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Die
vorliegende Erfindung liegt im Gebiet der Humanmedizin, insbesondere
der Behandlung von Diabetes und Hyperglykämie durch die Verabreichung
von monomeren Insulinanaloga. Genauer gesagt betrifft die vorliegende
Erfindung Formulierungen an monomeren Insulinanaloga, die eine überlegene
physikalische Langzeitstabilität
aufweisen, wenn sie einem hohen mechanischen Energieeintrag und
einer hohen Temperatur ausgesetzt sind.
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Stabile
Formulierungen von therapeutischen Mitteln sind besonders zur Verwendung
in Abgabesystemen erforderlich, die diese Mittel gegenüber hohen
Temperaturen und/oder mechanischen Stress aussetzen. Beispielsweise
sind stabile Insulinformulierungen zur Verwendung in kontinuierlichen
Infusionssystemen und Pen-Abgabesystemen erforderlich. Derzeitige
Formulierungen liefern nur eine begrenzte Stabilität in dieser
Art von Abgabevorrichtungen.
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In
kontinuierlichen Infusionssystemen wird eine ein therapeutisches
Mittel enthaltende Flüssigkeit
aus einem Reservoir gewöhnlich
in ein subkutanes, intravenöses
oder intraperitoneales Depot gepumpt. Das Reservoir, das periodisch
aufgefüllt
werden muss, ist am Körper
des Patienten angebracht oder ist im Körper des Patienten implantiert.
In beiden Fällen üben die
Körperwärme und
die Körperbewegung
plus die Turbulenz in der Leitung und der Pumpe eine relativ hohe
Menge an thermo-mechanischer Energie auf die Formulierung aus. Im
Interesse der Minimierung der Häufigkeit,
mit der das Reservoir wieder befüllt
werden muss und der Minimirung der Größe des Reservoirs sind Formulierungen
mit relativ hohen Konzentrationen des therapeutischen Mittel sehr
vorteilhaft.
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Massey
und Sheliga,
US 4 839
341 A (Eli Lilly and Company, 1989) diskutieren die Herausforderungen bei
der Bereitstellung von stabilen Insulinformulierungen für die kontinuierliche
Infusion und präsentieren
eine umfassende Zusammenfassung des Stands der Technik bis etwa
1984. Die Herausforderungen sind derzeit noch größer, da Insulinformulierungen,
die für
1 bis 3 Monate stabil sind, jetzt gefordert werden.
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Es
wurden auch Injektionspens entwickelt, um Diabetikern bei der Messung
und Verabreichung einer genauen und kontrollierten Insulindosis
zu helfen. Im allgemeinen sind diese Pens mit einer Kartusche mit
einer bestimmten Menge an flüssiger
Medikation verbunden, die hierin eingeschlossen ist. Die Kartusche
umfasst einen Kolben und einen Mechanismus zum Vorwärtsbewegen
dieses Kolbens in der Kartusche auf eine Weise, um die Medikation
zu dispensieren. Die Injektionspens können wieder verwendbar oder
zum wegwerfen sein. Bei wieder verwendbaren Pens kann der Anwender
eine verbrauchte Kartusche wechseln und die Einstellschraube des
Pens auf die anfängliche
Position zurücksetzen.
Bei einem Einwegpen ist die Kartusche permanent im Pen eingebaut,
der dann weggeworfen wird, nachdem der Inhalt der Kartusche erschöpft ist. Formulierungen,
die in diesen Pens verwendet werden, werden einem physikalischen
Stress ausgesetzt und es wird gewöhnlich eine begrenzte Stabilität beobachtet.
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Mit
der Einführung
der neuen monomeren Insulinanaloga zur Behandlung von Diabetes besteht
ein Bedarf zur Verwendung dieser Verbindungen in Behandlungsplänen, die
einen Kompromiss mit der inhärenten Stabilität dieser
Formulierungen eingehen müssen.
Schnell wirkende Insuline, die als monomere Insulinanaloga bekannt
sind, sind in der Technik gut bekannt und beschrieben in Chance
et al.
US 5 514 646
A vom 7. Mai 1996, Brems et al., Protein Engineering, 6:
527–533
(1992), Brange et al.
EP
0 214 826 A (veröffentlicht
am 18. März
1987) und Brange et al., Current opinion in Structural Biology 1:
934–940
(1991). Monomere Insulinanaloga werden viel schneller absorbiert
als Insulin und sind idealer weise zur postprandialen Kontrolle der Blutglucosespiegel
in behandlungsbedürftigen
Patienten geeignet. Sie sind auch speziell zur Verabreichung durch
kontinuierliche Infusion sowohl zur prandialen als auch zur basalen
Kontrolle der Blutglucosespiegel aufgrund ihrer schnellen Absorption
von der Verabreichungsstelle gut geeignet.
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Unglücklicherweise
haben monomere Insulinanalogonformulierungen eine Neigung zu aggregieren und
werden instabil, wenn sie thermo-mechanischem Stress ausgesetzt
werden [Bakaysa et al.,
US
5 474 978 A vom 12. Dezember 1995]. Die Aggregation kann
sich sogar als Fällung
von Insulinspecies höherer
Ordnung manifestieren. Auf diese Weise kann die Aggregation die
reproduzierbare Abgabe von effektiven therapeutischen Dosen an monomeren
Insulinanaloga verhindern und kann auch eine Irritation an der Verabreichungsstelle
oder eine systemischere immunologische Reaktion hervorrufen. Insulinanalogaformulierungen,
die gegen eine Aggregation stabilisiert sind, sind erwünscht.
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Formulierungen
der monomeren Insulinanaloga zur Verwendung in kontinuierlichen
Infusionssystemen müssen
löslich
und im wesentlichen frei von Aggregation bleiben, auch wenn sie
der Körperwärme des Patienten
und dessen Bewegungen für
Perioden ausgesetzt sind, die von wenigen Tagen bis mehreren Monaten
reichen. Die Instabilität
wird durch die höheren
Proteinkonzentrationen gefördert,
die für
kontinuierliche Infusionssysteme erwünscht sind und durch den thermo-mechanischen
Stress, dem Formulierungen in kontinuierlichen Infusionssystemen
ausgesetzt sind. Daher ist eine Verbesserung in der physikalischen
und chemischen Stabilität
von konzentrierten Insulinanalogonformulierungen dringend erforderlich,
um zu erlauben, dass sie in kontinuierlichen Infusionssystemen eingesetzt
werden. Die Verbesserung der Stabilität von monomeren Insulinformulierungen
für andere
Verwendungen als zur kontinuierlichen Infusion sind ebenfalls nützlich.
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Stabilisierte
Formulierungen an monomeren Insulinanaloga, die schnell wirkend
sind, sind bekannt. Bakaysa et al.,
US 5 474 978 A beschreiben und beanspruchen
einen Humaninsulinanalogonkomplex, der aus 6 Molekülen eines
Humaninsulinanalogons (Hexamerkomplex), zwei Zinkatomen und zumindest
drei Molekülen
eines phenolischen Konservierungsmittels besteht, Formulierungen,
die den Hexamerkomplex enthalten und Verfahren zur Behandlung von
Diabetes mellitus durch die Verabreichung der Formulierung. Bakaysa
et al., beanspruchen auch Formulierungen des Hexemerkomplexes, die
ferner ein Isotonizitätsmittel
und einen physiologisch tolerierten Puffer enthalten.
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Die
Beschreibung der
US
5 474 978 A beschreibt, dass die Zinkkomplexe der monomeren
Insulinanaloga in Gegenwart eines physiologisch tolerierten Puffers
formuliert werden können.
Unter den zur Verwendung in den Formulierungen erwähnten Puffern
sind Natriumphosphat, Natriumacetat, Natriumcitrat und TRIS. Die
Beispiele in
US 5 474
978 A beschreiben nur Formulierungen, worin der Puffer
Natriumphosphat ist und nur Natriumphosphatpuffer in einem Anspruch
erforderlich (Anspruch 5). Keines der Beispiele in
US 5 474 978 A beschreibt
spezifisch die Verwendung von TRIS Puffer in Formulierungen an Komplexen
aus Zink-monomerem Insulinanalogon.
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Formulierungen
aus monomerem Insulinanalogon, die Protamin enthalten, wurden entwickelt,
um bei der Verwendung eine mittlere Wirkdauer zu ergeben. Die Formulierungen
aus monomerem Insulinanaloga-Protamin sind in
US 5 461 031 A beschrieben.
Verfahren zur Kristallisation von monomeren Insulinanaloga mit dem
basischen Peptid Protamin unter Bildung einer neutralen Protaminsuspension
sind in der Technik bekannt. Zusätzlich
können
biphasische Gemische, die eine monomere Insulinanalo gonlösung und
eine Suspension aus monomerem Insulinanalogon-Protamin enthalten,
hergestellt werden. Diese Gemische haben die optimalen Zeitwirkungseigenschaften
des Analogons in Kombination mit der basalen Aktivität. Monomere
Insulinanalogagemische sind auch in
US 5 461 031 A beschrieben.
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Suspensionsformulierungen
aus monomerem Insulinanalogon-Protamin und biphasische Gemische sind
zur Verwendung in Kartuschenbehältervorrichtungen
brauchbar. Jedoch führen
sie zu einem erhöhten Stress
für die
Präparation,
da diese Vorrichtungen eine häufige
Manipulation durch den Patienten erfordern. Protaminsalzformulierungen
haben insbesondere eine begrenzte Stabilität, wenn sie thermodynamischem Stress
ausgesetzt werden. Daher besteht ein Bedarf zur Entwicklung stabiler
mittelschnell wirkender monomerer Insulinanalogon-Protamin-Formulierungen
wie auch Formulierungen mit biphasischem Gemisch.
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Es
wurde nun festgestellt, dass bei einer Verwendung von bestimmten
physiologisch tolerierten Puffern, die nicht Phosphat sind, in Formulierungen
aus Zink-monomerem Insulinanalogonkomplexen, Protaminsalzformulierungen
oder biphasischen Gemischen an monomerem Insulinanalogon, die physikalische
Stabilität
der Formulierungen unerwartet und beträchtlich höher ist, als bei einer Verwendung
von Phosphatpuffer. Am vorteilhaftesten ist die Feststellung, dass,
während
lösliche
Formulierungen an Komplexen aus Zink mit monomeren Insulinanalogon
mit einem Phosphatpuffer, wie die, die in
US 5 474 978 A beschrieben
sind, physikalisch nicht stabil genug für die Langzeitverabreichung
mittels kontinuierlicher Infusionspumpsysteme sind, die durch die
vorliegende Erfindung bereitgestellten löslichen Formulierungen ausreichend
stabil sind, um mit Sicherheit für
lange Zeiträume
der Insulininfusion verwendet zu werden. Es wurde ebenfalls festgestellt,
dass die Zugabe von Arginin zu Protaminsalzformulierungen der monomeren
Insulinanaloga zu dramatischen Verbesserungen sowohl in der chemischen
als auch physikalischen Stabilität
der Formulierung führt.
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Demnach
liefert die vorliegende Erfindung eine Lösungsformulierung, die einen
physiologisch tolerierten Puffer, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht
aus TRIS und Arginin, ein monomeres Insulinanalogon, Zink und ein
phenolisches Konservierungsmittel enthält.
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Die
Erfindung umfasst auch eine Insulinanalogonformulierung, die ein
monomeres Zinkanalogon, Zink, ein phenolisches Konservierungsmittel,
Protamin und einen Puffer enthält,
ausgewählt
aus der Gruppe, die besteht aus TRIS und Arginin.
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Die
Erfindung liefert ferner die Verwendung der Insulinanalogonformulierungen
zur Behandlung von Diabetes und Hyperglykämie bei einem behandlungsbedürftigen
Patienten.
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Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung, wie sie hierin beschrieben und beansprucht
ist, haben die folgenden Ausdrücke
und Abkürzungen
die folgenden Bedeutungen.
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Der
Ausdruck "verabreichen" meint die Einführung einer
Formulierung der vorliegenden Erfindung in den Körper eines behandlungsbedürftigen
Patienten zur Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustands.
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Die
verschiedenen Formen des Verbs "zu
aggregieren" beziehen
sich auf ein Verfahren, bei dem einzelne Moleküle oder Komplexe unter Bildung
von Aggregaten assoziieren. Ein Aggregat ist ein polymerer Zusammenschluss,
der Moleküle
oder Komplexe des monomeren Insulinanalogons enthält. Für den Zweck
der vorliegenden Erfindung ist das monomere Insulinanalogonhexamer
kein Aggregat, sondern ein Komplex. Monomere Insulinanaloga und
Hexamerkomplexe hiervon haben die Neigung zur ag gregieren, wenn
sie thermo-mechanischem Stress ausgesetzt sind. Die Aggregation
kann bis zu dem Ausmaß fortschreiten,
dass sich ein sichtbarer Niederschlag bildet.
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Der
Ausdruck "Arginin" bezieht sich auf
die Aminosäure
und umfasst die D- und L-Enantiomere wie auch Gemische hiervon.
Der Ausdruck umfasst auch alle pharmakologisch annehmbaren Salze
hiervon. Arginin ist in der Technik auch bekannt als 1-Amino-4-guanidinovaleriansäure. Arginin
bildet leicht Salze, wie das Hydrochloridsalz.
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Der
Ausdruck "Komplex" meint eine Verbindung,
worin ein Übergangsmetall
mit mindestens einem Liganden koordiniert ist. Liganden umfassen
Stickstoff-enthaltende Moleküle,
wie unter vielen anderen Verbindungen Proteine, Peptide, Aminosäuren und
TRIS. Monomeres Insulinanalogon kann ein Ligand von divalenten Zinkionen
sein.
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Der
Ausdruck "kontinuierliches
Infusionssystem" bezieht
sich auf eine Vorrichtung für
die kontinuierliche parenterale Verabreichung einer Flüssigkeit
an einen Patienten über
einen ausgedehnten Zeitraum oder für die intermittierende parenterale
Verabreichung einer Flüssigkeit
an einen Patienten über
einen ausgedehnten Zeitraum, ohne jedesmal eine neue Verabreichungsstelle
zu etablieren, wenn die Flüssigkeit
verabreicht wird. Die Flüssigkeit
enthält
ein oder mehrere therapeutische Mittel. Die Vorrichtung umfasst
ein Reservoir zur Lagerung der Flüssigkeit vor der Infusion,
eine Pumpe, einen Katheter oder einen anderen Schlauch zur Verbindung
des Reservoirs mit der Pumpe und Kontrollelemente zur Regulierung
der Pumpe. Die Vorrichtung kann für die Implantierung konstruiert
sein, gewöhnlich
subkutan. In einem solchen Fall ist das Insulinreservoir gewöhnlich für die perkutane
Wiederbefüllung
angepasst. Es ist offensichtlich, dass bei einer Implantierung der Vorrichtung
der Inhalt des Reservoirs Körpertemperatur
aufweist und der Körperbewegung
des Patienten unterworfen wird.
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Ein "Isotonizitätsmittel" ist eine Verbindung,
die physiologisch toleriert wird und der Formulierung eine geeignete
Tonizität
verleiht, um den Nettofluss von Wasser durch die Zellmembranen zu
verhindern, die mit der Formulierung in Kontakt sind. Verbindungen,
wie Glycerin, werden herkömmlich
für solche
Zwecke bei bekannten Konzentrationen verwendet. Andere mögliche Isotonizitätsmittel
umfassen Salze, beispielsweise Natriumchlorid, Dextrose und Lactose.
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Die
Ausdrücke "monomeres Humaninsulinanalogon", "monomeres Insulinanalogon" und "Humaninsulinanalogon" sind in der Technik
gut bekannt und beziehen sich auf schnell wirkende Humaninsulinanaloga,
die umfassen:
Humaninsulin, worin Pro an der Position B28 substituiert
ist durch Asp, Lys, Leu, Val oder Ala und worin die Position B29
für Lys
steht oder durch Pro substituiert ist,
AlaB26-Humaninsulin
Des(B28–B30)-Humaninsulin
und
Des(B27)-Humaninsulin
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Solche
monomeren Insulinanaloga sind beschrieben in Chance et al.,
US 5 514 646 A vom
7. Mai 1996, Chance et al., US Anmeldung 08/255 297, Brems et al.,
Protein Engineering, 6: 527–533
(1992), Brange et al.,
EP
0 214 826 A (veröffentlicht
am 18. März
1987) und Brange et al., Current Opinion in Structural Biology 1:
934–940
(1991). Die monomeren Insulinanaloga, die in den vorliegenden Formulierungen
verwendet werden sind korrekt quervernetzt. Ein korrekt quervernetztes
Insulinanalogon enthält
drei Dilsulfidbrücken:
Eine zwischen Position 7 der A-Kette und Position 7 der B-Kette,
eine zweite zwischen Position 20 der A-Kette und Position 19 der
B-Kette und eine dritte zwischen den Positionen 6 und 11 der A-Kette.
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Der
Ausdruck "phenolisches
Konservierungsmittel",
wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Chlorcresol, m-Cresol,
Phenol oder Gemische hiervon.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "Stabilität" auf die physikalische Stabilität von Formulierungen
an monomeren Insulinanaloga. Physikalische Instabilität einer
Proteinformulierung kann durch eine Aggregation der Proteinmoleküle unter
Bildung von Polymeren höherer
Ordnung oder sogar Niederschlägen verursacht
werden. Eine "stabile" Formulierung ist
eine, worin das Ausmaß an
Aggregation der Proteine hierin akzeptabel kontrolliert wird und
mit der Zeit nicht unannehmbar zunimmt. Monomere Insulinanalogonformulierungen
haben eine Neigung zur Aggregation wenn sie gegenüber thermomechanischem
Stress ausgesetzt werden. Die physikalische Stabilität kann durch
in der Technik gut bekannte Verfahren untersucht werden, einschließlich der
Messung der scheinbaren Lichtschwächung einer Probe (Absorption,
optische Dichte). Eine solche Messung der Lichtschwächung hängt mit
der Trübung
einer Formulierung zusammen. Die Trübung wird durch Aggregation
oder Fällung
der Proteine oder Komplexe in der Formulierung hervorgerufen. Andere
Methoden zur Untersuchung der physikalischen Stabilität sind in
der Technik gut bekannt.
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Der
Ausdruck "behandeln" bezieht sich auf
die Handhabung und die Sorge um einen Patienten, der Diabetes oder
Hyperglykämie
oder einen anderen Zustand hat, für den die Insulinverabreichung
zum Zweck der Bekämpfung
oder Linderung der Symptome oder Komplikationen dieser Zustände indiziert
ist. Die Behandlung umfasst die Verabreichung einer erfindungsgemäßen Formulierung,
um das Einsetzen der Symptome oder Komplikationen zu verhindern,
die Symptome oder Komplikationen zu lindern oder die Krankheit,
den Zustand oder die Störung
zu eliminieren.
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Der
Ausdruck "TRIS" bezieht sich auf
2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol und auf jedes pharmakologisch
annehmbare Salz hiervon. Die freie Base und die Hydrochloridform
sind zwei herkömmliche
Formen von TRIS. TRIS ist auch in der Technik als Trimethylolaminomethan,
Tromethamin und Tris(hydroxymethyl)aminomethan bekannt.
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Dass
die vorliegende Erfindung Formulierungen der monomeren Insulinanaloga
mit einer stark erhöhten
physikalischen Stabilität
im Vergleich zu denen in der Technik bekannten liefert, ist aus
den folgenden Daten leicht ersichtlich.
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Formulierungen,
die ein monomeres Insulinanalogon, nämlich LysB28ProB29-Humaninsulinanalogon und TRIS enthalten,
werden hergestellt, wie dies im wesentlichen in Beispiel 3 hierin
beschrieben ist, worin sie einem beschleunigten Stabilitätstest unterzogen
werden, wie dies im folgenden beschrieben ist. Die Proben der hergestellten
Formulierungen werden in vorgereinigte HPLC Probengebergläschen mit
einer Kapazität
von 2 ml gegeben. Jedes Gläschen
enthält
drei Teflon® Kügelchen
mit einem Durchmesser von etwa 3/16 Inch. Die Luft wird vollständig durch
die Probenformulierung aus dem Gläschen verdrängt. Nach dem Verschließen werden
die Gläschen
kontinuierlich bei 40 Hz (20 × g,
mittlere Linearbeschleunigung) mit einer Peak-zu-Peak Amplitude
von 12 mm und bei 37°C
geschüttelt,
um ein relativ hohes Maß an
mechanischem Energieeintrag in die Formulierungen bei einer Temperatur
bereitzustellen, die die Aggregation und physikalische Instabilität fördert. Die
Gläschen
werden im Schüttler
so positioniert, dass ihre Längsachse
(das heißt
Boden zu Öffnung)
parallel zur Richtung der linearen Beschleunigung orientiert ist,
das heißt
sie liegen auf der Seite auf der Oberfläche des Schüttlers. Es wurde für Insulinformulierungen
gezeigt, dass eine erhöhte
Stabilität
unter den oben beschriebenen beschleunigten Bedingungen mit einer
stark erhöhten
Gebrauchsstabilität
korreliert.
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Die
optische Dichte bei 450 nm der Probenformulierung und der Kontrollformulierungen
wird periodisch mittels eines Shimadzu 1201 Spektrophotometers gemessen.
Die Kontrollformulierungen werden auf dieselbe Weise hergestellt,
wie die Probenformulierungen, werden aber bei 4°C ohne Schütteln gelagert. Die optische
Nettodichte wird für
eine Probe durch die Subtraktion der optischen Dichte der Kontrolle
von der optischen Dichte der Probe berechnet. Die Werte in Tabelle
1 sind die mittlere optische Nettodichte und die Standardabweichung
für die
angegebene Probenanzahl (n). Die Proben- und Kontrollformulierungen,
die Phosphat als Puffer enthalten (pH 7,4 ± 0,1) werden im wesentlichen
hergestellt, wie dies in Beispiel 4 beschrieben ist. Tabelle
1: Effekte von Puffer und Expositionszeit gegenüber einem hohen mechanischen
Energieeintrag bei 37°C
auf die Trübung
(optische Dichte bei 450 nm) der Formulierungen an Lys
B28Pro
B29-Humaninsulinanalogon
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Unter
den oben beschriebenen Bedingungen erreicht die Trübung in
den Formulierungen mit einem Phosphatpuffer ein sehr hohes und unannehmbares
Maß nach
16 Stunden (Tabelle 1, Beispiel 4) im Vergleich zu Kontrollformulierungen,
die Phosphat enthalten, die bei 4°C
ohne Schütteln
gelagert werden. Andererseits bleibt die optische Dichte der Formulierung
mit TRIS als Puffer im wesentlichen dieselbe wie die optische Dichte
der Kontrolle für
500 Stunden bei Formulierungen, die TRIS enthalten (Beispiel 3).
Die Daten in Tabelle 1 zeigen deutlich, dass der Ersatz des Phosphatpuffers
durch TRIS Puffer in den Formulierungen mit LysB28ProB29 Humaninsulinanalogon die Stabilität der Formulierungen
drastisch erhöht.
Basierend auf den Beobachtungen mit anderen Insulinformulierungen
wird angenommen, dass die überraschende
und signifikante Stabilität
der Formulierungen des monomeren Insulinanalogons in TRIS Puffer
im beschleunigten Test sich in eine "im Gebrauch" Stabilität von viel mehr als 500 Stunden übersetzen
lässt,
da der Energieeintrag im beschleunigten Test größer ist als während den
erwarteten Verwendungen.
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Formulierungen,
die ein monomeres Insulinanalogon Lys
B28Pro
B29 Humaninsulinanalogon und entweder TRIS,
Phosphat oder L-Arginin als Puffer enthalten, werden hergestellt,
wie dies im wesentlichen jeweils in den Beispielen 3, 4 und 5 beschrieben
ist. Es werden drei Lots an Lys
B28Pro
B29 Humaninsulinanalogon zur Herstellung
der Formulierungen verwendet. Für
jede Kombination aus Analogonlot und Puffer werden sechs Proben
einem Stabilitätstest
unterzogen, wie dies oben beschrieben ist. Vier unterschiedliche
Schüttler
werden für
den Eintrag der mechanischen Energie in die Gläschen verwendet. Jeder Schüttler erhält zumindest
eine Probe von jedem Lot und jeder Pufferkombination. Die Stabilität der Formulierungen
wird periodisch durch die Messung der optischen Dichte der Proben
und Kontrolle wie oben beschrieben untersucht. Die Ergebnisse sind
in Tabelle 2 gezeigt. Die Werte in Tabelle 2 sind der Mittelwert
der optischen Nettodichte und die Standardabweichung für 6 Proben
für jeden
Lot und Puffer. Tabelle
2: Effekte von Puffer, Analogonlot und Expositionszeit gegenüber dem
hohen mechanischen Energieeintrag bei 37°C auf die Trübung (optische Dichte bei 450
nm) der Formulierungen von Lys
B28Pro
B29 Humaninsulinanalogon.
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Unter
den oben beschriebenen Bedingungen erreicht die Trübung in
den Formulierungen mit Phoshatpuffer ein sehr hohes und unannehmbares
Maß nach
23 Stunden unabhängig
von dem Lot des verwendeten Insulinanalogons (Tabelle 2). Im Gegensatz
dazu bleiben die Formulierungen mit TRIS als Puffer im wesentlichen
für 139
Stunden unverändert
unabhängig
vom Lot des verwendeten Insulins. Formulierungen, die L-Argininpuffer
enthalten, zeigen eine bessere physikalische Stabilität im Vergleich
zu Formulierungen, die Phosphat enthalten und die Stabilitätsdauer
hängt etwas
vom verwendeten Lot des Insulinanalogons ab. Die Daten in Tabelle
2 zeigen deutlich, dass die Formulierungen des LysB28ProB29-Humaninsulinanalogons, die TRIS Puffer
oder L-Argininpuffer bei pH 7,4 enthalten, für deutlich längere Zeiträume gegenüber einer
Aggregation stabil bleiben, als Formulierungen, die einen Phosphatpuffer
enthalten. Erneut wird angenommen, dass die überraschende und signifikante
Stabilität
der Formulierungen an monomerem Insulinanalogon in TRIS und L-Argininpuffer
sich in eine "in
Gebrauch" Stabilität übersetzen
lässt,
die viel größer ist
als die, die im beschleunigten Test beobachtet wird, da der Energieeintrag
im beschleunigten Test größer ist,
als während
der erwarteten Verwendung.
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Die
Empfindlichkeit gegenüber
Veränderungen
der Morphologie und des Erscheinungsbilds für LysB28ProB29 Suspensionsformulierungen werden durch
den physikalischen Stabilitätsstresstest
(PSST) evaluiert. In diesem thermodynamischen Verfahren werden Präparationen
ohne Luftüberstand
in einem Behälter
mit fixiertem Volumen mit einer Glaskugel verschlossen. Die Behälter werden
bei erhöhter
Temperatur (etwa 37°C) in
eine Kammer gegeben, die mit einer festgelegten Geschwindigkeit
(etwa 30 Upm) für
eine definierte Zeit (etwa 4 Stunden) rotiert und werden dann für weitere
24 Stunden ruhig gehalten. Die Behälter werden auf Veränderungen
untersucht und aus dem Test entfernt, wenn bestimmt wird, dass eine
Aggregation (Verklumpung) aufgetreten ist. Längere Testperioden ohne Versagen
wie auch eine größere Anzahl,
die im Test verbleibt, werden mit einer erhöhten physikalischen Stabilität gleichgesetzt.
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Zwei
unterschiedliche Gemische, die LysB28ProB29 und LysB28ProB29-Protaminkristalle enthalten, werden getestet.
Das Verhältnis
von LysB28ProB29 zu
LysB28ProB29 Protamin
beträgt
für das
Gemisch mit geringem Verhältnis
25:75 und für
das mit hohem Verhältnis
75:25. Das Gemisch wird hergestellt, wie dies in den Beispiel 6
und 7 beschrieben wird. Wenn das Gemisch mit geringem Verhältnis mit
dem PSST Verfahren getestet wird, verbleiben nur Behälter der
Arginin enthaltenden Formulierungen nach 18 Tagen. Zwei der Testproben
haben Behälter,
die bis zu 44 Tage im Test bleiben. Der PSST mit Gemischen mit hohem
Verhältnis
zeigt ähnliche Ergebnisse
mit den Formulierungen, die Arginin enthalten, wobei etwa 50 % der
Behälter
nach 36 Tagen im Tests verbleiben, während von den Kontrollformulierungen,
die Phosphatpuffer enthalten, nur 0 bis 5 % der Behälter nach
36 Tagen im Test verbleiben.
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Bevorzugte
monomere Insulinanaloga zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Formulierungen sind
LysB28ProB29 Humaninsulin,
AspB28-Humaninsulin und AlaB26-Humaninsulin.
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Die
Konzentration des monomeren Insulinanalogons in den vorliegenden
Formulierungen reicht von 1,2 mg/ml bis 50 mg/ml. Ein bevorzugter
Bereich der Analogonkonzentration beträgt etwa 3,0 mg/ml bis etwa 35
mg/ml. Bevorzugtere Konzentrationen sind etwa 3,5. mg/ml, etwa 7
mg/ml, etwa 14 mg/ml, etwa 17,5 mg/ml und etwa 35 mg/ml, das Formulierungen
mit jeweils etwa 100 Einheiten, etwa 200 Einheiten, etwa 400 Einheiten,
etwa 500 Einheiten und etwa 1000 Einheiten Insulinaktivität per ml
entspricht.
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Die
Konzentration an Zink in den Formulierungen reicht von etwa 4,5
mg/ml bis etwa 370 mg/ml und muss so sein, dass zumindest zwei Zinkatome
verfügbar
sind, um mit sechs Insulinmolekülen
in jedem Hexamer zu komplexieren. Das Verhältnis des gesamten Zinks (komplexiertes
Zink plus unkomplexiertes Zink) zu Insulinanalogonhexamer sollte
zwischen 2 bis 4 liegen. Ein Verhältnis von etwa 3 bis etwa 4
Atomen des gesamten Zinks pro Insulinanalogonhexamerkomplex ist
bevorzugt.
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Es
ist eine Minimalkonzentration des phenolischen Konservierungsstoffs
erforderlich, um das monomere Insulinanalogonhexamer in den vorliegenden
Formulierungen zu bilden. Für
einige Zwecke, wie die Erfüllung
von Konservierungswirkung für
Mehrfachverwendungsformulierungen, kann die Konzentration des phenolischen
Konservierungsstoffs in den vorliegenden Formulierungen über die,
welche zur Bildung von Hexameren erforderlich ist bis zu einer Menge
erhöht
werden, die zur Aufrechterhaltung der konservierenden Wirkung erforderlich
ist. Die Konzentration des Konservierungsstoffs, die zur wirksamen
Konservierung erforderlich ist, hängt ab vom verwendeten Konservierungsmittel,
dem pH der Formulierung und ob Substanzen, die das Konservierungsmittel
beeinflussen oder binden, ebenfalls vorhanden sind. Im allgemeinen
kann die erforderliche Menge gefunden werden in K.DH. Wallhauser,
Develop. Biol. Standard. 24, Seiten 9–28 (Basel, S. Krager, 1974).
Bei einer Formulierung bindet der Insulinanalogonhexamerkomplex,
der in den vorliegenden Formulierungen verwendet wird, bis zu sieben
phenolische Moleküle,
obwohl im allgemeinen nur sechs phenolische Moleküle an das
Hexamer gebunden sind. Es ist ein Minimum von etwa drei phenolischen
Molekülen zur
Nexamerbildung erforderlich. Wenn ein Konservierungsstoff für die antimikrobielle
Wirksamkeit erforderlich ist, beträgt die bevorzugte Konzentration
des phenolischen Mittels etwa 23 mM bis etwa 35 mM. m-Cresol und Phenol,
entweder getrennt oder in Gemischen, sind bevorzugte Konservierungssmittel.
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Die
Formulierungen können
wahlweise ein Isotonizitätsmittel
enthalten. Die Formulierungen enthalten vorzugsweise ein Isotonizitätsmittel
und Glycerin ist das bevorzugteste Isotonizitätsmittel. Die Konzentration an
Glycerin liegt, wenn es verwendet wird, im in der Technik bekannten
Bereich für
Insulinformulierungen, vorzugsweise bei etwa 16 mg/ml.
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Der
pH der Formulierungen wird durch ein pufferndes Mittel kontrolliert,
wie TRIS oder L-Arginin. Die Konzentration der Puffer dürfte keine
entscheidende Rolle bei der Erzielung des erfindungsgemäßen Ziels spielen
und sollte so sein, dass eine angemessene Pufferung des pHs während der
Lagerung bereitgestellt wird, um den pH im Ziel-pH ± 0,1 pH
Einheiten zu halten. Der bevorzugte pH liegt zwischen etwa 7 und
etwa 8, wenn er bei einer Temperatur von etwa 22°C gemessen wird.
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Andere
Zusätze,
wie pharmazeutisch annehmbare Lösungsvermittler,
wie Tween 20® (Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonolaurat),
Tween 40® (Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonopalmitat),
Tween 80® (Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonooleat),
Pluronic F68® (Polyoxyethylen-Polyoxypropylenblockcopolymere)
und PEG (Polyethylenglycol) können
wahlweise zur Formulierung gegeben werden. Diese Zusätze sind
nicht erforderlich, um den großen
Vorteil der vorliegenden Erfindung zu erreichen, können aber
nützlich
sein, falls die Formulierungen Plastikmaterialien berühren.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst auch Protaminsalzpräparationen
mit unterschiedlichen Anteilen der löslichen Fraktionen der monomeren
Insulinanaloga. Es sind keine spezifischen Konformationsanforderungen
des Insulinmoleküls
erforderlich, um die Formulierung mit Arginin zu stabilisieren,
obwohl Hilfsstoffe, wie Zink und Konservierungsstoffe, die normalerweise
zu Insulinformulierungen gegeben werden (oben diskutiert), zusammen
mit Arginin zur Erhöhung
der Stabilisierung wirken können.
Die Argininkonzentrationen reichen von 1 bis 100 mM in Formulierungen,
die Protamin enthalten. Am bevorzugtesten ist eine Argininkonzentration
im Bereich von 5 bis 25 mM. Arginin kann als Zusatz zu Lösungen oder
gefällten
Suspensionen zugegeben werden, die bereits Zinkionen und phenolische
Konservierungsstoffe enthalten.
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Die
Verabreichung kann auf jeden Weg erfolgen, der dem Arzt oder dem
Fachmann als wirksam bekannt ist. Die parenterale Verabreichung
ist bevorzugt. Als parenterale Verabreichung wird herkömmlich eine Verabreichung
verstanden, die nicht über
den gastrointestinalen Weg erfolgt. Die bevorzugten parenteralen Routen
zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Formulierungen der vorliegenden
Erfindung umfassen intravenöse,
intramuskuläre,
subkutane, intraperitoneale, intraarterielle, nasale, pulmonale
und bukkale Wege. Intravenöse,
intraperitoneale, intramuskuläre
und subkutane Verabreichungswege der in der vorliegenden Erfindung
verwendeten Verbindungen sind die bevorzugteren parenteralen Verabreichungswege.
Intravenöse, intraperitoneale
und subkutane Verabreichungswege der erfindungsgemäßen Formulierungen
sind noch bevorzugter.
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Die
Verabreichung über
bestimmte parenterale Wege kann die Einbringung der erfindungsgemäßen Formulierungen
in den Körper
eines Patienten durch eine Nadel oder einen Katheter umfassen, die
von einer Spritze oder einer anderen mechanischen Vorrichtung, wie
einem kontinuierlichen Infusionssys tem vorangetrieben werden. Eine
durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte Formulierung kann
mittels einer Spritze, eines Injektors, einer Pumpe oder einer anderen
Vorrichtung verabreicht werden, die in der Technik zur parenteralen
Verabreichung bekannt ist. Eine erfindungsgemäße Formulierung kann auch als
Aerosol zur Absorption in der Lunge oder dem Nasalraum verabreicht
werden. Die Formulierungen können
auch zur Absorption durch die mukösen Membranen verabreicht werden,
wie bei einer bukkalen Verabreichung.
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Die
Menge einer erfindungsgemäßen Formulierung,
die zur Behandlung von Diabetes oder Hyperglycämie verabreicht wird, hängt von
mehreren Faktoren ab, die ohne Einschränkung das Geschlecht des Patienten,
das Gewicht und das Alter, die zugrunde liegenden Ursachen des Zustands
oder der Erkrankung, die zu behandeln sind, den Verabreichungsweg
und die Bioverfügbarkeit,
die Persistenz des verabreichten monomeren Insulinanalogons im Körper, die
Formulierung und die Stärke
des monomeren Insulinanalogons umfassen. Wenn die Verabreichung
intermittierend ist sollte die Menge pro Verabreichung auch das
Intervall zwischen den Dosen und die Bioverfügbarkeit des monomeren Insulinanalogons
aus der Formulierung berücksichtigen.
Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Formulierung kann kontinuierlich
sein. Es liegt im Bereich des Könnens
eines herkömmlichen
Arztes, die Dosis und die Infusionsrate oder die Häufigkeit
der Verabreichung der erfindungsgemäßen Formulierung zu titrieren,
um das gewünschte
klinische Ergebnis zu erreichen.
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Monomere
Insulinanaloga, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden
können,
können
auf jede einer Vielzahl an bekannten Peptidsynthesetechniken hergestellt
werden, einschließlich
der klassischen Lösungsverfahren,
Festphasenverfahren, semisynthetischen Verfahren und rekombinanten
DNA Verfahren. Chance et al.,
US 5 514 646 A vom 7. Mai 1996 beschreibt
die Herstellung von verschiedenen monomeren Insulinanaloga ausreichend
detailliert, um es dem Fachmann zu ermöglichen, jedes der in der vorliegenden Erfindung
verwendeten monomeren Insulinanaloga herzustellen.
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Sowohl
Zink als auch ein phenolisches Konservierungsmittel sind essentiell,
um einen Komplex zu erhalten, der stabil und zur schnellen Auflösung und
Wirkungsentfaltung fähig
ist. Der Hexamerkomplex besteht aus zwei Zinkionen pro Hexamer des
humanen Insulinanalogons und mindestens drei Molekülen eines
phenolischen Konservierungsmittels, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht
aus Chlorcresol, m-Cresol, Phenol und Gemischen hiervon.
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Geeignetes
monomeres Insulinanalogon wird durch Auflösen des monomeren Insulinanalogons
in einem Verdünnungsmittel,
das das phenolische Konservierungsmittel in ausreichenden Mengen
bei einem pH von etwa 7 bis etwa 8 enthält, und einer anschließenden Zugabe
von Zink zum Hexamerkomplex umgewandelt. Zink wird vorzugsweise
als Zinksalz zugegeben, wie ohne Einschränkung Zinkacetat, Zinkbromid,
Zinkchlorid, Zinkfluorid, Zinkiodid und Zinksulfat. Der Fachmann
erkennt, dass es viele andere Zinksalze gibt, die zur Herstellung
der monomeren Insulinanalogakomplexe verwendet werden können, die
ein Teil vorliegenden Erfindung sind. Vorzugsweise wird Zinkacetat,
Zinkoxid oder Zinkchlorid verwendet, da diese Verbindungen keine
neuen chemischen Ionen zu den kommerziell bekannten Verfahren hinzufügen.
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Die
Auflösung
des monomeren Insulinanalogons kann dadurch erleichtert werden,
was als "Säureauflösung" bekannt ist. Für die Säureauflösung wird
der pH des wässrigen
Lösemittels
auf etwa 3,0 bis 3,5 mit einer physiologisch tolerierten Säure, vorzugsweise
HCl abgesenkt, um bei der Auflösung
des monomeren Analogons zu helfen. Andere physiologisch tolerierte
Säuren
sind unter anderem ohne Beschränkung
Essigsäure,
Citronensäure
und Schwefelsäure.
Phosphorsäure
wird vorzugsweise nicht zur Einstellung des pH bei der Herstellung
der erfindungsgemäßen Formulierungen
verwendet. Der pH wird dann mit einer physiologisch tolerierten
Base, vorzugsweise Natriumhydroxid, auf etwa pH 7,3 bis 7,5 eingestellt.
Andere physiologisch tolerierte Basen umfassen ohne Einschränkung Kaliumhydroxid
und Ammoniumhydroxid. Danach werden das phenolische Konservierungsmittel
und Zink zugegeben.
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Parenterale
Formulierungen der vorliegenden Erfindung können mittels herkömmlicher
Löse- und Mischverfahren
hergestellt werden. Zur Herstellung einer geeigneten Formulierung
wird beispielsweise eine gemessene Menge eines monomeren Insulinanalogons
in Wasser mit dem gewünschten
Konservierungsstoff, einer Zinkverbindung und dem Puffer in Wasser
in ausreichenden Mengen zur Bildung des Hexamerkomplexes kombiniert.
Die Formulierung wird im allgemeinen vor der Verabreichung sterilfiltriert.
Variationen des Verfahrens sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise
können
die Reihenfolge, in der die Bestandteile zugegeben werden, die Reihenfolge,
in der der pH eingestellt wird, falls es eine gibt, die Temperatur
und die Ionenstärke,
bei der die Formulierung hergestellt wird, in Bezug auf die Konzentration
und die verwendeten Verabreichungsmittel optimiert werden.
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Die
folgenden Beispiele und Präparationen
werden nur bereitgestellt, um die Herstellung der erfindungsgemäßen Formulierungen
weiter zu erläutern.
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Beispiel 1
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Herstellung einer löslichen
E100 Formulierung die LysB28ProB29-Humaninsulinanalogon
und TRIS enthält
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Eine
Menge an LysB28ProB29-Humaninsulinanalogon-Zink-Kristallen,
die so berechnet wurde, um 100 Einheiten Insulinaktivität pro Milliliter
in der Endformulierung zu ergeben, wird in einer wässrigen
Lösung
gelöst,
die 0,715 mg/ml Phenol, 1,76 mg/ml m-Cresol, 16 mg/ml Glycerin und
Zinkoxid enthält.
Die Kristalle aus Insulinanalogon und Zink enthalten etwa 0,36 %
Zink auf Gewichtsbasis. Die Konzentration des Zinkoxids im wässrigen
Verdünnungsmittel
wird so gewählt,
dass sie die schließliche
Endkonzentration der Formulierung auf etwa 0,025 mg pro 100 Einheiten
an Insulinaktivität
einstellt. Ein Volumen an 10 % Chlorwasserstoffsäure wird zugegeben, um den
pH auf 2,8 bis 3,0 einzustellen. Nach dem Rühren zur Auflösung der
Kristalle werden Aliquots an 10 % Natriumhydroxidlösung sorgfältig zugegeben,
um den pH auf 7,4 bis 7,7 einzustellen. Ein Volumen einer Stammlösung an
TRIS (50 mg/ml, pH 7,4, bei Umgebungstemperatur gemessen, das heißt etwa 22°C), das so
berechnet wurde, um eine Konzentration an TRIS von 2 mg/ml in der
schließlichen
Formulierung zu ergeben, wird zur Insulinanalogonlösung gegeben.
Es wird Wasser zur Verdünnung
der Formulierung auf das Endvolumen zugegeben. Die Formulierung
wird mittels eines 0,2 μm
Filters sterilfiltriert.
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Beispiel 2
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Herstellung einer löslichen
E100 Formulierung die LysB28ProB29-Humaninsulinanalogon
und L-Arginin enthält
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Das
in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird bis zur Zugabe des Puffers
befolgt. Dann wird anstelle der Zugabe eines Volumens der TRIS Stammlösung ein
Volumen einer L-Argininstammlösung
(200 mM, pH 7,4), die so berechnet wurde, um eine Konzentration
an L-Arginin von 20 mM in der schließ lichen Formulierung zu ergeben,
zur Insulinanalogonlösung
gegeben. Es wird Wasser zur Verdünnung
der Formulierung auf das Endvolumen zugegeben. Die Formulierung
wird mittels eines 0,2 μm
Filters sterilfiltriert.
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Beispiel 3
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Herstellung einer löslichen
E400 Formulierung die LysB28ProB29-Humaninsulinanalogon
und TRIS enthält
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Eine
Menge an LysB28ProB29-Humaninsulinanalogon-Zink-Kristallen,
die so berechnet wurde, um 400 Einheiten Insulinaktivität pro Milliliter
in der Endformulierung zu ergeben, wird in einer wässrigen
Lösung
gelöst,
die 0,715 mg/ml Phenol, 1,76 mg/ml m-Cresol, 16 mg/ml Glycerin und
Zinkoxid enthält.
Die Kristalle aus Insulinanalogon und Zink enthalten etwa 0,36 %
Zink auf Gewichtsbasis. Die Konzentration des Zinkoxids im wässrigen
Verdünnungsmittel
wird so gewählt,
dass sie die schließliche
Endkonzentration der Formulierung auf etwa 0,025 mg pro 100 Einheiten
an Insulinaktivität
einstellt. Ein Volumen an 10 % Chlorwasserstoffsäure wird zugegeben, um den
pH auf 2,8 bis 3,0 einzustellen. Nach dem Rühren zur Auflösung der
Kristalle werden Aliquots an 10 % Natriumhydroxidlösung sorgfältig zugegeben,
um den pH auf 7,4 bis 7,7 einzustellen. Ein Volumen einer Stammlösung an
TRIS (50 mg/ml, pH 7,4, bei Umgebungstemperatur gemessen, das heißt etwa 22°C), das so
berechnet wurde, um eine Konzentration an TRIS von 2 mg/ml in der
schließlichen
Formulierung zu ergeben, wird zur Insulinanalogonlösung gegeben.
Es wird Wasser zur Verdünnung
der Formulierung auf das Endvolumen zugegeben. Die Formulierung
wird mittels eines 0,2 μm
Filters sterilfiltriert.
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Vergleichsbeispiel 4
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Herstellung einer löslichen
E400 Formulierung die LysB28ProB29-Humaninsulinanalogon
und Phosphat enthält
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Eine
Menge an LysB28ProB29-Humaninsulinanalogon-Zink-Kristallen,
die so berechnet wurde, um 400 Einheiten Insulinaktivität pro Milliliter
in der Endformulierung zu ergeben, wird in einer wässrigen
Lösung
gelöst,
die 0,715 mg/ml Phenol, 1,76 mg/ml m-Cresol, 16 mg/ml Glycerin und
Zinkoxid enthält.
Die Kristalle aus Insulinanalogon und Zink enthalten etwa 0,36 %
Zink auf Gewichtsbasis. Die Konzentration des Zinkoxids im wässrigen
Verdünnungsmittel
wird so gewählt,
dass sie die schließliche
Endkonzentration der Formulierung auf etwa 0,025 mg pro 100 Einheiten
an Insulinaktivität
einstellt. Ein Volumen an 10 % Chlorwasserstoffsäure wird zugegeben, um den
pH auf 2,8 bis 3,0 einzustellen. Nach dem Rühren zur Auflösung der
Kristalle werden Aliquots an 10 % Natriumhydroxidlösung sorgfältig zugegeben,
um den pH auf 7,4 bis 7,7 einzustellen. Ein Volumen einer Stammlösung an
dibasischem Natriumphosphat, das so berechnet wurde, um eine Konzentration an
dibasischem Natriumphosphat von 3,78 mg/ml und einen pH von 7,4 ± 0,1 in
der schließlichen
Formulierung zu ergeben, wird zur Insulinanalogonlösung gegeben.
Es wird Wasser zur Verdünnung
der Formulierung auf das Endvolumen zugegeben. Die Formulierung
wird mittels eines 0,2 μm
Filters sterilfiltriert.
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Beispiel 5
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Herstellung einer löslichen
E400 Formulierung die LysB28ProB29-Humaninsulinanalogon
und L-Arginin enthält
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Das
in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wird bis zur Zugabe des Puffers
befolgt. Dann wird anstelle der Zugabe eines Volumens der TRIS Stammlösung ein
Volumen einer L-Argininstammlösung
(200 mM, pH 7,6), die so berechnet wurde, um eine Konzentration
an L-Arginin von 20 mM in der schließlichen Formulierung zu ergeben,
zur Insulinanalogonlösung
gegeben. Es wird Wasser zur Verdünnung
der Formulierung auf das Endvolumen zugegeben. Die Formulierung
wird mittels eines 0,2 μm
Filters sterilfiltriert.
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Beispiel 6
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Herstellung einer E100
LysB28ProB29-Humaninsulinanalogongemischformulierung
mit hohem Verhältnis
(75 % V/V löslich
25 % V/V neutrales Protamin LysB28ProB29 die L-Arginin enthält
-
A. Herstellung von neutralem
Protamin LysB28ProB29
-
Eine
Menge an LysB28ProB29-Insulin-Zink-Kristallen,
die so berechnet wurde, um 200 E/ml zu ergeben, wird in einer wässrigen
Lösung
suspendiert, die 0,715 mg/ml Phenol, 1,76 mg/ml m-Cresol, 16 mg/ml
Glycerin und mit Chlorwasserstoffsäure angesäuertes Zinkoxid enthält, um die
schließliche
Endkonzentration an Zinkionen auf etwa 0,025 mg/100 E einzustellen.
Ein Volumen an 10 % Chlorwasserstoffsäure wird zugegeben, um den
pH auf 2,8 bis 3,0 einzustellen. Nach dem Rühren zur Auflösung werden
Aliquots an 10 % Natriumhydroxidlösung sorgfältig zugegeben, um den pH auf
7,4 bis 7,7 einzustellen. Ein Volumenäquivalent für eine Endkonzentration der
Formulierung von 3,78 mg/ml an 75,6 mg/ml dibasischer Natriumphoshatlösung mit
pH 7,2 wird zugegeben. Nach der Auflösung der ausgefallenen Feststoffe
und der Titration zur Aufrechterhaltung von pH 7,4 wird Wasser zugegeben,
um die Formulierung auf ein Endvolumen zu verdünnen, wonach die Lösung filtriert
wird.
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Festes
Protaminsulfat, das so berechnet wurde, um 0,6 mg/100 E Protaminbase
zu enthalten, wird in einer wässrigen
Lösung
gelöst,
die 0,715 mg/ml Phenol, 1,76 mg/ml m-Cresol und 16 mg/ml Glycerin
enthält. Festes
dibasisches Natriumphosphat wird so zugegeben, dass die Konzentration
der Formulierung 3,78 mg/ml beträgt.
Die Lösung
wird mit 10 % Chlorwasserstoffsäure
auf pH 7,4 eingestellt, mit Wasser auf das Endvolumen verdünnt und
filtriert.
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Sowohl
die LysB28ProB29 Lösung mit
200 Einheiten als auch die Protaminlösung werden auf 15°C äquilibriert.
Die Protaminlösung
wird zur LysB28ProB29 Lösung gegeben
und die entstehende Suspension kann für 24 Stunden ungestört bei 15°C inkubieren.
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B. Herstellung des LysB28ProB29 Gemisches
mit hohem Verhältnis
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Eine
Menge der in Beispiel 2 hergestellten LysB28ProB29 Lösung
mit 100 Einheiten, die L-Arginin enthält, welche 75 % des Endvolumens
entspricht, wird zu einem berechneten Volumen des neutralen Protamin LysB28ProB29 mit 100
E/ml gegeben. Die Suspension wird bei Raumtemperatur gerührt.
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Beispiel 7
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Herstellung einer E100
LysB28ProB29-Humaninsulinanalogongemischformulierung
mit niedrigem Verhältnis
(25 % V/V löslich,
75 % V/V neutrales Protamin LysB28ProB29) die L-Arginin enthält
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A. Herstellung von neutralem
Protamin LysB28ProB29
-
Eine
Menge an LysB28ProB29-Insulin-Zink-Kristallen,
die so berechnet wurde, um 200 E/ml zu ergeben, wird in einer wässrigen
Lösung
suspendiert, die 0,715 mg/ml Phenol, 1,76 mg/ml m-Cresol, 16 mg/ml
Glycerin und mit Chlorwassrstoffsäure angesäuertes Zinkoxid enthält, um die
schließliche
Endkonzentration an Zinkionen auf etwa 0,025 mg/100 E einzustellen.
Ein Volumen an 10 % Chlorwasserstoffsäure wird zugegeben, um den
pH auf 2,8 bis 3,0 einzustellen. Nach dem Rühren zur Auflösung der
Kristalle werden Aliquots an 10 % Natriumhydroxidlösung sorgfältig zugegeben,
um den pH auf 7,4 bis 7,7 einzustellen. Ein Volumenäquivalent für eine Endkonzentration
der Formulierung von 3,78 mg/ml an 75,6 mg/ml dibasischer Natriumphoshatlösung mit
pH 7,2 wird zugegeben. Nach der Auflösung der ausgefallenen Feststoffe
und der Titration zur Aufrechterhaltung von pH 7,4 wird Wasser zugegeben,
um die Formulierung auf ein Endvolumen zu verdünnen, wonach die Lösung filtriert
wird.
-
Festes
Protamin, das so berechnet wurde, um 0,6 mg/100 E Protaminbase zu
enthalten, wird in einer wässrigen
Lösung
gelöst,
die 0,715 mg/ml Phenol, 1,76 mg/ml m-Cresol und 16 mg/ml Glycerin
enthält.
Festes dibasisches Natriumphosphat wird so zugegeben, dass die Konzentration
der Formulierung 3,78 mg/ml beträgt.
Die Lösung
wird mit 10 % Chlorwasserstoffsäure
auf pH 7,4 eingestellt, mit Wasser auf das Endvolumen verdünnt und
filtriert.
-
Sowohl
die LysB28ProB29 Lösung mit
200 Einheiten als auch die Protaminlösung werden auf 15°C äquilibriert.
Die Protaminlösung
wird zur LysB28ProB29 Lösung gegeben
und die entstehende Suspension kann für 24 Stunden ungestört bei 15°C inkubieren.
-
B. Herstellung des LysB28ProB29 Gemisches
mit niedrigem Verhältnis
-
Eine
Menge der in Beispiel 2 hergestellten LysB28ProB29 Lösung
mit 100 Einheiten, die L-Arginin enthält, welche 25 % des Endvolumens
entspricht, wird zu einem berechneten Volumen des neutralen Protamin LysB28ProB29 mit 100
E/ml gegeben. Die Suspension wird bei Umgebungstemperatur gerührt.