改善胰岛素在溶液中稳定性的方法
技术领域
本发明涉及一种改善胰岛素在溶液中的物理和化学稳定性的方法。本方法可用于减少或消除蛋白质(或多肽)转酰化反应,减少或消除蛋白质(或多肽)由于变性(如纤维化)而产生的凝聚和沉淀。本发明也涉及将所述方法应用于生产稳定的医疗用蛋白溶液制剂,改善它们的储存稳定性。
背景技术
随着基因重组技术的不断完善和广泛应用,人们研发了越来越多的医用蛋白用于临床医疗。稳定的制剂是在使蛋白质分子成为医用药物的过程中极为关键的一步。但是,鉴于蛋白质分子的本性,要将蛋白质配制成只含有单一蛋白质的制剂往往是不现实的。通常它们是与一些辅剂一起制成溶液或固体(冻干粉、喷雾烘干、喷雾冻干等),以使蛋白质能在生产和储存时有最大的稳定性。
蛋白质不稳定性包括两种形式:化学不稳定性和物理不稳定性。化学不稳定性是由于氨基酸残基的修饰或变化,主要有几种反应引起:二硫键的混换、脱酰胺反应、肽链的断裂、氧化反应、还原反应、水解反应、消旋反应等。物理不稳定性涉及蛋白质的二级、三级、四级结构的变化,这些变化可被各种因素引起例如:温度、pH、变性试剂等。这些因素引起蛋白质分子的构象变化,会导致蛋白质凝聚的产生。这些凝聚往往会导致沉淀并有致免疫原性。不论化学还是物理的不稳定性都将导致蛋白质药物的活性的降低或丧失,因此研究蛋白质不稳定性以及控制蛋白质的稳定性在蛋白质类药物的研发中具有十分重要的意义。
以胰岛素为例,胰岛素由两条肽链(A-链和B-链)通过二硫键连接而成。A-链C-末端的门冬酰胺能与另一个胰岛素分子的B-链N-末端的氨基发生转酰基反应,从而形成共价胰岛素二聚体。胰岛素单分子在溶液中很容易变性而产生纤维化沉淀。目前,采用胰岛素分子与锌离子螯合成六聚体以稳定其构象从而达到在溶液中比单体胰岛素更好的稳定性,包括已经用于临床的重组人胰岛素,猪胰岛素,重组胰岛素类似物如赖脯胰岛素和门冬胰岛素等。本发明揭示了采用脯氨酸超分子结构提高单体胰岛素的物理稳定性和化学稳定性的方法,还揭示了丙酮对减少胰岛素共价二聚体的作用。目前的研究表明,调节溶液制剂的pH值、离子强度、添加氨基酸、添加糖类或表面活性剂、调节蛋白质浓度、提高蛋白质纯度等,都有助于解决蛋白质凝聚及其沉淀的问题。
一个受人重视的改善多肽和蛋白质特性的策略就是对多肽和蛋白质进行化学修饰,其修饰基团包括:亲水性聚合物,例如聚乙二醇(Roberts et al.,Adv.Drug Rev.54,459-476(2002)),或者多糖,例如聚唾液酸(polysialic acid,Fernandes et al.,Biochim.Biophys.Acta 1341,26-34(1997))、葡聚糖或羟烃化淀粉等。在用聚乙二醇化学修饰多肽和蛋白质以改善其理化特性的同时,化学修饰也会妨碍多肽和蛋白质的生物活性。然而,如果修饰基团能在生物体内重新脱离,释放出来的多肽或蛋白质分子就有可能重新恢复其生物活性。成功的聚乙二醇修饰蛋白药物的例子是干扰素α-2(Peleg-Shulman et al.,J Med Chem 47,4897-4904(2004))、exendin-4(Tsubery et al.,J Biol Chem.37,38118-38124(2004))、干扰素-β-1b(Zhao et al.,Bio-conjugate Chem.17,341-351(2006))。Nektar公司曾经用此方法已改变胰岛素的药代动力学和药效学参数(美国专利6,890,518 B2)。
使用辅料(或辅剂)是更普遍的提高蛋白质稳定性的方法。例如糖类化合物、表面活性剂、氨基酸等是蛋白质制剂中常用的辅剂,它们主要是用作缓冲溶液试剂或调节离子强度或渗透压。
有文献报道,脯氨酸在浓度高于1.0M时显现出能改善疏水性化合物的溶解度。(Srinivas V,Balasubramanian D.1995.Proline is a protein compatiblehydrotrope.Langmuir 11:2830-2833)更进一步的研究表明,脯氨酸在浓度高于1.5M时,会行成一种疏水性的、松散但有序的超分子结构(supra-molecularstructure),能增加蛋白质的溶解度。(Proline Is a Protein Solubilizing Solute.Biochem Mol Biol Int.1997 Feb;41(2):235-42)。也有报道称,虽然脯氨酸能增加尿素变性后的蛋白质包含体的溶解度,但也阻碍蛋白质包含体的复性过程并降低蛋白质复性的回收率,所以,脯氨酸没有被广泛应用于蛋白质包含体的复性。(Samuel et al.,Proline Inhibits Aggregation During Protein Refolding,ProteinScience,2000 Feb;9(2):344-352)。本发明揭示该超分子结构可以用于稳定容易变性沉淀的蛋白质如胰岛素单体,并减少共价二聚体的生成。
有文献报道,精氨酸在水中形成疏水性的超分子结构并增加蛋白质溶解度,并已广泛作为胍的替代品用于蛋白质包含体的复性。(Kentaro Shiraki et al.,Biophysical Effect of Amino Acids on the Prevention of Protein Aggregation,J.Biochem.132,591-595,2002)
另一个减少或防止蛋白质形成凝聚和沉淀的方法是使用蛋白质的伴侣分子。(Anat Ben-Zvi,Paolo De Los Rios,Giovanni Dietler,Pierre Goloubinoff,Active Solubilization and Refolding of Stable Protein Aggregates By CooperativeUnfolding Action of Individual Hsp70 Chaperones,The Journal of BiologicalChemistry,Vol.279,No.36,Issue of September 3,37298-37303,2004)一个早期的成功案例是一个刚果红(Congo Red)的修饰物,它能同时与FK506结合蛋白和β-淀粉状蛋白结合,并抑止淀粉状蛋白的纤维化。(Jason e.Gestwicki etal.,Science,Vol 306,865,2004)
就胰岛素而言,它在生物体内自然酸碱度条件下有很好的溶解度,文献中也已有多种方法减缓能导致胰岛素沉淀的纤维化过程。例如,锌可以与胰岛素单体形成六聚体,六聚体比单体胰岛素稳定得多。诺和诺德公司(Novo Nordisk)曾通过调节各种辅剂间的比例以获得一定的稳定性改善(美国专利US6,211,144与US 6,489,292)。安万特公司(Aventis)利用锌、表面活性剂如Tween-20、Tween-80、Poloxamer 171使胰岛素出现纤维沉淀的时间延长5-7倍(美国专利US 6,960,561 B2)。诺和诺德公司(Novo Nordisk)还采用高浓度的镁离子来替代锌离子,也可提高单体胰岛素稳定性,并在猪动物试验中证实比含锌胰岛素有更快的降糖效果(美国专利US 5,070,186,1991年)。美国Aradigm公司采用了将pH降低到3.5的方法来改善单体胰岛素稳定性(美国专利US7,021,309 B2)。
单体胰岛素在有些应用中展示了比含锌胰岛素六聚体更多的优越性。美国Mannkind公司成功地将无锌胰岛素包裹在一种哌嗪衍生物的晶体粉末中,经肺吸入法取得了极短的降糖起效时间(美国专利US 6,652885 B2和US 7,648,960B2)。美国Aradigm公司将赖脯胰岛素制成肺吸喷雾溶液(美国专利US7,490,603 B2)。这些优越性主要是因为单体胰岛素比胰岛素六聚体能更快透过肺膜吸收。
Medronic MiniMed公司的William Peter Van Antwerp等人发现三羟甲基氨基甲烷与磷酸配成混合缓冲溶液对提高含锌六聚体胰岛素的稳定性有一定的帮助(美国专利US 6,734,162 B2,2004年5月)。他们还发现胰岛素类似物赖脯胰岛素与人胰岛素的混合溶液制剂比人胰岛素的单方溶液有更好的稳定性(美国专利US 6,852,694 B2,2005年2月)。
美国BioDel公司的Roderike Pohl等声称,胰岛素单体与柠檬酸混合溶液的干冻粉有利于胰岛素的长期保存。该干冻粉重新溶于水后的新鲜溶液在室温条件下有不超过一星期的稳定性(美国专利US 7,279,457 B2,2007年10月)。
有些蛋白质分子,特别是一些临床上广泛应用的蛋白药物,例如胰岛素,特别是胰岛素单体,在溶液中极易发生变性(例如纤维化),从而导致凝聚甚至沉淀。胰岛素在酸碱度pH 7-8有很好的溶解度(>50mg/ml),但其溶液,尤其是胰岛素稀溶液,会随放置时间产生纤维化沉淀。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能改善胰岛素单体在溶液中的物理和化学稳定性的新方法。胰岛素单体是指完全解离的单分子胰岛素,或指非共价的并能在溶液中迅速解离成单体的胰岛素二聚体或其它高聚体,或指不与重金属离子螯合的胰岛素二聚体或其它高聚体。
本发明所述的改善胰岛素单体在溶液中的物理和化学稳定性的方法,其特征在于:在胰岛素单体制剂中加入1-7mol/L的脯氨酸或者其衍生物。
根据本发明所述的改善胰岛素单体在溶液中的物理和化学稳定性的方法的进一步特征,还加入0-50mg/ml丙酮或者能与氨基形成席夫键的衍生物。可应用的丙酮的衍生物包括但不限于:丁酮、戊酮、异戊酮(甲基异丙基酮)、丙酮酸、乙醛酸、α-羰基丁酸、α-羰基戊酸、乙酰乙酸、吡哆醛、磷酸吡哆醛、及其它能与氨基形成席夫基化合物。
优选地,所述的胰岛素包括生物组织提取的或化学合成的或重组的人胰岛素、猪胰岛素、以及胰岛素类似物、胰岛素衍生物或它们不同比例的组合。胰岛素类似物是指胰岛素氨基酸序列发生改变后的多肽分子,有如目前已应于临床的赖脯胰岛素、门冬胰岛素等。胰岛素衍生物是指化学共价修饰后的化合物,有如聚乙二醇化学修饰的胰岛素、脂肪链修饰的胰岛素等。
本发明的另一目的在于提供一种稳定的胰岛素单体溶液药物制剂,包括以下成份:胰岛素原料;稳定剂,包括1-7mol/L脯氨酸或者其衍生物;药学上可接受的辅料;溶液酸碱度范围为pH 6.0-8.0,更优选为pH 6.8-pH 7.8。
根据本发明所述的稳定的胰岛素单体溶液药物制剂的进一步特征,所述的稳定剂中还包括0-50mg/ml的能与氨基形成席夫键的化合物。优选地,所述能与氨基形成席夫键的化合物选自:丙酮、丙酮酸、乙醛酸、α-羰基丁酸、α-羰基戊酸、乙酰乙酸、吡哆醛、磷酸吡哆醛。
本发明还提供了一种用于喷雾鼻吸、喷雾肺吸、通过针筒针刺注射、胰岛素注射笔、胰岛素泵以及其他已知的给药途径的胰岛素单体溶液药物制剂,包括以下成份:胰岛素原料;稳定剂,包括1-7mol/L脯氨酸或者其衍生物;药学上可接受的辅料;溶液酸碱度范围为pH 6.0-8.0,更优选为pH 6.8-pH 7.8。
根据本发明所述的用于喷雾鼻吸、喷雾肺吸、通过针筒针刺注射、胰岛素注射笔、胰岛素泵以及其他已知的给药途径的胰岛素单体溶液药物制剂的进一步特征,所述的稳定剂中还包括0-50mg/ml的能与氨基形成席夫键的化合物。优选地,所述能与氨基形成席夫键的化合物选自:丙酮、丙酮酸、乙醛酸、α-羰基丁酸、α-羰基戊酸、乙酰乙酸、吡哆醛、磷酸吡哆醛。
本发明还提供了一种比含锌人胰岛素六聚体制剂更快地产生降血糖效果的胰岛素单体溶液药物制剂,包括以下成份:胰岛素原料;稳定剂,包括1-7mol/L脯氨酸或者其衍生物;药学上可接受的辅料;溶液酸碱度范围为pH 6.0-8.0,更优选为pH 6.8-pH 7.8。
根据本发明所述的比含锌人胰岛素六聚体制剂更快地产生降血糖效果的胰岛素单体溶液药物制剂的进一步特征,所述的稳定剂中还包括0-50mg/ml的能与氨基形成席夫键的化合物。优选地,所述能与氨基形成席夫键的化合物选自:丙酮、丙酮酸、乙醛酸、α-羰基丁酸、α-羰基戊酸、乙酰乙酸、吡哆醛、磷酸吡哆醛。
本领域所熟知,术语“单体胰岛素”是指完全解离的单分子胰岛素,或指非共价的并能在溶液中迅速解离成单体的胰岛素二聚体或其它高聚体,或指不与重金属离子螯合的胰岛素二聚体或其它高聚体。
优选地,所述胰岛素原料选自:生物组织提取的或化学合成的或重组的人胰岛素、猪胰岛素、胰岛素类似物、胰岛素衍生物或它们的组合。
优选地,所述胰岛素原料选自:生物组织提取的或化学合成的或重组的无锌人胰岛素、无锌猪胰岛素,以及无锌胰岛素类似物、无锌胰岛素衍生物或它们的组合。
优选地,所述胰岛素原料是由锌离子螯合剂与含锌胰岛素混合在中性或偏碱性溶液中产生,酸碱度范围在pH 6.0至pH 8.0之间。
优选地,所述含锌胰岛素选自:生物组织提取的或化学合成的或重组的含锌人胰岛素、含锌猪胰岛素,以及含锌胰岛素类似物、含锌胰岛素衍生物或它们的组合。胰岛素类似物,例如,目前已应于临床的赖脯胰岛素、门冬胰岛素等。胰岛素衍生物,例如,聚乙二醇化学修饰的胰岛素、脂肪链修饰的胰岛素等。
优选地,所述的锌离子螯合剂所述的锌离子螯合剂选自:二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、二乙烯三胺五乙酸五钠(DTPA5Na)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四乙酸四钠(EDTA4Na),或它们的类似物。
优选地,所述的辅料还包括:甘油0-50mg/ml;以及酚类,胰岛素与酚类的比例为:每6分子胰岛素至少3个酚类分子。
优选地,所述的酚类选自:苯酚、间甲基苯酚。
所选择的甘油和酚类都是广泛应用于商业化胰岛素制剂的辅料。
本发明揭示了脯氨酸具有减少胰岛素单体的纤维化沉淀和减少胰岛素的共价化学二聚体的效果。本发明进一步揭示在含有脯氨酸的胰岛素单体溶液中再加入丙酮能更进一步减少胰岛素的共价化学二聚体的产生。甘油、间甲基苯酚、丙酮和脯氨酸的混合溶液能几乎完全抑止胰岛素的共价化学二聚体的产生。
如前所述,胰岛素A-链C-末端的门冬酰胺能与另一个胰岛素分子的B-链N-末端的氨基发生转酰基反应,从而形成共价胰岛素二聚体。本发明揭示了丙酮可与B-链N-末端的氨基形成可逆的席夫键,能减少共价胰岛素二聚体的形成。
本发明所述的稳定的胰岛素药物制剂具有以下优势:减少甚至不发生胰岛素单体在溶液中由于变性(例如,纤维化)导致的沉淀,减少了共价化学二聚体或共价化学多聚体。
本发明所述的稳定的胰岛素单体溶液药物制剂可用于喷雾鼻吸、喷雾肺吸、通过针筒针刺注射、胰岛素注射笔、胰岛素泵以及其他已知的溶液制剂的给药途径。
本发明还进一步揭示含有脯氨酸稳定剂的胰岛素单体溶液制剂在动物(例如,猪)试验中能比含锌胰岛素六聚体溶液制剂更快地产生降血糖效果。胰岛素类似物赖脯胰岛素和门冬胰岛素制剂中含有锌离子,以稳定的六聚体形式存在。它们的含锌六聚体比人或猪胰岛素的含锌六聚体更容易解离成分子量较小的、有生物活性的单体胰岛素,从而在注射后能比人或猪胰岛素的含锌六聚体制剂更快地被吸收和发挥降血糖的作用。本发明中的稳定单体胰岛素溶液制剂,注射后没有六聚体解离成单体的耗时过程,所以也有比常规含锌胰岛素六聚体(人或猪)更快的降血糖效果。
附图说明
图1为本发明所述的改善胰岛素单体在溶液中的物理和化学稳定性的方法的示意图。
具体实施方式
如图1所示,胰岛素单体在普通溶液中是不稳定的,目前通常采用6个胰岛素单体+2个锌离子构成胰岛素六聚体,是稳定型的胰岛素;当加入EDTA等锌离子螯合剂后,稳定的胰岛素六聚体会解离为不稳定的胰岛素单体。根据本发明所述,通过加入脯氨酸,以及补充加入丙酮等能与氨基形成席夫键的化合物,均可以使不稳定的胰岛素单体在溶液中处于稳定状态。
以下结合具体的实验,来进一步阐明本发明的内容。
实施例一:无锌单体重组人胰岛素在溶液中的不稳定性
胰岛素固体粉末溶于稀盐酸(0.10mol/L,5微升/毫克),并在稀释后用稀碱氢氧化钠(0.05mol/L)调节酸碱度至pH 7.4。溶液在室温(约25℃)避光保存,并按表一中的时间观察沉淀。结果列于表一。
表一:无锌单体重组人胰岛素在溶液中沉淀产生的时间
试样 |
无锌重组人胰岛素 |
[胰岛素] |
4mg/ml |
[甘油] |
0 |
[间甲苯酚] |
0 |
4天 |
有沉淀 |
7天 |
有沉淀 |
注:重组人胰岛素购自美国Millipore公司,通过EDTA萃取得到无锌重组人胰岛素。
实施例二:脯氨酸对单体重组人胰岛素在溶液中稳定性的影响
脯氨酸溶于磷酸钠缓冲溶液(50mM,pH 7.4),得脯氨酸浓度3.0M,最终pH 7.3。
配制备用原液,其含有:甘油(320mg/ml)和间甲苯酚(20mg/ml)。
无锌重组人胰岛素溶于稀盐酸(0.010M),并用上述脯氨酸溶液稀释如下表。试样室温(约25℃)避光保存。并定时用肉眼观察样品是否有沉淀产生。
表二:试样的成份组成
注:重组人胰岛素购自美国Millipore公司,通过EDTA萃取得到无锌重组人胰岛素。
注:本实验采用的“诺和锐”是诺和诺德公司的胰岛素类似物产品,为含锌胰岛素产品,购自诺和诺德公司。
实验结果:六个月后,该实验的所有试样无沉淀现象,而上述实施例一显示无锌胰岛素单体溶液几天内就产生沉淀。
结果表明,单独或联合加入脯氨酸能减少胰岛素的变性沉淀。
实施例三:八个胰岛素制剂及其SEC(Size Exclusion Chromatography)色谱(尺寸排阻色谱)分析
首先制备以下四种备用试剂溶液:脯氨酸水溶液(6.25M),EDTA溶液(0.10M,pH 7.4),甘油(320mg/ml)和间甲苯酚(25mg/ml)的混合水溶液,含磷酸钠缓冲溶液(25mM,pH 7.4)的无锌和含锌重组人胰岛素溶液(10mg/ml)。这些溶液再被稀释成八种不同的胰岛素制剂,如下表。
表三:八个胰岛素试样成份组成
注:上表中的间甲基苯酚也可用苯酚替代,也能获得同等的实验结果。
所有八个胰岛素试样室温避光保存,并定时取样做SEC色谱分析,计算共价胰岛素二聚体的含量,列于表四。
SEC高效液相色谱分析的条件如下:
色谱柱:Protein Pak,125
,Waters,WAT084601
移动相:20%乙腈、15%乙酸、65%水
流速:0.5ml/min
检测波长:260nm
注射剂量:0.10ml
表四:试样在保存不同时间后胰岛素共价二聚体的含量
试样序号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
12周 |
1.4% |
1.1% |
0.78% |
~0% |
1.4% |
1.4% |
0.53% |
~0% |
20周 |
2.5% |
2.1% |
1.2% |
~0% |
2.7% |
3.3% |
0.72% |
~0% |
35周 |
6.2% |
5.4% |
2.2% |
0.75% |
7.1% |
7.6% |
1.5% |
~0% |
结果表明,在脯氨酸存在时,无论是无锌胰岛素还是含锌胰岛素制剂中的共价二聚体都显著下降;当同时含有脯氨酸和丙酮时,胰岛素的共价二聚体迅速消失。
实施例四:猪降血糖试验
分别配制无锌重组人胰岛素和有锌重组人胰岛素两种溶液制剂,其组成如下表五所列。
表五:用于动物试验的单体胰岛素制剂配方
试样代号 |
制剂A |
制剂B |
胰岛素种类 |
无锌胰岛素 |
含锌胰岛素 |
[胰岛素] |
2mg/ml |
2mg/ml |
[EDTA] |
0 |
20mM |
[脯氨酸] |
2.4M |
2.4M |
[甘油] |
16mg/ml |
16mg/ml |
[间甲苯酚] |
3.2mg/ml |
3.2mg/ml |
[磷酸钠] |
10mM |
20mM |
注:上表中的间甲基苯酚也可用苯酚替代,也能获得同等的实验结果。
以医用诺和灵R(购自诺和诺德公司)作常规降血糖参照药剂,将制剂A和制剂B在猪(25公斤/只,共3只)颈部皮下注射,剂量为每公斤一个单位胰岛素,定时从耳部静脉取血并用Monroe法测血糖浓度。血糖浓度测定结果列于表六。
表六:猪试验降血糖效果
结果显示,无论是无锌胰岛素还是含锌胰岛素,采用本发明所述的含有脯氨酸的混合溶液制剂能比含锌胰岛素六聚体制剂更快地产生降血糖效果。