ES2211991T3 - Formulacion estabilizante para el ngf. - Google Patents
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Abstract
SE INCLUYEN FORMULACIONES QUE COMPRENDEN FCN Y UN TAMPON CON ACETATO DE PH 5 A 6, Y OFRECEN MAYOR ESTABILIDAD DEL FCN PARA SU USO EN PROMOVER EL CRECIMIENTO, REPARACION, SUPERVIVENCIA, DIFERENCIACION, MADURACION O LA FUNCION DE LAS CELULAS NERVIOSAS.
Description
Formulación estabilizante para el NGF.
Esta invención se refiere a formulaciones del
factor de crecimiento nervioso ("NGF") y a su uso para inducir
el crecimiento, diferenciación, supervivencia, reparación,
maduración, o función in vivo o ex vivo de células
nerviosas. Más particularmente, esta invención se refiere a tales
composiciones farmacéuticas que tienen una estabilidad y solubilidad
características incrementadas del componente NGF, particularmente
del factor de crecimiento nervioso recombinante humano
("rhNGF"), y aquéllas que hacen factible la posibilidad de
crear formas estables de la misma para una administración
terapéutica efectiva y segura a sujetos humanos.
El factor del crecimiento nervioso (NGF) es un
factor neurotrófico necesario para el crecimiento y supervivencia de
neuronas sensoriales y simpáticas durante el desarrollo y en
animales maduros (1). Las indicaciones clínicas para el factor de
crecimiento nervioso humano recombinante incluyen la neuropatía
sensorial periférica y la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, se
ha mostrado que la administración sistémica del factor de
crecimiento nervioso reduce la neuropatía sensorial inducida por la
administración de cisplatino y taxol a ratones (2, 3). En ensayos
clínicos recientes, se ha administrado factor de crecimiento
nervioso a humanos para mejorar la función sensorial en neuropatías
diabéticas (4).
Actualmente, se está desarrollando el factor de
crecimiento nervioso como una formulación parenteral líquida. La
estabilidad de la proteína es complicada, más allá de las vías
habituales de degradación química y física, debido a la estructura
dimérica del factor de crecimiento nervioso. La estabilidad de la
proteína puede complicarse aún más cuando la proteína recombinante
es una mezcla de variantes de factor de crecimiento nervioso
cortadas de forma C-terminal. La estructura
cristalina del factor de crecimiento nervioso de ratón muestra 3
pares antiparalelos de hojas-b que forman una
superficie plana a través de la cual se dimerizan los monómeros (5);
la constante de disociación de los dímeros es \leq 10^{-13} M
(6, 7). La reordenación de los monómeros dentro de los dímeros,
hacia una distribución de dímeros en equilibrio, complica la
cuantificación de la degradación del dímero de factor de crecimiento
nervioso.
Hay una necesidad de formulaciones que contengan
factor de crecimiento nervioso que conduzcan a la estabilidad del
factor de crecimiento nervioso, a la vez que sean seguras y
efectivas para su administración terapéutica a mamíferos,
particularmente a sujetos humanos.
WO-95/05845 descubre
formulaciones acuosas del factor de crecimiento nervioso, las
cuales, cuando contienen menos de 0,5 mg/ml de factor de crecimiento
nervioso, requieren la presencia de albúmina de suero humana.
La presente invención se basa en el hallazgo de
condiciones y procedimientos de formulación para conseguir la
estabilidad del factor de crecimiento nervioso en una formulación
líquida. Es un objeto de la presente invención proporcionar una
formulación apropiada del factor de crecimiento nervioso con
estabilidad potenciada del factor de crecimiento nervioso, para
proporcionar una inducción efectiva del crecimiento, supervivencia,
diferenciación, maduración, reparación, o función de células
nerviosas, preferiblemente in vivo o ex vivo. En
varias realizaciones, las formulaciones pueden tener una estabilidad
potenciada frente a la agitación, congelación, descongelación, luz,
o almacenamiento. Es otro objeto de la invención proporcionar una
formulación estable de factor de crecimiento nervioso para su uso en
el tratamiento de un mamífero, preferiblemente humano, que necesita
el tratamiento con factor de crecimiento nervioso para proporcionar
una cantidad terapéuticamente efectiva de factor de crecimiento
nervioso. Es otro objeto proporcionar una formulación de factor de
crecimiento nervioso con consistencia potenciada para una aplicación
mejorada a la neurona o animal. Estos y otros objetos serán
evidentes a los especialistas en la técnica.
Los objetos anteriores se consiguen
proporcionando una formulación de factor de crecimiento nervioso que
comprende una cantidad efectiva de factor de crecimiento nervioso en
un tampón acetato farmacéuticamente aceptable, preferiblemente
acetato sódico tal como se ilustra en las reivindicaciones. En una
realización específica, esta formulación contiene aproximadamente
0,1 a 0,5 mg/ml de factor de crecimiento nervioso en un tampón
acetato desde 5 hasta 10 mM, desde pH 5 hasta 6. La
formulación puede contener opcionalmente un diluyente
farmacéuticamente aceptable, una sal farmacéuticamente aceptable,
preferiblemente cloruro sódico, o un conservante, preferiblemente
alcohol bencílico.
En otra realización, la invención proporciona un
procedimiento para producir una formulación de factor de crecimiento
nervioso producida mediante los mismos pasos, incluyendo la
formulación del factor de crecimiento nervioso y acetato, y
opcionalmente del cloruro sódico, y además, opcionalmente, un
conservante, tal como se detalla en la reivindicación 26.
En otra realización, se presenta un procedimiento
mediante el cual se cuantifica la degradación del dímero de factor
de crecimiento nervioso independientemente del intercambio del
dímero.
La Figura 1 ilustra la dependencia de la
formación de agregado de factor de crecimiento nervioso a 37ºC
respecto la formulación de tampón y pH; cuantificada mediante
cromatografía de exclusión por tamaño, (\lozenge) succinato,
pH 4,2; (triángulo vacío) succinato, pH 5,0; (\Box)
succinato, pH 5,8; (\times) succinato, pH 5,0, con
el 0,05% de Tween 20; (triángulo relleno) acetato, pH 5,0; y
(\blacksquare) acetato, pH 5,8.
La Figura 2 ilustra cromatogramas representativos
de RP-HPLC del NGF en tampón succinato a pH
5,0 (a) -70ºC control y (b) después de 38 días de incubación a
37ºC.
La Figura 3 representa gráficas semilogarítmicas
del porcentaje de monómero de factor de crecimiento nervioso que
permanece después de la incubación a 37ºC, durante diferentes
longitudes de tiempo, tal como se cuantificó mediante
RP-HPLC, (\lozenge) succinato, pH 4,2;
(triángulo vacío) succinato, pH 5,0; (\Box) succinato,
pH 5,8; (\times) succinato, pH 5,0, con el 0,05% de
Tween 20; (triángulo relleno) acetato, pH 5,0; y
(\blacksquare) acetato, pH 5,8. Las curvas son ajustes de
primer orden a los datos.
La Figura 4 ilustra cromatogramas IEC
representativos del factor de crecimiento nervioso en tampón
acetato, a pH 5,0, después de 38 días de incubación a (línea
continua) -70ºC y (línea discontinua) a 37ºC. Cada dímero aparece
como un triplete en el cromatograma debido a la conversión de Ser
N-terminal a Gly (S1G) (13). El primer pico en el
triplete es el dímero progenitor, seguido por un dímero con una
única conversión de Ser a Gly, y finalmente el dímero con una
conversión de Ser a Gly en ambas cadenas.
La Figura 5 ilustra la dependencia respecto el
tiempo de la pérdida de dímeros de factor de crecimiento nervioso
118/118 y 117/120, mediante IEC, a partir de su incubación a 37ºC en
(triángulo vacío) succinato, pH 5,0; (\Box) succinato,
pH 5,8; (\times) succinato, pH 5,0, con el 0,05% de
Tween 20; (triángulo relleno) acetato, pH 5,0; y
(\blacksquare) acetato, pH 5,8.
La Figura 6 ilustra cromatogramas de
RP-HPLC que muestran la estabilidad del factor de
crecimiento nervioso después de 1,6 años (línea discontinua) a 5ºC y
(línea continua) a -70ºC. El principal producto de degradación a 5ºC
es la conversión de Asn93 a iso-Asp93.
Las Figuras 7A y 7B ilustran comparaciones
cromatogramas IEC de NGF (línea continua) a -70ºC control y (línea
discontinua) 5ºC después de 1,6 años de incubación en tampón acetato
a pH 5,0 sin tratamiento ácido (Figura 7A) y con tratamiento
ácido (Figura 7B) de las muestras antes del análisis.
La Figura 8 muestra cromatogramas de
RP-HPLC de 0,1 mg/ml de rhNGF en acetato 10 mM, a
pH 5,5 y NaCl 142 mM, almacenados a 5ºC (línea continua),
25ºC (línea discontinua), y 40ºC (línea punteada) durante 3 meses.
El pico (a) contiene rhNGF di-oxidada; el pico (b)
contiene rhNGF desaminado; el pico (c) contiene rhNGF
mono-oxidado; el pico (d) contiene
Iso-aspartato; el pico (e) contiene 120 rhNGF; y el
pico (i) contiene proteína eluída con un gradiente en rampa.
La Figura 9 ilustra la determinación de monómeros
de rhNGF (118 y 120) que permanecen en las formulaciones de rhNGF
después de 12 meses a 5 grados C, mediante HPLC de fase inversa. La
formulación A (-\medcirc-) contiene 2 mg/ml de rhNGF (NaCl 142 mM,
acetato 10 mM, pH 5,5); la formulación B (-\Box-) contiene
0,1 mg/ml de rhNGF (NaCl 136 mM, acetato 20 mM, pH 5,5); la
formulación C (-\lozenge-) contiene la formulación B más un 0,9%
de BA; la formulación D (-\times-) contiene la formulación B más
0,25% de fenol; la formulación E (-+-) contiene 0,1 mg/ml de rhNGF
(NaCl 136 mM, acetato 20 mM, 0,01% de F86, pH 5,5); la
formulación F (-triángulo vacío-) contiene la formulación E más 0,9%
de BA; y la formulación G (-\blacksquare-) contiene la formulación
E más 0,25% de fenol.
La Figura 10 ilustra la determinación de
monómeros de rhNGF (118 y 120) que permanecen en las formulaciones
de rhNGF después de 9 meses a 25 grados C, mediante HPLC de fase
inversa. La formulación A (-\medcirc-) contiene 2 mg/ml (acetato
10 mM, pH 5,5); la formulación B (-\Box-) contiene 0,1
mg/ml (acetato 20 mM, pH 5,5); la formulación C
(-\lozenge-) contiene la formulación B más un 0,9% de BA; la
formulación D (-\times-) contiene la formulación B más 0,25% de
fenol; la formulación E (-+-) contiene 0,1 mg/ml (acetato 20 mM,
0,01% de F86, pH 5,5); la formulación F (-triángulo vacío-)
contiene la formulación E más 0,9% de BA; y la formulación G
(-\medbullet-) contiene la formulación E más 0,25% de fenol.
La Figura 11 ilustra el efecto del conservante
sobre la formación de iso-aspartato de rhNGF en
formulaciones de múltiples dosis líquidas almacenadas a 5 grados C
durante 12 meses, tal como se determinó mediante
RP-HPLC. La formulación A (-\medcirc-) contiene 2
mg/ml (acetato 10 mM, pH 5,5); la formulación B (-\Box-)
contiene 0,1 mg/ml (acetato 20 mM, pH 5,5); la formulación C
(-\lozenge-) contiene la formulación B más un 0,9% de BA; la
formulación D (-\times-) contiene la formulación B más 0,25% de
fenol; la formulación E (-+-) contiene 0,1 mg/ml (acetato 20 mM,
0,01% de F86, pH 5,5); la formulación F (-triángulo vacío-)
contiene la formulación E más 0,9% de BA; y la formulación G
(-\blacksquare-) contiene la formulación E más 0,25% de fenol.
La Figura 12 ilustra el efecto del conservante
sobre la formación de iso-aspartato de rhNGF en
formulaciones líquidas de múltiples dosis almacenadas a 25 grados C
durante 9 meses, tal como se determinó mediante
RP-HPLC. La formulación A (-\medcirc-) contiene 2
mg/ml (acetato 10 mM, pH 5,5); la formulación B (-\Box-)
contiene 0,1 mg/ml (acetato 20 mM, pH 5,5); la formulación C
(-\lozenge-) contiene la formulación B más un 0,9% de BA; la
formulación D (-\times-) contiene la formulación B más 0,25% de
fenol; la formulación E (-+-) contiene 0,1 mg/ml (acetato 20 mM,
0,01% de F86, pH 5,5); la formulación F (-triángulo vacío-)
contiene la formulación E más 0,9% de BA; y la formulación G
(-\blacksquare-) contiene la formulación E más 0,25% de fenol.
La Figura 13 muestra cromatogramas de HPLC de
intercambio catiónico de 0,1 mg/ml de rhNGF en acetato 10 mM, a
pH 5,5, y NaCl 142 mM, almacenado a 5 grados C (línea
continua), 25 grados C (línea discontinua), y 40 grados C (línea
punteada) durante 3 meses. El pico (a) contiene rhNGF mono- y
di-oxidado 118/118, y cortado de forma
N-terminal y oxidado; el pico (b) contiene
homodímero de rhNGF 118/118; y el pico (c) contiene rhNGF
Ser-Gly 118/118 (1-cadena).
La Figura 14 ilustra la determinación, mediante
HPLC de intercambio catiónico, del dímero de rhNGF (118/118) que
permanece en las formulaciones de rhNGF después de 12 meses a 5
grados C. La formulación A (-\medcirc-) contiene 2 mg/ml (acetato
10 mM, pH 5,5); la formulación B (-\Box-) contiene 0,1
mg/ml (acetato 20 mM, pH 5,5); la formulación C
(-\lozenge-) contiene la formulación B más un 0,9% de BA; la
formulación D (-\times-) contiene la formulación B más 0,25% de
fenol; la formulación E (-+-) contiene 0,1 mg/ml (acetato 20 mM,
0,01% de F86, pH 5,5); la formulación F (-triángulo vacío-)
contiene la formulación E más 0,9% de BA; y la formulación G
(-\blacksquare-) contiene la formulación E más 0,25% de fenol.
La Figura 15 ilustra la determinación, mediante
HPLC de intercambio catiónico, del dímero de rhNGF (118/118) que
permanece en las formulaciones de rhNGF después de 9 meses a 25
grados C. La formulación A (-\medcirc-) contiene 2 mg/ml (acetato
10 mM, pH 5,5); la formulación B (-\Box-) contiene 0,1
mg/ml (acetato 20 mM, pH 5,5); la formulación C
(-\lozenge-) contiene la formulación B más un 0,9% de BA; la
formulación D (-\times-) contiene la formulación B más 0,25% de
fenol; la formulación E (-+-) contiene 0,1 mg/ml (acetato 20 mM,
0,01% de F86, pH 5,5); la formulación F (-triángulo vacío-)
contiene la formulación E más 0,9% de BA; y la formulación G
(-\blacksquare-) contiene la formulación E más 0,25% de fenol.
La Figura 16 ilustra espectros de DC del UV
cercano de rhNGF en acetato 10 mM, NaCl 136 mM, pH 5,5.
La Figura 17 ilustra una comparación de espectros
de DC del UV cercano de rhNGF en presencia (línea continua) y
ausencia (línea punteada) de un 0,9% de alcohol bencílico, en
acetato 10 mM, NaCl 136 mM, pH 5,5, después de 24 horas a 25
grados C.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que el NGF formulado en tampón acetato
farmacéuticamente aceptable, desde pH 5 hasta pH 6,
como composición farmacéutica, tiene una estabilidad marcadamente
incrementado en estas composiciones. Las concentraciones de acetato
pueden oscilar desde 0,1 hasta 200 mM, más preferiblemente desde 1
hasta 50 mM, e incluso más desde 5 hasta 30 mM, y más
preferiblemente desde 10 hasta 20 mM. Una sal de acetato preferida
para potenciar la estabilidad y capacidad tamponante es el acetato
sódico. No obstante, pueden usarse otras sales de acetato
fisiológicamente aceptables, por ejemplo, el acetato potásico. Los
rangos de pH apropiados para la preparación de las
composiciones en ésta van desde 5 hasta 6, preferiblemente desde 5,4
hasta 5,9, más preferiblemente desde 5,5 hasta 5,8. Un pH
preferido es 5,5, el cual potencia la estabilidad y la capacidad
tamponante. En otra realización preferida es pH 5,8.
Una "cantidad farmacéuticamente efectiva" de
NGF se refiere a aquella cantidad que proporciona un efecto
terapéutico en diversos regímenes de administración. Las
composiciones en ésta se preparan conteniendo cantidades de factor
de crecimiento nervioso desde 0,07 mg/ml, más preferiblemente desde
0,08 mg/ml, más preferiblemente desde 0,09 mg/ml, y los más
preferiblemente desde 0,1 hasta 0,5 mg/ml. En una realización
preferida la concentración de factor de crecimiento nervioso es de
0,1 mg/ml.
Para el uso de estas composiciones en la
administración a pacientes humanos que padecen, por ejemplo,
neuropatías periféricas, estas composiciones podrían contener desde
aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 0,5 mg/ml de factor
de crecimiento nervioso, que corresponden a la cantidad de
dosificación actualmente contemplada para tal tratamiento. El factor
de crecimiento nervioso se tolera bien y pueden administrarse dosis
superiores si es necesario, tal como determinará el médico.
Opcional, pero preferiblemente, la formulación
contiene una sal farmacéuticamente aceptable, preferiblemente
cloruro sódico, y preferiblemente en concentraciones fisiológicas.
Se prefieren las concentraciones bajas, por ejemplo, menos de
aproximadamente 0,3 M hasta aproximadamente 0,05 M, preferiblemente
desde 0,16 M hasta 0,20 M de NaCl, más preferiblemente 0,13 hasta
0,15 M. En una realización preferida la concentración de cloruro
sódico es 136 mM. En otra realización preferida la concentración es
142 mM.
Opcionalmente, las formulaciones de la invención
pueden contener un conservante farmacéuticamente aceptable. En
algunas realizaciones, la concentración de conservante oscila desde
el 0,1 hasta el 2,0%, típicamente v/v. Los conservantes apropiados
incluyen aquéllos conocidos en la técnica farmacéutica. El alcohol
bencílico, el fenol, el m-cresol, el metilparabén, y el
propilparabén son los conservantes preferidos. El alcohol bencílico
es un conservante particularmente preferido que resulta en una
estabilidad potenciada del factor de crecimiento nervioso. Una
concentración de alcohol bencílico particularmente preferida es del
0,7 al 1,2%, más preferiblemente del 0,8 al 1,0%, con una
concentración particularmente preferida de 0,9%.
Opcionalmente, las formulaciones de la invención
pueden incluir un tensioactivo farmacéuticamente aceptable. Los
tensioactivos preferidos son detergentes no iónicos. Los
tensioactivos preferidos incluyen el Tween 20 y el ácido plurónico
(F68). El F68 es particularmente preferido para potenciar la
estabilidad del factor de crecimiento nervioso. Las concentraciones
de tensioactivo apropiadas son del 0,005% al 0,02%. Una
concentración preferida para el tensioactivo es el 0,01%. Los
tensioactivos se usan para minimizar la formación de partículas.
En una realización particularmente preferida, la
composición contiene una concentración de factor de crecimiento
nervioso de 0,1 mg/ml, una concentración de acetato sódico de 20 mM,
pH 5,5, una concentración de cloruro sódico de 136 mM, y una
concentración de alcohol bencílico del 0,9% (v/v).
En otra realización de la invención se
proporciona un equipo para la administración del factor de
crecimiento nervioso, el cual incluye un vial o receptáculo que
contiene una composición farmacéutica de la invención, la cual
comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva del factor de
crecimiento nervioso y un tampón farmacéuticamente aceptable que
contiene acetato. Un volumen preferido de vial es uno apropiado para
un uso con múltiples dosis - que permite la extracción repetida de
muestra. La estabilidad incrementada conseguida con las
formulaciones de la invención permite la formulación líquida de
múltiples dosis. Típicamente, un vial de múltiples dosis
proporcionará la formulación suficiente para proporcionar dosis
suficientes para un paciente durante un mes, preferiblemente durante
una semana. Por ejemplo, el volumen de composición generalmente
oscila desde 0,3 hasta 10,0 ml, y más preferiblemente desde 1,6
hasta 2,0 ml, dependiendo de la concentración de la dosis, la
frecuencia y la facilidad de uso. Por ejemplo, un volumen de 1,8 ml
es apropiado cuando se usan o 0,3 \mug/kg o 0,1 \mug/kg,
permitiendo respectivamente 7 ó 24 dosis. Cuando está presente un
componente sensible a la luz, tal como el alcohol bencílico, el vial
se protege de la luz intensa. Generalmente es suficiente con
almacenar el vial en un refrigerador a oscuras, o dentro de una caja
opaca. No obstante, las paredes del vial pueden incluir materiales
reductores de la transmisión de la luz. Por ejemplo, pueden usarse
viales translúcidos ambarinos o marrones, o un vial opaco. En las
realizaciones preferidas, el vial contiene una formulación de
múltiples dosis. Para una configuración de vial, una formulación
líquida de múltiples dosis seleccionada puede verterse en viales de
vidrio del Tipo I de 3 cc con un volumen de llenado de 1,8 ml. La
selección del tapón se basará en la compatibilidad de los diferentes
tipos de tapones con la formulación seleccionada.
Las composiciones de la invención se almacenan
típicamente a 2 a 8 grados C. Las formulaciones son estables a
numerosos ciclos de congelación-descongelación, tal
como se muestra en ésta.
En otra realización, la formulación se prepara
con las anteriores concentraciones de acetato. Un medio preferido de
preparar una formulación es dializar una solución a granel de factor
de crecimiento nervioso en el tampón de formulación final. Las
concentraciones finales de factor de crecimiento nervioso se
consiguen mediante el ajuste apropiado de la formulación con factor
de crecimiento nervioso sin tampón de formulación. También se
proporcionan procedimientos para la preparación de la composición de
la reivindicación 1, que comprenden los pasos de componer dicha
tampón que contiene factor de crecimiento nervioso y acetato.
También se proporcionan procedimiento para incrementar la
estabilidad del factor de crecimiento nervioso en una composición
farmacéutica que contiene factor de crecimiento nervioso como
principio activo, comprendiendo la incorporación de acetato en dicha
composición, en donde dicho acetato está presente en una cantidad y
pH efectivos para incrementar la estabilidad del factor de
crecimiento nervioso.
Las composiciones de ésta que incluyen formas
liofilizadas se preparan, en general, mezclando los componentes
usando técnicas de preparación de compuestos generalmente
disponibles y conocidas per se. De igual forma, se emplean
los procedimientos y equipamiento de liofilización estándares bien
conocidos en la técnica. Un procedimiento particular para preparar
una composición farmacéutica de factor de crecimiento nervioso de
ésta comprende el uso de factor de crecimiento nervioso,
preferiblemente rhNGF, purificado (de acuerdo con cualquier esquema
estándar de purificación de proteínas), en uno cualquiera de los
varios procedimientos de intercambio de tampón conocidos, tales como
filtración en gel o diálisis.
El factor del crecimiento nervioso ("NGF")
es una proteína homodimérica de un polipéptido de 120 aminoácidos,
que tiene efectos prominentes en el desarrollo de neuronas
sensoriales y neuronas simpáticas del sistema nervioso periférico.
El factor de crecimiento nervioso actúa a través de receptores de
superficie celular específicos, situados sobre neuronas que
responden, para apoyar la supervivencia neuronal, promover el
crecimiento de las neuritas, y potenciar la diferenciación
neuroquímica. Las acciones del factor de crecimiento nervioso están
acompañadas por alteraciones en las membranas neuronales, en el
estado de fosforilación de las proteínas neuronales, y en la
abundancia de ciertos mARN y proteínas que probablemente juegan un
papel en la diferenciación y función neuronal (Connolly et
al., J. Cell. Biol. 90:176-180 (1981);
Skaper y Varon, Brain Res. 197:379-389
(1980); Yu et al., J. Biol. Chem.
255:10481-10492 (1980); Haleoqua y Patrick,
Cell 22:571-581 (1980); Tiercy y Shooter,
J. Cell. Biol. 103:2367-2378 (1986)).
Las neuronas colinérgicas del cerebro anterior
también responden al factor de crecimiento nervioso y podrían
precisar del factor de crecimiento nervioso para apoyo trófico
(Hefti, J. Neurosci. 6:2155 (1986)). Más aún, la distribución
y ontogénesis del factor de crecimiento nervioso y su receptor en el
sistema nervioso central (SNC) sugieren que el factor de crecimiento
nervioso actúa como un factor neurotrófico derivado de la diana para
las neuronas colinérgicas del cerebro anterior basal (Korsching,
TINS pp. 570-573 (Nov/Dic 1986)).
Se conoce poco sobre los residuos aminoácidos del
factor de crecimiento nervioso necesarios para la interacción con el
receptor quinasa de tirosina trkA. Se observaron pérdidas
significativas de actividad biológica y unión al receptor con
homodímeros purificados de factor de crecimiento nervioso de humano
y de ratón, que representaban formas truncadas homogéneas
modificadas en los extremos amino- y
carboxi-terminal. La especie de 109 aminoácidos
(10-118)hNGF, resultante de la pérdida de los
9 primeros aminoácidos del extremo N-terminal y de
los dos últimos residuos del extremo C-terminal del
NGF humano recombinante purificado, es 300 veces menos eficiente
para desplazar el [^{125}I]NGF del ratón del receptor trkA
humano en comparación con el (1-118)hNGF. Es
de 50 a 100 veces menos activo para la supervivencia del ganglio de
la raíz dorsal y del ganglio simpático en comparación con el
(1-118)hNGF. El
(1-118)hNGF tiene una actividad de
autofosforilación de la quinasa de tirosinas trkA considerablemente
inferior. Una forma preferida es el factor de crecimiento nervioso
humano de 118 aminoácidos, el cual es más preferiblemente como
homodímero.
Las formulaciones de la invención incluyen la
neurotrofina pantrópica NGF pantrópico. El factor de crecimiento
nervioso pantrópico es una neurotrofina pantrópica que tiene una
secuencia de aminoácidos homóloga a la secuencia de aminoácidos del
factor de crecimiento nervioso, con dominios que confieren otras
especificidades de neurotrofina. En la realización preferida, los
dominios se sustituyen con residuos de factor de crecimiento
nervioso; es decir, se suprime cierto número de aminoácidos de la
secuencia del factor de crecimiento nervioso, y se sustituyen con un
número idéntico o similar de aminoácidos, que confieren una
especificidad adicional. Por ejemplo, se construye un factor de
crecimiento nervioso pantrópico con una sustitución D16A, la cual
confiere especificidad BDNF. Opcionalmente, se incluyen
sustituciones en la región pre-variable 1
(V18E+V20L+G23T) y en la región variable 4
(Y79Q+T81K+H84Q+F86Y+K88R). Alternativamente, las sustituciones en
la región pre-variable 1 pueden combinarse sólo con
sustituciones de un único aminoácido en la región variable 4; por
ejemplo, podrían construirse V18E+V20L+G23T y una de Y79Q, T81K,
H84Q, F86Y o K88R.
Se investigó la estabilidad química y física del
factor de crecimiento nervioso humano recombinante (NGF) en solución
acuosa entre 5 y 37ºC, en el rango de pH 4,2 a 5,8. La
estabilidad química del factor de crecimiento nervioso incrementó
con pH crecientes. En tampón succinato a pH 5,8, la
estabilidad física del factor de crecimiento nervioso disminuyó
debido a la agregación de proteínas. En base tanto a los datos de
estabilidad a 5ºC, como a estudios de degradación acelerada a 37ºC,
se halló que la formulación óptima era un tampón acetato a pH
5,8. La HPLC de fase inversa fue el principal procedimiento
indicativo de estabilidad, mostrando que la conversión de
Asn-94 a iso-Asp era la vía
principal de degradación a 5ºC. La cuantificación de la degradación
del NGF mediante cromatografía de intercambio catiónico estuvo
complicada por la reordenación de las variantes del monómero del
factor de crecimiento nervioso en varios dímeros mezclados a lo
largo del tiempo (intercambio de dímeros). El tratamiento de
muestras y controles con ácido diluido equilibró rápidamente la
distribución de monómero en los dímeros, permitiendo que se pudiera
cuantificar la degradación del factor de crecimiento nervioso en
ausencia de intercambio de dímeros.
Se evaluó la compatibilidad y estabilidad del
alcohol bencílico y el fenol con el rhNGF en dos formulaciones
líquidas para uso con múltiples dosis. Estas dos formulaciones
consisten en 0,1 mg/ml de proteína en acetato sódico 20 mM a
pH 5,5 y cloruro sódico 136 mM, con y sin un 0,01% de ácido
plurónico (F68) como tensioactivo. Las concentraciones finales de
alcohol bencílico y fenol en cada una de estas formulaciones fueron
respectivamente del 0,9 y 0,25%. Sobre la base a los datos de
estabilidad durante 12 meses, el rhNGF es más estable en estas
formulaciones con el alcohol bencílico que con el fenol. La
formulación de rhNGF conservada con alcohol bencílico con la
presencia de tensioactivo es tan estable como la formulación sin
adición de tensioactivo, indicando que la adición de F68 a la
formulación de múltiples dosis del rhNGF no es necesaria para el
propósito de estabilidad. Por tanto, se recomienda una formulación
consistente en 0,1 mg/ml de proteína en acetato 20 mM, NaCl 136 mM,
0,9% de alcohol bencílico, pH 5,5 para el rhNGF usado para
múltiples dosis en ensayos clínicos de la Fase III. Esta formulación
de múltiples dosis del rhNGF superó el ensayo de eficacia del
conservante de la USP y EP después de 6 meses a 5 grados C, y es tan
estable como la formulación líquida actual a 2 mg/ml. No obstante,
la formulación debería evitar la exposición a luz intensa debido a
la presencia de alcohol bencílico como conservante, el cual es
sensible a la luz.
En general, las composiciones podrían contener
otros componentes en cantidades que preferiblemente no detraigan de
la preparación de formas estables, líquidas o liofilizables, y en
cantidades apropiadas para una administración farmacéutica segura y
efectiva.
Con objeto de que otros materiales similares el
rhNGF sean proporcionados a personal sanitarios y pacientes, estos
materiales debe prepararse como composiciones farmacéuticas. Tales
composiciones deben ser estables durante períodos de tiempo
apropiados, deben ser aceptables por sí mismas para su
administración a humanos, y deben ser fácilmente producibles. Una
solución diseñada para su administración parenteral sería un ejemplo
de tal composición. Aunque en muchos casos las formulaciones de
soluciones farmacéuticas se proporcionan en forma líquida,
apropiadas para un uso inmediato, tales formulaciones parenterales
podrían proporcionarse también en forma congelada o liofilizada. En
el primer caso, la composición debe descongelarse antes de su uso.
La última forma se usa a menudo para potenciar la estabilidad del
agente medicinal contenido en la composición bajo una amplia
variedad de condiciones de almacenamiento, puesto que los
especialistas en la técnica reconocen que las preparaciones
liofilizadas son generalmente más estables que sus equivalentes
líquidas. Tales preparaciones liofilizadas se reconstituyen antes de
su uso mediante la adición de diluyente(s) farmacéuticamente
aceptables, tales como agua estéril para inyecciones o solución
salina fisiológica estéril, y similares.
Se cree que las formulaciones de factor de
crecimiento nervioso de la invención son útiles para promover el
desarrollo, mantenimiento, o regeneración de neuronas in
vivo, incluyendo las centrales (de cerebro y médula espinal),
periféricas (neuronas simpáticas, parasimpáticas, sensoriales, y
entéricas) y motoneuronas. En consecuencia, las formulaciones de
factor de crecimiento nervioso de la invención se utilizan en
procedimientos para el tratamiento de una variedad de enfermedades y
desórdenes neurológicos. En una realización preferida, las
formulaciones de la presente invención se administran a un paciente
para tratar desórdenes neuronales. En ésta, por "desórdenes
neuronales" se quiere significar desórdenes del sistema nervioso
central y/o periférico que están asociados con la degeneración o
lesión de neuronas. Los ejemplos específicos de desórdenes
neuronales incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad de
Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la corea de Huntington, la
apoplejía, el ALS, las neuropatías periféricas, y otras condiciones
caracterizadas por necrosis o pérdida de neuronas, sean centrales,
periféricas o neuronas motoras, además de tratar los nervios
lesionados debido a traumas, quemaduras, disfunción renal, lesión, y
los efectos tóxicos de agentes quimioterapéuticos usados para tratar
cáncer y SIDA. Por ejemplo, las neuropatías periféricas asociadas
con ciertas condiciones, tales como las neuropatías asociadas con
diabetes, SIDA, o quimioterapia, podrían tratarse usando la
formulación de la presente invención. Es útil también como un
componente de medios de cultivo para su uso en el cultivo de células
nerviosas in vitro o ex vivo.
En varias realizaciones de la invención, las
formulaciones del factor de crecimiento nervioso se administran a
pacientes en los que el sistema nervioso a sido dañado por trauma,
intervenciones quirúrgicas, apoplejía, isquemia, infecciones,
enfermedades metabólicas, deficiencias nutricionales, cáncer, o
agentes tóxicos, para promover la supervivencia o crecimiento de
neuronas, o en cualesquiera otras condiciones que se haya hallado
que son tratables con factor de crecimiento nervioso. Por ejemplo,
la formulación de factor de crecimiento nervioso de la invención
puede usarse para promover la supervivencia o crecimiento de
neuronas motoras que han sido lesionadas por trauma o intervención
quirúrgica. Las formulaciones de factor de crecimiento nervioso de
la invención pueden usarse también para tratar desórdenes de
neuronas motoras, tales como la esclerosis amiotrófica lateral
(enfermedad de Lou Gehrig), la parálisis de Bell, y varias
condiciones que implican atrofia muscular espinal o parálisis. Las
formulaciones de factor de crecimiento nervioso de la invención
pueden usarse para tratar desórdenes neurodegenerativos humanos,
tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson,
la epilepsia, la esclerosis múltiple, la corea de Huntington, el
síndrome de Down, la sordera nerviosa, y la enfermedad de Meniere.
Las formulaciones de factor de crecimiento nervioso de la invención
pueden usarse como potenciador del conocimiento, para potenciar el
aprendizaje, especialmente en demencias o traumas. La enfermedad de
Alzheimer, la cual ha sido identificada por los "National
Institutes of Aging" como responsable de más del 50% de las
demencias en personas ancianas, es también la cuarta o quinta causa
principal de muerte en americanos de más de 65 años de edad. Cuatro
millones de americanos de más de 85 años de edad (el segmento de
población de los Estados Unidos que crece más rápidamente) padecen
la enfermedad de Alzheimer. El veinticinco por ciento de todos los
pacientes con la enfermedad de Parkinson también padecen demencia
parecida a la enfermedad de Alzheimer. Y en aproximadamente el 15%
de los pacientes con demencia, coexisten la enfermedad de Alzheimer
y la demencia multi-infarto. La tercera causa más
común de demencia, después de la enfermedad de Alzheimer y la
demencia vascular, es el deterioro cognitivo debido a enfermedad
cerebral orgánica relacionada directamente con el alcoholismo, la
cual ocurre en aproximadamente el 10% de los alcohólicos. Sin
embargo, la anormalidad más consistente para la enfermedad de
Alzheimer, así como para la demencia vascular y el deterioro
cognitivo debido a enfermedad cerebral orgánica relacionada con el
alcoholismo, es la degeneración del sistema colinérgico que surge
desde el cerebro anterior basal (BF, basal forebrain) hasta
el córtex y el hipocampo (Bigl et al., en Brain
Cholinergic Systems, Eds. M. Steriade y D. Biesold, Oxford
University Press, Oxford, pp. 364-386 (1990)). Y hay
un cierto número de otros sistemas neurotransmisores afectados por
la enfermedad de Alzheimer (Davies, Med. Res. Rev. 3:221
(1983)). No obstante, el deterioro cognitivo, relacionado por
ejemplo con la degeneración del sistema neurotransmisor colinérgico,
no se limita a individuos que padecen demencia. Se ha observado
también en adultos y ratas adultas que, de otro modo, están sanos.
Los estudios que comparan los grados de deterioro del aprendizaje
con el grado de flujo sanguíneo cerebral cortical reducido en ratas
envejecidas muestran una buena correlación (Berman et al.,
Neurobiol. Aging 9:691 (1988)). En el alcoholismo crónico, la
enfermedad cerebral orgánica resultante, como la enfermedad de
Alzheimer y el envejecimiento normal, se caracteriza también por
reducciones difusas en el flujo sanguíneo cerebral cortical en
aquellas regiones en las que se originan las neuronas colinérgicas
(cerebro anterior basal) y hacia las que se proyectan (córtex
cerebral) (Lofti et al., Cerebrovasc. and Brain Metab.
Rev. 1:2 (1989)). Tales demencias pueden tratarse mediante la
administración de formulaciones de NGF de la invención.
Además, las formulaciones de factor de
crecimiento nervioso de la invención se usan preferiblemente para
tratar neuropatías, y especialmente la neuropatía periférica.
"Neuropatía periférica" se refiere a un desorden que afecta el
sistema nervioso periférico, los más a menudo manifestado como una o
una combinación de disfunción neuronal motora, sensorial,
sensorimotora o autónoma. La amplia variedad de morfologías
exhibidas por las neuropatías periféricas pueden adquirirse
genéticamente, pueden ser consecuencia de una enfermedad sistémica,
o pueden ser inducidas por un agente tóxico. Los ejemplos incluyen,
pero no se limitan a la neuropatía periférica diabética, la
neuropatía sensorimotora distal, o las neuropatías autónomas tales
como la movilidad reducida del tracto gastrointestinal o la atonía
de la vejiga urinaria. Los ejemplos de neuropatías asociadas con
enfermedades sistémicas incluyen el síndrome
post-polio; los ejemplos de neuropatías hereditarias
incluyen la enfermedad de
Charcot-Marie-Tooth, la enfermedad
de Refsum, la abetalipoproteinemia, la enfermedad de Tangier, la
enfermedad de Krebbe, la leucodistrofia metacromática, la enfermedad
de Fabry, el síndrome de Dejerine-Sottas; y los
ejemplos de neuropatías causadas por un agente tóxico incluyen
aquéllas causadas por el tratamiento con un agente quimioterapéutico
tal como la vincristina, el cisplatino, metotrexato, o
3'-azido-3'-desoxitimidina.
Se administra una dosis terapéuticamente efectiva
de una formulación de factor de crecimiento nervioso a un paciente.
En ésta, por "terapéuticamente efectiva" se quiere indicar una
dosis que produce los efectos para los cuales se administra. La
dosis exacta dependerá de la alteración a tratar, y podrá ser
averiguado por alguien especialista en la técnica usando técnicas
conocidas. En general, las formulaciones de factor de crecimiento
nervioso de la presente invención se administran a aproximadamente
0,01 \mug/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg por día.
Preferiblemente, desde 0,1 hasta 0,3 \mug/kg. Además, tal como se
conoce en la técnica, podrían ser necesarios ajustes para la edad,
así como para el peso corporal, estado de salud general, sexo,
dieta, tiempo de administración, interacción del fármaco, y gravedad
de la enfermedad, y se podrán averiguar mediante experimentación
rutinaria por aquéllos especialistas en la técnica. Típicamente, el
médico administrará las formulaciones de factor de crecimiento
nervioso de la invención hasta que se alcance una dosis que repare,
mantenga y, óptimamente, restablezca la función neuronal. El
progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante ensayos
convencionales.
Un "paciente", para los objetivos de la
presente invención, incluye tanto humanos como otros mamíferos. Por
tanto, los procedimientos son aplicables tanto a la terapia humana
como a las aplicaciones veterinarias.
Las formulaciones terapéuticas del factor de
crecimiento nervioso se preparan mezclando factor de crecimiento
nervioso, que tenga el grado de pureza deseado, con portadores,
excipientes y estabilizantes opcionales fisiológicamente aceptables
(Remington's Pharmaceutical Sciences). Los portadores,
excipientes y estabilizantes aceptables no son tóxicos para los
receptores en las dosis y concentraciones empleadas, y no
disminuirán significativamente la estabilidad del factor de
crecimiento nervioso en las formulaciones, tal como se enseña en
ésta. Tales compuestos incluyen antioxidantes, incluyendo el ácido
ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de
aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina de
suero, la gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales
como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como la histidina,
metionina, glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina;
monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo
glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como el EDTA;
azúcares alcohol tales como el manitol y sorbitol; contraiones
formadores de sales tales como el sodio; y/o tensioactivos no
iónicos tales como el Tween, Pluronics o PEG.
Las formulaciones del factor de crecimiento
nervioso a usar para administración in vivo deben ser
estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través
de membranas de filtración estériles. Ordinariamente, las
formulaciones del factor de crecimiento nervioso de la presente
invención se almacenarán en forma líquida a de 2 a 8 grados C. Las
formulaciones son apropiadas para almacenarlas congeladas, con
repetidos ciclos de descongelación y congelación.
Las composiciones terapéuticas del factor de
crecimiento nervioso generalmente se colocan en un contenedor que
tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de
solución intravenosa, o un vial que tiene un tapón horadable
mediante una aguja de inyección hipodérmica.
Opcionalmente, el factor de crecimiento nervioso
se combina o administra conjuntamente con otros factores
neurotróficos, incluyendo el NT-4/5, el
NT-3, y/o el BDNF, y se usa con otras terapias
convencionales para desórdenes nerviosos.
La administración de las formulaciones de la
presente invención puede hacerse mediante varias vías, incluyendo,
pero no limitándose a, oralmente, subcutáneamente, intravenosamente,
intracerebralmente, intranasalmente, transdérmicamente,
intraperitonealmente, intramuscularmente, intrapulmonarmente,
vaginalmente, rectalmente, o intraocularmente. Las formulaciones
pueden administrarse continuamente mediante infusión hacia el
interior de los espacios de fluidos del SNC, aunque la inyección de
un bolo es aceptable, usando técnicas bien conocidas en la técnica,
tales como bombas o implantes. En algunos casos, por ejemplo, en el
tratamiento de heridas, las formulaciones pueden aplicarse
directamente como solución o aerosol.
Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de
ilustración y no a modo de limitación. Los descubrimientos de todas
las citas en la especificación se incorporan expresamente en esta
por referencia.
El factor de crecimiento nervioso humano
recombinante (rhNGF) se produjo en células de ovario de hámster
chino, y se purificó mediante cromatografía de fase inversa
(RP-HPLC) y de intercambio iónico (IEC), tal como se
ha descrito previamente (8). Para RP-HPLC se usaron
acetonitrilo y TFA de categoría HPLC. Todos los otros productos
químicos eran de la categoría USP. Se compraron a Wheaton viales de
2 cc., de vidrio transparente, estériles, del Tipo I, y se usaron
con tapones de goma butílica, recubiertos con teflón y
siliconados.
El factor de crecimiento nervioso se dializó en
acetato sódico 10 mM, cloruro sódico 142 mM, a pH 5,0 y 5,8,
y en succinato sódico 10 mM, NaCl 142 mM, a pH 4,2, 5,0 y
5,8, y se ajustó a 10 mg/ml. También se añadió Tween 20 a una
formulación con succinato, pH 5,0, para determinar si el
tensioactivo reduciría la agregación del factor de crecimiento
nervioso (succinato sódico 10 mM, NaCl 142 mM, 0,05% Tween 20).
Los viales se llenaron asépticamente con 0,3 ml
de la formulación de factor de crecimiento nervioso y se almacenaron
a 5, 25 y 37ºC (los datos a 25ºC no se mencionan aquí). Los
controles se almacenaron a -70ºC, donde no se ha observado una
degradación significativa. A cada intervalo se retiraron alícuotas
de 50 \mul de los viales individuales y se almacenaron a -70ºC
hasta su análisis.
Análisis mediante HPLC. La HPLC de
intercambio catiónico (IEC) se realizó en un sistema HP 1090 usando
una columna Tosohas sulfopropil
TSK-SP-5PW (7,5 x 75 mm) con
partículas de 10 m. Las fases móviles fueron (A) fosfato sódico 10
mM, 5% (v/v) de acetonitrilo, pH 7,0, y (B) A + cloruro
amónico 1,0 M. El factor de crecimiento nervioso se eluyó a 35ºC
(0,5 ml/min) con un gradiente lineal de 20-40% de B
desde el minuto 5 hasta el minuto 60. El control y las muestras de
1,6 años a 5ºC también se ensayaron después de "tratamiento
ácido" para llevar a equilibrio la distribución de variantes de
monómero (8, 9). Estas muestras se ajustaron a pH 3,5 con HCl
y se incubaron a 37ºC durante 2 horas (los resultados a 2 y 4 horas
fueron equivalentes). Para HPLC de fase reversa
(RP-HPLC) se usó una columna YMC C4, 5 \mum (4,6 x
250 mm) en un sistema HP 1090 a 25ºC. El factor de crecimiento
nervioso se eluyó (0,5 ml/min) usando un gradiente lineal de
26-30% de B en A (B = 0,05% de TFA en acetonitrilo,
y A = 0,05% de TFA en agua) aplicado entre 5 y 40 minutos. La HPLC
de exclusión de tamaño (SEC-HPLC) se realizó usando
una bomba Bio LC de la Serie 410 de Perkin Elmer, con un detector de
UV espectrofotométrico Perkin Elmer LC 90, y una columna Tosohas TSK
2000 SWXL, 5 \mum (7,8 x 300 mm). Esta columna de SEC se utilizó a
0,5 ml/min usando como fase móvil fosfato potásico a 0,2 M, cloruro
potásico 0,45 M, a pH 7,0. Para SEC la detección UV fue a 280
nm; para RP-HPLC e IEC fue a 214 nm. En todos los
ensayos se inyectaron 50 mg de factor de crecimiento nervioso.
SDS-PAGE. Las muestras se
diluyeron en tampón de muestras SDS tricina Novex, y se incubaron
durante 1 horas a 50ºC. El SDS-PAGE no reductor se
realizó sobre geles de tricina Novex que contenían un 10% de
acrilamida, seguidos por tinción con Coomassie Blue. Los pesos
moleculares se estimaron usando marcadores de bajo peso molecular de
Bio-Rad.
Ensayo de crecimiento de neuritas. La
actividad biológica del factor de crecimiento nervioso se determinó
usando el ensayo PC12 desarrollado por Greene (10) y modificado tal
como describieron Schmelzer et al. (8).
Hemólisis. Se ensayó la actividad
hemolítica de todas las formulaciones. El procedimiento de hemólisis
fue el de Reed y Yalkowsky (11) excepto que, antes del análisis, se
incubaron volúmenes iguales de hematíes humanos lavados y de
formulación durante 30 minutos.
El desarrollo de formulación del factor de
crecimiento nervioso requiere que se hallen la condición para la
cual la proteína muestra \geq 1,5 años de estabilidad química y
física a 2-8ºC. Determinamos el pH aproximado
de máxima estabilidad del factor de crecimiento nervioso averiguando
la estabilidad del factor de crecimiento nervioso en tampón
succinato a pH 4,2, 5,0 y 5,8, y en tampón acetato a
pH 5,0 y 5,8. La estabilidad del factor de crecimiento
nervioso disminuye por encima de pH 6,0. Los ensayos usados
para medir la estabilidad de la proteína fueron IEC, SEC,
RP-HPLC, SDS-PAGE y el ensayo de
bioactividad PC12. La biocompatibilidad de la formulación se
determinó ensayando la hemólisis. La estabilidad del factor de
crecimiento nervioso a 37ºC.
Agregación del factor de crecimiento
nervioso. La constante de equilibrio dímero/monómero para el
factor de crecimiento nervioso de ratón se inferior a
10-13 M a pH 4-4 (6, 7, 9,
12). Por tanto, el factor de crecimiento nervioso se ensayó
principalmente como un dímero en el ensayo de SEC a pH
neutro. Se observó una pequeña cantidad de factor de crecimiento
nervioso agregado (tetrámero, sobre la base a estándares de peso
molecular) en la muestra de control. Este área del pico de tetrámero
incrementó con el tiempo de 37ºC. En este pico se observó un hombro
anterior, que indica agregados mayores, en todas las formulaciones
después de 38 días a 37ºC. Las dependencias con el tiempo de la
formación de agregados para las diversas formulaciones se muestran
en la Figura 1. La formulación de succinato a pH 5,8 tenía la
velocidad de agregación más elevada. Todas las otras formulaciones
tenían velocidades similares. La adición del tensioactivo Tween 20
no ofreció protección frente a la agregación en la formulación de
succinato a pH 5,0. La formulación del factor de crecimiento
nervioso en succinato a pH 5,8 se tuvo que filtrar a través
de un filtro de 0,22 mm de 47 mm de diámetro durante su preparación,
mientras que todas las otras formulaciones se podían filtrar a
través de un filtro de 25 mm. Esto es consistente con la elevada
velocidad de agregación observada a 37ºC en el tampón succinato a
pH 5,8.
La agregación también se monitorizó usando
SDS-PAGE no reducida (no se muestran los geles). En
las muestras control a -70ºC se observaron 3 bandas: monómero a 13,5
kDa, una banda de dímero muy débil a aproximadamente 26 kDa, y una
banda ligeramente más intensa a 31 kDa. Las bandas de 26 y 31 kDa
devinieron más intensas a partir de su incubación a temperaturas
elevadas. Después de 38 días a 37ºC, se observó una pequeña cantidad
de un agregado de elevado peso molecular (> 97 kDa) en todas las
formulaciones. La intensidad de esta banda fue mayor en la
formulación de succinato a pH 5,8, de forma consistente con
la pobre filtrabilidad y la elevada velocidad de agregación
observada mediante SEC para esta formulación. El Tween 20 impidió la
formación de este agregado de elevado peso molecular a pH
5,0. Con la excepción del succinato a pH 5,8, estos
procedimientos de determinación del tamaño no diferencian entre la
calidad de las formulaciones de factor de crecimiento nervioso.
Monómero de factor de crecimiento nervioso y
Cuantificación del Producto de Degradación. El factor de
crecimiento nervioso usado en estos estudios consistió en una
proporción de 1:9:1 de los tres polipéptidos monoméricos que
contenían 120, 118 y 117 aminoácidos. La variante de 118 aminoácidos
se produjo cortando la Ala120 y Arg119 del extremo
C-terminal del progenitor de 120; la variante de 117
tenía un corte adicional, Arg118 (8). A pH 5,0, la variante
117 tenía dos cargas positivas menos, y la variante 118 tenía una
carga positiva menos que la 120 progenitora. No hay una diferencia
significativa en la bioactividad de los homodímeros y de los
heterodímeros formados por las variantes 117, 118 y 120, tal como se
midió mediante los ensayos PC12 y de ganglio raí dorsal del pollo
(8). En la fase móvil de RP, orgánica, ácida, en la que el factor de
crecimiento nervioso se disocia en monómeros (8), el orden de
elución es 120 antes del 118, a continuación el 117. En la Figura 2
se muestran cromatogramas de RP-HPLC típicos para
factor de crecimiento nervioso almacenado en tampón succinato a
pH 5,0, durante 38 días, a -70ºC y 37ºC. A temperatura
elevada, disminuye el área de los picos definidos como factor de
crecimiento nervioso (la suma de los picos de monómeros 118 y 120),
mientras que crece el área de los picos de iso-Asp,
oxidado, y otros picos de degradación. El área del pico 117 no se
incluyó en la definición del factor de crecimiento nervioso debido a
la coelución de los productos de degradación con este pico a
temperaturas elevadas. La dependencia con el tiempo de la
degradación del factor de crecimiento nervioso a 37ºC, y las
constantes de velocidad de primer orden aparentes para esta
degradación, se muestran respectivamente en la Figura 3 y en la
Tabla 1.
La estabilidad del factor de crecimiento nervioso
disminuyó a medida que se disminuía el pH. En ambos, los
tampones acetato y succinato a pH 5,8, la estabilidad fue
superior a la de a pH 5,0. En el tampón de succinato a
pH 4,2, la velocidad degradación del factor de crecimiento
nervioso está aún más incrementada, observándose varios productos de
degradación hidrofóbica, posiblemente debido la corte inducido por
las condiciones ácidas del enlace Asp60-Pro61. El
Tween 20 no tuvo efecto alguno sobre la estabilidad del factor de
crecimiento nervioso en el tampón succinato a pH 5,0 (Figura
3). La formulación de acetato parece ser algo mejor para mantener la
estabilidad del factor de crecimiento nervioso.
Distribución de dímeros del factor de
crecimiento nervioso. Los tres monómeros del factor de
crecimiento nervioso conteniendo 117, 118 y 120 aminoácidos podrían
combinarse para formar los homodímeros 117/117, 118/188 y 120/120, y
los heterodímeros 117/118, 118/120 y 117/120. Se ha observado que la
asociación de estas variantes de factor de crecimiento nervioso es
aleatoria, sin que ningún monómero parezcan preferirse ninguno otro
(8, 9). La disociación y reasociación dinámica de monómeros para
formar varios dímeros (intercambio de dímero) son aceleradas por el
pH bajo y una temperatura aumentada (9). Para un proceso de
asociación aleatoria en equilibrio, y una proporción inicial de
117/118/120 de 1:9:1, el homodímero 118/118 será la especia de
homodímero dominante, formándose menores cantidades de los dímeros
117/118 y 118/120.
Los dímeros 118/118 y 117/120 tienen la misma
carga neta efectiva en la fase móvil de IEC escogida, y, por tanto,
coeluyen en la IEC durante la purificación del factor de crecimiento
nervioso. Los dímeros 117/120 y 118/118 se disocian dando lugar a
los monómeros 117 y 120, los cuales se reasocian más frecuentemente
con el monómero 118 para formar los dímeros 117/118 y 120/118.
Debido a las diferentes cargas sobre los monómeros, el orden de
elución esperado de estos dímeros en cromatografía de intercambio
catiónico es: 117/117 < 117/118 < 118/118 = 117/120 <
118/120 < 120/120.
Los dímeros más poblados se pueden distinguir
mediante IEC (8) tal como se muestra en la Figura 4.
Los cromatogramas de IEC representativos para el
factor de crecimiento nervioso a pH 5,0 en tampón succinato,
después de 38 días a -70ºC y 37ºC se muestran en la Figura 4.
Durante la producción de factor de crecimiento nervioso, una
fracción de los residuos serina N-terminales se
convierten a glicina sin efecto alguno sobre la actividad del factor
de crecimiento nervioso (13). El factor de crecimiento nervioso se
cuantifica en ésta como la suma del homodímero 118/118 y del dímero
118/118, con una conversión Ser1 a Gly1 en uno de los dos monómeros
(13) (y cualesquiera variantes 117/120 coeluyentes); las áreas de
los picos 117/118 y 118/120 no se incluyen debido a los productos de
degradación que coeluyen con estos picos. La velocidad de pérdida
del factor de crecimiento nervioso, tal como se monitorizó mediante
IEC a 37ºC, se muestra en la Figura 5. Las cinéticas de degradación
para el dímero 118 son multifásicas. La perdida en el área del pico
principal antes de 13 días es debida mayoritariamente a las
variantes de monómeros entre los posibles tipos de dímeros. Los
datos después de 13 días describen más precisamente la degradación
química del factor de crecimiento nervioso. La máxima estabilidad
del factor de crecimiento nervioso se da en las formulaciones de
acetato a pH 5,0 y 5,8, las cuales tienen estabilidades
similares. El factor de crecimiento nervioso en tampón succinato a
pH 5,8 y pH 5,0, con o sin un 0,05% de Tween 20, tiene
estabilidades similares. También se ensayó la actividad hemolítica
de cada una de las formulaciones de factor de crecimiento nervioso.
Ninguna de las formulaciones mostró una hemólisis de hematíes
significativa (< 0,1%). También se determinó la bioactividad del
factor de crecimiento nervioso en cada una de las formulaciones
usando el ensayo PC12 de extensión de neuritas. El factor de
crecimiento nervioso fue bioactivo en todas las formulaciones
después de 38 días a 37ºC. La elevada variabilidad entre ensayos
(aproximadamente un 50% de error) no permitió la determinación de
diferencias cuantitativas entre estas formulaciones.
Una formulación líquida para el factor de
crecimiento nervioso preferiblemente tiene una vida de
almacenamiento adecuada a 5ºC. Los datos de estabilidad acelerada a
37ºC mostraron que la máxima estabilidad del factor de crecimiento
nervioso se da en tampón acetato. Sobre la base de estos datos, se
investigó la estabilidad del factor de crecimiento nervioso en
formulaciones de acetato a pH 5,0 y 5,8 durante 1,6 años a
5ºC. Los cromatogramas de RP-HPLC a pH 5,0 de
las muestras control a -70ºC y a -5ºC se muestran en la Figura 6.
El principal producto de degradación fue la conversión de
Asp-93 a iso-Asp; se observaron
cantidades más pequeñas de oxidación de Met-37 y
Met-92. Las constantes de velocidad de primer orden
aparentes para la degradación del factor de crecimiento nervioso,
cuantificadas mediante RP-HPLC, son 1,4 x 10^{-4}
\pm 1,7 x 10^{-5} d-1 y 6,8 x 10^{-5} \pm
7,0 x 10^{-6} d-1 a pH 5,0 y 5,8
respectivamente. A 5ºC, la IEC muestra que la estabilidad del factor
de crecimiento nervioso es aproximadamente la misma a pH 5,0
y 5,8, consistente con los datos de IEC a 37ºC. La agregación de
dímeros del factor de crecimiento nervioso no fue una vía de
degradación significativa a 5ºC, sólo se observó un 1% de incremento
en agregados durante 1,6 años de almacenamiento a 5ºC.
La interpretación de los datos de IEC a ambos,
5ºC y 37ºC, está complicada por el intercambio de dímeros, siendo la
velocidad de intercambio más lenta a temperaturas más bajas. Para
mejorar la cuantificación mediante IEC, se llevó la distribución de
dímeros al equilibrio mediante la incubación a pH 3,5 durante
2 horas a 37ºC antes del análisis mediante IEC (8, 9, 12). No se
observaron nuevos productos de degradación después de este
tratamiento. Las muestras en acetato pH 5,8 después de 1,6
años de incubación a 5ºC se compararon con controles antes y después
del "tratamiento ácido" en la Figura 7. La pérdida de área del
pico principal respecto los picos periféricos, debida al intercambio
de dímeros, se eliminó mediante el tratamiento ácido, revelando la
verdadera degradación del factor de crecimiento nervioso. La
cuantificación después del tratamiento ácido mostró que el 94 y el
92% de los picos principales de factor de crecimiento nervioso
permanecían después de 1,6 años a 5ºC y a pH 5,0 y 5,8,
respectivamente, en comparación con el 84 y 87% sin tratamiento
ácido. En comparación, los análisis mediante RP-HPLC
mostraron que el 93 y 95% de los monómeros 118 y 120 del factor de
crecimiento nervioso permanecían respectivamente a pH 5,0 y
5,8.
Se mostró que la estabilidad química del factor
de crecimiento nervioso aumentaba con el pH, siendo el
pH de la estabilidad máxima próximo a pH 5.8. A un
pH determinado, los datos de RP-HPLC e IEC a
5 y 37ºC fueron consistentes en mostrar que la estabilidad química
del factor de crecimiento nervioso era mayor en tampón acetato que
en tampón succinato. Además, la agregación del factor de crecimiento
nervioso no fue una vía de degradación significativa, excepto a
pH 5,8 en tampón succinato. Un factor que complica la
determinación de la estabilidad del factor de crecimiento nervioso
es que el intercambio de dímeros contribuye a la degradación
aparente de los dímeros de factor de crecimiento nervioso tal como
se determinó mediante IEC. Puede obtenerse una representación más
precisa de la degradación química del factor de crecimiento nervioso
mediante pretratamiento de los controles y muestras con ácido a 37ºC
para llevar la distribución de dímeros al equilibrio. Tomados
conjuntamente, estos datos muestran que la formulación óptima y las
condiciones de almacenamiento para la estabilidad del factor de
crecimiento nervioso son el tampón acetato a pH 5,8, con
almacenamiento a 5ºC.
Los resultados de los ensayos clínicos de la Fase
II indican que los pacientes con enfermedad de neuropatía periférica
requieren tres dosis por semana de rhNGF a 0,3 o 0,1 \mug/kg. Esto
quiere decir que sólo se necesitan 21 ó 7 \mug de rhNGF por dosis
para un paciente promedio con un peso corporal de 70 kg. Usando la
formulación actual de rhNGF (2 mg/ml en acetato sódico 10 mM,
pH 5,5, NaCl 142 mM) y una configuración de vial (0,7 ml por
vial) se hubiera desperdiciado mucha cantidad de fármaco. Por tanto,
se requiere una nueva formulación de rhNGF en baja concentración,
preferiblemente una configuración de múltiples dosis, para reducir
el coste y el desperdicio del producto. El propósito de este estudio
fue desarrollar una formulación líquida de múltiples dosis y estable
para el rhNGF a 0,1 mg/ml, con 1,8 ml de relleno en viales de vidrio
de 3 cc para su uso en ensayos clínicos de la Fase III. Con esta
nueva configuración, cada vial proporcionará 180 \mug de proteína
y proporcionará al menos 7 dosis al el nivel de dosis elevado (0,3
\mug/kg) y 24 dosis al nivel de dosis bajo (0,1 \mug/kg).
En este estudio se presentan los resultados sobre
la compatibilidad y estabilidad de las formulaciones líquidas, a
pH 5,5, de múltiples dosis de rhNGF a 0,1 mg/ml que contienen
conservante. También se estudió una comparación entre la estabilidad
de las nuevas formulaciones líquidas de múltiples dosis, con rhNGF a
0,1 mg/ml, y la formulación actual con rhNGF a 2 mg/ml. También se
presentaron los estudios sobre agitación, congelación y
descongelación, y compatibilidad con la luz de las principales
formulaciones líquidas de múltiples dosis para rhNGF a 0,1
mg/ml.
En este estudio se usó una preparación a granel
concentrada de rhNGF formulada a 11,6 mg/ml en acetato sódico 10 mM,
cloruro sódico 142 mM, a pH 5,5, con 20 ml en viales de
vidrio de 100 cc. Todos los reactivos químicos y materiales usados
en este ejemplo se listan en la Tabla 2.
| Lista de materiales |
| - Preparación a granel, concentrada, de rhNGF, 11,6 mg/ml, en acetato sódico 10 mM, cloruro sódico 142 mM, |
| \hskip1.5mm a pH 5,5 |
| - Acetato sódico trihidratado, Genentech, Código de materiales puestos a la venta: G20136, Lote #S0766 |
| - Ácido acético glacial, Código de materiales puestos a la venta: G20027-01, Lote S0567 |
| - Cloruro sódico, Código de materiales puestos a la venta: G20136, Lote S1152 |
| - Alcohol bencílico, Código de materiales puestos a la venta: G20226, Lote C0200 |
| - m-cresol, Sigma, Lote 107F-3497 |
| - Metilparabén, Napp Chemical Inc., Lote LM 86-6285 |
| - Propilparabén, Napp Chemical Inc., Lote LM 86-6241 |
| - Fenol, Código de materiales puestos a la venta: G20136, Lote 620015, Lote B0901 |
| - Polisorbato 20, Código de materiales puestos a la venta: G20091, Lote A1408 |
| - Ácido plurónico (F68), Código de materiales puestos a la venta: GXXXX, Lote XXXX |
| - Viales de vidrio claro del Tipo I, de 3 cc, no siliconados, libres de pirógenos, estériles (Wheaton Tubing |
| \hskip2mm Products); preparados en la Fase V mediante procedimientos estándares. |
| - Tapones de goma Purcoat, de 13 mm, estériles, de fabricación clínica, Genentech, Inc. |
| - Cubretapones desplegables de aluminio, de 13 mm, de fabricación clínica, Genentech, Inc. |
Preparación de formulaciones líquidas de
múltiples dosis de rhNGF. La preparación a granel concentrada de
rhNGF se dializó en un tampón de formulación consistente en acetato
sódico 20 mM, cloruro sódico 136 mM, a pH 5,5, mediante
ultrafiltración, usando un concentrador Centriprep™ de Amicon, con
peso molecular de corte de 10.000 kDa. Esta preparación a granel de
rhNGF reformulada se diluyó a continuación hasta 0,15 mg/ml usando
el mismo tampón de formulación que para la diálisis. Los
conservantes y tensioactivos usados en los estudios de verificación
de compatibilidad y desarrollo de la formulación se añadieron a esta
solución de rhNGF diluido en sus concentraciones de ensayo. A
continuación se ajustó la concentración de proteína a 0,1 mg/ml,
para cada formulación, mediante análisis con UV, usando la
formulación de tampón apropiada. En la Tabla 3 se proporciona una
lista de conservantes y sus concentraciones usadas para la
compatibilidad física con el rhNGF en formulaciones líquidas.
| Tampón de la formulación | Tensioactivo | Conservante |
| acetato 20 mM, pH 5,5, | ninguno | 0,9% de alcohol bencílico |
| NaCl 136 mM | 0,25% de fenol | |
| 0,45% de fenol | ||
| 0,25% de m-cresol | ||
| 0,18% de metilparabén | ||
| 0,02% de propilparabén | ||
| acetado 20 mM, pH 5,5, | 0,01% de Tween 20 | 0,9% de alcohol bencílico |
| NaCl 136 mM | 0,25% de fenol | |
| 0,45% de fenol |
| Tampón de la formulación | Tensioactivo | Conservante |
| 0,25% de m-cresol | ||
| 0,18% de metilparabén | ||
| 0,02% de propilparabén | ||
| acetato de 20 mM, pH 5,5, | 0,01% de F68 | 0,9% de alcohol bencílico |
| NaCl 136 mM | 0,25% de fenol | |
| 0,45% de fenol | ||
| 0,25% de m-cresol | ||
| 0,18% de metilparabén | ||
| 0,02% de propilparabén |
Todas las preparaciones líquidas de múltiples
dosis de rhNGF preparadas se esterilizaron mediante filtración a
través de un filtro de 0,22 \mum antes de verterlas. Todas las
formulaciones se vertieron asépticamente en viales Wheaton de
vidrio, del Tipo I, de 3 cc, con un volumen de llenado de 1,8 ml.
Los viales se taparon con tapones Purcoat de 13 mm, y se sellaron
con cubretapones de aluminio de 13 mm.
Para el estudio de verificación de conservantes,
las muestras se almacenaron a temperatura ambiente durante 24 horas
para determinar su compatibilidad física. Para el estudio de
desarrollo de formulación, las muestras se almacenaron a -70, 5, 25
y 40ºC. En cada intervalo de tiempo se ensayó una
muestra/formulación/temperatura.
Los estudios de agitación se realizaron a
temperatura ambiente con la formulación de rhNGF de 2 mg/ml actual,
las formulaciones de múltiples dosis que contenían 0,9% de alcohol
bencílico o 0,25% de fenol en ausencia de tensioactivo, y el control
de rhNGF a 0,1 mg/ml que no contiene tensioactivo ni conservante. Se
fijó un vial de 3 cc de cada formulación ensayada a un agitador de
sobremesa para laboratorio (Glas-Col) y se agitó a
80 r.p.m. durante 6 y 24 horas. Las muestras recogidas después de 6
y 24 horas de agitación se ensayaron mediante
SE-HPLC, RP-HPLC, ELISA y RRA.
Los ciclos de congelación y descongelación se
realizaron con las mismas formulaciones usadas para los estudios de
agitación. Se colocó Un vial de cada formulación ensayada en un
congelador a -70ºC, y se dejó congelar durante 24 horas.
Transcurridas 24 horas de congelación, se descongelaron las muestras
a 5ºC durante 24 horas. Este procedimiento de congelación y
descongelación se repitió hasta 3 veces. Las muestras recogidas la
final del tercer ciclo se ensayaron mediante
SE-HPLC, RP-HPLC, ELISA y RRA.
El efecto de la luz sobre la estabilidad del
rhNGF se estudió sobre las mismas formulaciones usadas en los
estudios de agitación. Se colocó un vial de cada formulación en una
caja de luz (Forma Scientific, Modelo 3890) bajo luz fluorescente
intensa durante 5 semanas. También se colocaron en la caja de luz
viales de control recubiertos con papel de aluminio. La intensidad
de luz fue de 20.000 lux, la cual era aproximadamente de
15-20 veces la intensidad de la luz fluorescente del
laboratorio, y la temperatura de la caja de luz se mantuvo a 28ºC.
Las muestras se ensayaron a las 2 y 5 semanas mediante
SE-HPLC, ELISA y RRA.
A. Análisis mediante UV. La concentración
de rhNGF se determinó barriendo desde 240 hasta 360 nm usando un
espectrofotómetro de UV-visible HP 8452A. El tampón
de formulación se usó como una referencia para calibrar el
instrumento, y la concentración de proteína en mg/ml se calculó a
partir de (A280-A320)/1,5, en donde 1,5 es el
coeficiente de extinción del rhNGF en ml/(mg.cm).
B. Análisis mediante HPLC. Se usaron los
siguientes procedimientos de HPLC,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
C. ELISA. Este ensayo, con un rango de
0,39-6,25 ng/ml, fue realizado por Immunoassay
Services (Procedimiento de Ensayo con Código SNGF:1 de Genentech,
Inc.). Cada muestra de rhNGF se diluyó en diluyente de ensayo hasta
dos concentraciones finales de 5 y 2,5 ng/ml, y cada dilución se
envió en tubos micrónicos por triplicado. La concentración de
proteína en mg/ml se normalizó respecto un estándar de referencia
interna de -70ºC, el cual se envió para el mismo ensayo.
D. Ensayo de radioreceptor (RAA). Este
ensayo mide la capacidad del rhNGF no marcado para competir con el
^{125}I-rhNGF por la unión al receptor sobre
células PC-12. Este ensayo fue realizado por el
Bioassay Service (Genentech, Inc. Procedimiento de Ensayo SNGF:6) y
tiene un rango de 3-80 ng/ml. Cada muestra de rhNGF
se diluyó en diluyente de ensayo hasta dos concentraciones finales
de 25 y 12,5 ng/ml, y cada dilución se envió en tubos micrónicos por
duplicado. La concentración de proteína en mg/ml se normalizó
respecto un estándar de referencia interna de -70ºC, el cual se
envió para el mismo ensayo.
E. Bioensayo de supervivencia celular de
PC-12. Este ensayo determina la capacidad del
rhNGF para unirse a sus receptores y generar señales intracelulares
que resulten en la supervivencia de células PC-12 en
condiciones de cultivo sin suero. Este ensayo fue realizado por el
Bioassay Service (Procedimiento de Ensayo SNGF:7) y tiene un rango
de 0,24-30 ng/ml. La concentración de proteína
activa en mg/ml se normalizó respecto un estándar de referencia
interna de -70ºC, el cual se envió para el mismo ensayo.
F. Inspección visual. La inspección visual
se realizó con todas las formulaciones en viales en el momento del
muestreo. Se observó la claridad, el color, la opalescencia, y la
formación de partículas de la solución.
G. Determinación del pH. El
pH de todas las formulaciones se determinó en cada intervalo
de tiempo usando un radiómetro (Modelo PHM82, Radiometer America,
Inc.) y un microelectrodo (Modelo M1-410,
Microelectrodes, Inc.). Las soluciones estándar a pH 4,0 y
pH 7,0 se usaron para la estandarización y calibración del
radiómetro antes de la medición del pH.
H. Ensayo de efectividad del conservante.
Las principales formulaciones líquidas de múltiples dosis del rhNGF
que eran estables a 5ºC durante 6 meses, se enviaron a Northview Lab
para un ensayo de desafío bacteriano basado en criterios estándares
de las USP y EP.
I. Análisis de dicroísmo circular (CD). Se
usó un espectropolarímetro AVIV® Modelo 60 DS, equipado con baño de
agua y procesador de datos, para medir el dicroísmo circular. Las
mediciones se hicieron a 20ºC. Se usaron cubetas de cuarzo de 1,0 cm
de longitud de paso de célula para medir el CD en el UV cercano. El
espectro de CD se tomó a intervalos de 0,2 nm, con un ancho de banda
de 0,5 nm, y un tiempo de promedio de 3,0 segundos. Cada muestra
para medición del CD se analizó continuamente durante 24 horas. Los
datos de CD se expresan como la elipticidad residual promedio [q],
grados\cdotcm^{2}/decimoles, usando el peso residual promedio de
120 para el rhNGF.
Primero se realizó un estudio de verificación de
conservantes para examinar la compatibilidad física de varios
conservantes, comúnmente usados, con el rhNGF a 0,1 mg/ml en la
formulación de acetato sódico 20 mM a pH 5,5. Estos
conservantes incluyen el alcohol bencílico, el fenol, el
m-cresol, el metilparabén, y el propilparabén. Además,
también se estudió la compatibilidad física de estos conservantes
con el rhNGF, en la formulación de acetato, con la presencia de
tensioactivos tales como el polisorbato 20 y el ácido plurónico
(F68). Los resultados de compatibilidad física se muestran en la
Tabla 4.
\newpage
Entre los conservantes usados en la verificación,
todos son físicamente compatibles con el rhNGF a 0,1 mg/ml en
formulación de acetato a pH 5,5. En presencia de polisorbato
20 al 0,01% en la misma formulación, sólo el alcohol bencílico y el
fenol a una concentración final de, respectivamente, 0,9% y 0,25%,
fueron físicamente compatibles con el rhNGF. El fenol a 0,45% y el
m-cresol a 0,25% formaron cada uno de ellos una solución
turbia con el rhNGF en la formulación de acetato en presencia de
polisorbato 20. La solución de rhNGF también devino ligeramente
opalescente a partir de la adición de metilparabén al 0,18%, o de
propilparabén al 0,02%, a la formulación de acetato que contenía
polisorbato 20. Por otra parte, el ácido plurónico al 0,01% en la
misma formulación no causó ninguna incompatibilidad física entre el
rhNGF y todos los conservantes ensayados.
Sobre la base de los resultados del estudio de
verificación de conservantes, se prepararon varias formulaciones
líquidas de múltiples dosis de rhNGF conteniendo, bien 0,9% de
alcohol bencílico o 0,25% de fenol en acetato 20 mM a pH 5,5,
con y sin 0,01% de F68, para el estudio de estabilidad a largo
plazo. En la Tabla 5 se proporciona una lista de estas
formulaciones.
La estabilidad del rhNGF en estas formulaciones
se ensayó mediante las técnicas siguientes: SE-HPLC,
RP-HPLC, IE-HPLC, ELIDA, ensayo de
radioreceptores (RAA), bioensayo de supervivencia celular con
PC-12, pH, e inspección visual. La
aceptabilidad de una formulación líquida de múltiples dosis para el
rhNGF se basará en la comparación de la formulación líquida actual,
la cual consiste en 2 mg/ml de rhNGF en acetato sódico 10 mM a
pH 5,5, y cloruro sódico 142 mM. Por otra parte, la
formulación de conservada debería ser tan estable como la
formulación líquida actual. Los resultados obtenidos hasta la fecha
representan datos de monitorización de la estabilidad durante 12
meses a -70 y 5ºC, durante 9 meses a 25ºC, y durante 3 meses a
40ºC.
\newpage
Cromatografía de exclusión por tamaño. Se
empleó la HPLC de exclusión por tamaño para detectar y cuantificar
la formulación de agregados en las formulaciones líquidas de
múltiples dosis del rhNGF, así como en sus formulaciones control,
las cuales no contienen conservante. Usando esta técnica, el rhNGF
eluye como un dímero (pico principal) con un tiempo de retención de
8,6 minutos. El alcohol bencílico y el fenol eluyen respectivamente
a los 16 y 19 minutos. La aparición de un hombro precediendo la pico
principal de dímero indica la presencia de agregado de peso
molecular más elevado. Los datos en la Tabla 6 muestran que el rhNGF
es estable para la formación de agregados en todas las formulaciones
que contienen un 0,9% de alcohol bencílico como conservante.
Se detectó una pequeña cantidad de agregado
(menos del 1%) en las formulaciones que contenían fenol (con y sin
0,01% de F68 como tensioactivo) después de 3 meses a 40ºC y 9 meses
a 5ºC. En la Tabla 7 se proporción la proteína total recuperada a
partir de estas muestras, comparada con sus controles a -70ºC.
La formulación actual, las formulaciones control
y las formulaciones que contenían alcohol bencílico tuvieron un 99%
o más de recuperación de proteína después de 9 meses a 25ºC,
mientras que las formulaciones que contenían fenol tuvieron un 97%
para el mismo tiempo de almacenamiento y temperatura. Estos
resultados indican que el rhNGF es más compatible y estable con el
alcohol bencílico que con el fenol en todas las formulaciones
estudiadas.
HPLC de fase inversa. El rhNGF usado en
este estudio consiste principalmente de homodímero 118/118 y de una
pequeña cantidad de homodímero 120/120. Bajo las condiciones de
cromatografía de fase inversa, las dos formas diméricas se disocian
y sus monómeros se separan. La RP-HPLC separa los
monómeros de rhNGF basándose en la hidrofobicidad de cada especie.
El monómero 118, el cual es más hidrofóbico que el monómero 120,
eluye con un tiempo de retención de 23 minutos. El monómero 120
eluye como un pico pequeño delante del pico de monómero 118. La
comparación de los cromatogramas de RP-HPLC del
rhNGF en la formulación conservada con alcohol bencílico que no
contiene tensioactivo a 5, 25 y 40ºC se muestran en la Figura 8. La
degradación del rhNGF almacenado a temperaturas elevadas se debió
principalmente a la formación de iso-aspartato,
disminución en las áreas de los picos de monómero de 118 y 120, la
formación de cortes y el incremento en rhNGF plegado
incorrectamente, tal como se determinó mediante
RP-HPLC. Los picos de rhNGF mono- y
di-oxidados, y el pico de rhNGF desamidado
permanecieron inalterados. En este estudio, el rhNGF se define como
la suma de las áreas de los picos de monómero 118 y 120 mediante
RP-HPLC, y los resultados se dan como porcentaje de
rhNGF que permanece en comparación con los controles a -70ºC.
La disminución en el porcentaje de proteína que
permanece, debida a la disminución en las áreas de los picos de
monómero 118 y 120 ensayada mediante RP-HPLC, es la
degradación principal del rhNGF en la formulación líquida. A 5ºC, la
estabilidad del rhNGF en las formulaciones de múltiples dosis, tal
como se determinó mediante RP-HPLC, es esencialmente
equivalente a las formulaciones control no conservadas, así como a
la de la formulación actual (permanece más del 95% del rnNGF después
de 12 meses), excepto para la formulación conservada con fenol que
contenía un 0,01% de F68 (Figura 9). Esta formulación tenía un
porcentaje ligeramente inferior de rhNGF restante (93%) después de
12 meses a 5ºC. A 25ºC, el rhNGF es claramente menos estable en
presencia de un 0,25% de fenol que en presencia de un 0,9% de
alcohol bencílico como conservante en la formulación de acetato
sódico 20 mM a pH 5,5 (Figura 10). La combinación de fenol y
F68 en la formulación de acetato causó más degradación de la
proteína que la presencia de fenol solo.
La formación de iso-aspartato del
rhNGF en la forma líquida depende del tiempo y de la temperatura. La
velocidad de formación de iso-aspartato incrementa
con el aumento en tiempo y temperatura. A 5ºC, todas las
formulaciones muestran una velocidad similar de formación de
iso-aspartato (Figura 11). Había aproximadamente un
1,5% de iso-aspartato formado en todas las
formulaciones de múltiples dosis del rhNGF, y sus formulaciones
control no conservadas, después de 12 meses a 5ºC. No obstante, la
velocidad de formación del iso-aspartato es
ligeramente mayor en las formulaciones de rhNGF conservadas con un
0,9% de alcohol bencílico que en las formulaciones control y en las
formulaciones conservadas con fenol almacenadas a 25ºC (Figura 12).
Puesto que la formación de iso-aspartato del rhNGF
no afecta la bioactividad de la proteína, el efecto del conservante
sobre la formación del iso-aspartato del rhNGF no es
una preocupación principal.
Cromatografía de intercambio catiónico.
Los cromatogramas de IE-HPLC para el rhNGF en la
formulación actual, después de 3 meses a 5, 25 y 40ºC, se muestran
en la Figura 13. Se observan tres picos principales. El pico
predominante es el dímero 118/118 (pico b) el cual eluye a
aproximadamente los 48 minutos. El pico c detrás del pico principal
procede de una sustitución de serina a glicina en la posición 1 en
una de las dos cadenas diméricas. El pico a por delante del pico
principal se cree que es el 118/188 oxidado y el rhNGF cortado
N-terminalmente y oxidado. A temperaturas elevadas
(25 y 40ºC), la degradación del rhNGF, tal como se determina
mediante IE-HPLC, se caracteriza por la disminución
en las áreas de los picos del pico principal 118/118 y del dímero
118/118 con la sustitución de serina a glicina, y el incremento en
el área del pico a. En este estudio, el rhNGF se define como la suma
de las áreas de los picos de dímero 118/118 (pico b) y de dímero con
sustitución de serina a glicina en una cadena (pico c), mediante
IE-HPLC, y los resultados de proporcionan como
porcentaje de rhNGF que permanece en comparación con los controles a
-70ºC.
Las Figuras 14 y 15 muestran el porcentaje de
rhNGF que permanece en todas las formulaciones de rhNGF, mediante
IE-HPLC, respectivamente después de 12 meses a 5ºC y
9 meses a 25ºC. A 5ºC, el área de pico de los picos b y c para todas
las formulaciones de rhNGF permaneció inalterada después de 12
meses. A 25ºC, todas las formulaciones de rhNGF mostraron una
velocidad de degradación similar, y no hubo una diferencia
significativa en estabilidad entre las formulaciones de múltiples
dosis y las formulaciones de control, tal como se ensayó mediante
IE-HPLC.
ELISA. Los datos en la Tabla 8 muestran el
porcentaje de rhNGF que permanece a 5, 25 y 40ºC después de,
respectivamente, 12, 9 y 3 meses de almacenamiento.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los resultados se normalizaron respecto los
controles de -70ºC almacenados a la misma temperatura durante el
mismo período de tiempo. No hubo una diferencia significativa entre
la formulación conservada con alcohol bencílico y la conservada en
fenol, tanto en presencia como en ausencia de un 0,01% de F68 como
tensioactivo, para todas las temperaturas e intervalos de tiempo
estudiados.
Ensayo de actividad de unión de radioreceptor
(RAA). Los resultados de RAA se presentan en la Tabla 9 y están
normalizados respecto los controles a -70ºC.
En ausencia del 0,01% de F68 en la formulación de
acetato a pH 5,5, la formulación conservada con fenol tenía
menos porcentaje de proteína restante que ambas, la formulación
conservada con alcohol bencílico y la formulación control para todas
las temperaturas estudiadas. En presencia del 0,01% de F68 en la
formulación de acetato a pH 5,5, el rhNGF en la formulación
conservada (con alcohol bencílico o fenol) y en la control había
perdido aproximadamente un 20% de su bioactividad a 25 y 40ºC
después de, respectivamente, 9 y 3 meses. Estos resultados sugieren
que el fenol y el F68 pueden afectar la capacidad del rhNGF para
unirse al receptor del NGF sobre células PC-12. Por
tanto, el alcohol bencílico al 0,9% es la mejor elección para el
rhNGF en la formulación de acetato que no contiene tensioactivo para
el propósito de múltiples usos.
Bioensayo de supervivencia de células
PC-12. En contraste con los resultados de RAA,
los datos del bioensayo de supervivencia de células
PC-12 en la Tabla 10 muestran que no hay una
diferencia significativa en la potencia del rhNGF en todas las
formulaciones almacenadas a 5ºC durante 12 meses y a 25ºC durante 9
meses.
Se halló que la proteína era totalmente activa en
todas las formulaciones, tal como se determinó en este bioensayo.
Por tanto, el ensayo de unión del radioreceptor es un ensayo que más
indicador de la estabilidad que el bioensayo de supervivencia de
células para la bioactividad del rhNGF.
Las soluciones de todas las formulaciones del
rhNGF eran claras y carecían de color a simple vista (Tabla 11). No
se observaron partículas en ninguna de las formulaciones a todas las
temperatura e intervalos de tiempo.
Resultados de pH. el rhNGF
formulado en acetato 10 mM, cloruro sódico 142 mM, a pH 5,0 o
a pH 5,8, tuvo un incremento en el pH de 0,2 unidades
durante el estudio de estabilidad. Las formulaciones de múltiples
dosis y sus formulaciones control usadas en este estudio se
formularon en acetato 20 mM a pH 5,5, el cual debería
proporcionar una mayor capacidad tamponante para impedir el cambio
de pH. La Tabla 11 muestra que el pH permaneció
inalterado para todas las formulaciones estudiadas.
Ensayo de efectividad del conservante.
Después de 6 meses de estudio de estabilidad, la formulación de
múltiples dosis más estable para el rhNGF, la cual consiste en 0,1
mg/ml de rhNGF en acetato 20 mM, a pH 5,5, cloruro sódico 136
mM, y alcohol bencílico 0,9%, se envió para ensayar la eficacia del
conservante. Esta formulación líder superó tanto los ensayos de la
USP como de la EP (criterios A y B) después de 6 meses de
almacenamiento a 5ºC.
Análisis de dicroísmo circular (CD). La
presencia de un 0,9% de alcohol bencílico en varias formulaciones
líquidas de interferón gamma (rhIFN-g) induce una
pérdida en las señales de dicroísmo circular en la región del UV
cercano. La señal de CD de UV cercano del rhIFN-g
desapareció antes de 24 horas, indicando que había un cambio en la
estructura terciaria de la proteína debido a la presencia de alcohol
bencílico. No obstante, este fenómeno no se observó en la
formulación de rhNGF conservada con un 0,9% de alcohol bencílico.
Transcurridas 24 horas desde la adición del conservante, el espectro
de CD del ultravioleta cercano permaneció inalterado, sugiriendo que
no hay interacción entre el rhNGF y el alcohol bencílico en la
formulación de acetato a pH 5,5. La Figura 16 muestra el
espectro de CD del ultravioleta cercano del rhNGF, y la Figura 17
compara el espectro de CD del ultravioleta cercano del rhNGF en
presencia y ausencia de alcohol bencílico después de 24 horas a
25ºC. Debido a la interferencia del alcohol bencílico a longitudes
de onda inferiores a 275 nm, el espectro de CD del rhNGF se adquirió
desde 325 nm hasta 275 nm cuando la muestra contenía el
conservante.
\newpage
1. Estudios con agitación. Los estudios
con agitador se realizaron para determinar si es necesario añadir
tensioactivo (F68) en las formulaciones de múltiples dosis del rhNGF
a concentraciones bajas de proteína, tales como 0,1 mg/ml, con
objeto de prevenir la agregación de proteína y mantener la claridad
visual de las soluciones durante la agitación. Los datos de la Tabla
12 muestran que el rhNGF a 0,1 mg/ml en la formulación de acetato 20
mM a pH 5,5 (con o sin conservante) es bastante estable a
alteraciones mecánicas tales como la agitación. Esto sugiere que el
tensioactivo no es necesario en la formulación del rhNGF a 0,1 mg/ml
con propósitos de estabilidad en formas líquidas de múltiples
dosis.
2. Estudios de
congelación-descongelación. Los resultados sobe
el efecto de la congelación y descongelación sobre la estabilidad de
las formulaciones líquidas de múltiples dosis de 1 mg/ml rhNGF se
presentan en la Tabla 13.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Después de 3 ciclos de congelación y
descongelación, el rhNGF a 0,1 mg/ml en la formulación de acetato 20
mM a pH 5,5 como control, y las dos formulaciones de
múltiples dosis que contenían o un 0,9% de alcohol bencílico o 0,25%
de fenol, no mostraron ninguna disminución en la estabilidad de la
proteína. Después de 3 ciclos de congelación y descongelación entre
-70ºC y 5ºC, son tan estables como la formulación líquida actual
de rhNGF a 2 mg/ml.
3. Estudios de compatibilidad con la luz.
La Tabla 14 resume el efecto de la luz sobre la estabilidad del
rhNGF en la formulación actual de 2 mg/ml, la formulación control de
0,1 mg/ml de rhNGF, y las formulaciones de 0,1 mg/ml rhNGF
conservadas con alcohol bencílico y fenol.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Después de almacenamiento durante 2 semanas en la
caja de luz, no hubo una merma significativa en la estabilidad de la
proteína en todas las formulaciones estudiadas. No obstante, después
de 5 semanas en la caja de luz, la SE-HPLC indicó un
incremento en la formación de agregados, acaecido en la formulación
actual (1,6%). La formación de agregados fue incluso más pronunciada
en la formulación conservada con fenol (12,1%) después de 5 semanas
de exposición a la luz. También hubo una pérdida del 30% en la
concentración de proteína y del 60% en bioactividad en la
formulación que contenía fenol expuesta a la luz, tal como se
determinó respectivamente mediante ELISA y RRA. Tanto la formulación
conservada con alcohol bencílico como la formulación control con 0,1
mg/ml de rhNGF fueron estables después de su exposición a la luz
durante 5 semanas. Todos los viales control recubiertos con papel de
aluminio fueron estables después de 5 semanas de almacenamiento en
la caja de luz. Estos resultados sugieren que el rhNGF es más
sensible a la luz a concentraciones de proteína más elevadas (2
mg/ml) que a concentraciones inferiores de proteína (0,1 mg/ml) en
la formulación de acetato a pH 5,5. En presencia de fenol, el
rhNGF se degrada más rápidamente a partir de su exposición a la
luz.
Todas las formulaciones líquidas de múltiples
dosis de rhNGF a 0,1 mg/ml, a pH 5,5, son estables a 5ºC
durante 12 meses. A 25ºC, las formulaciones (con o sin F68) que usan
un 0,25% de fenol como conservante son menos estables que las
formulaciones que usan un 0,9% de alcohol bencílico.
Las formulaciones de rhNGF a 0,1 mg/ml, a
pH 5,5, que contienen tensioactivo (F68) son tan estables
como las formulaciones que no contienen tensioactivo alguno.
La formulación de múltiples dosis líder para el
rhNGF es 0,1 mg/ml en acetato 20 mM, pH 5,5, NaCl 136 mM, y
0,9% de alcohol bencílico, vertida en viales de 3 cc llenados con
1,8 ml. Esta formulación, después de 6 meses de almacenamiento a
5ºC, superó el ensayo de eficacia conservadora de ambas, la USP y la
EP.
El rhNGF a 0,1 mg/ml formulado en acetato 20 mM,
NaCl 136 mM, pH 5,5, es tan estable como la formulación
líquida actual de 2 mg/ml.
La agitación no tiene efecto alguno sobre la
estabilidad del rhNGF, con independencia de la concentración de
proteína o excipiente en la formulación.
El rhNGF es más estable en la oscuridad que a la
luz, especialmente si la formulación contiene fenol como
conservante.
El rhNGF a 2 mg/ml en la formulación actual, y a
0,1 mg/ml en las formulaciones líquidas de múltiples dosis puede
soportar al menos 3 ciclos de congelación (-70ºC) y descongelación
(5ºC) sin ningún efecto adverso sobre la estabilidad de la
proteína.
1. H. Thoenen y Y.A. Barde.
Physiology of nerve growth factor. Physiol. Rev.
60:1284-1335 (1980).
2. S.C. Apfel, R.B. Lipton, J.C.
Arezzo, y J.A. Kessler. Nerve growth factor prevents
toxic neuropathy in mice. Ann. Neurol.
28:87-90 (1991).
3. S.C. Apfel, J.C. Arezzo, L.A.
Lipson y J.A. Kessler. Nerve growth factor prevents
experimental cisplatin neuropathy. Ann. Neurol.
31:76-80 (1992).
4. B.G. Petty, R.R. Comblath, B.T.
Adornato, V. Chaudhry, C. Flexner, M.
Wachsmna, D. Sinicropi, L.E. Burton, S.J.
Peroutka. The effect of systemically administered recombinant
human growth nerve factor in healthy human subjects. Ann.
Neurol. 36:244-246 (1994).
5. N.Q. McDonald, R. Lapatto, J.
Murray-Rust, J. Gunning, A.
Wlodawer, y T.L. Blundell. New protein fold revealed
by a 2.3 angstroms resolution crystal structure of nerve growth
factor. Nature 354:411-414 (1991).
6. M.A. Bothwell y E.M. Shooter.
Dissociation equilibrium constant of b nerve growth factor. J.
Biol. Chem. 252:8532-8536 (1977).
7. D.E. Timm, P.L. de Haseth y K.E.
Neet. Comparative equilibrium denaturation of the
neurotrophins: nerver growth factor, brain-derived
neurotrophic factor, neurotrophin 3, and neurotrophin 4/5.
Biochem. 33:4667-4676 (1994).
8. C.H. Schmelzer, L.E. Burton,
W.-P. Chan, E. Martin, C. Gorman, E.
Canova-Davis, V.T. Ling, M.B.
Sliwkowski, G. McGray, J.A. Briggs, T.H,
Nguyen y G. Polastri. Biochemical characterization of
recombinant human nerve growth factor. J. Neurochem.
59:1675-1683 (1992).
9. J.B. Moore y E.M. Shooter. The
use of hybrid molecules in a study of the equilibrium between nerve
growth factor monomers and dimers. Neurobiol.
5:369-381 (1975).
\newpage
10. L.A. Greene. A quantitative bioassay
for nerve growth factor activity employing a clonal pheocromocytoma
cell line. Brain Res. 133:350-353
(1977).
11. K. Reed and S. Yalkowsky. Lysis
of human red blood cells in the presence of various cosolvents. III.
The relationship between hemolytic potential and structure. J.
Parenter. Sci. Technol. 41:37-39
(1987).
12. D.E. Timm y K.E. Neet.
Equilibrium denaturation studies of mouse b-nerve
growth factor. Prot. Sci. 1:236-244
(1992).
13. E. Canova-Davis, V.
Ling, M. Eng y S. Skieresz.
Amino-terminal serine to glycine
post-translational modification observed in nerve
growth factor biosynthesized in Chinese hamster ovary cells. En
Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Escom Science
Publishers, Leiden, Los Paises Bajos, pp. (1993). (Libro de
resúmenes del Thirteenth American Peptide Symposium, Edmonton,
Alberta, Canadá, Junio 20-25, 1993).
14. L.R. De Young, J.A. Briggs y
M.F. Powell. Temperature and pH dependence of
recombinant human nerve growth factor dimer dissociations.
Biophys. J. 66:A401 (1994).
Claims (26)
1. Composición farmacéutica, que comprende una
cantidad farmacéuticamente efectiva, de no más de 0,5 mg/ml de un
factor de crecimiento nervioso, y un tampón farmacéuticamente
aceptable que contiene acetato, que tiene un pH de 5 a 6, y
que excluye la albúmina de suero humano.
2. Composición de la reivindicación 1 que tiene
un pH de 5,5.
3. Composición de la reivindicación 1 o de la
reivindicación 2, en donde el tampón es acetato sódico.
4. Composición de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que tiene una concentración de acetato
de 0,1 a 200 mM.
5. Composición de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la concentración de NGF es de
0,07 a 0,5 mg/ml.
6. Composición de la reivindicación 5, en donde
la concentración de NGF es de 0,1 a 0,5 mg/ml.
7. Composición de la reivindicación 5, en donde
la concentración de NGF es de 0,1 mg/ml.
8. Composición de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que además comprende un conservante
farmacéuticamente aceptable.
9. Composición de la reivindicación 8, en donde
el conservante se selecciona del grupo que consiste en alcohol
bencílico, fenol, m-cresol, metilparabén y propilparabén.
10. Composición de la reivindicación 9, en donde
el conservante es alcohol bencílico.
11. Composición de la reivindicación 10, en donde
la concentración de alcohol bencílico es de 0,1 a 2,0%.
12. Composición de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que además comprende un tensioactivo
farmacéuticamente aceptable.
13. Composición de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que además comprende una concentración
fisiológicamente aceptable de cloruro sódico.
14. Composición de la reivindicación 13, en donde
la concentración de cloruro sódico es de 0,05 a 0,3 M.
15. Composición de la reivindicación 14, en donde
la concentración de cloruro sódico es 136 mM ó 142 mM.
16. Composición según la reivindicación 1, en
donde el factor de crecimiento nervioso tiene una concentración de
al menos aproximadamente 0,1 mg/ml, y dicho ion acetato tiene una
concentración de 10 mM a 50 mM.
17. Composición de la reivindicación 1, en donde
la concentración de NGF es 0,1 mg/ml, la concentración de acetato
sódico es 20 mM, el pH es 5,5, la concentración de cloruro
sódico es 136 mM, y el alcohol bencílico es 0,9% (v/v).
18. Composición de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17 precedentes, en donde el factor de
crecimiento nervioso es un NGF de 118 aminoácidos.
19. Composición de la reivindicación 18, en donde
el factor de crecimiento nervioso es un homodímero de rhNGF
118/118.
20. Composición de la reivindicación 19, en donde
el factor de crecimiento nervioso se secreta a partir de células de
ovario de hámster chino.
21. Equipo para la administración del NGF, que
contiene una composición farmacéutica que comprende una cantidad
farmacéuticamente efectiva de no más de 0,5 mg/ml de factor de
crecimiento nervioso y un tampón farmacéuticamente aceptable que
contiene acetato, que tiene un pH de 5 a 6, y que excluye la
albúmina de suero humano.
22. Equipo de la reivindicación 21, en donde el
volumen de la composición es desde 1,6 hasta 2,0 ml.
23. Equipo de la reivindicación 21 o
reivindicación 22, en donde el vial reduce la exposición de la
composición a la luz.
24. Equipo de cualquiera de las reivindicaciones
21 a 23, en donde la composición se almacena desde 2 hasta 8ºC.
25. Equipo de cualquiera de las reivindicaciones
21 a 24, en donde el vial comprende un volumen de formulación de NGF
de múltiples dosis.
26. Procedimiento para incrementar la estabilidad
del NGF en una composición farmacéutica que no contiene más de 0,5
mg/ml de NGF como principio activo, que comprende incorporar acetato
en dicha composición en una cantidad y pH efectivos para
incrementar la estabilidad del NGF, y que excluye la albúmina de
suero humano.
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| AU776823B2 (en) * | 1998-07-23 | 2004-09-23 | Ares Trading S.A. | FSH and FSH variant formulations, products and methods |
| US20030166525A1 (en) | 1998-07-23 | 2003-09-04 | Hoffmann James Arthur | FSH Formulation |
| EP1407770B1 (en) * | 2001-06-26 | 2013-06-05 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Tgf-beta superfamily production/secretion promoter |
| DE10219545A1 (de) * | 2002-04-26 | 2003-11-06 | Lang Florian | Regulation der Apoptose |
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| AR044302A1 (es) * | 2003-05-13 | 2005-09-07 | Ares Trading Sa | Formulaciones con proteinas liquidas estabilizadas en recipientes farmaceuticos |
| CN1318087C (zh) * | 2003-06-06 | 2007-05-30 | 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司 | 去白蛋白神经生长因子制剂 |
| SI1638595T1 (sl) | 2003-06-20 | 2013-04-30 | Ares Trading S.A. | Liofilizirane formulacije fsh/lh |
| DE10333317A1 (de) * | 2003-07-22 | 2005-02-17 | Biotecon Therapeutics Gmbh | Formulierung für Proteinarzneimittel ohne Zusatz von humanem Serumalbumin (HSA) |
| ES2893239T3 (es) * | 2015-04-21 | 2022-02-08 | Staidson Beijing Biopharmaceuticals Co Ltd | Composición de factor de crecimiento nervioso y polvo de inyección |
| JP6533834B2 (ja) * | 2016-01-04 | 2019-06-19 | グレープ キング バイオ エルティーディー．Ｇｒａｐｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ Ｌｔｄ． | 聴覚低下を予防するための活性物質、活性物質を含む組成物及びその調製方法 |
| CN114252519B (zh) * | 2020-09-23 | 2023-11-24 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 一种测定神经生长因子纯度的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL109350A (en) * | 1993-05-12 | 2001-01-28 | Genentech Inc | Stable liquid preparations of gamma interferon |
| US6277828B1 (en) * | 1993-08-20 | 2001-08-21 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Pharmaceutical formulations of nerve growth factor |
-
1996
- 1996-10-21 EP EP96937710A patent/EP0862452B1/en not_active Expired - Lifetime
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