CZ287484B6 - Parenteral pharmaceutical preparation of human insulin analog complex - Google Patents

Description

Vynález se týká monomerního analogu lidského inzulínu. Především se vynález týká parenterálního farmaceutického prostředku komplexu analogu lidského inzulínu.

Dosavadní stav techniky

Od zavedení inzulínu v roce 1920 se dosahuje stálých velkých pokroků ve zlepšení léčby diabetes mellitus. Hlavního pokroku se dosáhlo v čistotě a v dostupnosti inzulínu. Byly rovněž vyvinuty různé farmaceutické prostředky s různou časovou aktivací. Navzdoiy těmto zlepšením terapie subkutánními injekcemi je stále neuspokojivá pro jedince, potřebujícího regulaci a normalizaci glykemické kontroly. Časté vybočení z normálních glykemických hladin během pacientovy doby života vede k hyperglykemií nebo k hypoglykemii a k dlouhodobým komplikacím včetně retinopatie, neuropatie, nefropatie, mikroangiopatie a makroangiopatie.

Aby se pomohlo vyhnout extrémním glykemickým hladinám, diabetici často praktikují terapii opakovaného injekčního vstřikování, přičemž se inzulín podává při každém jídle. Tato terapie však dosud není optimalizována. Nejiychleji působící, obchodně dostupný inzulín vykazuje vrchol příliš pozdě po vstříknutí a trvá příliš dlouho, než se dosáhne optimálního seřízení hladin glukózy. Nejnověji se věnuje velké úsilí vývoji inzulínových prostředků a inzulínových analogových prostředků, které mají změněnou kinetiku procesu subkutánní absorpce.

Jelikož všechny obchodní farmaceutické prostředky inzulínu obsahují inzulín ve spontánně asociovaném stavu a převážně v zinkové hexamemí formě, je domněnka, že stupněm, limitujícím rychlost absorpce inzulínu z místa subkutánního vstřiku do krevního oběhu, je disociace spontánně agregovaného inzulínového hexameru (Brange a kol., Diabetes Care 13, str. 923 až 954, 1990). K urychlení procesu absorpce se vyvinuly monomemí inzulínové analogy. Tyto monomemí inzulínové analogy vykazují srovnatelně iychlejší nastartování aktivity než inzulín za současného zachování biologické účinnosti nativního lidského inzulínu. Vykazují rychlejší absorpci na místě vstřiku a píkové působení inzulínu těsně s poobědovou glukózou, jakožto odezvou na jídlo. Způsob přípravy různých monomemích analogů popsal Chance a kol. (zveřejněná evropská přihláška vynálezu číslo EPO 383472) a Brange a kol. (zveřejněná evropská přihláška vynálezu číslo EPO 214826).

Modifikace inzulínu, vedoucí k monomemím analogům inzulínu, vedou však také k vysoké rychlosti vytváření polymeru v parenterálních farmaceutických prostředcích. Jelikož k expiraci inzulínových farmaceutických prostředků, když obsah polymeru stoupne na 1 % (U.S. Pharmacopoeia, 1990), je minimalizace tohoto typu znehodnocení extrémně významná pro snižování nežádoucích vedlejších účinků. Je proto žádoucí formulovat monomemí analogy tak, aby docházelo k samovolné asociaci analogu k vytváření stabilního uspořádání a při tom se ještě zachovala jeho rychlá absorpce.

Přísada některých kovových iontů, především zinku, zlepšuje chemickou stálost tím, že nutí inzulín k asociaci a vytváření hexamerů, specificky uspořádání Zn(II)-T₆. Dále se ukázalo, že fenoly specificky vážou inzulínový hexamer a zavádějí allosterickou změnu uspořádání, přičemž osm N-terminálních aminokyselin B-řetězce se převádí z rozvinutého uspořádání na a-šroubovici (Derewenda a kol., Nátuře 338, str. 594 až 596, 1989). Tento stav uspořádání s fenolickou vazbou je znám pod označením stav Zn(II)-R.

V silném kontrastu k těmto uznávaným poznatkům, že inzulín ochotně agreguje v přítomnosti zinku za vzniku dobře definované stabilní struktury hexameru zinku, ukázaly nejnovější studie

-1CZ 287484 B6 smonomemími inzulínovými analogy, že jakákoli agregace mezi zinkem a inzulínovým analogem se odlišuje od agregace, pozorované u inzulínu (Β. H. Frank, text a diapozitivy přednášky na konferenci o inzulínu „Self-Association and Conformational Studies in Human Proinsulin and Insulin Analogs“, University of York, 29. srpna až l.září 1989). Dále vysoce stabilní Zn-hexamerový komplex, pozorovaný u inzulínu, není pozorován u monomemích analogů. Podobně Brems a kol. (Protein Engineering 5:6 str. 527 až 533, 1992) objevil, že monomemí Lys^B28Pro^B29-hI je méně náchylný k dimerizaci a samočinné asociaci na tvary s vyšší molekulovou hmotností než inzulín. Brems a kol. dále dokládá, že Asp Pro -hl, Ala Pro hl a Lys Pro -hl vykazují malou nebo nevykazují vůbec žádnou zinkem vyvolanou asociaci, a že Pro^B29 inzulín, Lys®²⁸ inzulín, Asp®²⁸ inzulín a Ala®²⁸ inzulín vykazují zinkem vyvolanou asociaci, ale méně než Zn-inzulin. Následně naznačují nepublikované experimentální práce autora tohoto vynálezu, že asociace se zinkem je pozorována; avšak taková asociace mezi analogem a zinkem se liší od inzulínu. Asociace, kterou lze pozorovat v případě těchto analogů, má formy s mnohonásobně vyšší molekulovou hmotností a liší se od převládajících dobře definovaných Zn-inzulinových hexamerů.

Proto je zřejmé, že monomemí inzulínové analogy nevytvářejí uspořádání Zn(II)-T₆ způsobem, analogickým k inzulínu.

Vzhledem ke známému stavu techniky je překvapující, že tento vynález poskytuje monomemí analogy inzulínu v dobře definovaném stabilním zinek-fenol hexamerovém komplexu. Tento hexamerový komplex se jedinečně odlišuje od komplexů, pozorovaných s inzulínem za identických podmínek. Inzulínové komplexy se zinkem a fenolem jsou v uspořádání Zn(II)-R6. Hexamerový komplex podle tohoto vynálezu není s tímto uspořádáním identický. Také dosti pozoruhodně má analogový hexamerový komplex inzulínu značně větší náchylnost k disociaci než inzulín. Tato náchylnost k disociaci vede k žádoucí vlastnosti rychlého působení.

Brange a kol. (kniha Current Opinion in Structural Biology 1 str. 934 až 940, 1991) popisuje různé lychle působící inzulínové monomery a konstatuje, že zřejmou cestou k vytvoření rychle působícího innzulinu je zabránit vytváření dimeru nebo hexamerů. Podobně Brange a kol. (Diabetes Care 13, str. 923 až 954, 1990) uvádějí, že podává-li se inzulín v podobě hexamerů, musí být hexamer ještě kjeho pomalejší uvolňovací difúzi stericky více brzděn než monomer v průběhu difuzního transportu v podkoží a/nebo během svého průchodu kapilární membránou. Dále je-li injektováno subkutánně uspořádání ZnQIj-Rý, nedisociuje přímo, ale musí se transformovat přes uspořádání Ζη(Π)-Τ₆. Tyto konformační změny a z toho plynoucí disociace oddalují nástup aktivity. Proto se v současné době pracovníci v oboru domnívají, že úsilí k chemické stabilizaci monomemího inzulínového analogu zinkem za vytvoření dobře definovaného hexamemího komplexu bude neúspěšné, nebo pokud by bylo úspěšné, bylo by to na úkor rychlého nástupu žádané účinnosti.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je parenterální farmaceutický prostředek komplexu analogu lidského inzulínu, jehož podstata spočívá v tom, že komplex obsahuje šest molekul lidského inzulínu, kde Pro v poloze B28 je substituován Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala, a Lys v poloze B29 je Lys nebo substituovaný Pro, des(B28-B30)-lidského inzulínu nebo des(B27)-lidského inzulínu, dva zinečnaté ionty a alespoň tři molekuly fenolového derivátu, zvoleného ze souboru, zahrnujícího m-kresol, fenol nebo směs m-kresolu a fenolu, přičemž tento prostředek je komplex analog, jenž je hexamemí.

Při výhodném provedení parenterální farmaceutický prostředek podle tohoto vynálezu dále obsahuje izotonické činidlo a fyziologicky vhodný pufr.

-2CZ 287484 B6

Výhodné provedení vynálezu spočívá v parenterálním farmaceutickém prostředku, který obsahuje 3,5 mg/ml analogu lidského inzulínu, 14 až 35 pg/ml zinku a 23 až 35 mM fenolového derivátu. Zvláště výhodně parenterální farmaceutický prostředek obsahuje 3,5 mg/ml analogu lidského inzulínu, 19,7 μg/ml zinku, 29 mM m-kresolu, 7 mM fosforečnanu sodného a 16 mg/ml glycerinu.

Parenterální farmaceutický prostředek podle jiného výhodného provedení jako fenolový derivát obsahuje směs m-kresolu a fenolu.

Je účelné, pokud v parenterálním farmaceutickém prostředku podle tohoto vynálezu je analogem lidského inzulínu Lys^B28Pro^B29-lidský inzulín. Je také účelné, pokud analogem lidského inzulínu je Asp^B28-lidský inzulín.

Dále se zde uvádějí některé detailní údaje o tomto vynálezu.

Parenterální farmaceutický prostředek podle vynálezu obsahuje hexamemí komplex, který se rychle absorbuje. Rychlost absorpce hexamemího komplexu je alespoň dvakrát větší, než jaká je pozorovaná v případě inzulínu. Takový hexamemí komplex po zpracování na farmaceutický prostředek je stejně stálý, jako inzulín, proti chemickému odbourání. Proto je překvapivé, že se podle vynálezu převádí monomemí inzulínový analog na dobře definovaný, stálý hexamemí komplex se zinkem a s fenolem. Při zpracování si tento hexamemí komplex ponechává zvláště charakteristiky rychlého působení, které má monomemí inzulínový analog. Podle vynálezu se tedy získají parenterální farmaceutické prostředky hexamemího komplexu inzulínového analogu, který je stálý a rychle působící.

Přehled obrázků na výkresech

Vynález blíže objasňují také připojené obrázky:

Na obr. 1 je graf působení Lys^B28Pro^B29-hi a lidského inzulínu. Na grafu je střední glukózová infuzní odezva. Graf dokládá přednosti vynálezu. Na ose x je doba v minutách, na ose y hodnoty mmol/min. Křivka s plným černým kosočtverečkem je pro LysPro-monomer, 10 J, SC, křivka s prázdným kosočtverečkem je pro LysPro-hexamer, 10 J, SC, křivka s plným černým čtverečkem je pro regulérní lidský inzulín (hexamer) 10 J, SC.

Na obr. 2 je graf stability Lys Pro lidského inzulínu. Na grafu je stabilita vyjádřená měřením tvoření polymeru inzulínového analogu v hexamerovém seskupení ve srovnání s monomemím Lys^B28Pro^B29-lidským inzulínem a inzulínem. Graf dokládá přednosti vynálezu. Na ose x je doba ve dnech při teplotě 30 °C, na ose y vytváření dimeru v procentech. Křivka s plným černým kosočtverečkem je pro LysPro-monomer, křivka s prázdným kosočtverečkem je pro LysProhexamer, křivka s plným černým čtverečkem je pro hi neformulovaný, křivka s prázdným čtverečkem je pro hi formulovaný.

Na obr. 3 je graf disociace Lys^B28Pro^B29 lidského inzulínu ve formě hexamemího komplexu. Na grafu je in vitro disociace pro formulovaný inzulín (prázdné kolečko), pro Lys^B28Pro^B29-hi formulovaný jako hexamemí komplex (prázdný trojúhelník), pro neformulovaný inzulín (prázdný čtvereček) a pro Lys^B28Pro^B29-hi (hvězdička), monitorovaná statickým rozptylem světla při 488 nm pod úhlem 90°. Formulovaný vzorek obsahuje 0,5 mol zinku na mol proteinu, 1,25 mg/ml m-kresolu a 1,09 mg/ml fenolu, 7 mM fosforečnanu sodného a 16 mg/ml glycerolu. Neformulované a monomemí vzorky neobsahují žádné přídavné excipienty. Obr. dokládá přednosti vynálezu. Na ose x je koncentrace proteinu v mg/ml, na ose y střední molekulová hmotnost (g/mol).

-3CZ 287484 B6

Jak shora uvedeno, týká se vynález monomemího lidského inzulínového analogu, komplexovaného ve formě hexameru. Výrazy „monomemí inzulínový analog“ nebo „lidský inzulínový analog“ se týkají lidského inzulínu, přičemž:

Pro v poloze B28 je substituován Asp, Lys, Lau, Val nebo Ala; a Lys v poloze B29 je lysin nebo je substituován prolinem;

des(B28-B30); nebo des(B27).

Monomemí inzulínové analogy popsal Chance a kol. (evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo EPO 383472) a Brange a kol. (evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo EPO 214826). Monomemí inzulínové analogy jsou méně náchylné k dimerizaci nebo ke spontánní asociaci než inzulín.

Pracovníkům v oboru je jasné, že jsou možné další modifikace. Tyto modifikace jsou v oboru ve velké míře přijímány a zahrnují náhradu histidinového zbytku v poloze BIO kyselinou asparagovou; náhradu fenylalaninového zbytku v poloze BI kyselinou asparagovou; náhradu threoninového zbytku v poloze B30 alaninem; náhradu serinového zbytku v poloze B9 asparagovou kyselinou; vypuštění aminokyselin v poloze BI samotných nebo v kombinaci s jejich vypuštěním v poloze B2; vypuštění threoninu v poloze B30.

Všechny zkratky, používané pro aminokyseliny, jsou v souladu s 37 C, F, R, § 1.81 l(b) (2) úřadu United States Patent & Trademark Office. Obzvláště výhodným monomemím inzulínovým analogem je Lys^B28Pro^B29-lidský inzulín (B28 je Lys, B29 je Pro).

Výrazem „ošetřování“ se zde vždy míní zacházení s nemocným a péče o nemocné za účelem boje proti nemoci, stavu nebo poruše, a zahrnuje podávání sloučeniny podle vynálezu k předcházení nástupu symptomů nebo komplikací, snižování symptomů nebo komplikací nebo eliminaci onemocnění, chorobných stavů nebo poruch. Výrazem „izotonické činidlo“ se zde vždy míní činidlo fyziologicky snášené a zahrnuje vhodnou tonicitu k vytváření nebo k prevenci toku vody přes buněčnou membránu. Pro tyto účely se používají v koncentracích o sobě známých sloučeniny, jako glycerin. Výrazem „fenolická sloučenina“ nebo „fenolický derivát“ se zde vždy míní m-kresol, fenol, nebo jejich směsi. Výraz „fyziologicky vhodný pufr“ je pracovníkům v oboru znám. Jakožto fyziologicky vhodný pufr přichází v úvahu především fosfátový pufr, jako fosfát sodný. Jakožto další fyziologicky vhodné pufiy se uvádějí TRIS, acetát nebo citrát sodný. Volba a koncentrace pufru je v oboru známa.

Inzulínové analogy podle vynálezu vytvářejí komplex se zinečnatými ionty a s fenolovou sloučeninou za vzniku stabilní hexamemí konformace. Zinečnaté ionty a fenolová sloučenina mají rozhodující význam pro vytváření komplexu, který je stálý a rychle disociuje pro započetí působení. Hexamerový komplex sestává ze dvou zinečnatých iontů na hexamer analogu lidského inzulínu a z alespoň tří molekul fenolové sloučeniny, volené ze souboru, zahrnujícího m-kresol, fenol a směs m-kresolu a fenolu.

Rozpustný monomemí analog se převádí na hexamemí komplex rozpuštěním monomemího analogu v ředidle, obsahujícím fenolovou sloučeninu, při hodnotě pH přibližně 7,5 s přidáním zinku. Zinek se s výhodou přidává ve formě soli. Jakožto reprezentativní soli zinku se uvádějí acetát, bromid, chlorid, fluorid, jodid a síran zinečnatý. Pracovníkům v oboru je jasné, že je možné podle vynálezu použít i jiných zinečnatých solí. S výhodou se používá octanu nebo chloridu zinečnatého, jelikož se v takovém případě nezavádějí další chemické ionty do průmyslově vhodného procesu.

-4CZ 287484 B6

Rozpuštění analogu se může napomáhat způsobem, běžně známým jako kyselé rozpouštění, to znamená, že se hodnota pH snižuje na přibližně 3,0 až 3,5 použitím fyziologicky vhodné kyseliny, s výhodou kyseliny chlorovodíkové, k napomáhání rozpouštění monomemího analogu. Jakožto jiné fyziologicky vhodné kyseliny se uvádějí kyselina octová, citrónová a fosforečná. Hodnota pH se pak upraví fyziologicky vhodnou zásadou, s výhodou hydroxidem sodným, na přibližně 7,4 až 7,5. Jakožto jiná fyziologicky vhodná zásada se uvádějí hydroxid draselný a hydroxid amonný.

Hexamemí komplex se může formulovat na stálý, rychle působící parenterální farmaceutický prostředek. Koncentrace inzulínového analogu ve farmaceutickém prostředku je přibližně 0,5 až přibližně 20 mg/ml, s výhodou přibližně 1,2 až přibližně 17,5 mg/ml a především přibližně 3,5 mg/ml. Obecně je koncentrace zinku přibližně 10 až přibližně 50 pg/ml a optimálně je koncentrace zinku v prostředku 14 až přibližně 35 pg/ml, přičemž jsou dva ionty zinku vázány na každý hexamer. Při formulování váže hexamer až sedm molekul fenolové sloučeniny. Obecně se při formulaci váže na hexamer šest molekul fenolové sloučeniny. Do prostředku se proto přidává s výhodou nadbytek fenolové sloučeniny. Fenolová sloučenina působí také jako konzervační prostředek. Výhodnou koncentrací je proto přibližně 23 až 35 mM, nejvýhodněji 29 mM. Fenolovou sloučeninou je s výhodou m-kresol.

Do prostředku se může přidávat izotonické činidlo, s výhodou glycerin. Koncentrace izotonického činidla je o sobě známá pro inzulínové prostředky, s výhodou je přibližně 16 mg/ml. Hodnota pH farmaceutického prostředku se může pufrovat fyziologicky vhodným pufrem, s výhodou fosfátovým pufrem, například fosforečnanem sodným.

Podle známého stavu techniky potřeboval pracovník v oboru eliminovat agregaci, aby dosahoval rychlé absorpce. Proto je velmi překvapivé, že formulovaný hexamer analogu přináší rychlý začátek působení. Na rozdíl od inzulínu vytváření hexameru komplexu inzulínového analogu nemá nepříznivé působení na dobu, potřebnou k dosažení píku koncentrace inzulínového analogu v séru. Obr. 1 dokládá v případě lidí střední glukózovou infuzní odezvu na prostředek, obsahující monomem! Lys Pro ' -hi (formulovaný bez zinku); na formulovaný Lys Pro -hi hexamer; a na lidský inzulín. Formulovaný hexamemí komplex si ponechává rychlé působení monomemího Lys^B28Pro^B29-hi. Absorpce je značně lychlejší než u regulérního lidského inzulínu. Výsledky Dodle obr. 1 tedy dokládají, že především mají hexamer Lys^B28Pro^B29-hi a monomemí Lys^B28Pro-hi podobnou rychlost absorpce a dále, že jak hexamemí, tak monomemí Lys^B28Pro^B29-hi vykazují rychlejší absorpci než inzulín.

Farmaceutický prostředek, obsahující inzulínový analogový komplex ve formě hexameru, je stálý. Porovnávací studie monomemího Lys^B28Pro^B29-hi vykázala rychlejší odbourání s 1,63% týdenním vzrůstem se zřetelem na vytváření polymeru v průběhu šestitýdenní studie. Neformulovaný lidský inzulín podléhá pomalejšímu vytváření polymeru, 0,61 % za týden. Avšak po formulaci se rychlost vytváření polymeru s vyšší molekulovou hmotností snižuje na 0,095 % za týden pro inzulín. Formulovaný Lys^B28Pro^B29-hi ve formě hexamemího komplexu vykazuje sníženou rychlost vytváření polymeru s větší molekulovou hmotností 0,11 % za týden, což je porovnatelné s rychlostí v případě formulovaného inzulínu. Tyto studie jsou objasněny v příkladu 1 a na obr. 2.

Inzulínový analog podle vynálezu se může připravovat jakýmkoliv o sobě známým způsobem peptidové syntézy, včetně klasického (roztokového) způsobu, způsobů v pevné fázi, polosyntetických způsobů a nejnověji rekombinantními způsoby DNA. Způsoby přípravy různých monomemích analogů popsali například Chance a kol. (evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo EPO 383472) a Brange a kol. (evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo EPO 214826).

Následující příklady praktického provedení způsob přípravy inzulínových analogů podle vynálezu toliko objasňují, přičemž není jejich záměrem nějak vynález omezovat.

-5CZ 287484 B6

Příklady provedení vynálezu

Příprava 1

Příprava proteinového zásobního roztoku

Neformulované vzorky inzulínu a Lys^B28Pro^B29-hi se připraví v koncentraci 3,5 mg/ml v 7 mM fosforečnanu sodném as 1,25 mg/ml m-kresolu nebo bez m-kresolu, s 1,09 mg/ml fenolu a se 16 mg/ml glycerolu v závislosti na prováděném pokusu. Připraví se vzorky Lys Pro -hi ve formě hexamemího komplexu naprosto stejně, jedině se přidá 19,7 pg/ml zinku. Všechny vzorky se udržují na hodnotě pH 3,0, přičemž se přidá zinek. Hodnota pH se pak nastaví na 7,4. Proteinová koncentrace se stanovuje před přidáním fenolové sloučeniny UV absorpční spektroskopií za použití spektrofotometru model AVIV 14 DS. Proteinová koncentrace se vypočte způsobem, který popsal Frank Β. H., Pekar A. H. a Veros A. J. (Diabetes 21 (Suppl. 2) str. 486 až 491,1972).

Příklad 1

Chemická stálost

Odbourání se iniciuje inkubací formulovaných a neformulovaných prostředků inzulínu a monomemího a hexamemího Lys Pro -hi při teplotě 30 °C. Formulovaný inzulín a hexamemí Lys Pro -hi vždy obsahuje: 3,5 mg/ml proteinu, 16 mg/ml glycerolu, 7 mM heptahydrátu dibazického fosforečnanu sodného, 1,25 mg/ml m-kresolu, 1,09 mg/ml fenolu a 0,0245 mg/ml oxidu zinečnatého při hodnotě pH 7,3 až 7,4. Neformulovaný inzulín a monomemí Lys^B28Pro^B29hi vždy obsahuje: 3,5 mg/ml proteinu, 16 mg/ml glycerolu, 7 mM heptahydrátu dibazického fosforečnanu sodného, 1,25 mg/ml m-kresolu, 1,09 mg/ml fenolu při hodnotě pH7,3 až 7,4. V sedmidenních intervalech se odebírají vzorky z inkubace při 30 °C a zkouší se na vytvoření výšemolekulámích látek za použití chromatografie, prováděné vstřikováním 20 μΐ vzorků na sloupec Dupont Zorbax GF-250 Speciál (9,4 x 250 mm) a za použití jako elučního činidla směsi 0,4 M hydrogenuhličitanu sodného a acetonitrilu (průtoková rychlost 0,5 ml/min při teplotě okolí a za detekce při 214 nm). Procentové vytváření polymeru se stanovuje z poměru vysokomolekulámího píku k celkové ploše monomemího a vysokomolekulámího píku. Výsledky objasňuje obr. 2.

Příklad 2

Statický rozptyl světla

Charakteristiky disociace in vitro monomemího Lys^B28Pro^B29-hi, Lys^B28Pro^B29-hi ve formě hexamemího komplexu a inzulínu se zkoušejí za použití statického rozptylu světla (SLS „static light scattering“). Připraví se tři formulované a neformulované proteinové zásobní roztoky shora popsaným způsobem, přičemž však neformulovaný proteinový zásobní roztok neobsahuje zinek, glycerol nebo konzervační přísadu. Za použití těchto 3,5 mg/ml zásobních roztoků se připraví řada zředění pro jak inzulín, tak pro Lys^B28Pro^B29-hi, za koncentrace proteinu 3,5 až 0,2 mg/ml. Všechna zředění se upraví na konečný objem 10 ml použitím 7 mM fosforečnanu sodného jakožto pufru za hodnoty pH 7,4 k napodobení subkutánního místa po vstříknutí. Všechny roztoky se filtrují filtry Gelman s nízkou schopností vázat protein před prováděním SLS měření. Koncentrace proteinu v těchto vzorcích se stanovuje reverzní fázovou chromatografií HPLC.

Pro analýzu formulovaných vzorků se připraví proteinu prosté slepé rozpouštědlo pro každou řadu proteinových vzorků. Tyto slepé vzorky obsahují excipienty v téže koncentraci, jako odpovídající proteinové vzorky. Pro analýzu neformulovaných vzorků se použije slepého 7 mM

-6CZ 287484 B6 fosforečnanu sodného. Použití těchto odpovídajících slepých rozpouštědel zajišťuje, že hodnoty reflektují pouze rozptyly rozpouštědla a nikoliv příspěvek změn rozpouštědla.

Statické pokusy rozptylu světla SLS se provádějí za použití zařízení Brookhaven Instruments 2030AT autokorelátor, a za použití goniometru. Všechna měření se provádějí s 1 mm otvorem za úhlu rozptylu 90° za použití zařízení Lexelův Model 3500 argonového iontového laseru při 488 nm. Teplota se udržuje na 25 °C lázní Neslab RTE-110. Signál fotonásobící trubice je kalibrován za použití 0,1 pm filtrovaného toluenu.

Hmotnostní střední molekulová hmotnost se vypočte za použití rovnice, kterou popsal Cantor C. R. a Schimmel P. R. (Biochemical Chemistry W. H. Freeman and Company, New York, str. 838 až 843, 1982). Výsledky této studie jsou na obr. 3. Disociační profil in vitro Lys^B28Pro^B29hi ve formě hexamemího komplexu a inzulínu je značně rozdílný. Inzulínový analog vykazuje rychlou disociaci, která umožňuje rychlejší absorpci, než lidský inzulín. Jakkoliv oba prostředky obsahují hexamemí asociační formy a prostředky jsou stejně stálé proti chemickému odbourání, má hexamemí Lys^B28Pro^B29-hi větší sklon k disociaci než inzulín.

Průmyslová využitelnost

Hexamemí komplex analogu lidského inzulínu, vhodný pro parenterální farmaceutické prostředky, obsahuje lidské inzulínové analogy v hexamemí konfiguraci, zinečnaté ionty a alespoň tři molekuly fenolové sloučeniny ze souboru m-kresol, fenol a jejich směsi. Takové komplexy a farmaceutické prostředky, které je obsahují, jsou stálé proti chemickému odbourání a začínají rychle působit.

Claims (7)

1. Parenterální farmaceutický prostředek komplexu analogu lidského inzulínu, vyznačující se tím, že komplex obsahuje šest molekul lidského inzulínu, kde Pro v poloze B28 je substituován Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala, a Lys v poloze B29 je Lys nebo substituovaný Pro, des(B28-B30)-lidského inzulínu nebo des(B27)-lidského inzulínu, dva zinečnaté ionty a alespoň tři molekuly fenolového derivátu, zvoleného ze souboru, zahrnujícího m-kresol, fenol nebo směs m-kresolu a fenolu, přičemž tento prostředek je komplex analogu, jenž je hexamemí.

2. Parenterální farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje izotonické činidlo a fyziologicky vhodný pufř.

3. Parenterální farmaceutický prostředek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že obsahuje 3,5 mg/ml analogu lidského inzulínu, 14 až 35 pg/ml zinku a 23 až 35 mM fenolového derivátu.

4. Parenterální farmaceutický prostředek podle nároku 1, 2 nebo 3, vyznačující se tím, že fenolovým derivátem je směs m-kresolu a fenolu.

5. Parenterální farmaceutický prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že obsahuje 3,5 mg/ml analogu lidského inzulínu, 19,7 pg/ml zinku, 29 mM m-kresolu, 7 mM fosforečnanu sodného a 16 mg/ml glycerinu.

-7CZ 287484 B6 vyznačující

6. Parenterální farmaceutický prostředek podle nároku 1, 2, 3, 4 nebo 5, tjto R7Q setím, že analogem lidského inzulínu je Lys Pro -lidský inzulín.

7. Parenterální farmaceutický prostředek podle nároku 1, 2, 3, 4 nebo 5, 5 se tím, že analogem lidského inzulínu je Asp^B28-lidský inzulín.