the present invention that includes crystals of human insulin-protamine and mannitol.

Фіг. З є графіком дії препарату даного винаходу, що містить як розчинений, так і кристалічний Авр28 інсулін людини та препарат, що містить як розчинений, так і кристалічний інсулін людини. Обидва композиції, до того ж, містять маніт. Графік представляє реакцію глюкози крові після ін'єкції у свиней. З Фігури видно, що у високостабільного препарату Азре28 інсуліну людини зберігається швидкий початок дії.Fig. C is a graph of the action of a preparation of the present invention containing both dissolved and crystalline Avr28 human insulin and a preparation containing both dissolved and crystalline human insulin. Both compositions also contain mannitol. The graph represents the blood glucose response after injection in pigs. It can be seen from the Figure that the highly stable drug Azre28 of human insulin has a quick onset of action.

ВизначенняDefinition

Використовуваний нами термін "аналог інсуліну людини" означає інсулін людини, у якому одну або кілька амінокислот видалено та/або заміщено іншими амінокислотами, включаючи амінокислоти, що не кодуються, або інсулін людини, який включає додаткові амінокислоти, тобто більше, ніж 51 амінокислоту.As we use the term "human insulin analog," we mean human insulin in which one or more amino acids have been deleted and/or replaced by other amino acids, including noncoding amino acids, or human insulin that includes additional amino acids, i.e., more than 51 amino acids.

Використовуваний нами термін "похідна інсуліну людини" означає інсулін людини або його аналог, у якому принаймні один органічний замісник є зв'язаним з однією або кількома амінокислотами.As we use the term "human insulin derivative" means human insulin or its analog in which at least one organic substituent is linked to one or more amino acids.

У даному контексті термін "розчинний у воді" відповідає розчинності у воді приблизно принаймні 10 ммоль/л, краще - принаймні 50 ммоль/л, при температурі 2076.In this context, the term "water soluble" corresponds to a solubility in water of about at least 10 mmol/L, preferably at least 50 mmol/L, at a temperature of 2076.

Терміни "вуглевод", "відновлений вуглевод", "моносахарид", "дисахарид" та "естерні або ефірні похідні" таких сполук використовуються згідно з настановою К. А. депзеп, "Сгипагіав аг аєп огдапізКе Кеті, АІтеп КетіThe terms "carbohydrate", "reduced carbohydrate", "monosaccharide", "disaccharide" and "ester or ether derivatives" of such compounds are used according to the guidelines of K. A. depzep, "Sgypagiav ag ayep ogdapizKe Keti, AItep Keti

ІЙ, 1. Ед,, ди. С)іеПегире пад, 1969, рр. 299-316.II, 1. Ed,, di. S)iePegire pad, 1969, pp. 299-316.

У даному контексті вираз "невідновлюючий вуглевод" означає вуглевод, який є практично нездатним реагувати з амінними групами інсуліну у препаратах даного винаходу для утворення глікованого інсуліну. Це визначення включає вуглеводи, у яких карбонільнай(ї) група(и) є неактивованою(ими) або блокованою(ими), наприклад, через утворення ангідриду або похідної.In this context, the expression "non-reducing carbohydrate" means a carbohydrate that is practically incapable of reacting with the amine groups of insulin in the preparations of this invention to form glycated insulin. This definition includes carbohydrates in which the carbonyl group(s) is unactivated or blocked, for example through the formation of an anhydride or derivative.

В одному з аспектів даний винахід стосується водного інсулінового препарату, який включає: розчинений та/або осаджений інсулін людини або його аналог та/або похідну та 100 - 400 мМ, краще - 150 - 250 мМ, ще краще - 180 - 230 мМ, розчинного у воді відновленого або невідновлюючого вуглеводу, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній структурі, або розчинну у воді невідновлюючу естерну та/або ефірну похідну вуглеводу або відновленого вуглеводу, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній структурі, або їхню суміш.In one of the aspects, the present invention relates to an aqueous insulin preparation, which includes: dissolved and/or precipitated human insulin or its analog and/or derivative and 100-400 mM, better - 150-250 mM, even better - 180-230 mM, of soluble in water of a reduced or non-reducing carbohydrate containing at least 4 carbon atoms in the main carbohydrate structure, or a water-soluble non-reducing ester and/or ether derivative of a carbohydrate or reduced carbohydrate containing at least 4 carbon atoms in the main carbohydrate structure, or a mixture thereof.

В іншому аспекті даний винахід стосується водного інсулінового препарату, який включає: як розчинений, так і осаджений інсулін людини або його аналог та/або похідну та розчинний у воді відновлений або невідновлюючий вуглевод, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній структурі, або розчинну у воді невідновлюючу естерну або ефірну похідну вуглеводу або відновленого вуглеводу, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній структурі, або їхню суміш.In another aspect, the present invention relates to an aqueous insulin preparation comprising: both dissolved and precipitated human insulin or an analog thereof and/or a derivative and a water-soluble reduced or non-reduced carbohydrate containing at least 4 carbon atoms in the main carbohydrate structure, or a soluble in water, a non-reducing ester or ether derivative of a carbohydrate or a reduced carbohydrate containing at least 4 carbon atoms in the main carbohydrate structure, or a mixture thereof.

В іще одному аспекті даний винахід стосується водного препарату аналога інсуліну, який включає: розчинений та/або осаджений аналог інсуліну людини та розчинний у воді відновлений або невідновлюючий вуглевод, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній структурі, або розчинну у воді невідновлюючу естерну та/або ефірну похідну вуглеводу або відновленого вуглеводу, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній структурі, або їхню суміш.In yet another aspect, the present invention relates to an aqueous preparation of an insulin analog comprising: a dissolved and/or precipitated human insulin analog and a water-soluble reduced or non-reducing carbohydrate containing at least 4 carbon atoms in the main carbohydrate structure, or a water-soluble non-reducing ester and /or an ether derivative of a carbohydrate or a reduced carbohydrate containing at least 4 carbon atoms in the main carbohydrate structure, or a mixture thereof.

Вуглевод або вуглеводна похідна, використовувані в інсуліновому препараті даного винаходу в оптимальному варіанті містить від 5 до 18 атомів вуглецю у головній вуглеводній структурі і вибирається з3- поміж таких сполук: ї) моносахариди, вибрані з групи невідновлюючих альдоз або кетоз, краще - невідновлюючих альдотетроз, кетотетроз, альдопентоз, кетопентоз, альдогексоз та кетогексоз, ще краще - невідновлюючих альдопентоз, кетопентоз, альдогексоз та кетогексоз; ії) відновлені моносахариди, тобто, багатоатомні спирти, такі, як альдити, краще "вибрані з групи, що складається з відновлених форм альдотетроз, кетотетроз, альдопентоз, кетопентоз, альдогексоз та кетогексоз, ще краще - відновлених форм альдопентоз, кетопентоз, альдогексоз та кетогексоз (тобто, пентитів та гекситів); ії) невідновлюючі дисахариди, краще - вибрані з-поміж невідновлюючих дигексоз.The carbohydrate or carbohydrate derivative used in the insulin preparation of this invention in the optimal version contains from 5 to 18 carbon atoms in the main carbohydrate structure and is selected from among the following compounds: i) monosaccharides selected from the group of non-reducing aldoses or ketoses, preferably non-reducing aldotetroses, ketotetrose, aldopentose, ketopentose, aldogexose and ketohexose, even better - non-reducing aldopentose, ketopentose, aldogexose and ketohexose; iii) reduced monosaccharides, i.e., polyhydric alcohols such as aldites, preferably "selected from the group consisting of reduced forms of aldotetrose, ketotetrose, aldopentose, ketopentose, aldohexose and ketohexose, even more preferably - reduced forms of aldopentose, ketopentose, aldohexose and ketohexose (ie, pentites and hexites); ii) non-reducing disaccharides, preferably selected from non-reducing digexoses.

Конкретними прикладами підходящих відновлених або невідновлюючих вуглеводів є: маніт, сорбіт, ксиліт, інозит, сахароза та трегалоза.Specific examples of suitable reducing or non-reducing carbohydrates are: mannitol, sorbitol, xylitol, inositol, sucrose and trehalose.

Кращими сполуками з пп. і) - Ії) є маніт та сорбіт, найбільшу перевагу віддають манітові.The best compounds from paragraphs i) - II) there are mannitol and sorbitol, the greatest preference is given to mannitol.

Кращими естерними та ефірними похідними є відповідно похідні Сі-С. естерів жирних кислот та С1-Са4 похідні алкільних естерів.The best ester and ether derivatives are C-C derivatives, respectively. fatty acid esters and С1-Са4 derivatives of alkyl esters.

У конкретному варіанті втілення винаходу інсуліновий препарат також включає галогенід, краще - хлорид, ще краще - хлорид натрію. Було продемонстровано, що присутність галогеніду в результаті дає композиції, які мають ще більшу фізичну стабільність.In a specific embodiment of the invention, the insulin preparation also includes a halide, better - chloride, even better - sodium chloride. It has been demonstrated that the presence of a halide results in compositions that have even greater physical stability.

Оскільки інсулінові композиції які включають швидкодіючі аналоги інсуліну людини, як правило, виявляють досить низьку фізичну стабільність, переваги даного винаходу особливо виявляються у зв'язку з препаратами, які включають такі аналоги. Таким чином, інсуліновий препарат згідно з даним винаходом в оптимальному варіанті включає один або кілька швидкодіючих аналогів інсуліну людини, зокрема, аналоги, у яких позицію В28 займає Авр, Гуз, І ей, Ма! або Аа, а позицію В29 займає Гуз або Рго; або дез(В28-830), дез(В27) або дез(В30) інсулін людини. Аналог інсуліну в оптимальному варіанті вибирають з-поміж аналогів інсуліну людини, у яких позицію В28 займає Авр або Іуз, а позицію В29 займає Гуз або Рго. Найкращими аналогами є Авре28 інсулін людини або І узвг8Ргов2з інсулін людини.Since insulin compositions that include fast-acting analogs of human insulin, as a rule, show a rather low physical stability, the advantages of this invention are especially apparent in connection with preparations that include such analogs. Thus, the insulin preparation according to the present invention in the optimal version includes one or more fast-acting analogues of human insulin, in particular, analogues in which the B28 position is occupied by Avr, Guz, I hey, Ma! or Aa, and position B29 is occupied by Huz or Rgo; or des(B28-830), des(B27) or des(B30) human insulin. The insulin analog is optimally selected from human insulin analogs in which position B28 is occupied by Avr or Iuz, and position B29 is occupied by Huz or Rgo. The best analogues are Avre28 human insulin or I uzvg8Rgov2z human insulin.

В іншому варіанті втілення інсуліновий препарат згідно з винаходом включає похідну інсуліну, що має видовжений графік дії, таку, як інсуліни, що мають один або кілька ліпофільних замісників. Кращими ліпофільними інсулінами є ацильовані інсуліни, включаючи інсуліни, описані у УХО 95/07931 (Момо МогаївК А/5), наприклад, похідні інсуліну людини, у яких є-амінна група Гувз829 містить ацильний замісник, який включає принаймні 6 атомів вуглецю.In another embodiment, the insulin preparation according to the invention includes an insulin derivative having an extended schedule of action, such as insulins having one or more lipophilic substituents. Preferred lipophilic insulins are acylated insulins, including insulins described in UHO 95/07931 (Momo MogaivK A/5), for example, human insulin derivatives in which the amine group of Guvz829 contains an acyl substituent that includes at least 6 carbon atoms.

Кращими похідними інсуліну є такі: в29-М-міристоїл-дез(В830)-інсулін людини, В29-М-міристоїл інсулін людини, В29-М--пальмітоїл інсулін людини, В28-Ме-міристоїл І уз828 Рго829 інсулін людини, В28-Ме-пальмітоїл І увз828 Рго823 інсулін людини, В30-Ме- міристоїл. Тпг829| уєв830-Іінсулін людини, В30-Мепальмітоїл-ТНг229І увезо-інсулін людини, 8В29-МА(М-пальмітоїл-у- глутаміл)-дез(В30) інсулін людини, В29-М-(М-літохоліл-у-глутаміл)-дез(В30)-інсулін людини та В29-М'(о)- карбокеигептадеканоїл)-дез(В30)-інсулін людини; найбільшу перевагу віддають В29-Ме-міристоїл-дез(В30)- інсулінові людини.The best derivatives of insulin are the following: B29-M-myristoyl-des(B830)-human insulin, B29-M-myristoyl human insulin, B29-M--palmitoyl human insulin, B28-Me-myristoyl I uz828 Pgo829 human insulin, B28- Me-palmitoyl I uvz828 Rgo823 human insulin, B30-Me-myristoyl. Tpg829| human uev830-Iinsulin, B30-Mepalmitoyl-TNg229I human uveso-insulin, 8B29-MA(M-palmitoyl-u-glutamyl)-des(B30) human insulin, B29-M-(M-lithocholyl-u-glutamyl)-des (B30)-human insulin and B29-M'(o)-carboxyheptadecanoyl)-des(B30)-human insulin; the greatest preference is given to B29-Me-myristoyl-des(B30)-human insulin.

В оптимальному варіанті інсуліновий препарат включає і розчинений, і осаджений, краще - кристалічний інсулін, або аналог, або похідну інсуліну у ваговому співвідношенні від 1:99 до 991, краще - від 20:80 до 80:20, ще краще - від 30:70 до 70:30.In the optimal version, the insulin preparation includes both dissolved and precipitated, better - crystalline insulin, or an analogue, or a derivative of insulin in a weight ratio from 1:99 to 991, better - from 20:80 to 80:20, even better - from 30: 70 to 70:30.

У даному варіанті втілення винаходу інсуліновий препарат має ту перевагу, що він включає кристали, які включають: інсулін або аналог інсуліну та протамін, а також, не обов'язково, цинк та/"або фенольну сполуку, таку, як фенол, м-крезол або їхню суміш. Кількість протаміну у кристалах в оптимальному варіанті становить 0,20 - 0,40 мг протамінової основи на 100 міжнародних одиниць інсуліну або аналога інсуліну. Співвідношення протаміну з інсуліном у кристалах у варіанті, якому віддають ще більшу перевагу, відповідає співвідношенню ізофану. Цинк в оптимальному варіанті присутній у кількості від 10 до 40 мкг 7п/100 міжнародних одиниць інсуліну, ще краще - від 15 до 35 мкг 2п/100 міжнародних одиниць інсуліну. фенол та м-крезол, відповідно, в оптимальному варіанті присутні у кількості, що становить від 0 до 4 мг/мл. Однак, найбільшу перевагу віддають суміші з 1,4 - 2,0 мг/мл м-крезолу та 0,6 - 2,0 мг/мл фенолу.In this embodiment of the invention, the insulin preparation has the advantage that it includes crystals that include: insulin or an insulin analog and protamine, as well as, optionally, zinc and/or a phenolic compound such as phenol, m-cresol or a mixture thereof. The amount of protamine in the crystals is preferably 0.20 - 0.40 mg of protamine base per 100 international units of insulin or insulin analog. The ratio of protamine to insulin in the crystals in an even more preferred embodiment corresponds to the isophane ratio. Zinc is optimally present in an amount of from 10 to 40 mcg 7p/100 international units of insulin, even better - from 15 to 35 mcg 2p/100 international units of insulin, phenol and m-cresol, respectively, are optimally present in an amount that is from 0 to 4 mg/ml However, mixtures of 1.4 - 2.0 mg/ml m-cresol and 0.6 - 2.0 mg/ml phenol are most preferred.

Оптимальний інсуліновий препарат даного винаходу включає: а) 60 - 3000 нмоль/мл, краще - 240 - 1200 нмоль/мл, інсуліну людини або аналога інсуліну та/або похідної інсуліну; б) відновлений або невідновлюючий вуглевод, краще - маніт, у концентрації від 100 до 400 мм, краще - від 150 до 250 мМ, ще краще - від 180 до 230 мМ; в) а хлорид, краще - хлорид натрію, у концентрації від О до 100 мМ, краще - від 5 до 40 мМ, ще краще- від 5до20мМ;і г) фізіологічно прийнятний буфер, краще - фосфатний буфер, такий як динатрійфосфатдигідрат у кількості від 1 до 4 мг/мл.The optimal insulin preparation of this invention includes: a) 60 - 3000 nmol/ml, better - 240 - 1200 nmol/ml, of human insulin or insulin analog and/or insulin derivative; b) reduced or non-reducing carbohydrate, better - mannitol, in a concentration of 100 to 400 mM, better - from 150 to 250 mM, even better - from 180 to 230 mM; c) a chloride, preferably sodium chloride, in a concentration from 0 to 100 mM, better - from 5 to 40 mM, even better - from 5 to 20 mM; and d) a physiologically acceptable buffer, preferably a phosphate buffer, such as disodium phosphate dihydrate in an amount from 1 to 4 mg/ml.

Препарат даного винаходу може, крім того, містити одну або кілька сполук, які зазвичай використовуються як ізотонічні агенти, такі як гліцерин.The preparation of this invention may, in addition, contain one or more compounds that are commonly used as isotonic agents, such as glycerin.

Значення рН інсулінового препарату в оптимальному варіанті становить від 7,0 до 7,8.The optimal pH value of the insulin preparation is from 7.0 to 7.8.

Даний винахід, крім того, стосується способу приготування інсулінового препарату, що містить як розчинений, так і осаджений аналог інсуліну; цей спосіб включає такі етапи: а) забезпечення кислотного розчину, який включає аналог інсуліну людини, цинк та субізофанічну кількість протаміну; б) забезпечення лужного розчину, який включає речовину, що діє як буфер при фізіологічному рівні рн; причому принаймні один з зазначених розчинів також включає фенольну сполуку; в) змішування кислотного та лужного розчинів та, не обов'язково, доведення рН до значення у межах від 6,5 до 8,0, краще - від 7,0 до 7,8; і г) залишення отриманої в результаті суспензії для осадження.The present invention, in addition, relates to a method of preparation of an insulin preparation containing both a dissolved and a precipitated analog of insulin; this method includes the following steps: a) providing an acidic solution that includes a human insulin analog, zinc, and a subisophanic amount of protamine; b) providing an alkaline solution, which includes a substance that acts as a buffer at a physiological pH level; and at least one of the specified solutions also includes a phenolic compound; c) mixing acidic and alkaline solutions and, not necessarily, bringing the pH to a value in the range from 6.5 to 8.0, better - from 7.0 to 7.8; and d) leaving the resulting slurry for sedimentation.

Цим способом інсуліновий препарат, що містить як розчинений, так і осаджений аналог інсуліну, може бути отриманий дуже просто. Крім того, осад отриманої в результаті суспензії зазвичай складається з видовжених кристалів, яким віддають перевагу у так званих премікс-інсулінових препаратах.In this way, an insulin preparation containing both a dissolved and a precipitated insulin analog can be obtained very simply. In addition, the precipitate of the resulting suspension usually consists of elongated crystals, which are preferred in so-called premix insulin preparations.

Вагове співвідношення аналога інсуліну з протаміном у розчині етапу а) в оптимальному варіанті вибирається таким чином, щоб у кінцевому продукті вагове співвідношення розчиненого аналога інсуліну з осадженим становило у межах від 1:99 до 99:1, краще - від 20:80 до 80:20, ще краще - від 30:70 до 70:30.The weight ratio of the insulin analog to protamine in the solution of step a) is optimally chosen in such a way that in the final product the weight ratio of the dissolved insulin analog to the precipitated one ranges from 1:99 to 99:1, better - from 20:80 to 80: 20, even better - from 30:70 to 70:30.

Точніше, розчин етапу а) в оптимальному варіанті включає від 120 до 6000 нмоль/мл аналога інсуліну та від 0,01 до 5,0 мг/мл протаміну.More precisely, the solution of step a) optimally includes from 120 to 6000 nmol/ml of an insulin analog and from 0.01 to 5.0 mg/ml of protamine.

Розчин етапу а) також включає цинк, краще - у кількості, що становить від 10-40 мкг цинку/100 міжнародних одиниць інсуліну, ще краще - 15-35 мкг цинку/100 ІШ інсуліну.The solution of step a) also includes zinc, preferably in an amount of 10-40 mcg of zinc/100 international units of insulin, even better - 15-35 mcg of zinc/100 IU of insulin.

В оптимальному варіанті розчин а) та/або розчин б) включає хлорид, краще - хлорид натрію, у кількості, що становить у кінцевому продукті від О до 100 мМ, краще - від 5 до 40 мМ, ще краще - від 5 до 20 мМ.In the optimal version, solution a) and/or solution b) includes chloride, preferably sodium chloride, in an amount that is in the final product from 0 to 100 mM, better - from 5 to 40 mM, even better - from 5 to 20 mM .

Рівень рН кислотного розчину етапу а) в оптимальному варіанті є нижчим 5, ще краще - у межах від 2 до 3,5.The pH level of the acidic solution of step a) is optimally lower than 5, even better - in the range from 2 to 3.5.

Аналогом інсуліну в оптимальному варіанті є інсулін людини, у якому позицію В28 займає Агзр, Гув, І еи,An analogue of insulin in the optimal version is human insulin, in which position B28 is occupied by Agzr, Guv, I ei,

Маї або Аа, а позицію В29 займає Гуз або Рго; або дез(В28-830), дез(В27) або дез(В30) інсулін людини, ще краще - Азре28 інсулін людини або І уз828Ргов829 інсулін людини, найкраще - Азре28 інсулін людини.Mai or Aa, and position B29 is occupied by Guz or Rgo; or des(B28-830), des(B27) or des(B30) human insulin, even better - Azre28 human insulin or I uz828Rgov829 human insulin, best - Azre28 human insulin.

Фенольною сполукою, яка використовується у розчині етапу а) та/або етапу б), в оптимальному варіанті є фенол, м-крезол або їхня суміш.The phenolic compound used in the solution of step a) and/or step b) is optimally phenol, m-cresol or their mixture.

В оптимальному варіанті розчин етапу а) та/або етапу б) також включає розчинний у воді відновлений або невідновлюючий вуглевод, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній структурі, або розчинну у воді невідновлюючу естерну та/або ефірну похідну вуглеводу або відновленого вуглеводу, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній структурі, або їхню суміш.In an optimal version, the solution of step a) and/or step b) also includes a water-soluble reduced or non-reducing carbohydrate containing at least 4 carbon atoms in the main carbohydrate structure, or a water-soluble non-reducing ester and/or ether derivative of a carbohydrate or reduced carbohydrate, containing at least 4 carbon atoms in the main hydrocarbon structure, or a mixture thereof.

Вищезгаданий вуглевод або похідна вуглеводу в оптимальному варіанті містить від 5 до 18 атомів вуглецю у головній вуглеводній структурі.The aforementioned carbohydrate or carbohydrate derivative preferably contains from 5 to 18 carbon atoms in the main carbohydrate structure.

Особливу перевагу віддають варіантові, у якому розчин етапу а) та/або етапу б) включає маніт, сорбіт, ксиліт, інозит, трегалозу, сахарозу або будь-яку їхню суміш, краще - маніт та/або сорбіт, ще краще - маніт.Particular preference is given to the variant in which the solution of stage a) and/or stage b) includes mannitol, sorbitol, xylitol, inositol, trehalose, sucrose or any mixture thereof, preferably - mannitol and/or sorbitol, even better - mannitol.

Буферною речовиною, задіяною у лужному розчині етапу б) в оптимальному варіанті є фізіологічно прийнятний буфер, краще - фосфатний буфер, ще краще - динатрійфосфатдигідрат.The buffer substance used in the alkaline solution of stage b) is ideally a physiologically acceptable buffer, preferably a phosphate buffer, even better disodium phosphate dihydrate.

Осаджений аналог інсуліну в оптимальному варіанті має форму кристалів, що включають аналог інсуліну та протамін.The precipitated insulin analog preferably has the form of crystals comprising the insulin analog and protamine.

Суспензію, отриману на етапі г), в оптимальному варіанті залишають для осадження при температурі у межах від 57С до 40"С, краще - від 207С до 36 "С, ще краще - від ЗО "С до 34 "б.The suspension obtained at stage d) is optimally left for precipitation at a temperature ranging from 57C to 40C, better - from 207C to 36C, even better - from 30C to 34C.

Даний винахід ілюструють також нижчеподані приклади, які, однак, не є вичерпними.The present invention is also illustrated by the following examples, which, however, are not exhaustive.

ПРИКЛАДEXAMPLE

ПрепаратPreparation

Інсуліновий препарат, що містить як розчинений, так і кристалічний Аврег28 інсулін людини, готували таким чином:An insulin preparation containing both dissolved and crystalline Avreg28 human insulin was prepared as follows:

Розчин А:Solution A:

Розчин Авре28 інсуліну людини у концентрації 200 міжнародних одиниць/мл приготовляли шляхом розчинення 76,5 мг Авре28 інсуліну людини у воді шляхом додавання до нього 326 мкл 0,2 М соляної кислоти та 163 мкл розчину хлориду цинку (0,4 мг/мл). Потім до розчину інсуліну при перемішуванні додавали 6,35 мг протамінсульфату і до цього розчину при перемішуванні додавали суміш, яка складалася з 17,2 мг м-крезолу, мг фенолу та 455 мг маніту. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до рнН-2,6-2,9 і додавали воду до об'єму 10 мл. Розчин врівноважували при 28-3270.A solution of human insulin Avre28 at a concentration of 200 international units/ml was prepared by dissolving 76.5 mg of human insulin Avre28 in water by adding to it 326 µl of 0.2 M hydrochloric acid and 163 µl of zinc chloride solution (0.4 mg/ml). Then, 6.35 mg of protamine sulfate was added to the insulin solution while stirring, and a mixture consisting of 17.2 mg of m-cresol, mg of phenol, and 455 mg of mannitol was added to this solution while stirring. The pH level of the resulting transparent solution was adjusted to pH-2.6-2.9 and water was added to a volume of 10 ml. The solution was equilibrated at 28-3270.

Розчин Б: мг динатрійфосфатдигідрату розчиняли у воді для ін'єкції. При перемішуванні додавали 17,2 мг м- крезолу, 15 мг фенолу та 455 мг маніту. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до 9 і додавали до 10 мл води. Розчин врівноважували при 28-3276.Solution B: mg of disodium phosphate dihydrate was dissolved in water for injection. With stirring, 17.2 mg of m-cresol, 15 mg of phenol and 455 mg of mannitol were added. The pH level of the resulting clear solution was adjusted to 9 and added to 10 ml of water. The solution was equilibrated at 28-3276.

Змішування розчинів А та Б:Mixing solutions A and B:

Розчин Б додавали до розчину А, і рівень рН підводили до 7,30. Отриману в результаті суспензію залишали при 30"С на 6 днів для кристалізації.Solution B was added to solution A, and the pH was adjusted to 7.30. The resulting suspension was left at 30"C for 6 days for crystallization.

В отриманому в результаті препараті вагове співвідношення осадженого інсуліну з розчиненим становило 70:30.In the resulting drug, the weight ratio of precipitated insulin to dissolved insulin was 70:30.

Препарат вводили у 1,5 мл картриджі РепійІФ).The drug was injected into 1.5 ml cartridges of RepiiIF).

ПРИКЛАД ІІ Препарат 2EXAMPLE II Preparation 2

Інсуліновий препарат, що містить як розчинений, так і кристалічний Авре28 інсулін людини приготовляли таким чином: ї) Кристалічна фракція. Розчин А:An insulin preparation containing both dissolved and crystalline Avre28 human insulin was prepared as follows: i) Crystalline fraction. Solution A:

Розчин Авре8 інсуліну людини у концентрації 200 міжнародних одиниць/мл приготовляли шляхом розчинення 190,3 мг Азре28 інсуліну людини у воді через додавання до нього 813 мкл 0,2 М соляної кислоти та 410 мкл розчину хлориду цинку (0,4 мг/мл). Потім до розчину інсуліну при перемішуванні додавали 16,1 мг протамінсульфату, і до цього розчину при перемішуванні додавали суміш, що складалася з 43,0 мг м-крезолу, 37,5 мг фенолу, 909 мг маніту та 14,6 мг хлориду натрію. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до рн :- 2,6-2,9 і додавали воду до об'єму 22 мл. Розчин врівноважували при 3270.A solution of human insulin Avre8 at a concentration of 200 international units/ml was prepared by dissolving 190.3 mg of human insulin Azre28 in water by adding to it 813 µl of 0.2 M hydrochloric acid and 410 µl of zinc chloride solution (0.4 mg/ml). Then, 16.1 mg of protamine sulfate was added to the insulin solution with stirring, and to this solution was added a mixture consisting of 43.0 mg of m-cresol, 37.5 mg of phenol, 909 mg of mannitol, and 14.6 mg of sodium chloride. The pH level of the resulting clear solution was adjusted to pH: - 2.6-2.9 and water was added to a volume of 22 ml. The solution was equilibrated at 3270.

Розчин Б: 62,4 мг динатрійфосфатдигідрату розчиняли у воді. При перемішуванні додавали 43,0 мг м-крезолу, 37,5 мг фенолу, 909 мг маніту та 14,6 мг хлориду натрію. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до 9 і додавали воду до об'єму 22 мл. Розчин врівноважували при 3270.Solution B: 62.4 mg of disodium phosphate dihydrate was dissolved in water. With stirring, 43.0 mg of m-cresol, 37.5 mg of phenol, 909 mg of mannitol and 14.6 mg of sodium chloride were added. The pH level of the resulting transparent solution was adjusted to 9 and water was added to a volume of 22 ml. The solution was equilibrated at 3270.

Змішування розчинів А та Б:Mixing solutions A and B:

Розчин Б додавали до розчину А, рівень рН доводили до 7,30 і додавали до 50 мл води. Отриману в результаті суспензію залишали при 32"С на 4 дні для кристалізації.Solution B was added to solution A, the pH was adjusted to 7.30, and water was added to 50 ml. The resulting suspension was left at 32"C for 4 days for crystallization.

ПРИКЛАДИ ППІ-МІ Композиції З - 6EXAMPLES of PPI-MI Compositions Z - 6

Інсуліновий препарат, що містить як розчинений, так і кристалічний Авр828 інсулін людини, приготовляли, як описано у Прикладі Ії, за винятком того, що кількість маніту, використаного у Розчинах А та Б становила відповідно 818 мг, 1005 мг, 1047 мг та 1137 мг.An insulin preparation containing both dissolved and crystalline Avr828 human insulin was prepared as described in Example II, except that the amounts of mannitol used in Solutions A and B were 818 mg, 1005 mg, 1047 mg, and 1137 mg, respectively. .

Композиції вводили у 1,5 мл картриджі РепійФ. ПРИКЛАД МІ! Препарат 7The compositions were injected into 1.5 ml cartridges of RepiiF. EXAMPLE MI! Drug 7

Інсуліновий препарат, що містить як розчинений, так і кристалічний Іувв28Рго829 інсулін людини, приготовляли таким чином: ї) Кристалічна фракція.An insulin preparation containing both dissolved and crystalline Iuvv28Rgo829 human insulin was prepared as follows: i) Crystalline fraction.

Розчин А:Solution A:

Розчин І уввг8Ргов829 інсуліну людини у концентрації 200 міжнародних одиниць/мл приготовляли шляхом суспендування 69,7 мг Іузв28Рго829 інсуліну людини у воді. До цього розчину при перемішуванні додавали суміш, що складалася з 16,0 мг м-крезолу, 6,5 мг фенолу, 364 мг маніту та 251 мг динатрійдифосфатдигідрату. Потім додавали 50 мкл розчину хлориду цинку (10 мг/мл). Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до 7,40 і додавали воду до Об'єму 10 мл. Розчин врівноважували при 1576.Solution I uvvg8Rgov829 of human insulin at a concentration of 200 international units/ml was prepared by suspending 69.7 mg of human insulin Iuzv28Rgov829 in water. A mixture consisting of 16.0 mg of m-cresol, 6.5 mg of phenol, 364 mg of mannitol, and 251 mg of disodium diphosphate dihydrate was added to this solution with stirring. Then 50 μl of zinc chloride solution (10 mg/ml) was added. The pH level of the resulting transparent solution was adjusted to 7.40 and water was added to a volume of 10 ml. The solution was equilibrated at 1576.

Розчин Б:Solution B:

Розчин протамінсульфату приготовляли шляхом розчинення 7,61 мг протамінсульфату та 25,1 мг динатрійфосфатдигідрату у воді. При перемішуванні додавали 16,0 мг м-крезолу, 6,5 мг фенолу та 364 мг маніту. Цей розчин при перемішуванні додавали до розчину протамінсульфату. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до 7,40 і додавали воду до об'єму 10 мл. Розчин врівноважували при 1576.The protamine sulfate solution was prepared by dissolving 7.61 mg of protamine sulfate and 25.1 mg of disodium phosphate dihydrate in water. 16.0 mg of m-cresol, 6.5 mg of phenol and 364 mg of mannitol were added with stirring. This solution was added to the protamine sulfate solution while stirring. The pH level of the resulting clear solution was adjusted to 7.40 and water was added to a volume of 10 ml. The solution was equilibrated at 1576.

Змішування розчинів А та Б:Mixing solutions A and B:

Розчин Б додавали до розчину А і рівень рН доводили до 7,30. Отриману в результаті суспензію залишали при 157С на З дні для кристалізації.Solution B was added to solution A and the pH level was adjusted to 7.30. The resulting suspension was left at 157C for crystallization.

Ї) Розчинена фракціяЖ) Dissolved fraction

Розчин Іувгв28Ргов2з інсуліну людини приготовляли шляхом розчинення 34,9 мг Іузвг8Ргов29 іноуліну людини у воді шляхом додавання до нього 33 мкл 1 М соляної кислоти та 25 мкл розчину хлориду цинку (10 мг/мл). Потім до розчину інсуліну при перемішуванні додавали суміш, яка складалася з 26,1 мг натрійфосфатдигідрату, 6,5 мг фенолу, 16,0 мг м-крезолу та 364 мг маніту. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до рН :- 7,3 і додавали воду до об'єму 10 мл. 6 мл розчиненої фракції додавали до 14 мл кристалічної фракції і рівень рН доводили до 7,30.A solution of Iuvgv28Rgov2z human insulin was prepared by dissolving 34.9 mg of Iuzvg8Rgov29 human inulin in water by adding to it 33 μl of 1 M hydrochloric acid and 25 μl of zinc chloride solution (10 mg/ml). Then, a mixture consisting of 26.1 mg of sodium phosphate dihydrate, 6.5 mg of phenol, 16.0 mg of m-cresol and 364 mg of mannitol was added to the insulin solution with stirring. The pH level of the resulting clear solution was adjusted to pH: - 7.3 and water was added to a volume of 10 ml. 6 ml of the dissolved fraction was added to 14 ml of the crystalline fraction and the pH level was adjusted to 7.30.

В отриманому в результаті препараті вагове співвідношення осадженого та розчиненого інсуліну становило 70:30.In the resulting drug, the weight ratio of precipitated and dissolved insulin was 70:30.

ПРИКЛАД МІЇЇ Препарат 8EXAMPLE OF MIA Preparation 8

Інсуліновий препарат, що містить як розчинений, так і кристалічний інсулін людини, приготовляли таким чином: ї) Кристалічна фракція Розчин А:An insulin preparation containing both dissolved and crystalline human insulin was prepared as follows: i) Crystalline fraction Solution A:

Розчин інсуліну людини приготовляли шляхом розчинення 69,7 мг інсуліну людини у воді через додавання до нього 65 мкл 1 М соляної кислоти та 26 мкл розчину хлориду цинку (10 мг/мл). Потім до розчину інсуліну при перемішуванні додавали 6,0 мг протамінсульфату і до цього розчину при перемішуванні додавали суміш, що складалася з 15,0 мг фенолу та 17,2 мг м-крезолу. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до рН :- 2,7-3,2 і додавали воду до об'єму 10 мл.The human insulin solution was prepared by dissolving 69.7 mg of human insulin in water by adding 65 μl of 1 M hydrochloric acid and 26 μl of zinc chloride solution (10 mg/ml). Then, 6.0 mg of protamine sulfate was added to the insulin solution while stirring, and a mixture consisting of 15.0 mg of phenol and 17.2 mg of m-cresol was added to this solution while stirring. The pH level of the resulting clear solution was adjusted to pH: - 2.7-3.2 and water was added to a volume of 10 ml.

Розчин Б: 24,9 мг натрійфосфатдигідрату розчиняли у воді. При перемішуванні додавали 15 мг фенолу, 17,2 мг м- крезолу, 728 мг маніту та 11,7 мг хлориду натрію. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до рН : 9 і додавали воду до об'єму 10 мл.Solution B: 24.9 mg of sodium phosphate dihydrate was dissolved in water. With stirring, 15 mg of phenol, 17.2 mg of m-cresol, 728 mg of mannitol, and 11.7 mg of sodium chloride were added. The pH level of the resulting clear solution was adjusted to pH: 9 and water was added to a volume of 10 ml.

Розчин Б додавали до розчину А і рівень рН доводили до 7,30. Отриману в результаті суспензію залишали при 22-24"С на добу. ї) Розчинена фракціяSolution B was added to solution A and the pH level was adjusted to 7.30. The resulting suspension was left at 22-24"C for a day. i) Dissolved fraction

Розчин інсуліну людини приготовляли шляхом розчинення 34,9 мг інсуліну людини у воді через додавання до нього 33 мкл 1 М соляної кислоти та 13 мкл розчину хлориду цинку (10 мг/мл). Потім до розчину при перемішуванні додавали суміш, яка складалася з 12,5 мг натрійфосфатдигідрату, 15 мг фенолу, 17,2 мг м- крезолу, 364 мг маніту та 5,8 мг хлориду натрію. Рівень рН Отриманого в результаті прозорого розчину доводили до рН : 7,3 і додавали воду до об'єму 10 мл. 6 мл розчиненої фракції додавали до 14 мл кристалічної фракції і рівень рН доводили до 7,30.The human insulin solution was prepared by dissolving 34.9 mg of human insulin in water by adding 33 μl of 1 M hydrochloric acid and 13 μl of zinc chloride solution (10 mg/ml). Then, a mixture consisting of 12.5 mg of sodium phosphate dihydrate, 15 mg of phenol, 17.2 mg of m-cresol, 364 mg of mannitol, and 5.8 mg of sodium chloride was added to the solution with stirring. The pH level of the resulting transparent solution was adjusted to pH: 7.3 and water was added to a volume of 10 ml. 6 ml of the dissolved fraction was added to 14 ml of the crystalline fraction and the pH level was adjusted to 7.30.

Препарат вводили у 1,5 мл картриджі РепійїФ).The drug was injected into 1.5 ml cartridges (RepiyiF).

ПРИКЛАД ІХTHEIR EXAMPLE

Препарат 9Drug 9

Інсуліновий препарат, що містить як розчинений, так і кристалічний Авр828 інсулін людини, приготовляли таким чином:An insulin preparation containing both dissolved and crystalline Avr828 human insulin was prepared as follows:

Розчин А:Solution A:

Розчин Аврега інсуліну людини у концентрації 200 міжнародних одиниць/мл приготовляли шляхом розчинення 189,9 мг Азре28 інсуліну людини у воді через додавання до нього 163 мкл 1 М соляної кислоти та 163,5 мкл розчину хлориду цинку (10 мг/мл). Потім при перемішуванні додавали 11,5 мг протамінсульфату у розчині і до цього розчину при перемішуванні додавали суміш, яка складалася з 44,3 мг м-крезолу, 38,6 мг фенолу та 1048 мг маніту та 7,3 мг хлориду натрію. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до рН-2,6-2,9 і додавали воду до об'єму 25 мл. Розчин врівноважували при 22-2476.A solution of human insulin Avreg at a concentration of 200 international units/ml was prepared by dissolving 189.9 mg of Azre28 human insulin in water by adding 163 µl of 1 M hydrochloric acid and 163.5 µl of zinc chloride solution (10 mg/ml). Then, with stirring, 11.5 mg of protamine sulfate was added in solution, and to this solution, with stirring, was added a mixture consisting of 44.3 mg of m-cresol, 38.6 mg of phenol, and 1048 mg of mannitol and 7.3 mg of sodium chloride. The pH level of the resulting transparent solution was adjusted to pH-2.6-2.9 and water was added to a volume of 25 ml. The solution was equilibrated at 22-2476.

Розчин Б: 62,3 мг динатрійфосфатдигідрату розчиняли у воді. При перемішуванні додавали 44,3мг м-крезолу, 38,6 мг фенолу, 1048 мг маніту та 7,3 мг хлориду натрію. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до 9 і додавали воду до об'єму 25 мл. Розчин врівноважували при 22-2426.Solution B: 62.3 mg of disodium phosphate dihydrate was dissolved in water. With stirring, 44.3 mg of m-cresol, 38.6 mg of phenol, 1048 mg of mannitol and 7.3 mg of sodium chloride were added. The pH level of the resulting transparent solution was adjusted to 9 and water was added to a volume of 25 ml. The solution was equilibrated at 22-2426.

Змішування розчинів А та Б:Mixing solutions A and B:

Розчин Б додавали до розчину А і рівень рН доводили до 7,30. Отриману в результаті суспензію залишали при 32"С на 2 дні для кристалізації.Solution B was added to solution A and the pH level was adjusted to 7.30. The resulting suspension was left at 32"C for 2 days for crystallization.

В отриманому в результаті препараті вагове співвідношення осадженого та розчиненого інсуліну становило 50:50.In the resulting preparation, the weight ratio of precipitated and dissolved insulin was 50:50.

Препарат вводили у 1,5 мл картриджі Репій!Ф. ПРИКЛАД Х (Порівняльний) Препарат 10The drug was injected into 1.5 ml cartridges Repii!F. EXAMPLE X (Comparative) Drug 10

Розчин А:Solution A:

Розчин Авре8 інсуліну людини у концентрації 200 міжнародних одиниць/мл приготовляли шляхом розчинення 76,5 мг Авре28 інсуліну людини у воді через додавання до нього 326 мкл 0,2 М соляної кислоти та 163 мкл розчину хлориду цинку (0,4 мг/мл). Потім до розчину інсуліну при перемішуванні додавали 6,35 мг протамінсульфату у розчині і до цього розчину при перемішуванні додавали суміш, яка складалася з 17,2 мг м- крезолу, 15,0 мг фенолу та 160 мг гліцерину. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до рН - 2,6-2,9 і додавали воду до об'єму 10 мл. Розчин врівноважували при 28-3276.A solution of human insulin Avre8 at a concentration of 200 international units/ml was prepared by dissolving 76.5 mg of human insulin Avre28 in water by adding to it 326 µl of 0.2 M hydrochloric acid and 163 µl of zinc chloride solution (0.4 mg/ml). Then, 6.35 mg of protamine sulfate in solution was added to the insulin solution while stirring, and a mixture consisting of 17.2 mg of m-cresol, 15.0 mg of phenol, and 160 mg of glycerol was added to this solution while stirring. The pH level of the resulting transparent solution was adjusted to pH 2.6-2.9 and water was added to a volume of 10 ml. The solution was equilibrated at 28-3276.

Розчин Б: 25 мг динатрійфосфатдигідрату розчиняли у воді для ін'єкції. При перемішуванні додавали 17,2 мг м- крезолу, 15,0 мг фенолу та 160 мг гліцерину. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до 9 і додавали воду до об'єму 10 мл. Розчин врівноважували при 28-3276.Solution B: 25 mg of disodium phosphate dihydrate was dissolved in water for injection. 17.2 mg of m-cresol, 15.0 mg of phenol and 160 mg of glycerol were added with stirring. The pH level of the resulting transparent solution was adjusted to 9 and water was added to a volume of 10 ml. The solution was equilibrated at 28-3276.

Розчин Б додавали до розчину А і рівень рН доводили до 7,30. Отриману в результаті суспензію залишали при 28-32"7С на 2 дні для кристалізації.Solution B was added to solution A and the pH level was adjusted to 7.30. The resulting suspension was left at 28-32"7C for 2 days for crystallization.

ПРИКЛАД ХІEXAMPLE XI

ТЕСТИ З ДОДАТКОВИМ ФІЗИЧНИМ НАВАНТАЖЕННЯМ зразків кожного з інсулінових препаратів вводили у картриджі РепіФ й піддавали такому випробуванню з додатковим фізичним навантаженням:TESTS WITH ADDITIONAL PHYSICAL LOAD samples of each of the insulin preparations were injected into RepiF cartridges and subjected to the following test with additional physical load:

Картриджі Реп прикріплювали до обертаючого пристрою, розміщеного в інкубаторі, й обертали на 360" по чотири години на день з частотою ЗО обертів за хвилину й при температурі 377С ж 2"С. Картриджі РеппФ, коли їх не обертали, зберігалися при температурі 377С 276.The Rep cartridges were attached to a rotating device placed in the incubator and rotated 360" for four hours a day with a frequency of 30 revolutions per minute and at a temperature of 377C and 2"C. ReppF cartridges, when they were not rotated, were stored at a temperature of 377C 276.

Картриджі РепіййФ вивчали під мікроскопом 5 разів на тиждень, і зміни у зовнішньому вигляді сполуки занотовували згідно з такими принципами: ї) Картриджі, що містили білу суспензію, яка ресуспендувалася після перемішування й не мала грудок та гранул, класифікувалися як "нефібрильовані". ї) Картриджі, що містили суспензію з грудками та/або гранулами, які не ресуспендувалися після перемішування і/або осідали на стінках картриджу, вважалися "фібрильованими". Це було підтверджено шляхом додавання у картридж 6 мкл ЄМ НС: фібрильовані картриджі, як правило, стають непрозорими після додавання кислоти.RepiyF cartridges were examined under the microscope 5 times a week, and changes in the appearance of the compound were noted according to the following principles: i) Cartridges containing a white suspension that resuspended after stirring and had no lumps or granules were classified as "non-fibrillated". (j) Cartridges containing a suspension with lumps and/or granules that did not resuspend after mixing and/or settled on the walls of the cartridge were considered "fibrillated". This was confirmed by adding 6 μl EM NA to the cartridge: fibrillated cartridges tend to become opaque after acid addition.

Обертання картриджів тривало доти, доки всі зразки не стали фібрильованими. Результати зведено у нижчеподаній Таблиці.The rotation of the cartridges continued until all samples became fibrillated. The results are summarized in the Table below.

ТАБЛИЦЯ й Середня кількість днів Перший деньTABLE and Average number of days First day

Авра28 інсуліну 30/70 7 мМAvra28 insulin 30/70 7 mM

Авра28 інсуліну 30/70 7 мМ 2 фосфату 200 мм маніту 10 мМ 23 23 хлориду натріюAvra28 insulin 30/70 7 mM 2 phosphate 200 mM mannitol 10 mM 23 23 sodium chloride

Аврва28 інсуліну 30/70 7 мМAvrva28 insulin 30/70 7 mM

З фосфату 180 мм маніту 10 мМ 21 17 хлориду натріюFrom phosphate 180 mm mannitol 10 mm 21 17 sodium chloride

Аврва28 інсуліну 30/70 7 мМ 4 фосфату 220 мМ маніту 10 мМ 19 17 хлориду натрію фосфату 230 мМ маніту 10 мМAvrva28 insulin 30/70 7 mM 4 phosphate 220 mM mannitol 10 mM 19 17 sodium chloride phosphate 230 mM mannitol 10 mM

71111111 хлориду натрію пниишшияжяли ши71111111 of sodium chloride were used

Авра28 інсуліну 30/70 7 мМ фосфату 250 мМ маніту 10 мМ 22 22 хлориду натріюAvra28 insulin 30/70 7 mM phosphate 250 mM mannitol 10 mM 22 22 sodium chloride

Аврв28 інсуліну 50/50 7 мМ фосфату 230 мМ маніту 10 мМ 230 230 хлориду натрію , - Авра28 інсуліну 30/70 7 мМ (порівняльний) : 11 фосфату 174 мМ гліцерину - ВМ спину и їїAvrv28 insulin 50/50 7 mM phosphate 230 mM mannitol 10 mM 230 230 sodium chloride, - Avra28 insulin 30/70 7 mM (comparative): 11 phosphate 174 mM glycerol - VM back and its

ВК А о Кр АВ Ене Я с ня оон од Кв дО УР УВА Кс ее нн м екVK A o Kr AV Ene Ya s nya oon od Kv dO URUVA Ks ee nn m ek

ТАЖ окт совно ОВУ ЕяTHE SAME oct sovno OVU Eya

ВНУ о Те дали Не пи Я шен я МUniversity o Te gave Ne pi Ya shen ya M

ВОК шок в о АНЯ есе в и карою внVOK shock in about Anya essay in and punishment of the university

Во п А ик В.Vo p A ik V.

В а яAnd I

Мой о Кн деMy o Kn de

ЕК А НИ О агEK A NI O ag

Фіг. ші КОЖЕН Ех ут Тит Тест по в я я БК ве сни нки ен о ШК НИК и о а ЕЕ оуивя ан и и и ЙFig. everyone Eh ut Tit Test of knowledge BC spring en o SHK NIC i o a EE ouivya an i i i Y

ДЯ и дару Ж І ГЕО х КА БИ ЮРЕ дя о АDYA and daru Z I GEO x KA BY YURE dya o A

ФЕН ту у ТТ ВАМFEN tu in TT VAM

СКК ди еф АХ пк ж о а и ТЕ, и ОКSKK di ef AH pk z o a i TE, i OK

ПЕН пеPEN pe

Осо ної Ен ПДВ, АрЕТН. реOso noi En VAT, ArETN. re

ДНК вDNA in

ФГ. яFG. I

Тлюкова сту й самих буччх йкими ув МУрМЯй яжуєіх лугуTlyukova st and the very buchchh ykymi in the MUrMYai yazhuye meadows

Тлюбаза нямовну що ! Н і ! :Tlyubaza is speechless! No! :

Ге -і Н і т НGe -i N i t N

ОМАН і : Н : «щік. : 8 КМ : е І НИ І ї - п Н хО ру шкі г ра СПИ: ни и ен не і А в ее нав я І нен не о !OMAN and : N : "cheek. : 8 KM : e I NI I i - p N hO ru shki g ra SPY: ni i en ne i A v ee nav i I nen ne o !

Н Н ло : -чял п КО зо ІН пи їхЗО йо 5 185N N lo : -chyal p KO zo IN pi ihZO yo 5 185

Мле:тйгя Неси шен й тече двух яхMle:tygya Carry shen and flow dvuh yah

Claims

1. Aqueous composition of insulin, which contains: a) crystals that include an analog of human insulin, where position B28 is occupied by Avr, Guvg, I ey, Ma! or Aa, and position B29 is occupied by Guz or Rio, or des(B28-830), des(B27) or des(B30) human insulin, and protamine, and 5) from 100 to 400 mM mannitol, and the concentration of the insulin analog is from 60 to 3000 nmol/ml.

2. The composition of insulin according to claim 1, which differs in that it additionally includes chloride.

3. The composition of insulin according to claim 1 or claim 2, which differs in that the analogue of human insulin is Avrv28 human insulin or I uz828 Rgov29 human insulin.

4. The composition of insulin according to any of claims 1-3, which differs in that the crystals additionally include zinc and optionally - a phenolic compound.

5. The composition of insulin according to any one of claims 1-4, which is characterized by the fact that it includes both a dissolved and a crystalline analogue of insulin in a mass ratio of 20:80 to 80:20.

6. A method of obtaining an insulin composition containing both a dissolved and a crystalline analog of insulin, which includes the following stages: a) providing an acidic solution that includes an analog of human insulin, zinc, and a subisophanic amount of protamine; p) provision of an alkaline solution, which includes a substance that acts as a buffer at a physiological pH level; wherein at least one of said solutions additionally includes a phenolic compound and at least one of said solutions additionally includes mannitol; c) mixing acidic and alkaline solutions and, optionally, setting the pH level in the range from 6.5 to 8.0; and 4) leaving the resulting slurry for sedimentation.

7. The method according to claim 6, which differs in that the mass ratio of the insulin analogue and protamine in the solution of stage a) is chosen so that in the final product the mass ratio of the dissolved and crystalline insulin analogue is in the range from 20:80 to 80:20.

8. The method according to claim 7, which differs in that the solution of stage a) includes from 120 to 6000 nmol/ml of an insulin analog and from 0.01 to 5.0 mg/ml of protamine.

9. The method according to claim 8, which differs in that the solution of stage a) additionally includes zinc in an amount corresponding to 10-40 μg of zinc/100 IU of insulin.

10. The method according to any one of claims 6-9, which is characterized in that the solution of stage a) and/or the alkaline solution of stage B) includes chloride in an amount corresponding to 5 to 40 mM in the final product.

11. The method according to any of claims 6-10, which is characterized by the fact that the pH level of the acidic solution of stage a) is less than