KR100382326B1

KR100382326B1 - 인슐린유사제제

Info

Publication number: KR100382326B1
Application number: KR1019950015782A
Authority: KR
Inventors: 다이안리바카이사; 데이비드네틀쉽브렘스; 브루스힐프랭크; 헨리악켄하벨; 알렌하워드페카
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-14
Publication date: 2003-07-07
Also published as: FI118207B; RU2152399C2; RO113530B1; GR1003004B; ITMI951278A1; IE68853B1; UA26874C2; SE9502167D0; DK67795A; PT101722B; CO4410203A1; IL114151A; SE509052C2; BE1009408A5; MY115631A; LU88626A1; PL181310B1; JP3171541B2; PT101722A; NO952357L

Abstract

본 발명은 인간 인슐린 유사체 육량체 착화합물 및 배합물을 개시한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 하기를 포함하는 다양한 비경구 배합물에 관한 것이다: 육량체 구조의 인간 인슐린 유사체, 아연 이온, 및 m-크레졸, 페놀, 또는 m-크레졸과 페놀의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 3 분자 이상의 페놀성 유도체. 상기 배합물은 작용의 신속한 개시를 제공한다.

Description

인슐린 유사 제제

본 발명은 인간 인슐린의 단량체성 유사체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인슐린 유사체, 아연, 및 페놀성 유도체를 포함하는 육량체 복합체에 관한 것이다.

1920년대에 인슐린이 처음 밝혀진 이래로 계속적인 진보가 이루어져 진성 당뇨병의 치료가 개선되어 왔다. 인슐린의 순도 및 이용효율면에서 주된 진보가 이루어졌다. 상이한 시간-작용을 가지는 다양한 제제 또한 개발되었다. 이러한 개선에도 불구하고, 피하 주사 치료는 아직도 환자에게 편리한 조절 및 정상화된 혈당 조절을 충분히 제공하지 못하고 있다. 환자의 일생에 걸쳐 정상 혈당량으로부터 자주 높아지거나 낮아지면 과혈당증 또는 저혈당증, 및 망막증, 신경병증, 신장병증, 및 소혈관증 및 대혈관증을 비롯한 장기 간의 합병증으로 전이된다.

극도의 혈당량을 피하기 위하여, 당뇨병 환자는 가끔 복합 주사치료를 행함으로써 인슐린을 식사때마다 투여한다. 그러나, 상기 치료법은 아직 최적화되지 않았다. 구입할 수 있는, 가장 신속-작용하는 인슐린은 주사 후 너무 늦게 피크에 이르고 또한 너무 길게 지속되어 글루코스 양을 최적으로 조절하지 못한다. 최근에, 상당한 노력을 들여 피하 흡수 과정의 동역학을 바꾸는 인슐린 제제 및 인슐린 유사체 제제를 제조하였다.

모든 시판중인 인슐린의 제약학적 제제는 자체-회합 상태 및 주로 아연-육량체 형태의 인슐린을 함유하기 때문에, 피하 주사 저장부로부터 혈류로의 인슐린의 흡수에 있어서 속도-제한 단계는 상기 자체-집합된 인슐린 육량체의 해리 단계라고 생각된다. 브랜지(Brange)등의 문헌[Diabetes Care 13: 페이지 923-954(1990)] 참조. 상기 흡수 과정을 촉진하기 위하여, 단량체성 인슐린 유사체가 개발되었다. 이들 단량체성 유사체는 천연적인 인간 인슐린의 생물학적 활성은 보유하면서 인슐린보다는 상당히 신속한 활성의 개시를 나타낸다. 상기 유사체는 흡수를 신속하게 하여 인슐린의 주사 시간 및 최대 작용이 식사에의 반응에 연관되는 식후의 글루코스 변화와 보다 근접 되도록 한다. 다양한 단량체성 유사체의 제조 방법은 챈스(Chance)등의 유럽 특허공개 제 383 472 호 및 브랜지등의 유럽 특허 공개 제 214 826 호에 개시되어 있다.

불행하게도, 상기 유사체가 단량체로 되도록 인슐린을 변형시키면, 비경구 제제에 중합체가 또한 고속으로 형성된다. 중합체의 함량이 1%가 되면 인슐린 제제의 유효기간이 만료되기 때문에(미합중국 약전, 1990), 상기 형태의 변성을 최소화하는 것은 원치 않는 부작용을 감소시키는 데에 아주 중요하다. 그러므로, 단량체성 유사체를 자체-회합시켜 안정한 구조를 형성시키고, 그의 신속한 흡수를 계속 유지하는 방식으로, 상기 유사체를 배합하는 것이 바람직하였다.

특정 금속 이온(주로 아연)의 첨가는, 인슐린을 회합시켜 육량체, 구체적으로는 Zn(II)-T₆구조를 형성함으로써 화학적 안정성을 증진시킨다. 또한, 페놀성 물질은 상기 인슐린 육량체에 특이적으로 결합하여 알로스테릭 구조 변화를 유도함으로써 B-쇄의 8개의 N-말단 아미노산을 상기 펼쳐진 구조로부터 알파-나사선 구조로 전환시키는 것으로 나타났다. 데레웬다(Derewenda)등의 문헌[Nature, 338: 페이지 594-596 (1989)] 참조. 상기 페놀-결합 구조 상태는 Zn(II)-R 상태로 공지되어 있다.

인슐린이 아연의 존재하에 쉽게 집합되어 분명하게 규명된, 안정한 Zn-육량체 구조를 형성한다는 상기의 확립된 관찰 결과와는 완전히 대조적으로, 단량체성 인슐린 유사체에 대한 초기의 연구에서는 아연과 상기 인슐린 유사체사이의 임의의 집합이 인슐린의 경우 관찰된 것과는 상이함을 밝혀내었다. 프랭크(B. H. Frank)의 인슐린에 관한 회의 "인간 프로인슐린 및 인슐린 유사체에 관한 자체-회합 및 구조적 연구(Self-Association and Conformational Studies on Human Proinsulin andInsulin Analogs)"에서 행해진 강의의 교재 및 슬라이드 사본, 요크 대학, (1989년 8월 29일부터 9월 1일까지) 참조. 또한, 인슐린의 경우 관찰된 고도로 안정 한 Zn-육량체 복합체가 단량체성 유사체의 경우에는 관찰되지 않는다. 브렘스(Brems)등의 문헌[Protein Engineering, 5: 페이지 6, 527-533(1992)]에는, 단량체성 Lys^B28Pro^B29-hI는 이량체화 및 보다 고분자량의 형태로 자체-회합하는 경향이 인간의 인슐린보다 적음이 개시되어 있다. 브렘스등은 계속하여 Asp^B28Pro^B29-hI, Ala^B28Pro^B29-hI, 및 Lys^B28Pro^B29-hI는 Zn-유도성 회합을 거의 또는 전혀 나타내지 않으며, 또한 Pro^B29인슐린, Lys^B28인슐린, Asp^B28인슐린, 및 Ala^B28인슐린은 Zn-유도성 회합을 나타내지만 Zn-인슐린보다는 덜 하다고 결론짓고 있다. 본 발명자에 의한 후속의, 미공개된 실험 관찰 결과는 아연과의 회합이 관찰되나; 상기 유사체와 아연사이의 이러한 회합은 인슐린과는 상이함을 제시하였다. 상기 유사체의 경우 관찰된 상기 회합은 고분자량 형태의 군집이 되며 주된, 분명하게 규명된 Zn-인슐린 육량체와는 구별된다. 그러므로, 단량체성 인슐린 유사체는 인슐린과 유사한 방식으로 Zn(II)-T₆구조를 형성하지 않음이 분명하다.

공개된 문헌을 고려할 때, 본 발명 이 분명하게 규명된, 안정한 아연-페놀 육량체 복합체의 단량체성 인슐린 유사체를 제공한다는 것은 놀랍다. 상기 육량체 복합체는 동일 조건하의 인슐린의 경우 관찰되는 복합체와는 독특하게 상이하다. 아연 및 페놀과의 인슐린 복합체는 Zn(II)-R₆구조이다. 본 발명의 상기 육량체 복합체는 상기 구조와 동일하지 않다. 또한 아주 분명하게는, 상기 인슐린 유사체 육량체 복합체는 인슐린보다 해리되는 성향이 훨씬 더 크다. 상기 해리 성향을 목적하는 신속-작용 특성으로 해석한다.

브랜지등의 문헌[Current Opinion in Structural Biology 1: 페이지 934-940(1991)]은, 다양한 신속-작용하는 안정한 인슐린 단량체를 개시하고 있으며 또한 신속-작용하는 인슐린을 제조하는 분명한 경로는 이량체 또는 육량체의 형성을 방해하는 것이라고 기술하고 있다. 마찬가지로, 브랜지등의 문헌[Diabetes Care 13: 페이지 923-954(1990)]은, 인슐린이 육량체로서 투여될 때, 상기 육량체는 저속의 자유 확산에 더하여, 피하 조직에서의 확산 수송 중에 및/또는 모세혈관막을 통한 투과 중에 단량체보다 입체적으로 더 방해받음에 틀림없다고 개시하고 있다. 또한, 피하 주사되는 경우에는, Zn(II)-R₆구조는 직접 해리하지는 않지만, Zn(II)-T₆구조를 거쳐 변형되어야 한다. 상기의 구조적 변화 및 해리로 인하여 활성의 개시가 지연된다. 그러므로, 본 발명 당시 당해 분야의 숙련자는 분명하게 규명된 육량체 복합체를 형성시킴으로써 아연으로 단량체성 인슐린 유도체를 화학적으로 안정화시키는 노력이 성공하지 못하거나, 또는 성공하더라도 목적하는 작용의 신속한 개시는 얻을 수 없다고 생각하였다.

본 발명의 배합물은 신속하게 흡수되는 아연-페놀 유도된 육량체 복합체이다. 상기 육량체 복합체의 흡수 속도는 인슐린의 경우에 관찰된 속도의 2배 이상이다. 그러나, 상기 육량체 복합체가 배합되는 경우, 화학적 변성에 대해 인슐린과비교할 때 똑같이 안정하다. 따라서, 본 발명이 단량체성 인슐린 유사체를 분명하게 규명된, 안정한 아연-페놀 육량체 복합체로 전환시킨다는 것은 놀랄만한 일이다. 현저하게는, 상기 육량체 복합체가 배합되면, 이들은 상기 단량체성 인슐린 유사체와 관련되는 신속-작용 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 안정하고 신속-작용하는 인슐린 유사체 육량체 복합체의 비경구 배합물을 제공한다.

본 발명은 인간의 인슐린 유사체 복합체를 제공하며, 그 유사체 복합체는 6 분자의 인간 인슐린 유사체, 2개의 아연 이온, 및 m-크레졸, 페놀, 또는 m-크레졸과 페놀의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 3 분자 이상의 페놀성 유도체를 포함하는 육량체이다. 본 발명은 또한 상기 육량체 복합체를 포함하는 비경구 배합물을 제공한다.

제 1 도는 Lys^B28Pro^B29-hI 및 인간 인슐린의 작용 프로파일을 도시한 그래프이다. 이 그래프는 글루코스 주입액의 평균 반응 속도이다. 상기 도면은 본 발명의 장점을 설명한다.

제 2 도는 Lys^B28Pro^B29-인간 인슐린의 안정성을 도시한 그래프이다. 이 그래프는 육량체 회합 내 인슐린 유사체의 중합체 형성을 측정하여 단량체성 Lys^B28Pro^B29-인간 인슐린 및 인슐린과 비교함으로써 안정성을 나타낸다. 상기 도면은 본 발명의 장점을 설명한다.

제 3 도는 육량체 복합체내 Lys^B28Pro^B29-인간 인슐린의 해리를 도시한 그래프이다. 이 그래프는 488nm, 90°각도에서 정적 광산란에 의해 측정한, 배합 인슐린(); 육량체 복합체로서 배합된 Lys^B28Pro^B29-hI(△); 비배합 인슐린() 및 단량체성 Lys^B28Pro^B29-hI(*)의 시험관내 해리이다. 상기 배합 샘플은 Zn 0.5몰/몰단백질, m-크레졸 1.25mg/㎖ 및 페놀 1.09mg/㎖, 인산나트륨 7mM 및 글리세롤 16mg/㎖를 함유하였다. 비배합 샘플 및 단량체성 샘플은 추가의 부형제를 전혀 함유하지 않았다. 상기 도면은 본 발명의 장점을 설명한다.

상기에 기술한 대로, 본 발명은 단량체성 인간의 인슐린 유사체를 육량체로서 제공한다. 본 원에 사용된 "단량체성 인슐린 유사체" 또는 "인간 인슐린 유사체"란 용어는

B28 위치 의 Pro가 Asp, Lys, Leu, Val, 또는 Ala로 치환되고, B29 위치의 Lys는 Lys이거나 또는 Pro로 치환된 인간 인슐린;

des(B28-B30)-인간 인슐린; 또는

des(B27)-인간 인슐린

을 말한다.

단량체성 인슐린 유사체는 챈스등의 유럽 특허 공개 제 383 472 호, 및 브랜지 등의 유럽 특허 공개 제 214 826 호에 기술되어 있으며, 본 원에 참고로 인용되어 있다. 단량체성 인슐린 유사체는 인슐린보다 이량체화 또는 자체-회합하는 경향이 적다.

당해 분야의 숙련자는 다른 변형이 가능하다는 것을 인지할 것이다. 상기 변형은 당해 분야에서 널리 허용되고 있으며, B1O 위치의 히스티딘 잔기를 아스파르트산으로 대체하고; B1 위치의 페닐알라닌 잔기를 아스파르트산으로 대체하고; B30 위치의 트레오닌 잔기를 알라닌으로 대체하고; B9 위치의 세린 잔기를 아스파르트산으로 대체하고; B1 위치의 아미노산만을 삭제하거나 또는 B2 위치의 아미노산과 함께 삭제하고; 또한 B30 위치의 트레오닌을 삭제하는 것을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 모든 아미노산 약자는 37 C.F.R. §1.822(b)(2)에 기술된 미합중국 특허청이 인정한 것이다. 특히 바람직한 단량체성 인슐린 유사체는 Lys^B28Pro^B29-인간 인슐린이다(B28은 Lys이고; B29는 Pro임).

본 원에 사용된, "치료"라는 용어는 질병, 질환, 또는 장애에 대항하기 위한 환자의 관리 및 치료를 나타내고 또한 본 발명의 화합물을 투여 하여 증상 또는 합병증의 개시를 방지하고, 증상 또는 합병증을 완화시키거나, 또는 질병, 질환, 또는 장애를 제거하는 것을 포함한다.

"등장제"라는 용어는 생리적으로 허용되며 본 발명의 제제에 적당한 긴장성을 부여하여 세포막을 통한 물의 총 흐름을 방지하는 약제를 일컫는다. 글리세린과 같은 화합물이 공지된 농도로 상기의 목적에 통상적으로 사용된다.

"페놀성 유도체" 또는 "페놀성 물질"이 라는 용어는 m-크레졸, 페놀 또는 m-크레졸과 페놀의 혼합물이다. 바람직하게는, 페놀성 물질은 m-크레졸이다.

"생리적으로 허용되는 완충액"이라는 용어는 당해 분야에 공지되어 있다. 생리적으로 허용되는 완충액은 바람직하게는 인산나트륨과 같은 인산염 완충액이다.기타의 생리적으로 허용되는 완충액으로는 TRIS, 아세트산나트륨, 또는 시트르산나트륨을 들 수 있다. 완충액의 선택 및 농도는 당해 분야에 공지되어 있다.

본 발명의 인슐린 유사체는 아연 이온 및 페놀성 유도체와 착화되어 안정한 육량체 구조를 형성한다. 상기 아연 및 페놀성 유도체는 모두, 안정하고 또한 신속한 해리 및 작용 개시를 할 수 있는 복합체를 얻는 데에 중요하다. 상기 육량체 복합체는 인간 인슐린 유사체의 육량체 1개당 2개의 아연 이온 및 m-크레졸, 페놀, 또는 m-크레졸과 페놀의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 3 분자 이상의 페놀성 유도체로 이루어진다.

가용성의 단량체성 유사체는, 상기 페놀성 유도체를 함유하는 pH가 약 7.5인 희석제에 상기 단량체성 유사체를 용해시키고, 아연을 첨가함으로써 육량체 복합체로 전환시킨다. 아연은 바람직하게는 염으로서 첨가된다. 아연 염의 대표예로는 아세트산아연, 브롬화아연, 염화아연, 플루오르화아연, 요오드화아연 및 황산아연을 들 수 있다. 숙련자라면 본 발명의 방법에 또한 사용될 수 있는 기타 많은 아연 염이 있음을 인지할 것이다. 바람직하게는, 아세트산아연 또는 염화아연이 사용되는데, 이는 상기 염이 공업적으로 허용가능한 방법에 새로운 화학적 이온을 부가하지 않기 때문이다.

산 용해로서 통상적으로 공지된 방법으로 상기 유사체의 용해를 도울 수 있다. 즉, 생리적으로 허용되는 산, 바람직하게는 HCl을 사용하여 pH를 약 3.0 내지 3.5로 낮추어, 상기 단량체성 유사체의 용해를 돕는다. 기타 생리적으로 허용되는 산으로는 아세트산, 시트르산, 및 인산을 들 수 있다. 그 다음, 생리적으로 허용되는 염기, 바람직하게는 수산화나트륨을 사용하여 pH를 약 7.4 내지 7.5로 조정한다. 기타 생리적으로 허용되는 염기로는 수산화칼륨 및 수산화암모늄을 들 수 있다.

상기 육량체 복합체는 안정한, 신속 작용하는 비경구 제제로 제제화될 수 있다. 상기 배합물 중의 인슐린 유사체의 농도는 약 0.5mg/㎖ 내지 약 20mg/㎖이고; 바람직하게는, 약 1.2mg/㎖ 내지 약 17.5mg/㎖이고; 가장 바람직하게는, 약 3.5mg/㎖이다. 일반적으로, 아연의 농도는 약 10㎍/㎖ 내지 약 50㎍/㎖이다. 상기 제제 중의 아연의 최적 농도는 약 14㎍/㎖ 내지 약 35㎍/㎖이고, 이 중 2개의 아연 이온이 각 육량체에 결합된다. 배합시, 상기 육량체 복합체는 7개의 페놀성 물질과 결합한다. 일반적으로, 배합시 6개의 페놀성 물질이 상기 육량체에 결합된다. 따라서, 바람직하게는 과량의 페놀성 물질이 상기 제제에 첨가된다. 상기 페놀성 물질은 또한 방부제로서도 작용한다. 따라서, 바람직한 농도는 약 23mM 내지 35mM이고, 가장 바람직하게는 29mM이다. 상기 페놀성 물질은 바람직하게는 m-크레졸이다.

등장제, 바람직하게는 글리세린을 상기 제제에 첨가할 수 있다. 상기 등장제의 농도는 인슐린 제제에 대해 당해 분야에 공지된 범위내이고, 바람직하게는 약 16mg/㎖이다. 상기 배합물의 pH는 생리적으로 허용되는 완충액, 바람직하게는 인산나트륨과 같은 인산염 완충액으로 완충될 수 있다.

발명 당시, 공개된 문헌에서 당해 분야의 숙련자는 신속한 흡수를 얻기 위 해서는 집합을 제거하는 것이 필요하다고 제안하였다. 따라서, 상기 배합된 육량체 유사체가 작용의 신속한 개시를 일으킨다는 것은 매우 놀랄만한 일이다. 인슐린과는 달리, 인슐린 유사체 육량체 복합체의 형성은 최대 장액 인슐린 유사체 농도를 얻는 데에 필요한 시간에 나쁜 영향을 미치지 않는다. 제 1 도는, 인간 환자에 있어서, 단량체성 Lys^B28Pro^B29-hI(아연없이 배합됨); 배합 Lys^B28Pro^B29-hI 육량체; 및 인간의 정상적인 인슐린을 함유하는 배합물에 대한 글루코스 주입액의 평균 반응속도를 나타낸 것이다. 상기 제제화 육량체 복합체는 단량체성 Lys^B28Pro^B29-hI의 신속한 작용성을 보유한다. 흡수 속도는 정상적인 인간의 인슐린보다 상당히 빠르다. 그러므로, 제 1 도의 결과는 하기를 설명한다: 첫째, 육량체 Lys^B28Pro^B29-hI 및 단량체성 Lys^B28Pro^B29-hI는 유사한 흡수 속도를 가지며; 둘째, 육량체성 및 단량체성 Lys^B28Pro^B29- hI는 모두 인슐린보다 빠른 흡수 속도를 가진다.

육량체로서 상기 인슐린 유사체 복합체를 포함하는 제제는 안정하다. 6주에 걸친 비교 연구에 있어서, 단량체성 Lys^B28Pro^B29-hI는, 중합체의 형성이 주당 1.63% 증가함에 따라 가장 빠른 변성 속도를 보인다. 비제제화 인간의 인슐린은 주당 0.61%의 보다 느린 중합체 형성 속도를 보인다. 그러나, 제제화하면, 인슐린의 경우 고분자량의 중합체 형성 속도는 주당 0.095%로 감소된다. 육량체 복합체로서 제제화된 Lys^B28Pro^B29- hI는 주당 0.11%의 감소된 고분자량의 중합체 형성 속도를 나타내는데, 이는 제제화된 인슐린의 경우 나타난 상기 속도에 필적한다. 상기 연구는 실시예 1에 예시되어 있고 제 2 도에 나타나 있다.

본 발명의 인슐린 유사체는, 전통적인 (용액) 방법, 고형상 방법, 반 합성 방법, 및 보다 최근의 재조합 DNA 방법을 비롯한, 다양한 인지된 펩티드 합성 기술 중 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 챈스등의 유럽 특허 공개 제 383 472 호, 및 브랜지등의 유럽 특허 공개 제 214 826 호에 다양한 단량체성 유사체의 제조방법이 개시되어 있다.

하기 실시예 및 제조예는 인슐린 유사체의 제조방법 및 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위한 것이다. 본 발명의 영역은 하기 실시예로만 구성되는 것으로 간주되지 않는다.

제조예 1

단백질 원료의 제조

인슐린 및 Lys^B28Pro^B29-hI의 비제제화된 샘플을 7mM 인산나트륨 내 3.5mg/㎖로 제조하고, 또한 수행되는 실험에 따라, m-크레졸 1.25mg/㎖, 페놀 1.09mg/㎖ 및 글리세롤 16mg/㎖가 있거나 없이, 제조하였다. 아연 19.7㎍/㎖를 첨가한 것을 제외 하고는, 동일한 방법으로 육량체 복합체로서 Lys^B28Pro^B29-hI의 샘플을 제조하였다. 모든 샘플을 산 변화 단계를 통하여 pH 3으로 만들고, 이 때 아연을 상기 제제화 롯트내에 첨가하였다. 그 다음 pH를 7.4로 조정하였다. 단백질 농도를 페놀성 물질의 첨가에 앞서 AVIV 모델 14 DS 이중-빔 분광 광도계를 사용하는 UV 흡수 분광법으로 측정하였다. 프랭크, 페카(Pekar, A H.) 및 베로스(Veros, A. J.)의 문헌 [Diabetes, 21 (부록 2), 페이지 486-491(1972)]에 기술된 대로, 단백질 농도를 계산하였다.

실시예 1

화학적 안정성

인슐린 제제 및 비제제 그리 고 단량체성 및 육량체성 Lys^B28Pro^B29-hI를 30℃에시 배양시킴으로써 변성을 개시한다. 상기 배합된 인슐린 및 육량체 Lys^B28Pro^B29-hI는 pH 7.3 내지 7.4에서 하기를 함유하였다: 단백질 3.5mg/㎖, 글리세롤 16mg/㎖, 7mM 인산이나트륨 칠수화물, m-크레졸 1.25mg/㎖, 페놀 1.09mg/㎖, 및 산화아연 0.0245mg/㎖, 제제화되지 않은 인슐린 및 단량체성 Lys^B28Pro^B29-hI는 pH 7.3 내지 7.4에서 하기를 함유하였다: 단백질 3.5mg/㎖, 글리세롤 16mg/㎖, 7mM 인산이나트륨 칠수화물, m-크레졸 1.25mg/㎖, 페놀 1.09mg/㎖. 7일의 간격을 두고, 샘플을 30℃의 배양으로부터 꺼내어 크기-배제 HPLC를 사용하여 고분자량 종류의 형성을 분석하였다. 용리액으로서 0.4M 중탄산암모늄 및 아세토니트릴의 혼합물을 사용하는 듀퐁 조르박스(Dupont Zorbax) GF-250 스페셜(9.4×250mm) 컬럼에 샘플 20㎕를 주입함으로써 분석을 수행한다(주위 온도에서 유속 0.5㎖/분 및 214nm에서 검출). 중합체의 형성률은 고분자량의 피크 대 단량체와 고분자량의 피크의 총 면적의 비로써 결정한다. 그 결과가 제 2 도에 도시되어 있다.

실시예 2

정적 광산란

단량체성 Lys^B28Pro^B29-hI, 육량체 복합체로서의 Lys^B28Pro^B29-hI, 및 인슐린의 시험관내 해리 특성을 정적 광산란을 사용하여 측정하였다.

제제화 및 비제제화된 단백질 원료 용액을 상기 기술한 대로 3개 제조하되, 단, 상기 비배합 단백질 원료 용액은 아연, 글리세롤, 또는 방부제를 함유하지 않는다. 이들 원료 3.5mg/㎖를 사용하여, 인슐린 및 Lys^B28Pro^B29-hI에 대하여 단백질 농도가 3.5mg/㎖ 내지 0.2mg/㎖에 분포하도록 일련의 희석액을 제조한다. 모든 희석액을 pH 7.4의 7mM 인산나트륨 완충액을 사용하여 최종 용적 10㎖로 만들어, 주사하는 피하 부위를 모사한다. 모든 용액을 SLS 측정을 수행하기 전에 0.2㎛ 젤만(Gelman) 저 단백질 결합 필터를 통하여 여과시켰다. 상기 샘플의 단백질 농도를 역상 HPLC를 사용하여 측정한다.

상기 배합 샘플의 분석의 경우, 단백질 샘플의 각 세트에 대하여 단백질이 없는 용매 블랭크를 제조하였다. 이들 블랭크는 상응하는 단백질 샘플 세트와 동일한 농도의 부형제를 함유하였다. 상기 비제제화 샘플의 분석의 경우, 하나의 7mM 인산나트륨의 블랭크를 사용한다. 상기의 적당한 용매 블랭크의 사용은 데이타가 용질의 산란만을 반영하고 용매의 변화로 인해 가해진 영향은 반영하지 않게 한다.

브룩하벤(Brookhaven) 기기 2030AT 오토코릴레이터(autocorrelator) 및 측각기를 사용하여 정적 광산란(SLS) 실험을 수행한다. 모든 측정은 488nm로 세팅된 렉셀(Lexel) 모델 3500 아르곤 이온 레이저를 사용하여 90°의 산란각에서 1mm의 핀홀을 가지고 행한다. 온도는 네스랩(Neslab) RTE-110 온도조에 의해 25℃로 유지된다. 광전자증배관 튜브의 신호는 0.1㎛ 여과 톨루엔을 사용하여 보정한다.

중량-평균 분자량은, 캔터(Cantor, C. R.) 및 쉬멜(Schimmel, P. R.)의 문헌[Biophysical Chemistry, 프리만(W. H. Freeman) 앤드 캄파니, 뉴욕, 페이지 838-843(1982)]에 기술된 식을 사용하여 계산한다. 제 3 도에 상기 광산란의 연구 결과가 개시되어 있다. 육량체 복합체로서의 Lys^B28Pro^B29-hI 및 인슐린의 시험관내 해리 프로파일은 매우 상이하다. 상기 인슐린 유사체는 신속한 해리를 나타내고, 이로써 인간 인슐린보다 빨리 흡수되게 된다. 두 제제가 모두 육량체성 회합 상태를 함유하고 상기 제제이 화학적 변성에 대해 똑같이 안정할지라도, 육량체 Lys^B28Pro^B29-hI는 인슐린보다 해리되는 성향이 더 크다.

제 1 도는 Lys^B28Pro^B29-인간 인슐린 및 인간 인슐린의 작용 프로파일을 도시한 그래프이다.

제 2 도는 Lys^B28Pro^B29-인간 인슐린의 안정성을 도시한 그래프이다.

제 3 도는 육량체 복합체내 Lys^B28Pro^B29-인간 인슐린의 해리를 도시한 그래프이다.

Claims

(a) B28 위치의 Pro가 Asp, Lys, Leu, Val, 또는 Ala로 치환되고, B29 위치의 Lys가 Lys이거나 또는 Pro로 치환된 인간 인슐린, (b) des(B28-B30)-인간 인슐린, 및 (c) des(B27)-인간 인슐린으로 구성된 군으로부터 선택된 6 분자의 인간 인슐린; 2 개의 아연 이온; 및 m-크레졸, 페놀, 또는 m-크레졸과 페놀의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3 분자의 페놀성 유도체를 포함하는, 인간 인슐린보다 더 빠른 흡수율을 갖는 잘-정의된 아연-페놀성 육량체 복합체를 포함하고,

화학적 분해에 대해 인간 인슐린과 비교할 때 동등하게 안정한, 당뇨병 치료를 위한 인간 인슐린 유사체 복합체의 비경구용 제약학적 제제.
제 1항에 있어서, 아연의 농도가 약 14 ㎍/㎖ 내지 약 35 ㎍/㎖이고, 페놀성 유도체 의 농도가 약 23 mM 내지 약 35 mM이고 제제에서 인간 인슐린 유사체의 농도가 약 3.5 mg/mL인 것인 비경구용 제약학적 제제.
제 2 항에 있어서, 등장제 및 생리학적으로 허용되는 완충액을 추가로 포함하는 비경구용 제약학적 제제.
제 3 항에 있어서, 인간 인슐린 유사체 약 3.5mg/㎖, 아연 약 19.7㎍/㎖, 인산나트륨 약 7mM, 및 글리세린 약 16mg/㎖을 포함하는 비경구용 제약학적 제제.
제 1 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 인슐린 유사체가 Lys^B28Pro^B29-인간 인슐린인 비경구용 제약학적 제제.
제 5 항에 있어서, 상기 페놀성 유도체가 약 29mM 농도의 m-크레졸인 비경구용 제약학적 제제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 인슐린 유사체가 ASP^B28-인간 인슐린인 것인 비경구용 제약학적 제제.
제 7 항에 있어서, 상기 페놀성 유도체가 m-크레졸 및 페놀의 혼합물인 것인 비경구용 제약학적 제제.