DE69631063T2

DE69631063T2 - Stabilisierende formulierung für ngf

Info

Publication number: DE69631063T2
Application number: DE69631063T
Authority: DE
Inventors: R. Linda DE YOUNG; M. Xanthe Lam; Tue Nguyen; F. Michael POWELL
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1995-11-07
Filing date: 1996-10-21
Publication date: 2004-09-30
Anticipated expiration: 2016-10-22
Also published as: JP2002502358A; BR9611571A; ES2211991T3; EP0862452B1; KR100497087B1; WO1997017087A1; KR19990067350A; CA2234231A1; JP4057058B2; DE69631063D1; CA2234231C; HK1015261A1; BR9611571B1; AU7518696A; AU721112B2; ATE255903T1; EP0862452A1; CN1126567C; PT862452E; MX9803342A

Description

HINTERGRUND
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Formulierungen des Nervenwachstumsfaktors ("NGF") und ihre Verwendung zur Förderung von Nervenzellenwachstum, -differenzierung, -überleben, -wiederherstellung, -reifung oder -funktion in vivo oder ex vivo. Genauer gesagt betrifft diese Erfindung solche pharmazeutische Zusammensetzungen mit verbessertem Stabilitäts- und Löslichkeitsverhalten für die NGF-Komponente, insbesondere den menschlichen rekombinanten NGF ("rhNGF"), und jene, die die Fähigkeit möglich machen, stabile Formen daraus für sichere, wirksame therapeutische Verabreichung an Menschen zu schaffen.
Beschreibung von verwandten Offenbarungen
Der Nervenwachstumsfaktor (NGF) ist ein neurotroper Faktor, der für das Wachstum und Überleben von sympathischen und sensorischen Neuronen während der Entwicklung und in reifen Tieren erforderlich ist (1). Klinische Indikationen für den rekombinanten menschlichen NGF umfassen periphere sensorische Neuropathie und die Alzheimer-Krankheit. Beispielsweise zeigte sich, dass die systemische Verabreichung des NGF durch die Verabreichung von Cisplatin und Taxol an Mäuse ausgelöste sensorische Neuropathie verringert (2, 3). In neueren klinischen Studien wurde der NGF an Menschen verabreicht, um die sensorische Funktion bei diabetischen Neuropathien zu verbessern (4).
Der NGF wird derzeit als flüssige parenterale Formulierung entwickelt. Die Proteinstabilität wird aufgrund der dimeren Struktur des NGF über den üblichen chemischen und physikalischen Abbau hinaus kompliziert. Die Proteinstabilität kann weiters kompliziert werden, wenn ein rekombinantes Protein ein Gemisch von C-terminal beschnittenen NGF-Varianten ist. Die Kristallstruktur eines murinen NGF zeigt 3 antiparallele Paare von b-Strängen, die eine flache Oberfläche bilden, durch welche die Monomere dimerisieren (5); die Dimer-Dissoziationskonstante ist ≤ 10^–13 M (6, 7). Die Neuordnung von Monomeren innerhalb vom Dimeren, um eine ausgeglichene Dimerverteilung zu erreichen, kompliziert die Quantifizierung des NGF-Dimerabbaus.
Somit besteht Bedarf an NGF enthaltenden Formulierungen, die zu NGF-Stabilität führen und gleichzeitig eine sichere und wirksame therapeutische Verabreichung an Säugetiere, vor allem an Menschen, garantieren.
Die WO 95/05845 offenbart wässrige NGF-Formulierungen, die, wenn sie weniger als 0,5 mg/ml NGF enthalten, die Gegenwart von menschlichem Serumalbumin erfordern.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf Erkenntnissen zu Formulierungsbedingungen und Verfahren zur Stabilisierung des NGF in einer flüssigen Formulierung. Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine geeignete Formulierung des NGF mit erhöhter NGF-Stabilität bereitzustellen, um eine wirksame Induktion von Nervenzellenwachstum, -überleben, -differenzierung, -reifung-, -wiederherstellung oder -funktion bereitzustellen, vorzugsweise in vivo oder ex vivo. In verschiedenen Ausführungsformen können die Formulierungen erhöhte Stabilität gegenüber Bewegung, Einfrieren, Auftauen, Licht oder Lagerung aufweisen. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung einer stabilen NGF-Formulierung zur Verwendung bei der Behandlung eines Säugetiers, vorzugsweise eines Menschen, das eine NGF-Behandlung benötigt, um eine therapeutisch wirksame Menge NGF bereitzustellen. Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung einer NGF-Formulierung mit erhöhter Konsistenz zur besseren Verabreichung an ein Neuron oder Säugetier. Diese und andere Ziele werden für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung klar ersichtlich sein.
Die oben genannten Ziele werden erreicht, indem eine NGF-Formulierung bereitgestellt wird, die eine wirksame Menge NGF in einem pharmazeutisch annehmbaren Puffer, vorzugsweise Natriumacetat, umfasst, wie in den Ansprüchen dargelegt ist. In einer spezifischen Ausführungsform enthält diese Formulierung etwa 0,1 bis 0,5 mg/ml NGF in 5 bis 50 mM Acetatpufter mit einem pH von 5 bis 6. Die Formulierung kann gegebenenfalls einen pharmazeutisch annehmbaren Verdünner, ein pharmazeutisch annehmbares Salz, vorzugsweise Natriumchlorid, oder ein Konservierungsmittel, vorzugsweise Benzylalkohol, enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer NGF-Formulierung bereit, die durch den Schritt der Formulierung von NGF und Acetat, gegebenenfalls Natriumchlorid und gegebenenfalls einem Konservierungsmittel erhalten wird, wie in Anspruch 26 dargelegt ist.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, durch das ein NGF-Dimerabbau unabhängig vom Dimeraustausch quantifiziert wird.
KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 zeigt die Abhängigkeit der NGF-Aggregatbildung bei 37°C vom Formulierungspuffer und vom pH, quantifiziert durch Größenausschlusschromatographie, (♢) Succinat pH 4,2; (Δ) Succinat pH 5,0; (⎕) Succinat pH 5,8; (X) Succinat pH 5,0 mit 0,05% Tween 20; (
) Acetat pH 5,0; und (∎) Acetat pH 5,8.
2 zeigt repräsentative RP-HPLC-Chromatogramme für NGF in Succinatpuffer mit pH 5,0 (a) –70°C Kontrolle und (b) nach 38 Tagen Inkubation bei 37°C.
3 zeigt eine halblogarithmische Darstellung des Prozentanteils an NGF-Monomer, der nach Inkubation bei 37°C für verschiedene Zeitspannen verbleibt, quantifiziert durch RP-HPLC; (⟡) Succinat pH 4,2; (Δ) Succinat pH 5,0; (⎕) Succinat pH 5,8; (X) Succinat pH 5,0 mit 0,05% Tween 20; (
) Acetat pH 5,0; und (∎) Acetat pH 5,8. Die Kurven sind Fits erster Ordnung der Daten.
4 zeigt repräsentative IEC-Chromatogramme für NGF in einem Acetatpuffer mit pH 5,0 nach 38 Tagen Inkubation bei (durchgehende Linie) –70°C und (gestrichelte Linie) 37°C. Jedes Dimer erscheint aufgrund der N-terminalen Umsetzung von Ser zu Gly (SIG) im Chromatogramm als Triplett (13). Der erste Peak im Triplett ist das Elterndimer, gefolgt von einem Dimer mit einer einzelnen Ser-zu-Gly-Umsetzung und schließlich ein Dimer mit einer Ser-zu-Gly-Umsetzung in beiden Ketten.
5 zeigt die Zeitabhängigkeit des Verlustes an NGF-118/118- und -117/120-Dimeren, bestimmt durch IEC, bei Inkubation bei 37°C, (Δ) Succinat pH 5,0; (⎕) Succinat pH 5,8; (X) Succinat pH 5,0 mit 0,05% Tween 20; (
) Acetat pH 5,0; und (∎) Acetat pH 5,8.
6 zeigt RP-HPLC-Chromatogramme, welche die Stabilität von NGF nach 1,6 Jahren bei (gestrichelte Linie) 5°C und (durchgehende Linie) –70°C aufzeigt. Das wichtigste Abbauprodukt bei 5°C ist eine Umsetzung von Asn93 zu iso-Asp93.
Die 7A und 7B zeigen Vergleiche von IEC-Chromatogrammen von NGF-Kontrolle (–70°C) (durchgehende Linie) und NGF (5°C) (gestrichelte Linie) nach 1,6 Jahren Inkubation in Acetatpuffer mit pH 5,0, (7A) keine Säurebehandlung und (7B) Säurebehandlung der Proben vor der Analyse.
8 zeigt RP-HPLC-Chromatogramme von 0,1 mg/ml rhNGF in 10 mM Acetat mit pH 5,5 und 142 mM NaCl, gelagert 3 Monate lang bei 5°C (durchgehende Linie), 25 °C (gestrichelte Linie) und 40°C (gepunktete Linie). Peak (a) enthält dioxidierten rhNGF; Peak (b) enthält desamidierten rhNGF; Peak (c) enthält monooxidierten rhNGF; Peak (d) enthält iso-Aspartat; Peak (e) enthält 120-rhNGF; Peak (f) enthält 118-rhNGF; Peak (g) enthält N-terminal beschnittenen rhNGF; Peak (h) enthält falsch gefalteten rhNGF; und Peak (i) enthält ein Protein, eluiert bei einer Gradientenrampe.
9 zeigt die Bestimmung von rhNGF-Monomeren (118 und 120), die nach 12 Monaten bei 5°C verbleiben, durch Umkehrphasen-HPLC. Formulierung A (-⊖-) enthält 2 mg/ml rhNGF (142 mM NaCl, 10 mM Acetat, pH 5,5); Formulierung B (-⎕-) enthält 0,1 mg/ml rhNGF (136 mM NaCl, 20 mM Acetat, pH 5,5); Formulierung C (--♢--) enthält Formulierung B plus 0,9% BA; Formulierung D (--x--) enthält Formulierung B plus 0,25% Phenol; Formulierung E (---+---) enthält 0,1 mg/ml rhNGF (136 mM NaCl, 20 mM Acetat, 0,01% F68, pH 5,5); Formulierung F (--Δ--) enthält Formulierung E plus 0,9% BA; und Formulierung G (--∎--) enthält Formulierung E plus 0,25% Phenol.
10 zeigt die Bestimmung von rhNGF-Monomeren (118 und 120), die nach 9 Monaten bei 25°C verbleiben, durch Umkehrphasen-HPLC. Formulierung A (-⊖-) enthält 2 mg/ml (10 mM Acetat, pH 5,5); Formulierung B (-⎕-) enthält 0,1 mg/ml (20 mM Acetat, pH 5,5); Formulierung C (--♢--) enthält Formulierung B plus 0,9% BA; Formulierung D (--x--) enthält Formulierung B plus 0,25% Phenol; Formulierung E (---+---) enthält 0,1 mg/ml (20 mM Acetat, 0,01% F68, pH 5,5); Formulierung F (--Δ--) enthält Formulierung E plus 0,9% BA; und Formulierung G (--•--) enthält Formulierung E plus 0,25% Phenol.
11 zeigt die Wirkung eines Konservierungsmittels auf die iso-Aspartat-Bildung von rhNGF in flüssigen Mehrfachdosis-Formulierungen, die bei 5°C 12 Monate lang gelagert wurden, bestimmt durch RP-HPLC. Formulierung A (-⊖-) enthält 2 mg/ml (10 mM Acetat, pH 5,5); Formulierung B (-⎕-) enthält 0,1 mg/ml (20 mM Acetat, pH 5,5); Formulierung C (--♢--) enthält Formulierung B plus 0,9% BA; Formulierung D (--x--) enthält Formulierung B plus 0,25% Phenol; Formulierung E (---+---) enthält 0,1 mg/ml (20 mM Acetat, 0,01% F68, pH 5,5); Formulierung F (--Δ--) enthält Formulierung E plus 0,9% BA; und Formulierung G (--∎--) enthält Formulierung E plus 0,25 % Phenol.
12 zeigt die Wirkung eines Konservierungsmittels auf die iso-Aspartat-Bildung von rhNGF in flüssigen Mehrfachdosis-Formulierungen, die bei 25°C 9 Monate lang gelagert wurden, bestimmt durch RP-HPLC. Formulierung A (-⊖-) enthält 2 mg/ml (10 mM Acetat, pH 5,5); Formulierung B (-⎕-) enthält 0,1 mg/ml (20 mM Acetat, pH 5,5); Formulierung C (--♢--) enthält Formulierung B plus 0,9% BA; Formulierung D (--x--) enthält Formulierung B plus 0,25% Phenol; Formulierung E (---+---) enthält 0,1 mg/ml (20 mM Acetat, 0,01% F68, pH 5,5); Formulierung F (--Δ--) enthält Formulierung E plus 0,9% BA; und Formulierung G (--∎--) enthält Formulierung E plus 0,25 % Phenol.
13 zeigt Kationenaustausch-HPLC-Chromatogramme von 0,1 mg/ml rhNGF in 10 mM Acetat mit pH 5,5 und 142 mM NaCl, gelagert 3 Monate bei 5°C (durchgehende Linie), 25°C (gestrichelte Linie) und 40°C (gepunktete Linie). Peak (a) enthält mono- und dioxidiertes 118/118 und oxidierten N-terminal beschnittenen rhNGF; Peak (b) enthält ein 118/118-rhNGF-Homodimer; und Peak (c) enthält Ser-Gly118/118-rhNGF (1-Kette).
14 zeigt die Bestimmung eines rhNGF-Dimers (118/118), der bei rhNGF-Formulierungen nach 12 Monaten bei 5°C verbleibt, durch Kationenaustausch-HPLC. Formulierung A (-⊖-) enthält 2 mg/ml (10 mM Acetat, pH 5,5); Formulierung B (-⎕-) enthält 0,1 mg/ml (20 mM Acetat, pH 5,5); Formulierung C (--♢--) enthält Formulierung B plus 0,9% BA; Formulierung D (--x--) enthält Formulierung B plus 0,25% Phenol; Formulierung E (---+---) enthält 0,1 mg/ml (20 mM Acetat, 0,01% F68, pH 5,5); Formulierung F (--Δ--) enthält Formulierung E plus 0,9% BA; und Formulierung G (--•--) enthält Formulierung E plus 0,25% Phenol.
15 zeigt die Bestimmung eines rhNGF-Dimers (118/118), der bei rhNGF-Formulierungen nach 9 Monaten bei 25°C verbleibt, durch Kationenaustausch-HPLC. Formulierung A (-⊖-) enthält 2 mg/ml (10 mM Acetat, pH 5,5); Formulierung B (-⎕-) enthält 0,1 mg/ml (20 mM Acetat, pH 5,5); Formulierung C (--♢--) enthält Formulie rung B plus 0,9% BA; Formulierung D (--x--) enthält Formulierung B plus 0,25% Phenol; Formulierung E (---+---) enthält 0,1 mg/ml (20 mM Acetat, 0,01% F68, pH 5,5); Formulierung F (--Δ--) enthält Formulierung E plus 0,9% BA; und Formulierung G (--•--) enthält Formulierung E plus 0,25% Phenol.
16 zeigt ein Nah-UV-CD-Spektrum von rhNGF in 10 mM Acetat, 136 mM NaCl, pH 5,5.
17 zeigt einen Vergleich zwischen einem Nah-UV-CD-Spektrum von rhNGF in Gegenwart (durchgehende Linie) und in Abwesenheit (gepunktete Linie) von 0,9% Benzylalkohol in 20 mM Acetat mit pH 5,5 und 136 mM NaCl nach 24 Stunden bei 25°C.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass ein NGF, der in einem pharmazeutisch annehmbaren Acetatpuffer mit einem pH von 5 bis 6 als pharmazeutische Zusammensetzung formuliert ist, deutlich höhere Stabilität in diesen Zusammensetzungen aufweist. Die Acetatkonzentration kann von 0,1 Beispiel 200 mM, noch bevorzugter von 1 bis 50 mM, und sogar von 5 bis 30 mM, insbesondere von 10 bis 20 mM, variieren. Eine bevorzugte Ausführungsform weist 20 mM Acetat und weitere 10 mM Acetat in der verabreichten Lösung auf. Ein bevorzugtes Acetatsalz zur Förderung der Stabilität und Pufferkapazität ist Natriumacetat. Aber auch andere physiologisch annehmbare Salze können verwendet werden, beispielsweise Kaliumacetat. Geeignete pH-Bereich für die Herstellung der Zusammensetzungen hierin reichen von 5 bis 6, vorzugsweise 5,4 bis 5,9, noch bevorzugter 5,5 bis 5,8. Ein bevorzugter pH ist 5,5, bei dem die Stabilität und Pufferkapazität gefördert werden. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform weist einen pH von 5,8 auf.
Eine "pharmazeutisch wirksame Menge" NGF bezieht sich auf eine Menge, die in verschiedenen Verabreichungssystemen therapeutische Wirkung besitzt. Die Zusammensetzungen hierin werden so hergestellt, dass sie von 0,07 mg/ml, noch be vorzugter von 0,08 mg/ml, noch bevorzugter von 0,09 mg/ml, insbesondere von 0,1, bis 0,5 mg/ml NGF enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die NGF-Konzentration 0,1 mg/ml.
Zur Verwendung dieser Zusammensetzungen bei der Verabreichung an Menschen, die an peripherer Neuropathie leiden, können diese Zusammensetzungen beispielsweise 0,1 mg/ml bis etwa 0,5 mg/ml NGF enthalten, entsprechend der jeweils gewünschten Dosierungsrate einer Behandlung. Der NGF wird gut vertragen, und bei Bedarf können auch höhere Dosen verabreicht werden, wie durch den Arzt bestimmt.
Die Formulierung kann gegebenenfalls ein pharmazeutisch annehmbares Salz, vorzugsweise Natriumchlorid, enthalten, was auch bevorzugt wird, und zwar vorzugsweise in etwa physiologischen Konzentrationen. Geringe Konzentrationen werden bevorzugt, beispielsweise weniger als etwa 0,3 M bis etwa 0,5 M, vorzugsweise 0,16 bis 0,20 M NaCl, noch bevorzugter 0,13 bis 0,15 M. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Natriumchloridkonzentration 136 mM. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration 142 mM.
Die Formulierungen der Erfindung können gegebenenfalls ein pharmazeutisch annehmbares Konservierungsmittel enthalten. In einigen Ausführungsformen reicht die Konzentration des Konservierungsmittels von 0,1 bis 2,0%, typischerweise Vol.-%. Geeignete Konservierungsmittel umfassen in der Pharmazie bekannte. Benzylalkohol, Phenol, m-Kresol, Methylparaben und Propylparaben sind bevorzugte Konservierungsmittel. Benzylalkohol ist ein besonders bevorzugtes Konservierungsmittel, das zu erhöhter NGF-Stabilität führt. Eine besonders bevorzugte Benzylalkohol-Konzentration ist 0,7 bis 1,2%, noch bevorzugter 0,8 bis 1,0%, insbesondere 0,9%.
Gegebenenfalls können die Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung ein pharmazeutisch annehmbares Tensid enthalten. Bevorzugte Tenside sind nichtionische Detergentien. Bevorzugte Tenside umfassen Tween 20 und Pluronic-Säure (F68).
F68 wird besonders zur Förderung der NGF-Stabilität bevorzugt. Geeignete Tensid-Konzentrationen sind 0,005 bis 0,02%. Eine bevorzugte Konzentration für ein Tensid ist 0,01%. Tenside werden verwendet, um die Teilchenbildung zu minimieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die Zusammensetzung eine NGF-Konzentration von 0,1 mg/ml, eine Natriumacetat-Konzentration von 20 mM, pH 5,5, eine Natriumchlorid-Konzentration von 136 mM und eine Benzylalkohol-Konzentration von 0,9 Vol.-% auf.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Set zur Verabreichung des NGF bereitgestellt, das eine Ampulle oder ein Gefäß umfasst, das eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß vorliegender Erfindung enthält, die eine pharmazeutisch wirksame Menge Nervenwachstumsfaktor und einen pharmazeutisch annehmbaren acetathältigen Puffer umfasst. Das Ampullenvolumen ist vorzugsweise für eine Mehrfachdosis-Anwendung geeignet, die eine wiederholte Entnahme einer Probe ermöglicht. Die erhöhte Stabilität, die mit den Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung erzielt wird, ermöglicht flüssige Mehrfachdosis-Formulierungen. Eine Mehrfachdosis-Ampulle stellt typischerweise ausreichend Formulierung bereit, um einen Patienten einen Monat, vorzugsweise eine Woche, lang mit einer ausreichenden Dosis zu versorgen. Das Zusammensetzungsvolumen liegt beispielsweise vorzugsweise im Bereich von 0,3 bis 10,0 ml, noch bevorzugter von 1,6 bis 2,0 ml, je nach Dosiskonzentration, Häufigkeit und Anwendungsschwierigkeit. Ein Volumen von 1,8 ml ist beispielsweise geeignet, wenn entweder 0,3 μg/kg oder 0,1 μg/kg verwendet werden, was 7 bzw. 24 Dosen erlaubt. Wenn eine lichtempfindliche Komponente, wie beispielsweise Benzylalkohol, vorhanden ist, wird die Ampulle vor intensivem Licht geschützt. Im Allgemeinen reicht es aus, die Ampulle in einem verdunkelten Kühlschrank oder in einer undurchsichtigen Packung zu lagern. Die Ampullenwände können jedoch auch Lichtdurchlässigkeit verringernde Materialien enthalten. Beispielsweise können transluzente bernsteinfarbene oder braune Ampullen oder milchige Ampullen verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen enthält die Ampulle Mehrfachdosis-Formulierungen. Bei einer Ampullen-Konfiguration kann eine gewählte flüssige Mehrfachdosis-Formulierung in 3 cm³ fassende Glasampullen vom Typ I mit einem Füllvolumen von 1,8 ml gefüllt werden. Die Wahl des Verschlusses basiert auf der Verträglichkeit verschiedener Verschlüsse mit der gewählten Formulierung.
Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung werden typischerweise bei 2 bis 8°C gelagert. Die Formulierungen sind, wie hierin ausgeführt, durch zahlreiche Einfrier-und-Auftau-Zyklen hindurch stabil.
Eine weitere Ausführungsform der Formulierung wird mit den oben genannten Acetat-Konzentrationen hergestellt. Ein bevorzugtes Mittel zur Herstellung einer Formulierung besteht in der Dialyse einer Roh-NGF-Lösung in den letztendlichen Formulierungspuffer. Die endgültigen NGF-Konzentrationen werden durch geeignete Einstellung der Formulierung mit NGF ohne Formulierungspuffer erreicht. Auch Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung nach Anspruch 1 sind bereitgestellt, welche die Schritte der Vermischung des NGFs mit acetathältigem Puffer umfasst. Außerdem sind Verfahren zur Erhöhung der Stabilität des NGF in einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt, die den NGF als aktiven Grundbestandteil enthält, umfassend die Aufnahme von Acetat in die Zusammensetzung, worin das Acetat in einer Menge und bei einem pH vorhanden ist, die wirksam sind, die Stabilität des NGF zu erhöhen.
Die Zusammensetzungen daraus, einschließlich gefriergetrocknete Formen, werden im Allgemeinen durch Vermischen der Komponenten erhalten, wobei allgemein bekannte pharmazeutische Mischverfahren eingesetzt werden. Auf ähnliche Weise werden herkömmliche, auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Gefriertrocknungsverfahren und -geräte verwendet. Ein spezielles Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung aus NGF umfasst den Einsatz von (gemäß einem beliebigen herkömmlichen Proteinreinigungsschema) gereinigtem NGF, vorzugsweise rhNGF, in einem aus verschiedenen bekannten Pufferaustausverfahren ausgewählten Verfahren, beispielsweise Gelfiltration oder Dialyse.
Der Nervenwachstumsfaktor ("NGF") ist ein 120 Aminosäuren umfassendes homodimeres Polypeptid-Protein, das markante Auswirkungen auf die Entwicklung von sensorischen und sympathischen Neuronen des peripheren Nervensystems hat. Der NGF wirkt durch spezifische Zelloberflächenrezeptoren auf reaktionsfähige Neuronen, um das Überleben von Neuronen zu unterstützen, das Neuritenwachstum zu fördern und neurochemische Differenzierung voranzutreiben. NGF-Wirkungen werden, im Phosphorylierungszustand von neuronalen Proteinen, von Veränderungen in neuronalen Membranen begleitet, wobei ein Überfluss an bestimmten mRNAs und Proteinen wahrscheinlich eine Rolle bei der neuronalen Differenzierung und Funktion spielt. (Connolly et al., J. Cell. Biol. 90, 176–180 (1981); Skaper und Varon, Brain Res. 197, 379–389 (1980); Yu et al., J. Biol. Chem. 255, 10481–10492 (1980); Halequoa und Patrick, Cell 22, 571–581 (1980); Tiercy und Shooter, J. Cell. Biol. 103, 2367–2378 (1986)).
Cholinergische Vorderhirn-Neuronen sprechen ebenfalls auf den NGF an und können den NGF eventuell für trophische Unterstützung benötigen (Hefti, J. Neurosci. 6, 2155 (1986)). Tatsächlich führt die Verteilung und Ontogenese des NGF und seines Rezeptors im Zentralnervensystem (ZNS) zu der Annahme, dass der NGF als von einem Ziel stammender neurotroper Faktor für basale cholinergische Vorderhirn-Neuronen agiert (Korsching, TINS, 570–573 (Nov/Dez. 1986)).
Über die NGF-Aminosäurereste, die für die Wechselwirkung mit dem trkA-Tyrosinkinase-Rezeptor erforderlich sind, ist noch wenig bekannt. Ein bedeutender Rückgang an biologischer Aktivität und an Rezeptorbindung wurden bei gereinigten Homodimeren von menschlichem und murinem NGF beobachtet, die homogene trunkierte Formen darstellen, die an den Amino- und Carboxytermini modifiziert wurden. Die 109 Aminosäure umfassenden Spezie (10–118)hNGF, die aus dem Verlust der ersten 9 Reste des N-Terminus und der letzten beiden Reste des C-Terminus eines gereinigten rekombinanten menschlichen NGF resultiert, ist 300-mal weniger wirksam bei der Verdrängung von murinem [¹²⁵I]NGF aus dem menschlichen trkA-Rezeptor als (1– 118)hNGF. Sie sind beim Überleben des Dorsalwurzelganglions und des sympathischen Ganglions 50- bis 100-mal weniger aktiv als (1–118)hNGF. Der (1–118)hNGF weist bedeutend geringere trkA-Tyrosinkinase-Autophosphoylierungsaktivität auf. Eine bevorzugt Form ist der 118 Aminosäuren umfassende menschliche NGF, der als Homodimer noch bevorzugter ist.
Die Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung umfassen das pantrope Neurotrophin, nämlich pantropen NGF. Ein pantroper NGF ist ein pantropes Neurotrophin, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mit der Aminosäuresequenz des NGF homolog ist, mit Domänen, die andere Neurotrophin-Spezifitäten übertragen. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Domänen für NGF-Reste substituiert; d.h. eine Reihe von Aminosäuren wird aus der NGF-Sequenz deletiert, und eine identische oder ähnliche Anzahl an Aminosäuren wird substituiert, was eine zusätzliche Spezifität verleiht. Beispielsweise wird ein pantroper NGF mit einer D16A-Substitution hergestellt, der BDNF-Spezifität verleiht. Gegebenenfalls können auch Substitutionen in der prävariablen Region 1 (V18E + V20L + G23T) und in der variablen Region 4 (V79Q + T81K + H84Q + F86Y + K88R) enthalten sein. Alternativ dazu können die Substitutionen in der prävariablen Region 1 mit nur einzelnen Aminosäure-Substitutionen in der variablen Region 4 vorgenommen werden; beispielsweise V18E + V20L + G23T und eines von Y79Q, T81K, H84Q, F86Y oder K88R.
Die chemische und physikalische Stabilität des rekombinanten menschlichen Nervenwachstumsfaktors (NGF) in einer wässrigen Lösung wurde zwischen 5 und 37°C und einem pH von 4,2 bis 5,8 untersucht. Die chemische Stabilität des NGF nahm mit steigendem pH zu. In einem Succinatpuffer mit pH 5,8 nahm die physikalische Stabilität des NGF aufgrund von Proteinaggregation ab. Aufgrund der Daten der Stabilität bei 5°C und von Untersuchungen über beschleunigten Abbau bei 37°C war die optimale Formulierung Acetatpuffer mit pH 5,8. Umkehrphasen-HPLC war die wichtigste Stabilitätsbestimmungsmethode und zeigte, dass eine Umsetzung von Asn-93 zu iso-Asp der wichtigste Abbauweg bei 5°C ist. Eine Quantifizierung des NGF-Abbaus durch Kationenaustausch-Chromatographie wurde durch die Neuord nung der NGF-Monomervarianten in verschiedene gemischte Dimere im Laufe der Zeit (Dimeraustausch) verkompliziert. Eine Behandlung der Proben und Kontrollen mit verdünnter Säure äquilibrierte die Monomerverteilung in den Dimeren rasch, wodurch der NGF-Abbau in Abwesenheit eines Dimeraustausches quantifiziert werden konnte.
Benzylalkohol und Phenol wurden in zwei flüssigen Formulierungen für mehrere Verwendungszwecke auf ihre Verträglichkeit und Stabilität mit rhNGF überprüft. Diese beiden Formulierungen bestanden aus 0,1 mg/ml Protein in 20 mM Natriumacetat mit pH 5,5 und 136 mM Natriumchlorid, mit und ohne 0,01% Pluronic-Säure (F68) als Tensid. Die Endkonzentrationen von Benzylalkohol und Phenol in den beiden Formulierungen betrugen 0,9 bzw. 0,25%. Basierend auf den Stabilitätsdaten nach 12 Monaten war rhNGF mit Benzylalkohol in diesen Formulierungen stabiler als mit Phenol. Eine mit Benzylalkohol konservierte rhNGF-Formulierung mit einem Tensid ist so stabil wie die Formulierung ohne Tensid, was darauf hinweist, dass kein Zusatz von F68 zur rhNGF-Mehrfachdosis-Formulierung für Stabilisierungszwecke erforderlich ist. Daher wird ein Formulierung, die aus 0,1 mg/ml Protein in 20 mM Acetat, 136 mM NaCl, 0,9% Benzylalkohol mit pH 5,5 besteht, für den rhNGF empfohlen, der für Mehrfachdosierungen in klinischen Studien der Phase III verwendet wird. Diese rhNGF-Mehrfachdosis-Formulierung bestand nach 6 Monaten bei 5°C den USPund EP-Konservierungsmittel-Wirksamkeitstest und ist so stabil wie die derzeitige flüssige Formulierung mit 2 mg/ml. Die Formulierung sollte jedoch aufgrund des Vorhandenseins von Benzylalkohol als Konservierungsmittel, das lichtempfindlich ist, keinem intensiven Licht ausgesetzt werden.
Die Zusammensetzungen können im Allgemeinen auch andere Komponenten in Mengen enthalten, welche die Herstellung von stabilen, flüssigen oder gefriertrockenbaren Formen nicht beeinträchtigen, und in Mengen, die für eine wirksame, sichere pharmazeutische Verabreichung geeignet sind.
Um medizinisches Personal und Patienten mit Materialien wie NGF zu versorgen, müssen diese Materialien in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen vorbereitet werden. Solche Zusammensetzungen müssen über einen geeigneten Zeitraum stabil bleiben, selbst zur Verabreichung an Menschen geeignet sein und leicht herstellbar sein. Ein Beispiel für solch eine Zusammensetzung wäre eine Lösung, die für eine parenterale Verabreichung ausgerichtet ist. Obwohl in vielen Fällen pharmazeutische Lösungsformulierungen in flüssiger Form bereitgestellt werden, die zum sofortigen Gebrauch geeignet sind, können solche parenteralen Formulierungen auch in gefrorener oder gefriergetrockneter Form bereitgestellt werden. Im ersteren Fall muss die Zusammensetzung vor der Verwendung aufgetaut werden. Zweiteres wird oft eingesetzt, um die Stabilität des medizinischen Wirkstoffs in der Zusammensetzung unter einer größeren Vielfalt an Lagerbedingungen zu erhöhen, wobei Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sein wird, dass gefriergetrocknete Zubereitungen im Allgemeinen stabiler sind als ihre flüssigen Gegenstücke. Solche gefriergetrockneten Zubereitungen werden vor ihrer Verwendung durch den Zusatz von (einem) geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Verdünner(n), wie beispielsweise sterilem Injektionswasser oder einer sterilen physiologischen Kochsalzlösung und dergleichen, zur ursprünglichen Konzentration verdünnt.
Es wird angenommen, dass NGF-Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung auch bei der Förderung der Entwicklung, Erhaltung oder Wiederherstellung von Neuronen in vivo, einschließlich zentraler (Gehirn und Rückenmark), peripherer (sympathische, parasympathische, sensorische und enterische Neuronen) und Motorneuronen von Nutzen sind. Demgemäß werden NGF-Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung bei Verfahren zur Behandlung verschiedenster neurologischer Störungen und Erkrankungen verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung an einen Patienten verabreicht, um neurale Störungen zu behandeln. "Neurale Störungen" bezieht sich hierin auf Störungen des zentralen und/oder peripheren Nervensystems, die mit Neuronenabbau oder -schädigung zusammenhängen. Spezifische Beispiele für neurale Störungen umfassen die Alzheimer-Krankheit, die Parkinson-Krankheit, Huntington-Chorea, Schlaganfall, ALS, periphere Neuropathien und andere durch Nekrose oder Neuronenverlust charakterisierte Störungen der zentralen, peripheren oder Motorneuronen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt, aber auch die Behandlung von aufgrund von Traumen, Verbrennungen, Nierenfunktionsstörungen, Verletzungen und toxischen Wirkungen von Chemotherapeutika, die zur Behandlung von Krebs und AIDS eingesetzt werden, geschädigten Nerven zählt dazu. Beispielsweise können periphere Neuropathien, die mit bestimmten Störungen auftreten, wie beispielsweise Neuropathien in Zusammenhang mit Diabetes, AIDS oder Chemotherapie, unter Einsatz der Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung behandelt werden. Außerdem sind sie als Komponenten von Nährmedien zur Verwendung bei der Züchtung von Nervenzellen in vitro oder ex vivo geeignet.
In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung werden NGF-Formulierungen an Patienten verabreicht, deren Nervensystem durch Traumen, Operationen, Schlaganfall, Blutleere, Infektion, Verdauungsstörungen, Nährstoffmängel, Malignität oder toxische Wirkstoffe geschädigt wurde, um das Überleben oder Wachstum von Neuronen zu fördern, oder die an Störungen leiden, die mit NGF behandelbar sind. Beispielsweise kann eine NGF-Formulierung gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden, um das Überleben oder Wachstum von Motorneuronen zu fördern, die durch Traumen oder Operationen geschädigt wurden. Außerdem können NGF-Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden, um Motorneuronstörungen, wie beispielsweise amyotrophische Lateralsklerose (Lou-Gehrig-Krankheit), Bell-Lähmung und andere Störungen in Zusammenhang mit spinaler Muskelatrophie oder Lähmungen zu behandeln. NGF-Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung können verwendet werden, um neurodegenerative Störungen an Menschen, wie beispielsweise Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Epilepsie, Multiple Sklerose, Huntington-Chorea, das Down-Syndrom, Nerventaubheit und Meniere-Krankheit zu behandeln. NGF-Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung könne auch als kognitive Enhancer verwendet werden, um das Lernen zu fördern, vor allem bei Demenz oder Traumen. Die Alzheimer-Krankheit, die vom National Institute of Aging als für mehr als 50% der Demenzen bei älteren Menschen verantwortlich gemacht wird, ist auch die viert- oder fünfthäufigste Todesursache bei US-Amerikanern über 65 Jahre. Vier Millionen Amerikaner und 40% aller Amerikaner über 85 Jahre (die am schnellsten wachsende Gruppe der amerikanischen Bevölkerung) leiden an Alzheimer. 25% aller Parkinson-Patienten leiden auch an Alzheimer-ähnlicher Demenz. Und etwa 15% aller Demenz-Patienten leiden gleichzeitig an Alzheimer und Multiinfarktdemenz. Nach der Alzheimer-Krankheit und vaskulärer Demenz sind kognitive Störungen aufgrund einer organischen Gehirnerkrankung in direktem Zusammenhang mit Alkoholismus, was auf etwa 10% aller Alkoholiker zutrifft, die dritthäufigste Ursache für Demenz. Die häufigsten Anomalien bei Alzheimer sowie bei vaskulärer Demenz und kognitiven Störungen aufgrund von organischen Gehirnerkrankungen in Zusammenhang mit Alkoholismus ist die Degeneration des cholinergischen Systems, das sich vom basalen Vorderhirn (BF) zum Codex und zum Hippocampus erstreckt (Bigl et al., Brain Cholinergic Systems, 364–386, M. Steriade und D. Biesold, Hrsg., Oxford University Press, Oxford (1990)). Und es gibt eine Reihe von anderen Neurotransmittersystemen, die von der Alzheimer-Krankheit betroffen sind (Davies, Med. Res. Rev. 3, 221 (1983)). Kognitive Störungen, die beispielsweise mit der Degeneration des cholinergischen Neurotransmittersystems zusammenhängen, treten jedoch nicht nur bei Personen auf, die an Demenz leiden. Sie wurden auch bei sonst gesunden älteren Erwachsenen und Ratten beobachtet. Studien, die den Grad der Lernstörung mit dem Grad der Reduktion des Blutflusses in der Großhirnrinde bei älteren Ratten vergleichen, weisen einen engen Zusammenhang auf (Berman et al., Neurobiol. Aging 9, 691 (1988)). Bei chronischem Alkoholismus ist die resultierende organische Gehirnerkrankung, wie beispielsweise Alzheimer und normale Alterung, auch durch verbreitete Reduktionen des Blutflusses in der Großhirnrinde (Cortex cerebralis) charakterisiert (Lofti et al., Cerebrovasc. and Brain Metab. Rev. 1, 2 (1989)). Solche Demenzen können durch die Verabreichung von NGF-Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung behandelt werden.
Außerdem werden NGF-Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung vorzugsweise zur Behandlung von Neuropathie, insbesondere peripherer Neuropathie, eingesetzt. "Periphere Neuropathie" bezieht sich auf eine Störung des peripheren Nerven systems, die sich meist als Kombination von motorischen, sensorischen, sensomotorischen oder autonomen neuralen Funktionsstörungen manifestiert. Die große Anzahl an Morphologien peripherer Neuropathien kann nur auf eine ebenso große Anzahl an Ursachen zurückgeführt werden. Beispielsweise können periphere Neuropathien genetisch erworben werden, aus einer systemischen Erkrankung resultieren oder durch einen toxischen Wirkstoff ausgelöst werden. Beispiele umfassen diabetische periphere Neuropathie, distale sensomotorische Neuropathie oder autonome Neuropathien, wie beispielsweise verringerte Motilität des Magen-Darm-Kanals oder Atonie der Harnblase, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Beispiele für Neuropathien in Zusammenhang mit einer systemischen Erkrankung umfassen das Postpolio-Syndrom; Beispiele für erbliche Neuropathien umfassen das Charcot-Marie-Tooth-Syndrom, die Refsum-Krankheit, Abetalipoproteinämie, die Tangier-Krankheit, das Krabbe-Syndrom, metachromatische Leukodystrophie, das Fabry-Syndrom und das Dejerine-Sottas-Syndrom; und Beispiele für Neuropathien, die durch einen toxischen Wirkstoff ausgelöst wurden, umfassen solche, die durch die Behandlung mit einem chemotherapeutischen Wirkstoff, wie beispielsweise Vincristin, Cisplatin, Methotrexat oder 3'-Azido-3'desoxythymidin, verursacht wurden.
Eine therapeutisch wirksame Dosis einer NGF-Formulierung wird an einen Patienten verabreicht. "Therapeutisch wirksame Dosis" bezieht sich hierin auf eine Dosis, welche die Wirkungen erzielt, zu deren Zweck sie verabreicht wurde. Die genaue Dosis hängt von der zu behandelnden Krankheit ab und kann von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung mithilfe bekannter Verfahren bestimmt werden. Im Allgemeinen werden die NGF-Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung bei etwa 0,01 μg/kg bis etwa 100 mg/kg pro Tag verabreicht. Vorzugsweise 0,1 bis 0,3 μg/kg. Außerdem können, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, Anpassungen an das Alter sowie das Körpergewicht, den allgemeinen Gesundheitszustand, das Geschlecht, die Ernährungsgewohnheiten, die Verabreichungszeit, Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten und die Schwere der Krankheit erforderlich sein, die von erfahrenen Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung vorgenommen werden können. Typischerweise wird ein Arzt NGF-Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung so lan ge verabreichen, bis eine Dosis erreicht wird, welche die Neuronenfunktion repariert, beibehält und optimalerweise wiederherstellt. Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht mithilfe herkömmlicher Assays überwacht werden.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff "Patient" sowohl Menschen als auch andere Säugetiere. Somit sind die Verfahren sowohl für Therapien an Menschen als auch für veterinäre Anwendungen geeignet.
Therapeutische Formulierungen des NGF werden hergestellt, indem ein NGF mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren vermischt wird (Remington's Pharmaceutical Sciences). Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht-toxisch gegenüber Rezipienten und verringern die NGF-Stabilität in den Formulierungen nicht bedeutend, wie hierin ausgeführt ist. Solche Verbindungen umfassen Antioxidanzien; einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare (weniger als 10 Reste) Polypetide; Proteine, wie beispielsweise Serumalbumin, Gelatine oder Immunoglobuline; hydrophile Polymere, wie beispielsweise Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren, wie beispielsweise Histidin, Methionin, Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide oder andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie beispielsweise EDTA; Zuckeralkohole, wie beispielsweise Mannitol oder Sorbitol; salzbildende Gegenionen, wie beispielsweise Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie beispielsweise Tween, Pluronic oder PEG.
NGF-Formulierungen, die zur In-vivo-Verabreichung verwendet werden, müssen steril sein. Das kann leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen erreicht werden. Herkömmliche NGF-Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung werden in flüssiger Form bei 2 bis 8°C gelagert. Die Formulierungen sind zum Einfrieren geeignet, wobei wiederholte Einfrier-und-Auftau-Zyklen möglich sind.
Therapeutische NGF-Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung platziert, beispielsweise in einen Beutel oder eine Ampulle für intravenöse Lösungen mit einem Stöpsel, der von einer subkutanen Injektionsnadel durchstochen werden kann.
NGF kann gegebenenfalls mit anderen neurotrophen Faktoren kombiniert oder verabreicht werden, einschließlich NT-4/5, NT-3 und/oder BDNF, und wird zusammen mit anderen herkömmlichen Therapien zur Behandlung von Nervenstörungen eingesetzt.
Die Verabreichung der Formulierungen gemäß vorliegender Erfindung kann auf verschiedene Arten erfolgen, einschließlich oral, subkutan, intravenös, intrazerebral, intranasal, transdermal, intraperitoneal, intramuskulär, intrapulmonal, vaginal, rektal oder intraokulär, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Die Formulierungen können kontinuierlich durch eine Infusion in die Flüssigkeitsreservoirs des ZNS verabreicht werden, obwohl auch eine Bolus-Injektion möglich ist, wobei auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren eingesetzt werden, wie beispielsweise Pumpen oder Implantation. In manchen Fällen, beispielsweise bei der Behandlung von Wunden, können die Formulierungen direkt als Lösung oder Spray aufgetragen werden.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung angeführt. Die Offenbarungen aller Literaturangaben der Beschreibung sind durch Verweis hierin aufgenommen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Materialien
Rekombinanter menschlicher Nervenwachstumsfaktor (NGF) wurde in Chinahamster-Eierstockzellen produziert und durch Umkehrphasen- (RP-HPLC) und Ionenaustauschchromatographie (IEC) gereinigt, wie vorher wurde (8). Acetonitril von HPLC- Güte und TFA wurden für die RP-HPLC verwendet. Alle anderen Chemikalien besaßen USP-Güte. 2 cm³ fassende Ampullen vom sterilen Typ 1 aus klaren Glas wurden von Wheaton bezogen und mit siliconisierten, Teflon-beschichteten Butylgummi-Stöpseln verwendet.
Verfahren
Der NGF wurde in 10 mM Natriumacetat, 142 mM Natriumchlorid, mit pH 5,0 und 5,8, und in 10 mM Natriumsuccinat, 142 mM NaCl, mit pH 4,2, 5,0 und 5,8, dialysiert und auf 10 mg/ml eingestellt. Tween 20 wurde ebenfalls zu einer Succinatformulierung mit pH 5,0 zugesetzt, um zu bestimmen, ob ein Tensid die NGF-Aggregation verringern würde (10 mM Natriumsuccinat, 142 mM NaCl, 0,05% Tween 20).
Ampullen wurden aseptisch mit 0,3 ml NGF-Formulierung gefüllt und bei 5, 25 und 37°C (die Daten für 25°C sind hierin nicht angeführt) gelagert. Kontrollen wurden bei –70°C gelagert, wobei kein erwähnenswerter Abbau beobachtet wurde. Zu jedem Zeitpunkt wurden 50-μl-Aliquote aus den einzelnen Ampullen entfernt und bis zur Analyse bei –70°C gelagert.
HPLC-Analyse: Eine Kationenaustausch-HPLC (IEC) wurde auf einem HP-1090-System unter Verwendung einer Sulfopropyl-TSK-SP-5PW-Säule (7,5 × 75 mm) von Tosohas mit 10-m-Teilchen durchgeführt. Mobile Phasen waren (A) 10 mM Natriumphosphat, 5 Vol.-% Acetonitril, pH 7,0, und (B) A + 1,0 M Ammoniumchlorid. Der NGF wurde bei 35°C (0,5 ml/min) 5 bis 60 Minuten lang mit einem linearen Gradienten von 20 bis 40% B eluiert. Die Kontrolle und 1,6 Jahre alte Proben mit 5°C wurden ebenfalls nach einer "Säurebehandlung" untersucht, um die Verteilung von Monomervarianten in den Dimern ins Gleichgewicht zu bringen (8, 9). Diese Proben wurden mit HCl auf pH 3,5 eingestellt und bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert (die Ergebnisse nach 2 und 4 Stunden waren äquivalent). Eine 5-μm-YMC-C4-Säule (4,6 × 250 mm) wurde für einen Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC) auf einem HP-1090-System bei 25°C verwendet. Der NGF wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 26 bis 30% B in A (B = 0,05% TFA in Acetonitril und A = 0,05% TFA in Wasser) 5 bis 40 Minuten lang laufen gelassen. Eine Größenausschluss-HPLC ("SEC-HPLC") wurde unter Verwendung einer Bio-LC-Pumpe der Perkin Elmer Serie 410 mit einem spektralphotometrischen UV-Detektor LC 90 von Perkin Elmer und einer Säule TSK 2000 SWXL von Tosohas, 5 μm (7,8 × 300 mm) durchgeführt. Diese SEC-Säule wurde bei 0,5 ml/min unter Verwendung einer 0,2 M Kaliumphosphat und 0,45 M Kaliumchlorid umfassenden mobilen Phase mit pH 7,0 laufen gelassen. Für die SEC lag die UV-Detektion bei 280 nm; für die RP-HPLC und die IEC bei 214 nm. Bei allen Assays wurden 50 mg NGF injiziert.
SDS-PAGE: Proben wurden in einem Novex-Tricin-SDS-Probenpuffer verdünnt und 1 Stunde lang bei 50°C inkubiert. Eine nicht reduzierte SDS-PAGE wurde auf Novex-Tricin-Gelen laufen gelassen, die 10% Acrylamid enthielten, gefolgt von einer Färbung mit Coomassie-Blau. Die Molekulargewichte wurden unter Verwendung von niedermolekularen Gewichtsmarkern von Bio-Rad berechnet.
Neuritenwachstumsassay: Die biologische Aktivität des NGF wurde unter Verwendung des PC12-Assays, der von Greene (10) entwickelt und von Schmelzer et al. (8) modifiziert wurde, bestimmt.
Hämolyse: Alle Formulierungen wurden auf ihre hämolytische Aktivität getestet. Der Hämolysevorgang folgte dem von Reed und Yalkowsky (11), mit der Ausnahme, dass gleiche Volumina von gewaschen menschlichen roten Blutkörperchen und eine Formulierung vor der Analyse bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert wurden.
Ergebnisse
Die Entwicklung einer Formulierung des NGF erfordert Bedingungen, bei denen das Protein ≥ 1,5 Jahre lang bei 2 bis 8°C chemische und physikalische Stabilität aufweist. Die Erfinder bestimmten den ungefähren pH von maximaler NGF-Stabilität durch Feststellung der NGF-Stabilität in einem Succinatpuffer mit pH 4,2, 5,0 und 5,8 und in einem Acetatpuffer mit pH 5,0 und 5,8. Die Stabilität des NGF nahm über pH 6,0 ab. Die Assays, die zur Messung der Proteinstabilität verwendet wurden, waren IEC, SEC, RP-HPLC, SDS-PAGE und der PC12-Bioaktivitätsassay. Die Biokompatibilität einer Formulierung wurde durch Hämolysetests bestimmt. Stabilität des NGF bei 37°C.
Aggregation des NGF: Die Dimer/Monomer-Gleichgewichtskonstante für murinen NGF ist kleiner als 10 bis 13 M bei pH 4 bis 7 (6, 7, 9, 12). Der NGF wird daher zuerst als Dimer im SEC-Assay mit neutralem pH untersucht. Eine kleine Menge aggregierter NGF (Tetramer, basierend auf Molekulargewichtstandards) wurde in der Kontrollprobe nachgewiesen. Dieser Tetramer-Peakbereich nahm bei 37°C im Laufe der Zeit zu. Eine Hauptschulter bei diesem Peak, die größere Aggregate anzeigt, trat bei allen Formulierungen nach 38 Tagen bei 37°C auf. Die Zeitabhängigkeit der Aggregatbildung für die verschiedenen Formulierungen ist in 1 dargestellt. Die Succinatformulierung, pH 5,8, wies die höchste Aggregationsgeschwindigkeit auf. Alle anderen Formulierungen wiesen ähnliche Aggregatbildungsgeschwindigkeiten auf. Der Zusatz des Tensids Tween 20 brachte in der pH-5,0-Succinatformulierung keinen Schutz gegen Aggregation. Während der Herstellung musste die NGF-Succinatformulierung mit pH 5,8 durch einen 0,22-mm-Filter mit einem Durchmesser von 47 mm filtriert werden, während alle anderen Formulierungen durch einen Filter mit einem Durchmesser von 25 mm filtriert werden konnten. Das stimmt mit der hohen Aggregationsgeschwindigkeit bei 37°C in einem Succinatpuffer mit pH 5,8 überein.
Die Aggregation wurde auch unter Einsatz von nicht-reduzierter SDS-PAGE überwacht (Gele nicht angeführt). In der Kontrollprobe bei –70°C wurden 3 Banden beobachtet: Monomer bei 13,5 kDa, eine sehr schwache Dimerbande bei etwa 26 kDa und eine etwas intensivere Bande bei 31 kDa. Die Banden bei 26 und 31 kDa wurden bei Inkubation bei höheren Temperaturen intensiver. Eine kleine Menge eines Aggregats mit hohem Molekulargewicht (> 97 kDa) wurde bei allen Formulierungen nach 38 Tagen bei 37°C beobachtet. Die Intensität dieser Bande war in der Succinatformulierung mit pH 5,8 am größten, was mit der schlechten Filtrierbarkeit und der durch SEC bestimmten hohen Aggregationsgeschwindigkeit dieser Formulierungen übereinstimmt. Tween 20 verhinderte die Bildung dieses Aggregats mit hohem Mole kulargewicht bei pH 5,0. Mit Ausnahme des Succinats mit pH 5,8 unterscheiden diese Größenbestimmungsverfahren nicht zwischen der Qualität der NGF-Formulierungen.
Quantifizierung der NGF-Monomere und des Abbauprodukts: Der in diesen Untersuchungen verwendete NGF bestand aus einem 1 : 9 : 1-Verhältnis dreier monomerer Polypeptide, die 120, 118 und 117 Aminosäuren umfassten. Die Variante mit 118 Aminosäuren wurde durch Abschneiden von Ala120 und Arg119 vom C-Terminus des 120 Aminosäuren umfassenden Elternstammes hergestellt; bei der 117-Variante wurde zusätzlich Arg118 abgeschnitten (8). Bei pH 5,0 wies die 117-Variante zwei positive Ladungen weniger auf, und die 118-Variante wies eine positive Ladung weniger auf als der 120-Elternstamm. Es gibt keinen bedeutenden Unterschied zwischen der Bioaktivität der Homodimere und der Heterodimere, die durch die 117-, 118- und 120-Varianten gebildet werden, gemessen mithilfe der PC12- und Kükendorsalwurzelganglion-Assays (8). In der sauren, organischen mobilen RP-Phase, in der der NGF zu einem Monomer dissoziiert (8), ist die Elutionsreihenfolge 120, 118 und 117. Typische RP-HPLC-Chromatogramme für NGF, der 38 Tage lang in Succinatpuffer mit pH 5,0 gelagert worden war, bei –70°C und 37°C sind in 2 dargestellt. Bei einer erhöhten Temperatur verlieren die Peaks, die als NGF mit dem iso-Asp definiert sind (die Summe der 118- und 120-Monomerpeaks), an Fläche, werden oxidiert, und andere NGF-Abbaupeaks gewinnen an Fläche. Der 117-Peakbereich war aufgrund der Coelution von Abbauprodukten mit diesem Peak bei erhöhten Temperaturen nicht in die Definition des NGF inkludiert. Die Zeitabhängigkeit des NGF-Abbaus bei 37°C und die Geschwindigkeitskonstanten scheinbarer erster Ordnung für diesen Abbau sind in 3 bzw. Tabelle 1 angeführt.
Die NGF-Stabilität wurde mit abnehmendem pH geringer. Sowohl bei den Acetat- als auch bei den Succinatpuffern mit pH 5,8 war die NGF-Stabilität höher als bei pH 5,0: Im Succinatpuffer mit pH 4,2 wurde die NGF-Abbaugeschwindigkeit weiter erhöht, wobei verschiedene hydrophobe Abbauprodukte beobachtet wurden, die möglicherweise auf säureinduzierte Spaltung der Asp60-Pro61-Bindung zurückzuführen sind. Tween 20 hatte keine Auswirkungen auf die NGF-Stabilität im Succinatpuffer mit pH 5,0 (3). Die Acetatformulierung scheint die NGF-Stabilität etwas besser aufrecht zu erhalten.
NGF-Dimerverteilung: Die drei NGF-Monomere, die 117, 118 und 120 Aminosäuren umfassen, können kombiniert werden, um die 117/117-, 118/118- und 120/120-Homodimere und die 117/118-, 118/120- und 117/120-Heterodimere zu bilden. Verbindungen dieser NGF-Varianten werden zufällig gebildet, wobei kein Monomer ein bestimmtes anderes zu bevorzugen scheint (8, 9). Die dynamische Aufspaltung und Wiedervereinigung von Monomeren, um verschiedene Dimere zu bilden (Dimeraustausch), wird durch niedrigen pH und erhöhte Temperatur (9) beschleunigt. Für einen zufälligen Verbindungsprozess im Gleichgewicht und für ein anfängliches Verhältnis 117/118/120 von 1 : 9 : 1 stellt das 118/118-Homodimer die dominante Art dar, wobei kleinere Mengen der 117/118- und 118/120-Dimere gebildet werden.
Die 118/118- und 117/120-Dimere weisen in der gewählten mobilen IEC-Phase dieselbe wirksame Nettoladung auf und coeluieren daher bei IEC während der NGF-Reinigung. Das führt zu einer anfänglichen. unausgeglichenen Verteilung der Monomervarianten in NGF-Dimeren im NGF-Produkt. Die 117/120- und 118/118-Dimere spalten sich auf, was die 117- und 120-Monomere ergibt, die sich häufig mit einem 118-Monomer verbinden, um 117/118- und 118/120-Dimere zu bilden. Aufgrund der unterschiedlichen Ladungen auf den Monomeren lautet die erwartete Elutionsreihenfolge dieser Dimere bei einer Kationenaustausch-Chromatographie:
117/117 < 117/118 < 118/118 = 117/120 < 118/120 < 120/120.
Die am häufigsten auftretenden Dimere können durch IEC (8) unterschieden werden_; wie in 4 dargestellt ist.
Repräsentative IEC-Chromatogramme für NGF mit pH 5,0 in einem Succinatpuffer nach 38 Tagen bei –70°C und 37°C sind in 4 dargestellt. Während der NGF-BiIdung wird ein Teil der N-terminalen Serinreste in Glycin übergeführt, was keinerlei Auswirkungen auf die NGF-Aktivität hat (13). Der NGF wird hier als die Summe des 118/118-Homodimers und des 118/118-Dimers mit einer Überführung von Ser1 in Gly1 in einem der beiden Monomere (13) (und jeder beliebigen coeluierenden 117/120-Variante) quantifiziert; die 117/118- und 118/120-Peaks sind aufgrund der Abbauprodukte, die mit diesen Peaks coeluieren, nicht enthalten. Die Abnahmegeschwindigkeit an NGF, überwacht durch IEC bei 37°C, ist in 5 dargestellt. Die Abbaukinetik für das 118-Dimer ist mehrphasig. Der Rückgang der Hauptpeakfläche vor 13 Tagen ist hauptsächlich auf die Neuordnung der Monomervarianten zwischen den möglichen Dimertypen zurückzuführen. Die Daten nach 13 Tagen beschreiben den chemischen NGF-Abbau genauer. Der NGF ist in den Acetatformulierungen mit pH 5,0 und 5,8, die ähnliche Stabilität aufweisen, am stabilsten. Der NGF in Succi natpuffern mit pH 5,8 und pH 5,0, mit und ohne Tween 20, weisen alle ähnliche Stabilität auf. Die hämolytische Aktivität der einzelnen NGF-Formulierungen wurde ebenfalls bestimmt. Keine der Formulierungen wies bedeutende Hämolyse roter Blutzellen auf (< 0,1%). Die Bioaktivität des NGF in den einzelnen Formulierungen wurde ebenfalls bestimmt, wobei der Neuritverlängerungs-PC12-Test verwendet wurde. Der NGF war in allen Formulierungen nach 38 Tagen bei 37°C bioaktiv. Die große Variabilität des Assays (etwa 50% Fehlerquote) ermöglichte keine quantitative Unterscheidung der Bioaktivität dieser Formulierungen.
Eine flüssige Formulierung für NGF weist vorzugsweise eine angemessene Lagerbeständigkeit bei 5°C auf. Die beschleunigten Stabilitätsdaten bei 37°C zeigen, dass der NGF in einem Acetatpuffer am stabilsten ist. Ausgehend von diesen Daten wurde die NGF-Stabilität in Acetatformulierungen mit pH 5,0 und 5,8 nach 1,6 Jahren bei 5°C untersucht. RP-NPLC-Chromatogramme mit pH 5,0 für eine Kontrolle nach 1,6 Jahren bei –70°C und Proben bei 5°C sind in 6 dargestellt. Das wichtigste Abbauprodukt war die Überführung von Asp-93 in iso-Asp; kleinere Mengen Met-37- und Met-92-Oxidation wurden beobachtet. Die Geschwindigkeitskonstanten scheinbarer erster Ordnung für NGF-Abbau, quantifiziert durch RP-HPLC, sind 1,4 × 10-4 ± 1,7 × 10-5 d-1 und 6,8 × 10-5 ± 7,0 × 10-6 d-1 bei pH 5,0 bzw. 5,8. Bei 5°C zeigt eine IEC, dass die NGF-Stabilität bei pH 5,0 und 5,8 etwa gleich ist, was mit den IEC-Daten bei 37°C übereinstimmt. Die Aggregation von NGF-Dimeren war bei 5°C kein bedeutender Abbauweg, wobei die Aggregate über die 1,6 Jahre Lagerung bei 5°C um nur 1% zunahmen.
Die Auslegung der IEC-Daten bei 5°C und bei 37°C wird durch Dimeraustausch verkompliziert, wobei die Austauschgeschwindigkeit bei niedrigeren Temperaturen geringer ist. Um die IEC-Quantifizierung zu verbessern, wurde die Dimerverteilung durch 2-stündige Inkubation bei pH 3,5 und 37°C vor der IEC-Analyse ins Gleichgewicht gebracht (8, 9, 14). Nach dieser Behandlung traten keine neuen Abbauprodukte auf. Die Acetatproben mit pH 5,8 nach 1,6 Jahren Inkubation bei 5°C werden in 7 mit Kontrollen vor und nach der "Säurebehandlung" verglichen. Der Rückgang der Hauptpeakfläche zugunsten der peripheren Peaks aufgrund des Dimeraustausches wurde durch Säurebehandlung eliminiert, wodurch der wahre Abbau des NGF aufgedeckt wurde. Die Quantifizierung nach einer Säurebehandlung zeigte, dass 94 bzw. 92% der NGF-Hauptpeaks nach 1,6 Jahren bei 5°C und pH 5,0 bzw. pH 5,8 verblieben, verglichen mit 84 bzw. 87% ohne Säurebehandlung. Zum Vergleich zeigte eine RP-HPLC-Analyse, dass 93 bzw. 96% der NGF-118- und -120-Monomere bei pH 5,0 bzw. 5,8 verbleiben.
Es zeigte sich, dass die chemische Stabilität des NGF mit steigendem pH zunimmt, wobei der pH der maximalen Stabilität nahe pH 5,8 liegt. Bei einem fixen pH stimmten die RP-HPLC- und IEC-Daten bei 5 und 37°C darin überein, dass sie beide in einem Acetatpuffer größere chemische NGF-Stabilität aufzeigten als in einem Succinatpuffer. Außerdem war NGF-Aggregation kein bedeutender Abbauweg, mit der Ausnahme von bei pH 5,8 in Succinatpuffer. Ein Faktor, der die Bestimmung der NGF-Stabilität erschwert, ist, dass ein Dimeraustausch zum scheinbaren Abbau von NGF-Dimern beiträgt, wie durch IEC bestimmt wurde. Eine genauere Darstellung des chemischen Abbaus von NGF kann erhalten werden, indem die Kontrollen und Proben mit Säure mit 37°C behandelt werden, um die Dimerverteilung ins Gleichgewicht zu bringen. Zusammen zeigen diese Daten, dass die optimalen Formulierungsund Lagerungsbedingungen für NGF-Stabilität Acetatpufter mit pH 5,8 und Lagerung bei 5°C umfassen.
Beispiel II
Ergebnisse aus klinischen Versuchen der Phase II zeigen, dass Patienten mit peripherer Neuropathie drei Dosen rhNGF von entweder 0,3 oder 0,1 μm/kg pro Woche brauchen. Das bedeutet, dass für einen durchschnittlichen Patienten mit einem Körpergewicht von 70 kg nur 21 oder 7 μg pro Dosis rhNGF erforderlich sind. Unter Verwendung der derzeitigen flüssigen rhNGF-Formulierung (2 mg/ml in 10 mM Natriumacetat, pH 5,5, 142 mM NaCl) und Ampullenkonfiguration (0,7 ml pro Ampulle) würde viel von dem Arzneimittelprodukt verschwendet werden. Daher ist eine neue rhNGF- Formulierung mit geringer Konzentration, vorzugsweise mit einer Mehrfachdosis-Konfiguration, erforderlich, um die Kosten und Vergeudung des Produkts zu verringern. Der Zweck dieser Studie bestand darin, eine stabile flüssige Mehrfachdosis-Formulierung für rhNGF von 0,1 mg/ml zu entwickeln, wobei 1,8 ml in eine 3 cm³ fassende Glasampulle gefüllt werden, um in klinischen Studien der Phase III eingesetzt zu werden. Bei dieser neuen Konfiguration ergibt jede Ampulle 180 μg Protein und stellt bei hoher Dosierung (0,3 μg/kg) zumindest 7 Dosen und bei geringer Dosierung (0,1 μg/ml) 24 Dosen bereit.
In dieser Studie werden die Ergebnisse in Bezug auf die Verträglichkeit und die Stabilität eines Konservierungsmittels, das flüssige 0,1-mg/ml-rhNGF-Mehrfachdosis-Formulierungen mit pH 5,5 enthält, präsentiert. Ein Vergleich zwischen der Stabilität der neuen flüssigen Mehrfachdosis-Formulierungen mit 0,1 mg/ml rhNGF und der derzeitigen 2 mg/ml rhNGF umfassenden Formulierung wurde ebenfalls durchgeführt. Außerdem wurden Ergebnisse zu Bewegung, Einfrieren und Auftauen sowie Lichtverträglichkeitsstudien der flüssigen Mehrfachdosis-Formulierungen für 0,1 mg/ml rhNGF angeführt.
In dieser Studie wurde konzentriertes Roh-rhNGF, der mit 11,6 mg/ml in 10 mM Natriumacetat, 142 mM Natriumchlorid mit pH 5,5 formuliert wurde, verwendet, wobei 20 ml in eine 100 cm³ fassende Glasampulle gefüllt wurden. Alle in diesem Beispiel verwendeten chemischen Reagenzien und Materialien sind in Tabelle 2 angeführt.
Verfahren
Flüssige rhNGF-Mehrfachdosis-Formulierungszubereitung: Konzentrierter Roh-rhNGF wurde in einen Formulierungspuffer dialysiert, der aus 20 mM Natriumacetat, 136 mM Natriumchlorid mit pH 5,5 bestand, und zwar durch Ultrafiltration unter Verwendung eines Konzentrationsapparats Amicon Centriprep^TM mit einem Molekulargewicht-Cutoff von 10.000 kD. Dieser reformulierte Roh-rhNGF wurde dann auf 0,15 mg/ml verdünnt, wobei der gleiche Formulierungspuffer wie für die Dialyse verwendet wurde. Konservierungsstoffe und Tenside, die zum Screenen der Verträglichkeit und für Untersuchungen der Entwicklung der Formulierungen verwendet wurden, wurden in ihren getesteten Konzentrationen zu dieser verdünnten rhNGF-Lösung zugesetzt. Die Proteinkonzentration für die einzelnen Formulierungen wurden dann durch UV-Anlayse unter Einsatz des geeigneten Formulierungspuffers auf 0,1 mg/ml eingestellt. Eine Liste von Konservierungsstoffen und ihrer Konzentrationen, die für die physikalische Verträglichkeit mit rhNGF in flüssigen Formulierungen eingesetzt werden, ist in Tabelle 3 angeführt.
Versuchsaufbau
Alle vorbereiteten flüssigen rhNGF-Mehrfachdosis-Formulierungen wurden vor dem Einfüllen steril durch einen 0,22-μm-Filter filtriert. Alle Formulierungen wurden aseptisch in 3 cm³ fassende klare Glasampullen vom Typ 1 von Wheaton gefüllt, wobei das Füllvolumen 1,8 ml betrug. Die Ampullen wurden mit 13-mm-Purcoat-Stöpseln verschlossen und per Hand mit 13-mm-Aluminium-Flip-Off-Verschlüssen verschlossen.
Für die Konservierungsmittel-Screeninguntersuchungen wurden Proben 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gelagert, um ihre physikalische Verträglichkeit zu bestimmen. Für die Formulierungsentwicklungsuntersuchung wurden Proben bei –70, 5, 25 und 40°C gelagert. Zu jedem Zeitpunkt wurde eine Probe/Formulierung/Temperatur untersucht.
Schütteluntersuchungen wurden bei Raumtemperatur an der derzeitigen 2-mg/ml-rhNGF-Formulierung, an den Mehrfachdosis-Formulierungen, die entweder 0,9% Benzylalkohol oder 0,25% Phenol in Abwesenheit von Tensiden enthalten, und an der 0,1-mg/ml-rhNGF-Kontrolle, die kein Tensid und kein Konservierungsmittel enthielt, durchgeführt. Eine 3 cm³ fassende Ampulle mit jeder einzelnen Formulierung wurde für die Tests in einer Labortisch-Schüttelvorrichtung (Glas-Col) befestigt und 6 bis 24 Stunden lang bei 80 U/min geschüttelt. Proben, die nach 6 und 24 Stunden Schütteln entnommen wurden, wurden durch SE-HPLC, RP-HPLC, ELISA und RRA untersucht.
Einfrier-und-Auftau-Zyklen wurden mit denselben Formulierungen durchgeführt, die für die Schüttelstudien verwendet wurden. Eine Ampulle jeder getesteten Formulierung wurde bei –70°C in ein Gefrierabteil gegeben und 24 Stunden lang eingefroren. Nach 24 Stunden wurden die Proben 24 Stunden lang bei 5°C aufgetaut. Dieser Einfrier-und-Auftauvorgang wurde bis zu 3-mal wiederholt. Proben, die am Ende des dritten Zyklus entnommen wurden, wurden durch SE-HPLC, RP-HPLC, ELISA und RRA untersucht.
Die Wirkung von Licht auf die Stabilität von rhNGF wurde an denselben Formulierungen untersucht, die für die Schüttelstudien verwendet wurden. Eine Ampulle jeder Formulierung wurde 5 Wochen lang in einem Lichtbehälter (Forma Scientific, Modell 3890) intensivem fluoreszentem Licht ausgesetzt. Kontrollampullen, die mit Aluminiumfolie umwickelt waren, wurden ebenfalls in den Lichtbehälter gegeben. Die Lichtintensität betrug 20.000 Lux, was etwa 15- bis 20-mal der von fluoreszentem Raumlicht entspricht, und die Temperatur des Lichtbehälters wurde bei 28°C gehalten.
Proben wurden nach 2 und 5 Wochen durch SEC-HPLC, ELISA und RRA untersucht.
Analyseverfahren
A. UV-Analyse: Die rhNGF-Konzentration wurde durch Scannen bei 240 bis 360 nm unter Einsatz eines UV-Vis-Spektralphotometers HP 8452A bestimmt. Ein Formulierungspuffer wurde als Referenz verwendet, um einen Blindwert für das Instrument zu erhalten, und die Proteinkonzentration in mg/ml wurde aus (A280-320)/1,5 berechnet, worin 1,5 der Extinktionskoeffizient von rhNGF in ml/(mg·cm) ist.

B. HPLC-Analyse: Die folgenden HPLC-Verfahren wurden eingesetzt:
Umkehrphasen-HPLC

Säule:	YMC C4, 5 μm, 4,6 × 250 mm
mobile Phase:	A: 0,05 Vol.-% TFA, Wasser B: 0,05 Vol.-% TFA, 100% AcCN
Gradient:	25–27% B (26'), 27–50% B (4'), 50–80% B (1'), 80–25% B (4'), 25% B (20')
Fließgeschwindigkeit:	1 ml/min
Laufzeit:	55 min
Temperatur:	25°C
LC:	HP-1090
Detektion:	214, 280 nm
Injektion:	15 μg

Größenausschluss-HPLC

Säule:	Tosohaas TSK 2000SWXL, 5 μm, 7,8 × 300 mm
mobile Phase:	0,2 M Kaliumphosphat, 0,45 M KCl, pH 7,0
Gradient:	isokratisch
Fließgeschwindigkeit:	1,0 ml/min
Laufzeit:	30 min
Temperatur:	Umgebungstemperatur
LC:	HP-1090
Detektion:	214, 280 nm
Injektion:	15 μg

Kationenaustausch-HPLC

Säule:	Tosohaas TSK SP-5PW, 10 μm, 7,5 × 75 mm
mobile Phase:	A: 10 mM Natriumphosphat, 10 Vol.-%. AcCN, pH 7,0 B: A + 1 M Ammoniumchlorid
Gradient:	10–40% B (60'), 40–60% B (5'), 60–10% B (1'), 71–86% B (15')
Fließgeschwindigkeit:	0,5 ml/min
Laufzeit:	86 min
Temperatur:	35°C
LC:	HP-1090
Detektion:	214 nm
Injektion:	15 μ4g

C. ELISA: Dieser Assay mit einem Bereich von 0,39 bis 6,25 ng/ml wurde von Immunoassay Services (Testablauf-Code SNGF:1 von Genentech, Inc.) durchgeführt. Jede rhNGF-Probe wurde in einem Assay-Verdünner zu zwei gewünschten Konzentra tionen von 5 und 2,5 ng/ml verdünnt, und jede Verdünnung wurde dreifach in Mikronröhrchen vorgelegt. Die Proteinkonzentration in mg/ml wurde auf einen internen Bezugsstandard bei –70°C normalisiert, der für den gleichen Assay vorgelegt wurde.
D. Radiorezeptor-Test (RRA): Dieser Test misst die Fähigkeit von unmarkiertem rhNGF, mit 125I-rhNGF um Rezeptorbindung an PC-12-Zellen zu konkurrieren. Dieser Test wurde von Bioassay Service (Genentech, Inc., Testablauf SNGF:6) durchgeführt und weist einen Bereich von 3 bis 80 ng/ml auf. Jede rhNGF-Probe wurde in einem Assay-Verdünner auf zwei gewünschte Konzentrationen von 25 und 12,5 ng/ml verdünnt, und jede Verdünnung wurde zweifach in Mikronröhrchen vorgelegt. Die Proteinkonzentration in mg/ml wurde auf einen internen Bezugsstandard bei –70 °C normalisiert, der für den gleichen Assay vorgelegt wurde.
E. PC-12-Zellüberlebens-Bioassay: Dieser Assay bestimmt die Fähigkeit von rhNGF, an seine Rezeptoren zu binden und intrazelluläre Signale zu erzeugen, die zum Überleben von PC-12-Zellen unter serumfreien Kulturbedingungen führen. Dieser Assay wurde von Bioassay Service (Testablauf SNGF:7) durchgeführt und weist einen Bereich von 0,24 bis 30 ng/ml auf. Die aktive Proteinkonzentration in mg/ml wurde auf einen internen Bezugsstandard bei –70°C normalisiert, der für den gleichen Assay vorgelegt wurde.
F. Sichtprüfung: Alle Formulierungen, die sich zum Zeitpunkt der Probenentnahme in Ampullen befanden, wurden einer Sichtprüfung unterzogen. Die Proben wurden auf ihre Lösungsklarheit, Farbe, Opaleszenz und Teilchenbildung untersucht.
G. pH-Bestimmung. Der pH aller Formulierungen wurde zu jedem Zeitpunkt bestimmt, wobei ein Radiometer (Modell PHM82, Radiometer America Inc.) und eine Mikroelektrode (Modell M1-410, Microlectrodes, Inc.) verwendet wurden. Standardlösungen mit pH 4,01 und pH 7,00 wurden für die Standardisierung und Kalibrierung des Radiometers vor der pH-Messung verwendet.
H. Konservierungsmittel-Wirksamkeitstest: Die flüssigen rhNGF-Mehrfachdosis-Formulierungen, die bei 5°C 5 Monate lang stabil waren, wurden an das Northview Lab gesandt, um sie einem bakteriellen Belastungstest auf Basis von USP- und EP-Standardkriterien zu unterziehen.
I. Zirkulärdichroismus- (CD-) Analyse: Ein AVIV^®-Spektralpolarimeter Modell 60 DS, das mit einem Wasserbad und Datenprozessor ausgestattet war, wurde verwendet, um den Zirkulärdichroismus zu messen. Die Messungen wurden bei 20°C durchgeführt. Quarz-Küvetten mit einer Zellweglänge von 1,0 cm wurden zur Messung von Nah-UV-CD verwendet. Die CD-Spektren wurden in Intervallen von 0,2 nm mit einer Bandbreite von 0,5 nm und einer Mittelungszeit von 3,0 Sekunden erhalten. Jede Probe für eine CD-Messung wurde kontinuierlich 24 Stunden lang entnommen. Die CD-Daten wurden als mittlere Restelliptizität [q], Grad·cm2/Dezimol, ausgedrückt, wobei für den rhNGF ein mittleres Restgewicht von 120 verwendet wurde.
Ergebnisse
Zuerst wurde ein Konservierungsmittel-Screeningtest durchgeführt, um die physikalische Verträglichkeit von verschiedenen gemeinsam verwendeten Konservierungsmitteln mit rhNGF bei 0,1 mg/ml in der 20-mM-Natriumacetatformulierung mit pH 5,5 zu untersuchen. Die Konservierungsmittel umfassen Benzylalkohol, Phenol, m-Kresol, Methylparaben und Propylparaben. Außerdem wurde die physikalische Verträglichkeit dieser Konservierungsmittel mit rhNGF in der Acetatformulierung in Gegenwart von Tensiden, wie beispielsweise Polysorbat 20 und Pluronic-Säure (F68), untersucht. Die Ergebnisse der physikalischen Verträglichkeit sind in Tabelle 4 angeführt.
Von den zum Screenen verwendeten Konservierungsmitteln sind alle physikalisch mit rhNGF mit 0,1 mg/ml in einer Acetatformulierung mit pH 5,5 verträglich. In Gegenwart von 0,01% Polysorbat 20 in derselben Formulierung waren nur Benzylalkohol und Phenol in Endkonzentrationen von 0,9% bzw. 0,25% physikalisch mit rhNGF verträglich. 0,45% Phenol und 0,25% m-Kresol bildeten in Gegenwart von Polysorbat 20 jeweils eine trübe Lösung mit rhNGF in der Acetatformulierung. Die rhNGF-Lösung wurde auch bei Zusatz von 0,18% Methylparaben oder 0,02% Propylparaben zu der Polysorbat 20 enthaltenden Acetatformulierung leicht milchig. Auf der anderen Seite führten 0,01% Pluronic-Säure in derselben Formulierung zu keiner physikalischen Unverträglichkeit zwischen dem rhNGF und allen getesteten Konservierungsmitteln.
Ausgehend von den Ergebnissen der Konservierungsmittel-Screeningtets wurden mehrere flüssige rhNGF-Mehrfachdosis-Formulierungen, die entweder 0,9% Benzylalkohol oder 0,25% Phenol in 20 mM Acetat mit pH 5,5 mit und ohne 0,01% F68 enthielten, für langfristige Stabilitätsstudien vorbereitet. Eine Liste dieser Formulierungen ist in Tabelle 5 angeführt.
Die Stabilität von rhNGF in diesen Formulierungen wurde mithilfe der folgenden Verfahren bestimmt: SE-HPLC, RP-HPLC, IE-HPLC, ELISA, Radiorezeptortest (RRA), PC-12-Zellüberlebens-Bioassay, pH und Sichtprüfung. Die Annehmbarkeit einer flüssigen Mehrfachdosis-Formulierung von rhNGF basiert auf einem Vergleich mit der derzeitigen flüssigen Formulierung, die aus 2 mg/ml rhNGF in 10 mM Natriumacetat mit pH 5,5 und 142 mM Natriumchlorid besteht. Mit anderen Worten sollte die konservierte Formulierung so stabil sein wie die derzeitige flüssige Formulierung. Ergebnisse, die bis heute erhalten wurden, stellen Stabilitätsüberwachungsdaten für 12 Monate bei –70 und 5°C, 9 Monate bei 25°C und 3 Monate bei 40°C dar.
Größenausschlusschromatographie: Eine Größenausschluss-HPLC wurde eingesetzt, um die Aggregatbildung in den flüssigen rhNGF-Mehrfachdosis-Formulierungen sowie ihre Kontrollformulierungen, die keine Konservierungsmittel enthielten, zu detektieren und zu quantifizieren. Unter Einsatz dieses Verfahrens eluiert rhNGF als Dimer (Hauptpeak) bei einer Retentionszeit von 8,6 Minuten. Benzylalkohol und Phenol eluieren nach 16 bzw. 19 Minuten. Das Aussehen der Hauptschulter auf dem Dimer-Hauptpeak weist auf die Gegenwart eines Aggregats mit höherem Molekulargewicht hin. Die Daten in Tabelle 6 zeigen, dass rhNGF in allen Formulierungen, die 0,9% Benzylalkohol als Konservierungsmittel enthalten, stabil gegenüber Aggregatbildung ist.
Nach 3 Monaten bei 40°C und nach 9 Monaten bei 5°C wurde eine kleine Menge Aggregat (weniger als 1%) in den Phenol enthaltenden Formulierungen (mit und ohne 0,01% F68 als Tensid) detektiert. Die gesamte Protein-Rückgewinnung aus diesen Proben ist in Tabelle 7 im Vergleich mit ihren Kontrollen bei –70°C angeführt.
Die derzeitige Formulierung, Kontrollen und Benzylalkohol enthaltende Formulierungen wiesen nach 9 Monaten bei 25°C eine Proteinrückgewinnungsrate von 99 oder mehr auf, während Phenol enthaltende Formulierungen bei derselben Lagerzeit und -temperatur 97% aufwiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass rhNGF in allen untersuchten Formulierungen mit Benzylalkohol verträglicher und stabiler ist als mit Phenol.
Umkehrphasen-HPLC: Der in dieser Untersuchung verwendete rhNGF besteht hauptsächlich aus einem 118/118-Homodimer und einer kleinen Menge 120/120-Homodimer. Unter den Bedingungen der Umkehrphasenchromatographie werden die beiden dimeren rhNGF-Formen aufgespalten und ihre Monomere getrennt. Eine RP-HPLC trennt die rhNGF-Monomere basierend auf der Hydrophobizität der einzelnen Arten. Das 118-Monomer, das hydrophober ist als das 120-Monomer, eluiert bei einer Retentionszeit von 23 Minuten. Das 120-Monomer eluiert als kleiner Peak vor dem Peak des 118-Monomers. Ein Vergleich der RP-HPLC-Chromatogramme von rhNGF in der mit Benzylalkohol konservierten Formulierung, die kein Tensid enthält, bei 5, 25 und 40°C ist in 8 dargestellt. Der Abbau von rhNGF, das bei erhöhten Temperaturen gelagert wird, war hauptsächlich auf die Bildung von iso-Aspartat, einen Rückgang der Peakbereiche der 118- und 120-Monomere, Beschneidungen und einen Anstieg an falsch gefaltetem rhNGF zurückzuführen, wie durch RP-HPLC bestimmt wurde. Die mono- und dioxidierten rhNGF-Peaks und der desamidierte rhNGF-Peak bleiben unverändert. In dieser Untersuchung ist rhNGF als Summe der durch RP-HPLC bestimmten 118- und 120-Monomerpeakbereiche definiert, und die Ergebnisse sind als Prozentanteil von im Vergleich zu den Kontrollen bei –70°C verbleibendem rhNGF angeführt.
Eine Abnahme des Prozentanteils des verbleibenden Proteins aufgrund eines Rückgangs der 118- und 120-Monomerpeakbereiche, der durch RP-HPLC bestimmt wird, stellt den wichtigsten Abbaufaktor für rhNGF in einer flüssigen Formulierung dar. Bei 5°C entspricht die Stabilität von rhNGF in Mehrfachdosis-Formulierungen, die durch RP-HPLC bestimmt wird, im Wesentlichen jener von nicht konservierten Kontrollformulierungen sowie jener der derzeitigen Formulierung (mehr als 95% rhNGF nach 12 Monaten), mit Ausnahme der mit Phenol konservierten Formulierung, die 0,01% F68 enthält (9). Diese Formulierung wies einen etwas geringeren Prozentanteil (93%) an nach 12 Monaten bei 5°C verbleibendem rhNGF auf. Bei 25°C ist rhNGF in Gegenwart von 0,25% Phenol offensichtlich weniger stabil als bei Verwendung von 0,9% Benzylalkohol als Konservierungsmittel in der 20-mM-Acetatformulierung mit pH 5,5 (10). Die Kombination von Phenol und F68 in der Acetatformulierung verursachte mehr Proteinabbau als die Gegenwart von Phenol alleine.
Die Bildung von iso-Aspartat aus rhNGF in flüssiger Form ist zeit- und temperaturabhängig. Die Geschwindigkeit der iso-Aspartat-Bildung steigt mit zunehmender Zeit und Temperatur. Bei 5°C weisen alle Formulierungen eine ähnliche iso-Aspartat-Bildungsgeschwindigkeit auf (11). In allen rhNGF-Mehrfachdosis-Formulierungen und in ihren nicht konservierten Kontrollformulierungen wurden nach 12 Monaten bei 5°C etwa 1,5% iso-Aspartat gebildet. Die Geschwindigkeit der iso-Aspartat-Bildung ist jedoch in den rhNGF-Formulierungen, die mit 0,9% Benzylalkohol konserviert wurden, etwas höher als in den Kontrollformulierungen und mit Phenol konservierten Formulierungen, die bei 25°C gelagert wurden (12). Da die iso-Aspartat-Bildung von rhNGF keine Auswirkungen auf die Bioaktivität des Proteins hat, ist die Wirkung eines Konservierungsmittels auf die iso-Aspartat-Bildung von rhNGF kein großes Anliegen.
Kationenaustauschchromatographie: IE-HPLC-Chromatogramme für rhNGF in der derzeitigen Formulierung nach 3 Monaten bei 5, 25 und 40°C sind in 13 dargestellt. Es gibt drei Hauptpeaks. Der größte Peak ist das 118/118-Dimer (Peak b), das nach etwa 48 Minuten eluiert. Der Peak c hinter dem Hauptpeak stammt von einer Serin-zu-Glycin-Substitution an Position 1 in einer der beiden Dimerketten. Der Peak a vor dem Hauptpeak ist wahrscheinlich auf das oxidierte 118/118 und den oxidierten N-terminal beschnittenen rhNGF zurückzuführen. Bei erhöhten Temperaturen (25 und 40°C) ist der Abbau von rhNGF, der durch IE-HPLC bestimmt wird, durch einen Rückgang der Peakbereiche des 118/118-Hauptpeaks und des Serin-zu-Glycin-substituierten 118/118-Dimers sowie den Anstieg der Fläche des Peaks a charakterisiert. In dieser Untersuchung ist rhNGF als Summe der 118/118-Dimer- (Peak b) und einer Kette der Serin-zu-Glycin-Dimer-Peakflächen (Peak c) definiert, bestimmt durch IE-HPLC, und die Ergebnisse sind als Prozentanteil von im Vergleich zu den Kontrollen bei –70°C verbleibendem rhNGF angeführt.
Die 14 bzw. 15 zeigen den Prozentanteil an rhNGF, der in den einzelnen rhNGF-Formulierungen nach 12 Monaten bei 5°C bzw. 9 Monaten bei 25°C verbleibt. Bei 5 °C bleiben der Peakbereich der Peaks b und c bei allen rhNGF-Formulierungen nach 12 Monaten unverändert. Bei 25°C weisen alle rhNGF-Formulierungen eine ähnliche Abbaugeschwindigkeit auf, und es gab keinen bedeutenden Unterschied in der Stabilität zwischen den Mehrfachdosis-Formulierungen und den Kontrollformulierungen, bestimmt durch IE-HPLC.
ELISA: Die Daten in Tabelle 8 zeigen den Prozentanteil an rhNGF, der nach 12, 9 und 3 Monaten Lagerung bei 5, 25 und 40°C verbleibt.
Die Ergebnisse wurden auf die Kontrollen, die unter den gleichen Bedingungen für den gleichen Zeitraum bei –70°C gelagert wurden, normalisiert. Es gab keinen bedeutenden Unterschied zwischen den mit Benzylalkohol und Phenol konservierten Formulierungen, sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von 0,01% F68 als Tensid, und das bei allen untersuchten Temperaturen und Zeitpunkten.
Rezeptorbindungsaktivität (RRA): Die RRA-Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengefasst und auf die Kontrollen bei –70°C normalisiert.
In Abwesenheit von 0,01% F68 in der Acetatformulierung mit pH 5,5 wies die konservierte Formulierung bei allen untersuchten Temperaturen einen geringeren Prozentsatz an verbleibendem Protein auf als die mit Benzylalkohol konservierte Formulierung und die Kontrollformulierung. In Gegenwart von 0,01% F68 in der Acetatformulierung mit pH 5,5 verlor rhNGF in der (mit Benzylalkohol oder Phenol) konservierten Formulierung und in der Kontrollformulierung bei 25 und 40°C nach 9 bzw. 3 Monaten etwa 20% seiner Bioaktivität. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich Phenol und F68 auf die Fähigkeit von rhNGF auswirken können, an den NGF-Rezeptor auf PC-12-Zellen zu binden. Daher sind 0,9% Benzylalkohol in der für verschiedene Zwecke bestimmten Acetatformulierung, die kein Tensid enthält, besser als Konservierungsmittel für rhNGF geeignet.
PC-12-Zellüberlebens-Bioassay: Im Gegensatz zu den RRA-Ergebnissen zeigen die in Tabelle 10 zusammengefassten Daten des PC-12-Zellüberlebens-Bioassays, dass keine bedeutenden Unterschiede in der Wirksamkeit von rhNGF in allen Formulierungen, die 12 Monate bei 5°C und 9 Monate bei 25°C gelagert wurden, auftrat.
Das Protein war in allen Formulierungen voll aktiv, wie durch den Bioassay bestimmt wurde. Daher ist der Radiorezeptor-Bindungsassay bei der Untersuchung der Bioak tivität von rhNGF besser dazu geeignet, die Stabilität zu bestimmen, als der Zellüberlebens-Bioassay.
Lösungen aller rhNGF-Formulierungen waren mit freiem Auge betrachtet klar und farblos (Tabelle 11). In keiner der Formulierungen traten bei keiner Temperatur und zu keinem Zeitpunkt Teilchen auf.
pH-Ergebnisse: rhNGF, der in 10 mM Acetat, 142 mM Natriumchlorid mit entweder pH 5,5 oder pH 5,8 formuliert wurde, wies während der Stabilitätsuntersuchung einen pH-Anstieg von 0,2 Einheiten auf. Die Mehrfachdosis-Formulierungen und ihre in dieser Untersuchung verwendeten Kontrollformulierungen wurden in 20 mM Acetat mit pH 5,5 formuliert, was eine höhere Pufferkapazität bereitstellen sollte, um eine pH-Veränderung zu verhindern. Tabelle 11 zeigt, dass der pH bei allen untersuchten Formulierungen unverändert blieb.
Konservierungsmittel-Wirksamkeitstest: Nach 6 Monaten Stabilitätsuntersuchungen wurde die stabilste Mehrfachdosis-Formulierung für rhNGF, die aus 0,1 mg/ml rhNGF in 20 mM Acetat mit pH 5,5, 136 mM Natriumchlorid und 0,9% Benzylalkohol besteht, einem Konservierungsmittel-Wirksamkeitstest unterzogen. Diese Formulierung entsprach nach 6 Monaten Lagerung bei 5°C sowohl den USP als auch den EP (Kriterien A und B).
Zirkulärdichroismus- (CD-) Analyse: Die Gegenwart von 0,9% Benzylalkohol in verschiedenen flüssigen Interferongamma- (rhIFN-g-) Formulierungen führt zu einem Rückgang des Zirkulärdichroismus-Signals im Nah-UV-Bereich. Das Nah-UV-CD-Signal von rhIFN-g verschwand innerhalb von 24 Stunden, was darauf hinweist, dass aufgrund der Gegenwart von Benzylalkohol eine Veränderung in der tertiären Struktur des Proteins stattfand. Dieses Phänomen wurde jedoch nicht in der rhNGF-Formulierung beobachtet, die mit 0,9% Benzylalkohol konserviert wurde. 24 Stunden nach dem Zusatz des Konservierungsmittels war das Nah-UV-CD-Spektrum unverändert, was darauf schließen lässt, dass in der Acetatformulierung mit pH 5,5 keine Wechselwirkung zwischen rhNGF und Benzylalkohol stattfindet. 16 zeigt das Nah-UV-CD-Spektrum von rhNGF, und 17 vergleicht die Nah-UV-CD-Spektren von rhNGF in Gegenwart und Abwesenheit von Benzylalkohol nach 24 Stunden bei 25°C. Aufgrund der Interferenz von Benzylalkohol bei einer Wellenlänge unter 275 nm wurde das CD-Spektrum von rhNGF von 325 bis 275 nm gescannt, wenn die Probe das Konservierungsmittel enthielt.
Belastungen, die die Stabilität testen
1. Schüttelstudien: Schüttelstudien wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob es notwendig ist, der rhNGF-Mehrfachdosis-Formulierung bei geringer Proteinkonzentration, wie beispielsweise 0,1 mg/ml, ein Tensid (F68) zuzusetzen, um eine Proteinaggregation zu verhindern und die visuelle Klarheit der Lösungen während des Schüttelns aufrechtzuerhalten. Die Daten aus Tabelle 12 zeigen, dass 0,1 mg/ml rhNGF in 20-mM-Acetatformulierung mit pH 5,5 (mit oder ohne Konservierungsmittel) relativ stabil gegenüber mechanischen Störungen, wie beispielsweise Schütteln, ist. Das lässt darauf schließen, dass bei der Formulierung von 0,1 mg/ml rhNGF zu einer flüssigen Mehrfachdosisform kein Tensid für Stabilitätszwecke erforderlich ist.
2. Einfrier-Auftau-Studien: Die Ergebnisse der Wirkung von Einfrieren und Auftauen auf die Stabilität von 0,1-mg/ml-rhNGF-Mehrfachdosis-Formulierungen sind in Tabelle 13 zusammengefasst.
Nach 3 Einfrier-und-Auftau-Zyklen wiesen die 0,1 mg/ml rhNGF in der 20-mM-Acetatformulierung mit pH 5,5 als Kontrolle und die zwei Mehrfachdosis-Formulierungen mit entweder 0,9% Benzylalkohol oder 0,25% Phenol keinen Stabilitätsverlust des Proteins auf. Sie sind so stabil wie die derzeitige flüssige 2-mg/ml-rhNGF-Formulierung nach 3 Einfrier-und-Auftau-Zyklen zwischen –70°C und 5°C.
3. Lichtverträglichkeitsstudien: Tabelle 14 fasst die Wirkung von Licht auf die Stabilität von rhNGF in der derzeitigen 2-mg/ml-Formulierung, der 0,1-mg/ml-rhNGF-Kontrollformulierung und der mit Benzylalkohol oder Phenol konservierten 0,1-mg/ml-rhNGF-Formulierung zusammen.
Nach 2-wöchiger Lagerung im Lichtbehälter trat bei allen untersuchten Formulierungen kein bedeutender Rückgang der Stabilität des Proteins auf. Nach 5 Wochen Lagerung im Lichtbehälter zeigte eine SE-HPLC jedoch einen Anstieg der Aggregatbildung in der derzeitigen Formulierung auf (1,6%). In der mit Phenol konservierten Formulierung stieg die Aggregatbildung nach 5 Wochen Bestrahlung sogar noch stärker an (12,1%). Außerdem ging in der dem Licht ausgesetzten, Phenol enthaltenden Formulierung die Proteinkonzentration um 30% und die Bioaktivität um 60% zurück, wie durch ELISA bzw. RRA bestimmt wurde. Sowohl die mit Benzylalkohol konservierte Formulierung als auch die 0,1-mg/ml-rhNGF-Kontrollformulierung waren nach 5-wöchiger Bestrahlung stabil. Alle Kontrollampullen, die mit Aluminiumfolie umwickelt worden waren, waren nach 5-wöchiger Lagerung im Lichtbehälter stabil. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass rhNGF in der Acetatformulierung mit pH 5,5 bei höherer Proteinkonzentration (2 mg/ml) empfindlicher gegenüber Licht ist als bei niedrigerer Proteinkonzentration (0,1 mg/ml). In Gegenwart von Phenol wird rhNGF bei Belichtung schneller abgebaut.
Alle flüssigen 0,1-mg/ml-rhNGF-Mehrfachdosis-Formulierungen mit pH 5,5 sind bei 5°C 12 Monate lang stabil. Bei 25°C waren die Formulierungen (mit oder ohne F68) mit 0,25% Phenol als Konservierungsmittel weniger stabil als die Formulierungen mit 0,9% Benzylalkohol.
0,1-mg/ml-rhNGF-Formulierungen mit pH 5,5, die ein Tensid (F68) enthalten, sind so stabil wie Formulierungen ohne Tensid.
Die wichtigste Mehrfachdosis-Formulierung für rhNGF besteht aus 0,1 mg/ml Protein in 20 mM Acetat, pH 5,5, 136 mM NaCl und 0,9% Benzylalkohol und wird in einer Menge von 1,8 ml in eine 3 cm³ fassende Ampulle gefüllt. Diese Formulierung bestand sowohl den USP- als auch den EP-Konservierungsmittel-Wirksamkeitstest nach 6-monatiger Lagerung bei 5°C.
rhNGF, das in einer Menge von 0,1 mg/ml in 20 mM Acetat, 136 mM NaCl pH 5,5 formuliert wird, ist so stabil wie die derzeitige flüssige 2-mg/ml-Formulierung.
Schütteln hatte keinerlei Auswirkungen auf die Stabilität von rhNGF, unabhängig von der Proteinkonzentration oder dem Arzneimittelträger in der Formulierung.
rhNGF ist in Dunkelheit stabiler als in Licht, vor allem, wenn die Formulierung Phenol als Konservierungsmittel enthält.
2 mg/ml rhNGF in der derzeitigen Formulierung und eine flüssige 0,1-mg/ml-Mehrfachdosis-Formulierung können zumindest 3 Einfrier- (–70°C) und -Auftau- (5°C) Zyklen durchlaufen, ohne dass die Stabilität des Proteins negativ beeinträchtigt wird.
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Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge von nicht mehr als 0,5 mg/ml an Nervenwachstumsfaktor (NGF) und einen pharmazeutisch annehmbaren acetathältigen Puffer mit einem pH von 5 bis 6, unter Ausschluss von menschlichem Serumalbumin.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 mit einem pH von 5,5.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin der Puffer Natriumacetat ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche mit einer Acetatkonzentration von 0,1 bis 200 mM.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die NGF-Konzentration 0,07 bis 0,5 mg/ml beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin die NGF-Konzentration 0,1 bis 0,5 mg/ml beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin die NGF-Konzentration 0,1 mg/ml beträgt.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die weiters ein pharmazeutisch annehmbares Konservierungsmittel umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, worin das Konservierungsmittel aus der aus Benzylalkohol, Phenol, m-Kresol, Methylparaben und Propylparaben bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin das Konservierungsmittel Benzylalkohol ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin die Benzylalkohol-Konzentration 0,1 bis 2,0% beträgt.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die weiters ein pharmazeutisch annehmbares Tensid umfasst.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die weiters eine physiologisch annehmbare Natriumchlorid-Konzentration umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin die Natriumchlorid-Konzentration 0,05 bis 0,3 M beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, worin die Natriumchlorid-Konzentration 136 mM oder 142 mM beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Nervenwachstumsfaktor in einer Konzentration von zumindest etwa 0,1 mg/ml vorliegt und die Acetationen in einer Konzentration von 10 mM bis 50 mM vorliegen.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die NGF-Konzentration 0,1 mg/ml beträgt, die Natriumacetat-Konzentration 20 mM beträgt, der pH 5,5 beträgt, die Natriumchlorid-Konzentration 136 mM beträgt und der Benzylalkohol in 0,9 Vol.-% vorliegt.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 17, worin der Nervenwachstumsfaktor NGF mit 118 Aminosäuren ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, worin der Nervenwachstumsfaktor das 118/118-rhNGF-Homodimer ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 19, worin der Nervenwachstumsfaktor von Chinahamster-Eierstockzellen sekretiert ist.
Set zur NGF-Verabreichung, das eine pharmazeutische Zusammensetzung enthält, die eine pharmazeutisch wirksame Menge von nicht mehr als 0,5 mg/ml an Nervenwachstumsfaktor und einen pharmazeutisch annehmbaren acetathältigen Puffer mit einem pH von 5 bis 6 umfasst, wobei menschliches Serumalbumin ausgeschlossen ist.
Set nach Anspruch 21, worin das Zusammensetzungsvolumen 1,6 bis 2,0 ml beträgt.
Set nach Anspruch 21 oder 22, worin die Ampulle das Einwirken von Licht auf die Zusammensetzung verringert.
Set nach einem der Ansprüche 21 bis 23, worin die Zusammensetzung bei 2 bis 8°C gelagert wird.
Set nach einem der Ansprüche 21 bis 24, worin die Ampulle ein Mehrfachdosis-Volumen an NGF-Formulierung umfasst.
Verfahren zur Erhöhung der Stabilität von NGF in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die nicht mehr als 0,5 mg/ml NGF als Wirkprinzip enthält, umfassend das Aufnehmen von Acetat in die Zusammensetzung in einer Menge und einem pH, die wirksam die Stabilität des NGF erhöhen, wobei menschliches Serumalbumin ausgeschlossen ist.