RS49577B

RS49577B - Formulacije analoga insulina

Info

Publication number: RS49577B
Application number: YUP-396/95A
Authority: RS
Inventors: Diane Lee BAKAYSA; David Nettleship BREMS; Bruce Hill Frank; Henry Acken HAVEL; Allen Howard PEKAR
Original assignee: Eli Lilly And Company,
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-13
Publication date: 2007-04-10
Also published as: HK1015138A1; SE9502167D0; NL1000566A1; ATA101695A; NL1000566C2; NZ272359A; CN1122248A; CH689935A5; JPH083067A; DE19521720B4; NO952357L; BE1009408A5; HU227240B1; FR2721214A1; AT408720B; KR100382326B1; BR9502795A; PL181310B1; IL114151A0; GB9512038D0

Abstract

Kompleks analoga ljudskog insulina, naznačen time, što obuhvata: 6 molekula analoga ljudskog insulina, 2 jona cinka, i najmanje 3 molekula fenolnih derivata odabranih iz grupe koja se sastoji od m-krezola, fenola, ili smeše m-krezola i fenola; tako da kompleks analoga predstavlja heksamer, u kome je analog ljudskog insulina LysB28ProB29- ljudski insulin. Prijava sadrži još 1 nezavisan i 4 zavisna patentna zahteva. <patent>

Description

Ovaj pronalazak se odnosi na monomerske analoge ljudskog insulina. Preciznije, ovaj pronalazak se odnosi na kompleks heksamera koji obuhvata insulinski analog, cink, i derivat fenola.

Još od pojave insulina u 1920-im godinama neprestano su činjeni napori da se poboljša lečenje šećerne bolesti. Učinjen je veliki napredak u pogledu čistoće Insulina i njegove korisnosti. Takođe su razvijene različite formulacije sa različitim vremenskim delovanjima. Uprkos ovim poboljšanjima terapija supkutanom injekcijom i dalje ne uspeva da obezbedi pacijenta sa odgovarajućom regulacijom i normalnom glikemskom kontrolom. Česte digresije od normalnih nivoa glikemije tokom života pacijenta dovode do hiper ili hipoglikemije, i do dugotrajnih komplikacija uključujući retinopatiju, neuropatiju, nefropatiju, i mikro i makroangiopatiju.

Da bi se izbegli ekstremni glikemski nivoi, dijabetičari često koriste terapiju višekratne injekcije, pri čemu se insulin daje uz svaki obrok. Međutim ova terapija još nije optimizirana. Insulin koji najbrže deluje, i komercijalno je dostupan, dostiže vrhunac isuviše kasno nakon ubrizgavanja i traje isuviše dugo da bi optimalno kontrollsao nivoe gllkoze. U skorije vreme je učinjen znatan napor da bi se stvorile formulacije insulina i formulacije insullnskog analoga koje menjaju kinetiku postupka supkutane apsorpcije.

Iz razloga što sve komercijalne farmaceutske formulacije insulina sadrže insulin u samo-vezanom stanju i predominantno u obliku cink-heksamera, veruje se da faza ograničavanja brzine apsorpcije insulina iz rezerve supkutane injekcije u krvotok predstavi ja đisoci jaci ju samo-sakupl Jenog heksamera insulina. Brange et al. u Diabetes Care 13: 923-954 (1990). Radi ubrzanja ovog postupka apsorpcije, razvijeni su monomerski analozi insulina. Ovi monomerski analozi poseduju znatno brži početak aktivnosti nego insulin, dok zadržavaju biološku aktivnost nativnog ljudskog insulina. Oni obezbeđuju brzu apsorpciju radi dovodjenja vremena injekcije i maksimalnog delovanja insulina u blisku vezu sa postprandijalnom digresijom glikoze koja Je povezana sa reakcijom na obrok. DobiJanje različitih monomerskih analoga Je opisano kod Chance-a et al. , EPO publikacija br. 383 472, 1 kod Brange et al. , EPO publikacija br. 214 826.

Nažalost, modifikacije insulina, koje uzrokuju da ovi analozi budu monomerski, takodje rezultiraju visokom brzinom obrazovanja polimera kod parenteralnih formulacija. Zbog toga Sto dolazi do isticanja insulinskih preparata kada su postignuti nivoi1%polimera (U.S. Pharmacopoeia, 1990), smanjivanje ove vrste degradacije je veoma značajno kod reduciranja neželjenih sporednih dejstava. Prema tome, bilo je poželjno formulisati monomerske analoge na takav način da se utiče na analog da se samo-vezuje radi stvaranja stabilne konformabilnosti a da se pak očuva njegova brza apsorpcija.

Dodavanje izvesnih metalnih jona, prvenstveno cinka, povećava hemijsku stabilnost podsticanjem vezivanja insulina 1 obrazovanja heksamera, posebno konformacije Zn(II)-T . Osim toga, pokazalo se da se jedinjenja fenola posebno vezuju za insulinski heksamer i izazivaju alosterićnu konformabilnu promenu, pri čemu osam amino kiselina B-lanca sa N-završetkom se prevode iz produžene konformacije alfa-heliksu.Derewenda, et al. Nature. 338: 594-596 (1989). Ovo stanJeTckonformacije kod vezivanja fenolom je poznato kao Zn(II)-R stanje.

Sasvim suprotno ovim dobro utvrdjenim opažanjima da se insulin lako agregira u prisustvu cinka radi obrazovanja dobro definisane, stabilne Zn-heksamer strukture, rana proučavanja monomerskih analoga insulina su otkrila da je bilo kakva agregacija izmedju cinka i analoga insulina različita od one zapažene kod insulina. B. H. Frank, kopije tekstova i slajdova sa predavanja održanog na Konferenciji o insulinu pod nazivom "Self-Association and Conformational Studies on Human Proinsulln and Insulin Analogs", Universltv of York, (August 29 - September 1, 1989). Osim toga, veoma stabilan Zn-heksamer kompleks, kako Je primećeno kod Insulina, nije zapažen kod monomerskih analoga. Id. Brems et al., Protein Englneerlng, 5:6,

B28 B29 ~

527-533 (1992), objašnjavaju da Je monomerski Lys Pro -hl manje sklon dimerizaciji i samo-vezivanju za oblike veće molekulske mase nego ljudski

B28 B29 insulin. Brems et al. nastavljaju da zaključuju da Asp Pro -hl, Ala828Pro829 1 Lvs828?™829-*!! pokazuju malu, ili nikakvu Zn-lndukovanu vezu, a da Pro829 insulin, Lys828 insulin, Asp828 insulin, 1 Ala828 Insulin pokazuju Zn-lndukovanu vezu, ali manje od Zn-insulina. Osim toga, neobjavljene eksperimentalne opservacije od strane ovih pronalazača ukazuju da je uočena veza sa cinkom; međutim, takva veza između analoga i cinka se razlikuje od Insulina. Veza koja je uočena kod ovih analoga je u mnoštvu oblika većih molekulskih masa 1 različita od predominantnlh, dobro deflnlsanih Zn-lnsulinsklh heksamera. Prema tome, Jasno Je da monomerski analozi insulina ne obrazuju Zn(II)-Tg podudaranje na način analogan insulinu. ;S obzirom na objavljenu literaturu, iznenađujuće je da ovaj pronalazak obezbeđuje monomerske analoge Insulina u dobro deflnlsanom, stabilnom kompleksu Zn-fenol heksamera. Ovaj kompleks heksamera je različit od onih kompleksa uočenih kod insulina pod identičnim uslovima. Kompleksi insulina sa cinkom i fenolom nalaze se u Zn(II)-R„ b podudarnosti. Kompleks heksamera iz ovog pronalaska nije identičan ovoj podudarnosti. Takođe, sasvim primetno, heksamerski kompleks analoga insulina ima mnogo veću sklonost ka dlsocijaciji nego Insulin. Ova sklonost]^dlsocijaciji prelazi u željenu osobinu brzog delovanja. ;Brange et al. u Current Opinion in Structural Biologv I: 934-940 (1991) prikazuju razne brzo-delujuće stabilne monomere insulina i navode da je očigledan način za stvaranje brzo-delujućeg insulina sprečavanje obrazovanja dimera ili heksamera. Slično, Brange et al. u Diabetes Care 13: 923-954 ;(1990) objašnjavaju da, kada se insulin daje kao heksamer, pored njegove usporenije slobodne difuzije, heksamer mora biti više blokiran u steričkom pogledu nego monomer tokom difuzije u supkutis i/ili za vreme prolaza kroz membranu sa kapilarima. Osim toga, kada se ubrigava supkutano, Zn(II)-Rb„ podudaranje se ne odvaja direktno već se mora transformisati kroz Zn(II)-Tb„ podudaranje. Ove promene kod podudaranja^ dlsocijaciji0Je odatle proizlazi usporavaju početak aktivnosti. Prema tome, stručnjak je u vreme ovog pronalaska verovao da bi stremljenja ka hemijskoj stabilizaciji monomerskog analoga insulina sa cinkom, obrazovanjem dobro definisanog, heksamerskog kompleksa, bila neuspešna, ili ako bi bila uspešna, žrtvovala bi brz početak željene aktivnosti. ;Ova formulacija predstavlja heksamerski kompleks indukovan Zn-fenolom koji se brzo apsorbuje. Brzina apsorpcije za heksamerski kompleks Je najmanje dva puta ona primećena kod insulina. Ipak, kada se heksamerski kompleks formuliše, on je podjednako stabilan u poređenju sa insulinom prema hemijskoj degradaciji. Prema tome, iznenađujuće Je da ovaj pronalazak prevodi monomerski analog insulina u dobro definlsan, stabilan heksamerski kompleks Zn-fenol. Primetno je da, kada Je formulisan, ovaj heksamerski kompleks zadržava osobine brzog delovanja zajedno sa monomerskim analogom insulina. Prema tome, ovaj pronalazak obezbeđuje parenteralne formulacije heksamerskog kompleksa analoga insulina koji je stabilan i brzo-delujući. ;Ovaj pronalazak obezbeđuje kompleks analoga ljudskog insulina, koji obuhvata: 6 molekula analoga ljudskog insulina, 2 jona cinka, i najmanje 3 molekula derivata fenola odabranog iz grupe koja se sastoji od m-krezola, fenola, ili sraese m-krezola 1 fenola; tako da Je kompleks analoga heksamer. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje parenteralne formulacije koje obuhvataju heksamerski kompleks. ;B28 B29 ;Slika 1 predstavlja grafički prikaz profila delovanja Lys Pro -hl i ljudskog insulina. Grafikon predstavlja srednju brzinu reakcije prilikom infuzije glikoze. Slika prikazuje prednosti ovog pronalaska. ;Đ28 B29 ;Slika 2 predstavlja grafički prikaz stabilnosti Lys Pro -ljudskog insulina. Grafikon predstavlja stabilnost merenjem obrazovanja polimera ;B28 B29 analoga insulina u heksamerskoj vezi u poređenju sa monomerskim Lys Pro ljudskim insullnom i insulinom. Slika prikazuje prednosti ovog pronalaska. ;Slika 3 predstavlja grafički prikaz disocijacije Lys B28 Pro B29-ljudskog insulina u heksamerskom kompleksu. Grafikon predstavlja in vitro disocijaciju ;B28 B29 ;formulisanog insulina (0); Lys Pro -hl formulisan kao heksamerski ;B28 B29 kompleks ( ); neformulisani insulin (□); i monomerski Lys Pro -hl (*) kontrolisano razbacivanjem statičke svetlosti pri 488 nm pod uglom od 90°. Formullsani uzorci su sadržali 0.5 mola Zn. po molu proteina, 1.25mg/ml m-krezola i 1.09mg/ml fenola, 7mM natrijumfosfata i 16mg/ml glicerola. Neformulisani i monomerski uzorci nisu sadržali dodatne ekscipijente. SLika prikazuje prednosti ovog pronalaska.

Kao sto je napred zapaženo, ovaj pronalazak obezbeđuje kompleks monomerskog analoga ljudskog insulina kao heksamer. Izraz "monomerski analog insulina" ili "analog ljudskog insulina" kako je ovde upotrebijen predstavlja ljudski insulin u kojem: Pro na poziciji B28 je supstituisan sa Asp, Lys, Leu, Val, ili Ala; a Lys na poziciji B29 je lizin ili supstituisan prolinom;

Des (B28-B30); ili

Des (B27).

Monomerski analozi insulina su opisani kod Chance et al., EPO publikacija broj 383 472, i Brange et al., EPO publikacija broj 214 826, 1 ovde su obuhvaćeni referencom. Monomerski analozi insulina su manje skloni dimerizaciji ili samo-vezivanju nego insulin.

Stručnjak će uvideti da su moguće druge modifikacije. Ove modifikacije su veoma prihvaćene u tehnici 1 obuhvataju zamenu ostatka histidina na poziciji BIO sa asparaginskom kiselinom; zamena ostatka fenilalanlna na poziciji BI sa asparaginskom kiselinom; zamena ostatka treonina na poziciji B30 sa alaninom; zamena ostatka serina na poziciji B9 sa asparaginskom kiselinom; izbacivanje amino kiselina samo na poziciji BI ili u kombinaciji sa Izbacivanjem na poziciji B2; i Izbacivanje treonina sa pozicije B30.

Sve skraćenice amino kiselina korišćene u ovom pronalasku su one prihvaćene od strane Američkog ureda za patentne i žigovekaoSto Je izloženo u 37 C.F.R.$1.822 (b) (2). Posebno pogodan monomerski analog Insulina Je LysB28ProB29-1Judski insulin (B28 Je Lys; B29 Je Pro).

Izraz "tretiranje", kako je ovde upotrebijeno, opisuje postupanje sa pacijentom i brigu o njemu u cilju borbe protiv bolesti, stanja, ili obolenja, i obuhvata davanje Jedlnjenja lz ovog pronalaska radi sprečavanja početka pojave simptoma 111 komplikacija, olakšavanje simptoma ili komplikacija, ili ellmlnlsanje bolesti, stanja, Ili obolenja.

Izraz "izotonlčno sredstvo" se odnosi na sredstvo koje je fiziološki tolerlsano i obezbeđuje odgovarajuću tonlčnost formulaciji radi sprečavanja čistog protoka vode duž membrane ćelije. Jedlnjenja, kao Sto je glicerin, se obično upotrebljavaju u takve svrhe u poznatim koncentracijama.

Izraz "derivat fenola" ili "fenolski" je m-krezol, fenol ili smeša m-krezola i fenola. Pogodno, fenolski predstavlja m-krezol.

Izraz "fiziološki tolerisan pufer" je poznat u tehnici. Fiziološki tolerisan pufer je pogodno fosfatni pufer, kao što je natrijum fosfat. Drugi fiziološki tolerisani puferi obuhvataju TRIS, natrijum acetat, ili natrijum citrat. Selekcija i koncentracija pufera je poznata u tehnici.

Insulinski analozi iz kompleksa ovog pronalaska sa Jonima cinka i derivatom fenola obrazuju stabilno, heksamersko podudaranje. I derivat cinka i derivat fenola su kritični kod ostvarivanja kompleksa koji je stabilan i sposoban za brzu disocijaciju°0<;etak delovanja. Kompleks heksamera se sastoji od 2 Jona cinka po heksameru analoga ljudskog insulina i najmanje 3 molekula derivata fenola odabranog iz grupe koja se sastoji od m-krezola, fenola, ili smeše m-krezola 1 fenola.

Rastvorljiv monomerski analog se prevodi u kompleks heksamera rastvaranjem monomerskog analoga u razblaživaču koji sadrži derivat fenola pri pH od oko 7.5 i dodavanjem cinka. Cink se pogodno dodaje kao so. Reprezentativni prlmerl cinkovih soli obuhvataju cink acetat, cink bromld, cink hlorid, cink fluorid, cink jodid i cink sulfat. Stručnjak će uvideti da postoji mnogo drugih soli cinka koje bi se takođe mogle upotrebljavati u postupku ovog pronalaska. Pogodno, cink acetat Ili cink hlorid se upotrebljava zbog toga Sto ove soli ne dodaju nove hemljske Jone komercijalno prihvaćenim postupcima.

Rastvaranje analoga može biti potpomognuto onim Sto je obično poznato kao rastvaranje kiselinom, tj. pH se smanji na oko 3.0 do 3.5 sa fiziološki tolerisanom kiselinom, pogodno HC1, radi potpomaganja kod rastvaranja monomerskog analoga. Druge fiziološki tolerlsane kiseline obuhvataju slrćetnu kiselinu, limunovu kiselinu, i fosfornu kiselinu. pH se zatim podešava sa fiziološki tolerisanom bazom, pogodno natrijum hidroksldom do oko 7.4 do 7.5. Druge fiziološki tolerisane baze ukljućuju kalijum hidroksid i amonijum hidroksid.

Kompleks heksamera se može formulisati u stabilne, brzo-delujuće parenteralne formulacije. Koncentracija insulinskog analoga u formulaciji je oko O.Smg/ml do oko 20mg/ml; pogodno oko 1.2mg/ml do oko 17.5mg/ral; najpogodnije oko 3.5mg/ml. Opste gledano koncentracija cinka je oko lOjig/ml do oko 50jjg/ml. Optimalna koncentracija cinka u formulaciji je od oko H;xg/ml do oko 35jig/ml, od kojih su 2 jona cinka vezana za svaki heksamer. Kada je formulisan, kompleks heksamera se vezuje u isto tako velikom broju kao 7 derivata fenola. Obično je to slučaj kada su formulisani 6 derivata fenola vezani za heksamer. Prema tome, višak derivata fenola se pogodno dodaje formulaciji. Derivat fenola takođe deluje kao zaštitno sredstvo. Prema tome, pogodna koncentracija je oko 23 mM do 35 mM, najpogodnije 29 mM. Derivat fenola je pogodno m-krezol.

Izotonično sredstvo, pogodno glicerin, se može dodavati formulaciji. Koncentracija izotoničnog sredstva je u opsegu poznatom u tehnici za formulacije insulina, pogodno oko 16mg/ml. pH formulacije može biti puferovan fiziološki tolerisanim puferom, pogodno fosfatnim puferom, kao što je natrijum fosfat.

U vreme ovog pronalaska, objavljena literatura je ukazivala da je stručnjaku trebalo da eliminiše agregaciju u cilju dobijanja brze apsorpcije. Prema tome, sasvim je neočekivano da formulisani analog heksamera dovodi do brzog početka delovanja. Suprotno insulinu, obrazovanje heksamerskog kompleksa insulinskog analoga ne utiče nepovoljno na vreme potrebno za postizanje maksimalne koncentracije serumskog analoga insulina. Slika I prikazuje, kod 1judi-pacijenata, srednju brzinu reakcije prilikom infuzije

B28 B29

glikoze na formulaciju koja sadrži monomerski Lys Pro -hl (formulisan bez cinka); formulisan Lys B28 Pro B29-hl heksamer; i običan ljudski insulin. Formulisan kompleks heksamera zadržava brzo delovanje monomerskog

B28 B29

Lys Pro -hl. Brzina apsorpcije je značajno brža nego kod običnog ljudskog insulina. Stoga, rezultati na slici I ilustruju: prvo, heksamerski

T B28,, B29 . T .... B28D B29 . T .. , . Lys Pro -hl i monomerski Lys Pro -hl imaju slične brzine apsorpcije;

B28 B29

drugo, i heksamerski i monomerski Lys Pro -hl imaju veće brzine apsorpcije nego insulin.

Formulacija koja obuhvata kompleks insulinskog analoga kao heksamera je B28 B29

stabilna. U komparativnim proučavanjima, monomerski Lys Pro -hl pokazuje najveću brzinu degradacije sa 1.63% povećanjem obrazovanja polimera nedeljno tokom šestonedeljnog proučavanja. Neformulisan ljudski insulin podvrgava se manjoj brzini obrazovanja polimera od 0.61% nedeljno. Medjutim, nakon formulisanja, brzina obrazovanja polimera velike molekulske mase se smanjuje

B28 B29

na 0.0957. nedeljno za insulin. Formulisan Lys Pro -hl, kao kompleks heksamera, pokazuje umanjenu brzinu obrazovanja polimera veće molekulske mase od 0.117. nedeljno, koja se može uporediti sa brzinom zapaženom za formulisani insulin. Ova proučavanja su prikazana primerima u Primeru 1 i ilustrovana na Slici 2.

Analog insulina iz ovog pronalaska se može dobiti bilo kojom od mnoštva različitih priznatih tehnika sinteze peptida uključujući klasične metode (rastvora), metode čvrste faze, polu-sintetičke metode, i skorašnje rekombinantne DNK metode. Na primer, Chance et al., EPO publikacija br. 383 472, i Brange et al. , EPO publikacija broj 214 826, prikazuju dobijanje različitih monomerskih analoga.

Sledeći primeri i dobijanja su dati samo radi dalje ilustracije dobijanja insulinskih analoga i ovog pronalaska. Obim ovog pronalaska nije protumačen kao da se sastoji samo od sledećih primera.

Dobi. ian. ie 1

Pobijanje zalihe proteina

B28 B29 Neformulisani uzorci insulina i Lys Pro -hl su dobijeni pri 3.5mg/ml u 7 mM natrijum fosfata, i sa ili bez 1.25mg/ml m-krezola, 1.09mg/ml fenola i 16mg/ml glicerola, zavisno od eksperimenta koji se vrši. Uzorci

B28 B29

Lys Pro -hl kao kompleks heksamera, dobijeni su na identičan način osim što je dodato 19.7/ig/ml cinka. Svi uzorci su uzeti preko faze digresije kiseline do pH 3.0, kada je dodat cink u formulacijskim grupama. pH je zatim podešen do 7.4. Koncentracije proteina su utvrđene pre dodavanja derivata fenola putem ultraljubičaste apsorpcione spektroskopije korišćenjem spektrofotometra, AVIV model 14 DS sa dvostrukim zrakom. Koncentracije proteina su sračunate onako kako je opisano kod Frank-a, B.H., Pekar-a, A.H. i Veros-a, A.J. (1972) Diabetes. 21 (Suppl. 2), 486-491.

Primer 1.

Hemi. lska stabilnost

Degradacija je započeta inkubiranjem formulisanih i neformulisanih B28 B29 o preparata insulina i monomerskih i heksamerskih Lys Pro -hl na 30 C.

B28 B29

Formulisani insulin i heksamer Lys Pro -hl sadržavali su: 3.5mg/ml proteina, 16mg/ml glicerola, 7 mM dvobaznog heptahidrata natrijumfosfata, 1.25mg/ml m-krezola, 1.09mg/ml fenola, i 0.0245mg/ml cinkoksida pri pH od 7.3

B28 B29

do 7.4. Nef ormul isan insulin i monomerski Lys Pro -hl sadržavali su: 3.5mg/ml proteina, 16mg/ml glicerola, 7 mM dvobaznog heptahidrata natriJumfosfata, 1.25mg/ml m-krezola, i 1.09mg/ml fenola, pri pH od 7.3 do 7.4. U intervalima od 7 dana, uzorci su uklonjeni iz inkubacije na 30°C i analizirani radi utvrđivanja obrazovanja vrsta sa velikom molekulskom masom korišćenjem HPLC uz isključivanje veličine. Analiza je izvršena ubrizgavanjem 20fil uzoraka na kolonu tipa Dupont Zorbax GF-250 Special (9.4x2S0mm), korišćenjem smeše od 0.4 M amonijumbikarbonata i acetonitrila kao eluirajućeg rastvora (brzina protoka od 0.5ml/mln na temperaturi okoline i detekciji pri 214nm). Obrazovanje polimera u procentima je utvrđeno na osnovu odnosa maksimuma velike molekulske mase prema ukupnoj zoni monomera i maksimumima velike molekulske mase. Rezultati su ilustrovani na slici 2.

Primer 2

Razbacivanje statičke svetlosti

Osobine in vitro disocijacije monomerskog Lys 528 Pro B29 -hl, Lys 628 Pro B29-hl kao kompleksa heksamera i insulin su ispitivani pomoću razbacivanja statičke svetlosti.

Tri formulisana i neformulisana rastvora zalihe proteina su dobijena kao što je opisano, osim što neformulisani rastvori zalihe proteina nisu sadržavali cink, glicerol, ili zaštitna sredstva. Korišćenjem ovih zaliha od

B28 B29

3.5mg/ml, dobijen je čitav niz razblaživanja za insulin i Lys Pro -hl, reducirajući opseg koncentracije proteina od 3.5mg/ml na 0.2mg/ml. Sva razblaživanja su obavljena do konačne zapremine od lOml sa 7 mM natrijumfosfatnim puferom, pH 7.4, u cilju podražavanja supkutane pozicije nakon ubrizgavanja. Svi rastvori su filtrirani kroz vezivne filtere sa proteinom od 0.2p:m, tipa Gelman, pre izvođenja SLS merenja. Koncentracija proteina za ove uzorke je utvrđena korišćenjem HPLC sa povratnom fazom.

Za analizu formulisanih uzoraka, blanketi rastvaraća bez proteina su pripremljeni za svaki komplet uzoraka proteina. Ovi blanketi su sadržavali ekscipijente u istoj koncentraciji kao odgovarajući kompleti uzorka proteina. Za analizu neformulisanih uzoraka, korišćen je jedan blanket od 7 mM natrijumfosfata. Korišćenjem ovih pogodnih blanketa rastvaraća obezbedilo je da su podaci odražavali samo rastvorene rasute supstance, a pri tome nikakav dodatni doprinos usled promena rastvaraća.

Eksperimenti sa rasipanjem statičke svetlosti (SLS) su vršeni pomoću autokorelatora i goniometra tipa Brookhaven Instruments 2030AT. Sva merenja su vršena sa rupicom od igle od lmm pod uglom rasipanja od 90°, korišćenjem laserske opreme tipa Lexel Model 3500 sa Jonom argona pri 488nm. Temperatura se održava na 25°C u temperaturnom kupatilu tipa Neslab RTE-110. Signal na cevi fotomultiplikatora je kalibrisan korišćenjem 0.ljun filtriranog toluena.

Molekulske mase prosečne težine su sračunate pomoću jednačina opisanih kod Cantor-a, C. R., i Schimmel-a, P.R., Biophysical Chemlstry. W. H. Freeman and Company, New York, pp. 838-843 (1982). Slika 3 prikazuje rezultate

B28 B29

proučavanja rasipanja svetlosti. Profil::in vitro disocijacijeLys Pro _nI kao kompleksa heksamera i insulina Je sasvim različit. Rezultati insulinskog analoga pokazuju bl'ZU disccijacij&°Je omogućavabržu apsorpciju nego ljudski insulin. Mada oba preparata sadrže vezane heksamere, a formulacije su

B28 B29

podjednako stabilne na hemijsku degradaciju heksamer Lys Pro -hl ima veću sklonost ka disocijaciji nego insulin.

Claims

1.Kompleks analoga ljudskog insulina, naznačen time, Sto obuhvata: 6 molekula analoga ljudskog insulina, 2 jona cinka, i najmanje 3 molekula fenolnih derivata odabranih iz grupe koja se sastoji od m-krezola, fenola, ili smeše m-krezola i fenola; tako da kompleks analoga predstavlja heksamer, u kome je analog ljudskog insulina LysB28ProB29- ljudski insulin.

2. Parenteralna farmaceutska formulacija, naznačena time, Sto obuhvata kompleks analoga ljudskog insulina prema zahtevu 1.

3. Parenteralna farmaceutska formulacija prema zahtevu 2, naznačena time, što dalje obuhvata izotonično sredstvo i fiziološki tolerisan pufer.

4. Parenteralna farmaceutska formulacija prema zahtevu 3, naznačena time, što obuhvata 3,5mg/ml LysB28ProB29- ljudskog insulina, 19,7 ug/ml cinka, 7mM natrijumfosfata, 16 mg/ml glicerina, i 29 mM m-krezola.

5. Kompleks analoga ljudskog insulina prema zahtevu 1, naznačen time, što je taj kompleks analoga u obliku rastvora.

6. Parenteralna farmaceutska formulacija prema zahtevu 2, naznačena time, što je koncentracija analoga insulina od 0,5 mg/ml do 20 mg/ml, a koncentracija cinka je od 10 ug/ml do 50 ug/ml.