AT408720B

AT408720B - Parenterale pharmazeutische formulierung eines humaninsulinanalogon-komplexes

Info

Publication number: AT408720B
Application number: AT0101695A
Authority: AT
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-14
Publication date: 2002-02-25
Also published as: HK1015138A1; SE9502167D0; NL1000566A1; ATA101695A; NL1000566C2; NZ272359A; CN1122248A; CH689935A5; JPH083067A; DE19521720B4; NO952357L; BE1009408A5; HU227240B1; FR2721214A1; KR100382326B1; BR9502795A; PL181310B1; IL114151A0; GB9512038D0; CZ287484B6

Description

AT 408 720 B

Die vorliegende Erfindung betrifft monomere Analoga des Human-Insulins. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen Hexamer-Komplex, der ein Insulin-Analogen, Zink und ein Phenolderivat enthält.

Seit der Einführung des Insulins in den Zwanzigerjahren dieses Jahrhunderts sind kontinuierliche Fortschritte zur Verbesserung der Behandlung des Diabetes mellitus gemacht worden. Große Fortschritte sind hinsichtlich der Reinheit und Verfügbarkeit des Insulins gemacht worden. Es sind auch verschiedene Formulierungen mit unterschiedlicher Wirksamkeit in bezug auf die Zeit entwickelt worden. Trotz dieser Verbesserungen ermangelt es der Therapie mit subkutanen Injektionen noch immer daran, für den Patienten eine praktische Regelung und Kontrolle hinsichtlich einer Normalisierung des Blutzuckers zu schaffen. Häufige Abweichungen von den normalen Blutzuckerwerten im Verlauf der Lebenszeit eines Patienten führen zu einer Blutzuckererhöhung (Hyperglykämie) oder zu einer Hypoglykämie sowie zu Langzeit-Komplikationen, einschließlich einer Retinopathia diabetica, einer Neuropathie, einer Nephropathie und von Mikro- und Makroangiopathien.

Um die Vermeidung extremer Blutzuckerwerte zu unterstützen, wenden Diabetiker häufig eine Therapie in der Form von Mehrfachinjektionen an, wobei das Insulin zu jeder Mahlzeit verabreicht wird. Diese Therapie ist jedoch noch nicht optimiert worden. Das im Handel erhältliche, am raschesten wirkende Insulin erreicht seine Spitzenwirksamkeit zu spät nach der Injektion, und seine Wirkung halt zu lange an, so dass keine optimale Regelung des Glukosehaushalts erzielt wird. In jüngster Zeit sind beträchtliche Anstrengungen dahingehend unternommen worden, Insulin-Formulierungen und Insulin-Analoga-Formulierungen zu schaffen, welche die Kinetik des Vorganges der subkutanen Resorption verändern.

Da alle im Handel erhältlichen, pharmazeutischen Formulierungen des Insulins dasselbe im selbst-assoziierten Zustand enthalten, und zwar überwiegend in der Form des Zink-Hexamers, wird angenommen, daß diejenige Stufe, welche die Geschwindigkeit der Resorption des Insulins aus dem subkutanen Injektionsdepot in den Blutstrom beschränkt, die Dissoziation des selbst-aggre-gierten Insulin-Hexamers ist. Brange et al. in Diabetes Care, 13: 923-954 (1990). Zur Beschleunigung dieses Resorptionsvorganges sind monomere Insulin-Analoga entwickelt worden. Diese monomeren Analoga weisen einen vergleichsweise rascheren Beginn der Aktivität als das Insulin auf, sie behalten aber zugleich die biologische Wirksamkeit des natürlich vorkommenden Humaninsulins bei. Sie führen zu einer raschen Resorption, mit dem Ziel, die Injektionszeit und die Spitzenaktivität des Insulins näher an die nach dem Essen auftretende, mit der Antwort auf eine Mahlzeit verbundene Abweichung des Glukosespiegels heranzubringen. Die Herstellung verschiedener monomerer Analoga ist in Chance et al., der EP 383 472 A, und Brange et al., EP 214 826 A, beschrieben.

Leider führen die Modifikationen an dem Insulin, welche bewirken, daß diese Analoga monomer sind, auch zu einer hohen Rate der Polymerbildung in parenteralen Formulierungen. Da der Verfall von Insulinpräparaten dann auftritt, wenn Gehalte von 1% an Polymer erreicht worden sind (U.S.-Pharmakopöe, 1990), ist die Minimierung dieser Art von Abbau zur Verringerung unerwünschter Nebenwirkungen äußerst wichtig. Es war daher erwünscht, monomere Analoga auf eine solche Art und Weise zu formulieren, daß dadurch eine Selbst-Assoziation des Analogons unter Bildung einer stabilen Struktur bewirkt wird, daß aber dessen rasche Resorption dennoch aufrechterhalten bleibt.

Durch die Zugabe gewisser Metallionen, in erster Linie von Zink, wird die chemische Stabilität dadurch erhöht, daß das Insulin angetrieben wird, sich zu assoziieren und Hexamere, nämlich spezifisch die Zn(ll)-T6-Struktur, zu bilden. Weiterhin ist gezeigt worden, daß Phenolverbindungen das Insulin-Hexamer spezifisch binden und eine allosterische Strukturveränderung induzieren, wodurch die acht endständigen Aminosäuren am N-Ende der B-Kette aus der langgestreckten Struktur in eine Alpha-Helix umgewandelt werden. Derewenda et al., Nature, 338: 594-596 (1989). Dieser an die Phenolverbindung gebundene Strukturzustand ist als der Zn(ll)-R-Zustand bekannt.

In starkem Gegensatz zu diesen wohlbegründeten Beobachtungen, dass sich das Insulin in Gegenwart von Zink unter Bildung einer wohldefinierten, stabilen Zn-Hexamer-Struktur leicht aggregiert, haben frühe Untersuchungen mit monomeren Insulin-Analoga gezeigt, dass sich jegliche Aggregation zwischen Zink und dem Insulin-Analogon von der mit Insulin beobachteten unterscheidet. B.H. Frank, Kopien des Textes und der Diapositive eines Vortrages, der bei einer Insulin-Tagung über das Thema "Self-Association and Conformational Studies on Human Proinsulin and 2

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Insulin Analogs", an der University of York (29. August bis 1. September 1989), gehalten worden ist. Weiterhin wird der in hohem Maße stabile Zn-Hexamer-Komplex, wie er mit dem Insulin ersichtlich ist, bei monomeren Analoga nicht beobachtet. Id. Brems et al., in Protein Engineering, 5:6, 527-533 (1992), führen aus, dass das monomere LysB28ProB29-hl für eine Dimerisierung und Selbstassoziation zu Formen mit höherem Molekulargewicht weniger anfällig als es das Humaninsulin ist. Brems et al. kommen in ihren fortgesetzten Ausführungen zu der Schlußfolgerung, daß AspB28ProB29-hi, AlaB28ProB29-hl und LysB28ProB29-hl nur eine geringfügige oder überhaupt keine Zn-induzierte Assoziation zeigen, und daß ProB29-lnsulin, Lys -Insulin, AspB28-lnsulin und Ala628-Insulin zwar eine Zn-induzierte Assoziation zeigen, aber in geringerem Ausmaß als das Zn-Insulin. Spätere, unveröffentlichte, an Hand von Versuchen gemachte Beobachtungen seitens der Erfinder der vorliegenden Erfindung legen es nahe, dass zwar eine Assoziation mit Zink stattfindet; dass aber ein solches Zusammentreten zwischen dem Analogon und dem Zink von jenem des Insulins verschieden ist. Die bei diesen Analoga beobachtete Assoziation führt zu einer großen Zahl von Formen mit einem höheren Molekulargewicht als jenem der überwiegenden, wohldefinierten Zn-Insulin-Hexameren, welche Formen sich von diesen letztgenannten unterscheiden. Es ist daher klar, daß monomere Insulin-Analoga nicht in analoger Weise wie das Insulin die Zn(ll)-T6-Struktur ausbilden.

Im Hinblick auf die veröffentlichte Literatur ist es überraschend, dass durch die vorliegende Erfindung monomere Insulin-Analoga in einem wohldefinierten, stabilen Zink-Phenol-Hexamer-Komplex geschaffen werden. Dieser Hexamer-Komplex unterscheidet sich in einzigartiger Weise von jenen Komplexen, die mit dem Insulin unter identischen Bedingungen beobachtet werden. Die Insulinkomplexe mit Zink und Phenol liegen in einer Zn(ll) -Re-Struktur vor. Der Hexamer-Komplex der vorliegenden Erfindung ist nicht identisch mit dieser Struktur. Es ist auch recht bemerkenswert, daß der Insulin-Analogon-Hexamer-Komplex eine viel größere Neigung, zur Dissoziation aufweist als das Insulin aufweist. Diese Neigung zur Dissoziation drückt sich in der gewünschten Eigenschaft einer raschen Wirkung aus.

Brange et al., in Current Opinion in Structural Biology, 1:934-940 (1991), beschreiben verschiedene, rasch wirkende, stabile Insulin-Monomere und führen aus, dass der naheliegende Weg zur Schaffung eines rasch wirkenden Insulins darin besteht, die Bildung des Dimers oder Hexa-mers zu verhindern. Ebenso führen Brange et al., in Diabetes Care, 13: 923-954 (1990), aus, dass dort, wo das Insulin als Hexamer verabreicht wird, das Hexamer nicht nur langsamer als ein Monomer in seiner freien Diffusion ist, sondern auch während des Diffusionstransportes in der Subku-tis (im Unterhautzellgewebe) und/oder während seines Durchganges durch die Kapillarmembranen in höherem Maße als ein Monomer sterisch behindert sein muss. Weiterhin gilt, daß die Zn(ll)-R6-Struktur, wenn sie subkutan injiziert wird, nicht direkt dissoziiert, sondern über die Zn(ll)-T6-Struktur transformiert werden muss. Diese Strukturveränderungen und die sich daraus ergebende Dissoziation verzögern den Beginn der Aktivität. Ein Fachmann nahm daher zum Zeitpunkt der Erfindung an, dass Bemühungen im Sinne einer chemischen Stabilisierung des monomeren Insulin-Analogons mit Zink durch Bildung eines wohldefinierten Hexamer-Komplexes erfolglos sein würden; oder, dass dann, wenn sie doch erfolgreich wären, der gewünschte rasche Beginn der Wirkung geopfert werden müßte.

Die vorliegende Formulierung ist ein Zink-Phenolverbindung-induzierter Hexamer-Komplex, der rasch resorbiert wird. Die Geschwindigkeit der Resorption des Hexamer-Komplexes ist wenigstens zweimal so groß wie die bei Insulin beobachtete. Und dennoch ist der Hexamer-Komplex, wenn er formuliert ist, im Vergleich zum Insulin bezüglich eines chemischen Abbaus ebenso beständig wie dieser. Es ist daher überraschend, dass gemäß der vorliegenden Erfindung ein monomeres Insulin-Analogon in einen wohldefinierten, stabilen Zink-Phenol-Hexamer-Komplex umgewandelt wird. Es ist auch bemerkenswert, dass dieser Hexamer-Komplex, wenn er formuliert ist, die mit dem monomeren Insulin-Analogon verbundenen Eigenschaften einer raschen Wirksamkeit beibehält. Demgemäß wird durch die vorliegende Erfindung eine parenterale Formulierung des Insulin-Analogon-Hexamer-Komplexes zur Verfügung gestellt, welche stabil und rasch wirkend ist.

Durch die vorliegende Erfindung wird ein Human-Insulin-Analogon-Komplex geschaffen, welcher enthält: sechs Moleküle eines Human-Insulin-Analogons, zwei Zinkionen, und wenigstens drei Moleküle eines Phenolderivates, das aus einer aus m-Kresol, Phenol, oder einem Gemisch von m-Kresol und Phenol bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei der Analogon-Komplex ein 3

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Hexamer ist. Durch die Erfindung werden weiterhin parenterale Formulierungen geschaffen, welche den Hexamer-Komplex enthalten.

Die Fig. 1 zeigt eine graphische Darstellung des Wirkungsprofiles von LysB28ProB29-hl und Hu-man-lnsulin. Die Kurve stellt die mittlere Geschwindigkeit der Antwort auf eine Glukose-Infusion dar. Die Fig. zeigt die Vorteile der vorliegenden Erfindung auf.

Die Fig. 2 zeigt eine graphische Darstellung der Beständigkeit des LysB28ProB29-Human-Insulins. Die Kurve stellt die Beständigkeit dadurch dar, daß die Polymerbildung des Insulin-Analogons im Hexamer-Verband im Vergleich zu monomerem LysB28Pro -Human-Insulin und Insulin gemessen wird. Die Fig. zeigt die Vorteile der vorliegenden Erfindung auf.

Die Fig. 3 zeigt eine graphische Darstellung der Dissoziation des LysB28ProB29-Human-lnsulins in einem Hexamer-Komplex. Die Kurve zeigt die in-vitro-Dissoziation von formuliertem Insulin (o); von als Hexamer-Komplex formuliertem LysB28ProB29-hl (Δ); von unformuliertem Insulin (□); und von monomerem LysB28ProB29-hl (*); jeweils überwacht aufgrund der Streuung von statischem Licht bei 488 nm und unter einem Winkel von 90°. Die formulierten Proben enthielten 0,5 Mol Zn pro Mol Protein, 1,25 mg/ml an m-Kresol und 1,09 mg/ml an Phenol, 7 mM Natriumphosphat und 16 mg/ml Glycerin. Die unformulierten und monomeren Proben enthielten keine zusätzlichen Vehikel. Die Fig. zeigt die Vorteile der vorliegenden Erfindung auf.

Wie oben bereits erwähnt worden ist, wird durch die Erfindung ein Komplex eines monomeren Human-Insulin-Analogons als ein Hexamer geschaffen. Die hierin verwendeten Ausdrücke: "monomeres Insulin-Analogon" oder "Human-Insulin-Analogon" bedeuten ein Human-Insulin, worin:

Pro in der Position B28 durch Asp, Lys, Leu, Val oder Ala ersetzt worden ist; und Lys in der Position B29 entweder Lysin ist oder durch Prolin ersetzt worden ist;

Des(B28-B30) oder

Des(B27).

Monomere Insulin-Analoga sind in Chance et al., der EP 383 472 A, Brange et al. und der EP 214 826 A beschrieben, welche Schriften durch Bezugnahme darauf in die vorliegenden Unterlagen aufgenommen werden. Monomere Insulin-Analoga sind für eine Dimerisierung oder Selbstassoziation weniger anfällig als Insulin.

Ein Fachmann wird erkennen, dass andere Modifikationen möglich sind. Diese Modifikationen sind auf dem Fachgebiet umfassend anerkannt und umfassen den Ersatz des Histidinrestes in der Position B10 durch Asparaginsäure; den Ersatz des Phenylalaninrestes in der Position B1 durch Asparaginsäure; den Ersatz des Threoninrestes in der Position B30 durch Alanin; den Ersatz des Serinrestes in der Position B9 durch Asparaginsäure; die Deletion der Aminosäure(n) in der alleinigen Position B1 oder in Kombination mit einer Deletion in der Position B2; und die Deletion des Threonins aus der Position B30.

Alle in dieser Beschreibung verwendeten Abkürzungen für Aminosäuren sind in der Technik üblich. Ein besonders bevorzugtes, monomeres Insulin-Analogon ist das LysB28ProB29Human-ln-sulin (B28 ist Lys; B29 ist Pro).

Der hierin verwendete Ausdruck "Behandeln" beschreibt die Führung eines Patienten und die Fürsorge für denselben, zu dem Zweck, die Krankheit, den Zustand oder die Störung zu bekämpfen, und er umfaßt die Verabreichung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung, um den Ausbruch der Symptome oder Komplikationen zu verhindern, um die Symptome oder Komplikationen zu lindern, oder um die Krankheit, den Zustand oder die Störung zu eliminieren.

Der Ausdruck "isotonisch machendes Mittel" bezieht sich auf ein Mittel, das physiologisch toleriert wird, und welches der Formulierung einen solchen Tonus verleiht, dass dadurch ein Strom von Wasser durch die Zellmembran verhindert wird. Verbindungen, wie z.B. Glycerin, werden gewöhnlich für solche Zwecke in bekannten Konzentrationen verwendet.

Der Ausdruck "Phenolderivat" oder "Phenolverbindung" steht für m-Kresol, Phenol oder für ein Gemisch von m-Kresol und Phenol. Vorzugsweise ist die Phenolverbindung m-Kresol.

Der Ausdruck "physiologisch tolerierter Puffer" ist auf dem Fachgebiet bekannt. Ein physiologisch tolerierter Puffer ist vorzugsweise ein Phosphatpuffer, wie z.B. Natriumphosphat. Andere physiologisch tolerierte Puffer umfassen TRIS, Natriumacetat oder Natriumcitrat. Die Auswahl und Konzentration des Puffers sind auf dem Fachgebiet bekannt.

Die Insulin-Analoga der vorliegenden Erfindung bilden mit Zinkionen und einem Phenolderivat unter Bildung einer stabilen Hexamerstruktur einen Komplex. Sowohl das Zink als auch das 4

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Phenolderivat sind für die Erzielung eines Komplexes, der stabil ist und der zu einer raschen Dissoziation und zu einem raschen Wirkungsbeginn befähigt ist, kritisch. Der Hexamerkomplex besteht aus zwei Zinkionen pro Hexamer des Human-Insulin-Analogons und wenigstens drei Molekülen eines Phenolderivates, das aus einer aus m-Kresol, Phenol, oder einem Gemisch von m-Kresol und Phenol bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

Das lösliche, monomere Analogon wird dadurch in den Hexamerkomplex umgewandelt, dass man das monomere Analogon in einem Verdünnungsmittel auflöst, welches das Phenolderivat bei einem pH-Wert von etwa 7,5 enthält, und dass man Zink hinzufügt. Das Zink wird vorzugsweise als Salz zugegeben. Repräsentative Beispiele von Zinksalzen umfassen Zinkacetat, Zinkbromid, Zinkchlorid, Zinkfluorid, Zinkiodid und Zinksulfat. Der Fachmann wird erkennen, dass es viele andere Zinksalze gibt, welche in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden könnten. Vorzugsweise werden Zinkacetat oder Zinkchlorid verwendet, weil diese Salze keine neuen chemischen Ionen in kommerziell anerkannte Verfahren einbringen.

Dem Auflösen des Analogons kann durch einen Vorgang nachgeholfen werden, der normalerweise als Auflösung in einem sauren Medium bekannt ist; was bedeutet, dass der pH-Wert mit einer physiologisch tolerierten Säure, vorzugsweise HCl, auf etwa 3,0 bis 3,5 abgesenkt wird. Andere, physiologisch tolerierte Säuren umfassen Essig-, Zitronen- und Phosphorsäure. Der pH-Wert wird dann mit einer physiologisch tolerierten Base, vorzugsweise Natriumhydroxid, auf etwa 7,4 bis 7,5 eingestellt. Andere physiologisch tolerierte Basen umfassen Kaliumhydroxid und Ammoniumhydroxid.

Der Hexamerkomplex kann zu stabilen, rasch wirkenden, parenteralen Formulierungen formuliert werden. Die Konzentration des Insulin-Analogons in der Formulierung beträgt etwa 0,5 mg/ml bis etwa 20 mg/mi; vorzugsweise etwa 1,2 mg/ml bis etwa 17,5 mg/ml; und in höchstem Maße bevorzugt etwa 3,5 mg/ml. Im allgemeinen beträgt die Konzentration des Zinks etwa 10 μg/ml bis etwa 50 pg/ml. Die optimale Konzentration des Zinks in der Formulierung beträgt etwa 14 μg/ml bis etwa 35 μg/ml, wovon zwei Zinkionen an jedes Hexamer gebunden sind. Der Hexamerkomplex bindet, wenn er formuliert ist, bis zu sieben Phenolverbindungen. Im Allgemeinen sind an das Hexamer, wenn es formuliert ist, sechs Phenolverbindungen gebunden. Demgemäß wird die Phenolverbindung vorzugsweise im Überschuss zu der Formulierung zugegeben. Die Phenolverbindung wirkt auch als Konservierungsmittel. Die bevorzugte Konzentration beträgt daher etwa 23 mM bis 35 mM, in höchstem Maße bevorzugt 29 mM. Die Phenolverbindung ist vorzugsweise m-Kresol.

Zu der Formulierung kann ein isotonisch machendes Mittel, vorzugsweise Glycerin, zugegeben werden. Die Konzentration des isotonisch machenden Mittels fällt in den auf dem Fachgebiet für Insulinformulierungen bekannten Bereich und beträgt vorzugsweise etwa 16 mg/ml. Der pH-Wert der Formulierung kann mit einem physiologisch tolerierten Puffer, vorzugsweise einem Phosphatpuffer, wie Natriumphosphat, gepuffert werden.

Zum Zeitpunkt der Erfindung wurde es durch die veröffentlichte Literatur nahegelegt, dass der Fachmann die Aggregation beseitigen musste, um eine rasche Resorption zu erzielen. Es ist daher durchaus überraschend, dass das formulierte Hexamer-Analogon einen raschen Beginn der Wirkung mit sich bringt. Im Gegensatz zum Insulin hat die Bildung eines Insulin-Analogon-Hexamer-Komplexes keine nachteilige Wirkung auf die Zeit, welche erforderlich ist, um eine Spitzenserumkonzentration an Insulin-Analogon zu erzielen. Die Fig. 1 zeigt, bei Human-Patienten, die mittlere Geschwindigkeit der Antwort auf eine Glukoseinfusion bei Anwendung einer monomeres (ohne Zink formuliertes) LysB28ProB29-hl enthaltenden Formulierung; bzw. bei Anwendung eines formulierten LysB28ProB29-hl-Hexamers; bzw. bei Anwendung von regulärem Human-Insulin. Der formulierte Hexamer-komplex behält die rasche Wirkung des monomeren LysB28ProB29-hl bei. Die Resorptionsgeschwindigkeit ist signifikant höher als jene von regulärem Humaninsulin. Somit veranschaulichen die in der Fig. I angeführten Ergebnisse folgendes; Erstens haben hexameres LysB28ProB29-hl und monomeres LysB28ProB29-hl ähnliche Resorptionsgeschwindigkeiten; zweitens haben sowohl hexameres als auch monomeres LysB28ProB29-hl höhere Resorptionsgeschwindigkeiten als Insulin.

Die Formulierung, welche den Insulin-Analogon-Komplex als Hexamer enthält, ist stabil. Bei Vergleichsuntersuchungen zeigt das monomere LysB28ProB29-hl die höchste Abbaurate mit einer Zunahme in der Polymerbildung von 1,63% pro Woche über den Zeitraum der Untersuchung von 6 Wochen. Unformuliertes Humaninsulin unterliegt einer langsameren Rate der Polymerbildung von 5

AT 408 720 B 0,61% pro Woche. Nachdem das Insulin formuliert worden ist, ist die Rate der Bildung von Polymeren mit hohem Molekulargewicht für Insulin jedoch auf 0,095% pro Woche reduziert. Als Hexamer-komplex formuliertes Lys®28ProB29-hl zeigt eine verringerte Rate der Bildung von Polymeren eines höheren Molekulargewichtes von 0,11% pro Woche, was mit der für formuliertes Insulin beobachteten Rate vergleichbar ist. Diese Untersuchungen sind in Beispiel 1 beispielhaft veranschaulicht und in der Fig. 2 dargestellt.

Das Insulin-Analogon der vorliegenden Erfindung kann nach irgendeiner aus einer Vielfalt von anerkannten Peptidsynthesetechniken hergestellt werden, einschließlich der klassischen (Lö-sungs)verfahren, der Festphasenverfahren, der halbsynthetischen Verfahren und der Verfahren jüngeren Datums unter Verwendung von rekombinanter DNA. Beispielsweise beschreiben Chance et al., die EP 383 472 A, Brange et al., und die EP 214 826 A die Herstellung verschiedener monomerer Analoga.

Die nachstehenden Beispiele und Herstellungsverfahren bzw. Präparate werden bloß zur weiteren Veranschaulichung der Herstellung der Insulin-Analoga und der Erfindung angeführt.

Herstellungsverfahren 1 Herstellung eines Protein-Vorratsmaterials

Unformulierte Proben von Insulin und Lys Pro -hl wurden in einer Konzentration von 3,5 mg/ml in 7 mm Natriumphosphat, und mit oder ohne 1,25 mg/ml m-Kresol, 1,09 mg/ml Phenol und 16 mg/ml Glycerin, in Abhängigkeit von dem jeweils durchgeführten Versuch, hergestellt. Proben von LysB2SProB29-hl als Hexamer-Komplex wurden in identischer Weise hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, daß 19,7 μg/ml Zink zugegeben wurden. Alle Proben wurden einer Stufe des Ansäuerns auf einen pH-Wert von 3,0 unterworfen, zu welchem Zeitpunkt das Zink zu den Formulierungschargen hinzugefügt wurde. Der pH-Wert wurde dann auf 7,4 eingestellt. Vor der Zugabe der Phenolverbindungen wurden die Proteinkonzentrationen durch UV-Absorptionsspektroskopie unter Verwendung eines Doppelstrahlspektrophotometers vom Typus "AVIV Model 14 DS Double-Beam Spectrophotometer" bestimmt. Die Proteinkonzentrationen wurden wie in Frank, B.H., Pekar, A.H., und Veras, A,J. (1972), Diabetes, 21 (Beil. 2), 486-491, beschrieben berechnet.

Beispiel 1

Die chemische Stabilität

Der Abbau wurde dadurch ausgelöst, dass man formulierte bzw. unformulierte Präparate von Insulin und monomerem und hexamerem LysB28ProB29-hl bei 30°C inkubierte. Das formulierte Insulin bzw. hexamere LysB28ProB29-hl enthielt jeweils: 3,5 mg/ml Protein, 16 mg/ml Glycerin, 7mM zweibasiges Natriumphosphatheptahydrat, 1,25 mg/ml m-Kresol, 1,09 mg/ml Phenol und 0,0245 mg/ml Zinkoxid bei einem pH-Wert von 7,3 bis 7,4. Das unformulierte Insulin bzw. monomere LysB28ProB29-hl enthielt jeweils: 3,5 mg/ml Protein, 16 mg/ml Glycerin, 7mM zweibasiges Natriumphosphatheptahydrat, 1,25 mg/ml m-Kresol und 1,09 mg/ml Phenol bei einem pH-Wert von 7,3 bis 7,4. In Abständen von 7 Tagen wurden jeweils Proben aus dem Inkubationsgemisch von 30°C entnommen und auf die Bildung von Spezies mit einem hohen Molekulargewicht unter Anwendung von Größen-Ausschluß-HPLC geprüft. Die Analyse wird durchgeführt, indem man 20 μΙ-Proben in eine Dupont Zorbax GF-250 Spezial- (9,4x250 mm)-Säuie injiziert und ein Gemisch aus 0,4 M Ammoniumbicarbonat und Acetonitril als Elutionslösung verwendet (Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min bei Umgebungstemperatur und Detektion bei 214 nm). Die prozentmäßige Polymerbildung wird aufgrund des Verhältnisses zwischen dem Peak für die Anteile mit hohem Molekulargewicht und der Gesamtfläche der Peaks für die monomeren Anteile und die Anteile mit hohem Molekulargewicht bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Fig. 2 dargestellt.

Beispiel 2

Streuung von statischem Licht

Die Eigenschaften hinsichtlich der in-vitro-Dissoziation von monomerem LysB28ProB29-hl, LysB28Pro -hl als Hexamer-Komplex und von Insulin werden unter Anwendung der Streuung von statischem Licht geprüft.

Es werden drei formulierte bzw. unformulierte Proteinvorratslösungen wie oben beschrieben hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, daß die unformulierten Protein-Vorratslösungen weder Zink noch Glycerin noch Konservierungsmittel enthielten. Unter Verwendung dieser Vorratslösungen mit einer Konzentration von 3,5 mg/ml wird sowohl für das Insulin als auch für das LysB28ProB29-hl eine Reihe von Verdünnungen hergestellt, welche den Bereich von Proteinkonzentrationen von 6

Claims

AT 408 720 B 3,5 mg/mi bis 0,2 mg/ml umspannen. Alle Verdünnungen werden mit 7 mM Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,4 auf ein Endvolumen von 10 ml hergestellt, um die subkutane Stelle nach der Injektion nachzuahmen. Vor der Durchführung der SLS-Messungen wurden alle Lösungen durch 0,2 pm-Gelman-Filter mit geringem Bindungsvermögen für Proteine ("low protein binding") filtriert. Für diese Proben wird die Proteinkonzentration unter Anwendung von Umkehrphasen-HPLC bestimmt. Für die Analyse der formulierten Proben wurden für jeden Satz von Proteinproben proteinfreie Lösungsmittel-Leerproben hergestellt. Diese Leerproben enthielten Vehikel in der gleichen Konzentration wie die entsprechenden Sätze der Proteinproben. Für eine Analyse der unformulierten Proben wird eine einzige Leerprobe von 7 mM Natriumphosphat verwendet. Durch die Verwendung dieser angemessenen Lösungsmittel-Leerproben wurde gewährleistet, daß die Daten nur die durch den gelösten Stoff bewirkte Streuung widerspiegeln und daß es keinerlei zusätzlichen Beitrag zu dieser Streuung aufgrund von Veränderungen im Lösungsmittel gibt. Die Versuche der Streuung von statischem Licht (SLS) werden unter Verwendung einer Autokorrelationsvorrichtung vom Typus Brookhaven Instruments 2030AT und eines Goniometers durchgeführt. Alle Messungen werden mit einem 1 mm-Pinhole und einem Streuwinkel von 90° unter Verwendung einer Argonionenlaseranordnung vom Typus "Lexel Model 3500" bei 488 nm durchgeführt. Die Temperatur wird durch ein Neslab RTE-110-Temperaturbad auf 25°C gehalten. Das Signal bei der Sekundärelektronenvervielfacherröhre wird unter Verwendung von durch ein 0,1 pm-Filter filtriertem Toluol kalibriert. Die gewichtsmäßigen, mittleren Molekulargewichte werden unter Verwendung der Gleichungen berechnet, die in Cantor, C.R., und Schimmel, P.R., Biophysical Chemistry, W.H. Freeman and Company, New York, S. 838-843 (1982), beschrieben sind. Die Fig. 3 veranschaulicht die Ergebnisse der Untersuchungen mit Lichtstreuung. Das in-vitro-Dissoziationsprofil des LysB28ProB29-hl als Hexamer-Komplex und jenes des Insulins sind völlig verschieden voneinander. Die Ergebnisse für das Insulin-Analogon zeigen eine rasche Dissoziation, welche eine schnellere Resorption als jene des Human-Insulins ermöglicht. Obwohl beide Präparate Zustände eines hexameren Verbandes enthalten, und obwohl die Formulierungen gegenüber einem chemischen Abbau gleichermaßen stabil sind, so zeigt dennoch das hexamere LysB28ProB29-hl eine größere Neigung zum Dissoziieren als das Insulin. PATENTANSPRÜCHE: 1. Parenterale pharmazeutische Formulierung eines Humaninsulinanalogon-Komplexes, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex aus sechs Molekülen Humaninsulin, worin Pro in der Position B28 durch Asp, Lys, Leu, Val oder Ala ersetzt ist und Lys in der Position B29 Lys ist oder durch Pro ersetzt ist, Des(B28-B30)-Humaninsulin, oder Des(B27)-Human-insulin, sowie zwei Zinkionen, und wenigstens drei Molekülen eines Phenolderivats, das aus einer aus m-Cresol, Phenol oder einem Gemisch von m-Cresol und Phenol bestehenden Gruppe ausgewählt ist, besteht, wobei die Formulierung ein Zink-Phenol-Hexamer-komplex ist, der eine höhere Absorptionsgeschwindigkeit als Humaninsulin aufweist und die Formulierung, verglichen mit Humaninsulin, gegenüber einem chemischen Abbau gleich beständig ist.
2. Parenterale pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie weiterhin ein isotonisch machendes Mittel und einen physiologisch tolerierten Puffer enthält.
3. Parenterale pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie etwa 3,5 mg/ml Humaninsulinanalogon, 14 bis 35 pg/ml Zink und 23 bis 35 mM Phenolderivat enthält.
4. Parenterale pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Phenolderivat ein Gemisch aus m-Cresol und Phenol ist.
5. Parenterale pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie etwa 3,5 mg/ml Humaninsulinanalogon, etwa 19,7 μπη/ml Zink, etwa 29 mM m-Cresol, etwa 7 mM Natriumphosphat und etwa 16 mg/ml Glycerin enthält. 7 AT 408 720 B
6. Parenterale pharmazeutische Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Humaninsuiinanalogon LysB28ProB29- Humaninsulin ist.
7. Parenterale pharmazeutische Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Humaninsulinanalogon AspB28-Humaninsulin ist. HIEZU 3 BLATT ZEICHNUNGEN 8