ES2624180T3 - Modulación de la actividad de proneurotrofinas - Google Patents

Modulación de la actividad de proneurotrofinas Download PDF

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ES2624180T3 ES07846437.7T ES07846437T ES2624180T3 ES 2624180 T3 ES2624180 T3 ES 2624180T3 ES 07846437 T ES07846437 T ES 07846437T ES 2624180 T3 ES2624180 T3 ES 2624180T3
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Olav Michael Andersen
Anders Nykjaer
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H Lundbeck AS
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Abstract

Un anticuerpo dirigido contra una parte extracelular de sortilina y capaz de inhibir la unión de una proneurotrofina a un sitio de unión de un receptor sortilina, en donde el anticuerpo se une al motivo de unión de proneurotrofina de acuerdo con SEQ ID NO: 25, 26, 27 o 28 o un fragmento de las mismas.

Description

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sobre la orientación de la cadena principal del polipéptido, tal como una sustitución de o por Pro o Gly por otro residuo; y/o iii) diferiría sustancialmente en la carga eléctrica, por ejemplo, una sustitución de un residuo cargado negativamente tal como Glu o Asp por un residuo cargado positivamente tal como Lys, His o Arg (y viceversa); y/o iv) diferiría sustancialmente en la masa estérica, por ejemplo, una sustitución de un residuo voluminosos tal como His, Trp, Phe o Tyr por uno que tenga una cadena lateral menor, por ejemplo, Ala, Gly o Ser (y viceversa).
Las variantes obtenidas mediante sustitución de aminoácidos pueden prepararse, en una realización preferida, en base a los valores de hidrofobicidad e hidrofilicidad y a la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de los aminoácidos, que incluyen la carga, el tamaño y similares. Los ejemplos de sustituciones de aminoácidos que toman en consideración varias de las anteriores características, son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.
Además de las variantes descritas en la presente memoria, se pueden formular variantes estéricamente similares para imitar las porciones clave de la estructura de la variante y así dichos compuestos también pueden usarse de la misma manera que las variantes de la descripción. Esto puede lograrse mediante técnicas de modelización y diseño químico, conocidas por los expertos en la técnica. Se debe entender que todas las estructuras artificiales estéricamente similares están abarcadas por el alcance de la presente descripción.
En una realización adicional, la presente descripción se refiere a variantes funcionales que comprenden aminoácidos sustituidos que presentan valores hidrofílicos o índices hidropáticos que están en el intervalo de +/-4,9, por ejemplo, dentro del intervalo de +/-4,7, tal como dentro del intervalo de +/-4,5, por ejemplo, dentro del intervalo de +/-4,3, tal como dentro del intervalo de +/-4,1, por ejemplo, dentro del intervalo de +/-3,9, tal como dentro del intervalo de +/3,7, por ejemplo, dentro del intervalo de +/-3,5, tal como dentro del intervalo de +/-3,3, por ejemplo, dentro del intervalo de +/-3,1, tal como dentro del intervalo de +/-2,9, por ejemplo, dentro del intervalo de +/-2,7, tal como dentro del intervalo de +/-2,5, por ejemplo, dentro del intervalo de +/-2,3, tal como dentro del intervalo de +/-2,1, por ejemplo, dentro del intervalo de +/-2,0, tal como dentro del intervalo de +/-1,8, por ejemplo, dentro del intervalo de +/-1,6, tal como dentro del intervalo de +/-1,5, por ejemplo, dentro del intervalo de +/-1,4, tal como dentro del intervalo de +/1,3, por ejemplo, dentro del intervalo de +/-1,2, tal como dentro del intervalo de +/-1,1, por ejemplo, dentro del intervalo de +/-1,0, tal como dentro del intervalo de +/-0,9, por ejemplo, dentro del intervalo de +/-0,8, tal como dentro del intervalo de +/-0,7, por ejemplo, dentro del intervalo de +/-0,6, tal como dentro del intervalo de +/-0,5, por ejemplo, dentro del intervalo de +/-0,4, tal como dentro del intervalo de +/-0,3, por ejemplo, dentro del intervalo de +/-0,25, tal como dentro del intervalo de +/-0,2 del valor del aminoácido que ha sustituido.
La importancia de los índices hidrofílico e hidropático de los aminoácidos a la hora de conferir una función biológica interactiva a una proteína, es bien conocida en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982, y Hopp, documento de Patente de EE.UU. nº 4.554.101).
Los valores de índice hidropático de los aminoácidos tal como se usan en la presente memoria son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) y arginina (-4,5) (Kyte y Doolittle, 1982).
Los valores de hidrofilicidad de aminoácidos son: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 +-,1); glutamato (+3,0 +-,1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 +-0,1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4) (documento de Patente de EE.UU. nº 4.554.101).
Además de los compuestos de peptidilo descritos en esta memoria, se pueden formular compuestos estéricamente similares para imitar las porciones clave de la estructura peptídica y tales compuestos también se pueden emplear de la misma manera que los péptidos descritos de la descripción. Esto se puede lograr empleando técnicas de modelización y de diseño químico, conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede emplear la esterificación y otras alquilaciones para modificar el extremo amino de, por ejemplo, una cadena peptídica principal de diarginina, para imitar una estructura de tetrapéptido. Se entenderá que todas esas estructuras artificiales estéricamente similares, también están contempladas dentro del alcance de la presente descripción. Los péptidos con alquilaciones N-terminales y esterificaciones C-terminales también se incluyen dentro de la presente descripción. Los equivalentes funcionales también comprenden conjugados glicosilados y covalentes o agregados, formados con los mismos, o con otros, fragmentos de modulador de la actividad de proneurotrofina y/o moléculas de modulador de la actividad de proneurotrofina, incluyendo dímeros o restos químicos funcionales no relacionados. Tales equivalentes funcionales se preparan mediante la unión de funcionalidades a grupos presentes en el fragmento, que incluyen uno
o ambos extremos N y C, empleando medios conocidos en la técnica.
Por tanto, los equivalentes funcionales pueden comprender fragmentos conjugados con ésteres o amidas alifáticas o de acilo de los extremos carboxilo, alquilaminas o residuos que contengan cadenas laterales de carboxilo, por ejemplo, conjugadas con alquilaminas en residuos de ácido aspártico; derivados de O-acilo de residuos que contengan grupos hidroxilo y derivados de N-acilo de los aminoácidos amino-terminales o de residuos que contengan grupos amino, por ejemplo, conjugados con fMet-Leu-Phe o proteínas inmunogénicas. Los derivados de los grupos acilo se
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seleccionan a partir del grupo de restos alquilo (que incluyen alquilos C3 a C10 normales), formando de este modo especies de alcanoilo, y compuestos carbocíclicos o heterocíclicos, formando de este modo especies de aroilo. Los grupos reactivos preferiblemente son compuestos difuncionales conocidos de por sí para uso en la reticulación de proteínas en matrices insolubles a través de grupos laterales reactivos.
Los equivalentes funcionales covalentes o agregativos y los derivados de los mismos son útiles como reactivos en inmunoensayos o para procedimientos de purificación por afinidad. Por ejemplo, un fragmento de modulador de la actividad de proneurotrofina de acuerdo con la presente descripción, se puede insolubilizar mediante un enlace covalente a Sefarosa activada con bromuro de cianógeno, empleando métodos conocidos de por sí, o adsorberse a superficies de poliolefinas, con reticulación de glutaraldehído o no, para uso en un ensayo o en una purificación de anticuerpos de modulador de la actividad anti-neurotrofina o en receptores de la superficie celular. Los fragmentos también se pueden marcar con un grupo detectable, por ejemplo, pueden estar radioyodados mediante el procedimiento de cloramina T, ligados covalentemente a quelatos de tierras raras o conjugados con otro resto fluorescente para uso, por ejemplo, en ensayos diagnósticos.
La mutagénesis de un fragmento predeterminado preferido de modulador de la actividad de proneurotrofina se puede llevar a cabo realizando inserciones de aminoácidos, normalmente en el orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácidos, preferiblemente desde aproximadamente 1 a 5 residuos de aminoácidos, o deleciones desde aproximadamente 1 a 10 residuos, tal como desde aproximadamente 2 a 5 residuos.
En una realización, el fragmento de modulador de la actividad de proneurotrofina se sintetiza mediante síntesis automatizada. Se puede emplear cualquiera de las técnicas en fase sólida disponibles comercialmente, tal como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que los aminoácidos se añaden secuencialmente a una cadena de aminoácidos en crecimiento (véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963).
El equipo para la síntesis automatizada de polipéptidos está disponible comercialmente a partir de suministradores tales como Applied Biosystems, Inc. de Foster City, California, y se puede manejar de forma general según las instrucciones del fabricante. La síntesis en fase sólida permitirá la incorporación de sustituciones de aminoácidos deseables en cualquier fragmento de modulador de la actividad de proneurotrofina de acuerdo con la presente descripción. Debe entenderse que las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier subcombinación de las mismas se pueden combinar para alcanzar una secuencia final de un equivalente funcional. Debe entenderse que las inserciones incluyen fusiones amino-terminales y/o carboxi-terminales, por ejemplo, con una proteína o un vehículo hidrofóbico o inmunogénico, tal como cualquier polipéptido o estructura de soporte capaz de actuar como vehículo.
También se proporcionan oligómeros que incluyen dímeros que incluyen homodímeros y heterodímeros de fragmentos de modulador de la actividad de proneurotrofina de acuerdo con la descripción. Los equivalentes funcionales y las variantes de modulador de la actividad de proneurotrofina se pueden producir como homodímeros o heterodímeros con otras secuencias de aminoácido o con secuencias naturales de modulador de la actividad de proneurotrofina. Los heterodímeros incluyen dímeros que contienen fragmentos de modulador de la actividad de proneurotrofina inmunorreactivos, así como fragmentos de modulador de la actividad de proneurotrofina que no necesitan tener o ejercer ninguna actividad biológica.
Los fragmentos de modulador de la actividad de proneurotrofina de acuerdo con la descripción se pueden sintetizar tanto in vitro como in vivo. El método para la síntesis in vitro es bien conocido, y los métodos que son adecuados o adecuadamente adaptables a la síntesis in vivo de modulador de la actividad de proneurotrofina también se describen en la técnica anterior. Cuando se sintetizan in vivo, una célula hospedadora se transforma con vectores que contienen ADN que codifica modulador de la actividad de proneurotrofina o un fragmento del mismo. Un vector se define como una estructura artificial de ácido nucleico replicable. Los vectores se usan para mediar en la expresión del modulador de la actividad de proneurotrofina. Un vector de expresión es una estructura artificial de ADN replicable en la que una secuencia de ácido nucleico que codifica el fragmento predeterminado de modulador de la actividad de proneurotrofina, o cualquier equivalente funcional del mismo que pueda expresarse in vivo, se liga funcionalmente a secuencias de control adecuadas, capaces de efectuar la expresión del fragmento o del equivalente en un hospedador adecuado. Tales secuencias de control son bien conocidas en la técnica.
Los cultivos de células obtenidas a partir de organismos multicelulares representan células hospedadoras preferidas. En principio, cualquier cultivo de células eucarióticas superiores es factible, tanto de cultivos de vertebrados como de invertebrados. Los ejemplos de líneas celulares hospedadoras útiles son células VERO y HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) y líneas celulares WI38, BHK, COS-7, 293 y MDCK. Las células hospedadoras preferidas son células eucarióticas que se sabe que sintetizan modulador de la actividad de proneurotrofina endógeno. Los cultivos de tales células hospedadoras se pueden aislar y emplear como una fuente del fragmento, o usar en métodos terapéuticos de tratamiento, que incluyen métodos terapéuticos dirigidos a promocionar o inhibir un estado de crecimiento, o a métodos diagnósticos llevados a cabo en un organismo humano o animal.
Agente farmacéutico: las expresiones "agente farmacéutico" o "fármaco" o "medicamento" se refieren a cualquier agente terapéutico o profiláctico que se puede usar en el tratamiento (que incluye la prevención, el diagnóstico, el alivio o la cura) de un malestar, aflicción, afección, enfermedad o lesión en un paciente. Los determinantes genéticos, péptidos, polipéptidos y polinucleótidos útiles terapéuticamente se pueden incluir dentro del significado de la
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expresión producto farmacéutico o fármaco. Tal como se define en esta memoria, un "agente terapéutico", "agente farmacéutico" o "fármaco" o "medicamento" es un tipo de agente bioactivo.
La expresión "agente bioactivo" tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a cualquier sustancia que se pueda usar en relación con una aplicación que sea terapéutica o de diagnóstico, tal como por ejemplo, en métodos para diagnosticar la presencia o ausencia de una enfermedad en un paciente y/o métodos para el tratamiento de una enfermedad en un paciente. "Agente bioactivo" se refiere a sustancias que son capaces de ejercer un efecto biológico in vitro y/o in vivo. Los agentes bioactivos pueden ser neutros, cargados negativa o positivamente. Los agentes bioactivos adecuados incluyen, por ejemplo, profármacos, agentes de diagnóstico, agentes terapéuticos, agentes farmacéuticos, fármacos, agentes de aporte de oxígeno, sustitutos sanguíneos, moléculas orgánicas sintéticas, polipéptidos, péptidos, vitaminas, esteroides, análogos de esteroides y determinantes genéticos, que incluyen nucleósidos, nucleótidos y polinucleótidos.
Tratamiento: el término "tratamiento" tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un método que implica una terapia que incluye la cirugía de una afección clínica en un individuo que incluye un organismo humano o animal. La terapia puede ser profiláctica, paliativa o curativa, es decir, que reduce el riesgo de adquirir una enfermedad.
ARN antisentido: una molécula de ARN capaz de causar el silenciamiento de un gen mediante la unión específica a una molécula de ARNm de interés.
ADN antisentido: una molécula de ADN capaz de causar el silenciamiento de un gen mediante la unión específica a una molécula de ARNm de interés.
siARN: "ARN de interferencia pequeño" (del inglés "small interfering RNA") es una molécula de ARN de cadena doble, corta (frecuentemente, aunque sin restricción, de menos de 30 nucleótidos de longitud) capaz de causar el silenciamiento específico de un gen en células de mamífero.
"Silenciamiento" de un gen: un proceso que conduce a una expresión reducida de genes endógenos. El silenciamiento génico preferiblemente es el resultado de una reducción post-transcripcional de la expresión génica.
Regulación al alza de la expresión: un proceso que conduce a un aumento de la expresión de genes, preferiblemente de genes endógenos.
In vitro/in vivo: los términos se usan con su significado normal.
Polipéptido: el término “polipéptido” tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula que comprende al menos dos aminoácidos. Los aminoácidos pueden ser naturales o sintéticos. "Oligopéptidos" se define en la presente memoria como polipéptidos que tienen una longitud no superior a 100 aminoácidos. El término "polipéptido" también se entiende que incluye proteínas, es decir, biomoléculas funcionales que comprenden al menos un polipéptido; cuando comprenden al menos dos polipéptidos, éstos pueden formar complejos, estar unidos covalentemente o pueden estar unidos no covalentemente. Los polipéptidos en una proteína pueden estar glicosilados y/o lipidados y/o comprender grupos prostéticos.
"Polinucleótido", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a una molécula que comprende al menos dos ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos pueden existir de forma natural o pueden estar modificados, tal como ácidos nucleicos cerrados (LNA, del inglés "locked nucleic acids"), o ácidos nucleicos peptídicos (PNA, del inglés "peptide nucleic acids"). Polinucleótido, tal como se usa en la presente memoria, generalmente pertenece a:
i) un polinucleótido que comprende una secuencia codificante predeterminada, o
ii) un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos predeterminada, o
iii) un polinucleótido que codifica un fragmento de un polipéptido codificado por polinucleótidos (i) o (ii), en donde dicho fragmento tiene al menos una actividad predeterminada como la especificada en la presente memoria; y
iv) un polinucleótido cuya cadena complementaria se hibrida en condiciones restrictivas con un polinucleótido como el definido en una cualquiera de (i), (ii) y (iii), y que codifica un polipéptido, o un fragmento del mismo, que tiene al menos una actividad predeterminada como la especificada en la presente memoria; y
v) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que está degenerada respecto a la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos (iii) o (iv); o la cadena complementaria de un polinucleótido de este tipo.
Un "anticuerpo purificado" es un anticuerpo en el que al menos el 60 por ciento en peso está exento de polipéptidos y moléculas orgánicas naturales con las que se asocia de forma natural. Preferiblemente, la preparación comprende un anticuerpo en una cantidad de al menos el 75 por ciento en peso, más preferiblemente de al menos el 90 por ciento en peso, y aún más preferiblemente de al menos el 99 por ciento en peso.
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ninguna afinidad de unión significativa o efectos adversos después de la unión con otros receptores con dominio Vps10p o de hecho otros receptores distintos de sortilina.
Los receptores con dominio Vps10p, especialmente sortilina, identificada inicialmente como receptor de neurotensina 3 (NTR-3), tienen especificidad de sustrato que se solapa parcialmente con los receptores de neurotensina 1 y 2 (NTR-1 y NTR-2), uniéndose ambos a NT(1-13) con alta afinidad. Además, una serie de moduladores del sistema de neurotensina son ligandos conocidos de NTR-1 y NTR-2. Ejemplos de los mismos son los péptidos NT66L (SEQ ID NO. 15), NT67L (SEQ ID NO. 16), NT69L (SEQ ID NO. 17), Eisai (SEQ ID NO. 18), JMV-449 (SEQ ID NO. 19), PD149163 (SEQ ID NO. 20), PD-149598 (SEQ ID NO. 21), PD-156425 con la estructura:
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y PD-156556 (SEQ ID NO. 23), CGX-1160 (SEQ ID NO. 24), PD-147113 (SEQ ID NO. 29), GZR-123 (SEQ ID NO. 30), NT64D (SEQ ID NO. 31), NT64L (SEQ ID NO. 32), NT65L (SEQ ID NO. 33), NT66D (SEQ ID NO. 34), NT69L' (SEQ ID NO. 35), NT71 (SEQ ID NO. 36), NT72 (SEQ ID NO. 37), NT73 (SEQ ID NO. 38), NT74 (SEQ ID NO. 39), NT75 (SEQ ID NO. 40), NT76 (SEQ ID NO. 41), NT77 (SEQ ID NO. 42) y los compuestos SR-142948A, SR-48692, UK-73093 y L-737631. Todos estos compuestos y péptidos son agentes de acuerdo con la presente descripción. Además, los derivados de los compuestos anteriores y variantes o fragmentos o péptidos que comprenden los péptidos mencionados anteriormente, son agentes de acuerdo con la presente descripción. Por derivados se entienden compuestos que conservan una parte sustancial y/o significativa de la estructura de los compuestos mencionados, pero que están sustituidos de manera diferente, es decir, que comprenden otros sustituyentes. Los derivados pueden ser también moléculas que son capaces de interaccionar de la misma manera que el compuesto de origen, es decir, interaccionan con los mismos residuos sobre el receptor con dominio Vps10p. Ejemplos de tales sustituyentes comprenden y no se limitan a: grupos alicíclicos: la expresión "grupo alicíclico" significa un grupo hidrocarburo cíclico que tiene propiedades parecidas a las de los grupos alifáticos. Grupos alifáticos: en el contexto de la presente descripción, la expresión "grupo alifático" significa un grupo hidrocarburo saturado o insaturado, lineal o ramificado. Esta expresión se usa para incluir grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, por ejemplo. Grupos alquilo: la expresión "grupo alquilo" significa un grupo hidrocarburo saturado, lineal o ramificado que incluye, por ejemplo, metilo, etilo, isopropilo, t-butilo, heptilo, dodecilo, octadecilo, amilo, 2-etilhexilo y similares. Grupos alquenilo: la expresión "grupo alquenilo" significa un grupo hidrocarburo insaturado, lineal o ramificado con uno o varios dobles enlaces carbono-carbono, tal como un grupo vinilo. Grupos alquinilo: la expresión "grupo alquinilo" significa un grupo hidrocarburo insaturado, lineal o ramificado con uno o varios triples enlaces carbono-carbono; anfífilos: sustancia que contiene grupos tanto polares y solubles en agua como no polares insolubles en agua. Grupo aromático: la expresión "grupo aromático" o "grupo arilo" significa un grupo hidrocarbonado aromático, monocíclico o policíclico. Grupos cíclicos: la expresión "grupo cíclico" significa un grupo hidrocarburo de anillo cerrado que se clasifica como un grupo alicíclico, grupo aromático o grupo heterocíclico. Cicloalquenilos: significa un radical carbocíclico monovalente insaturado que consiste en uno, dos o tres anillos, de tres a ocho carbonos por anillo, que puede estar opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes, seleccionados a partir del grupo que consiste en hidroxi, ciano, alquenilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alqueniltio, halo, haloalquenilo, hidroxialquenilo, nitro, alcoxicarbonenilo, amino, alquenilamino, alquenilsulfonilo, arilsulfonilo, alquenilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alquenilaminocarbonilo, arilaminocarbonilo, alquenilcarbonilamino y arilcarbonilamino. Cicloalquilos: significan un radical carbocíclico monovalente saturado, que consiste en uno, dos o tres anillos, de tres a ocho carbonos por anillo, que pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o dos sustituyentes seleccionados a partir del grupo que consiste en hidroxi, ciano, alquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alquiltio, halo, haloalquilo, hidroxialquilo, nitro, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, alquilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alquilaminocarbonilo, arilaminocarbonilo, alquilcarbonilamino y arilcarbonilamino. Grupos catiónicos: un grupo químico capaz de actuar como un donante de protones cuando un compuesto que comprende el grupo químico se disuelve en un disolvente, preferiblemente cuando se disuelve en agua. En general, un "Grupo" / Resto / sustituto se entiende bien en esta área técnica, y no solo se tolera un alto grado de sustitución, sino que frecuentemente es recomendable. Se prevé una sustitución en los materiales de la presente descripción.
Como un modo de simplificar la exposición y la descripción de cierta terminología utilizada en toda esta solicitud, los términos "grupo" y "resto" se usan para diferenciar entre especies químicas que permiten una sustitución o que pueden estar sustituidas y las que no lo permiten o no se pueden sustituir de ese modo. Por lo tanto, cuando se emplea el término "grupo" para describir un sustituyente químico, el material químico descrito incluye el grupo no sustituido y ese grupo con átomos de O, N o S, por ejemplo, en la cadena, así como grupos carbonilo u otra sustitución convencional. Cuando el término "resto" se utiliza para describir un compuesto químico o un sustituyente, únicamente se
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enfermedad de Parkinson, la epilepsia, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Huntington, el síndrome de Down, la sordera nerviosa y la enfermedad de Meniere. Las neurotrofinas son esenciales para la salud y el bienestar del sistema nervioso. Por ejemplo, NGF (factor de crecimiento nervioso), BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro), NT-3 (neurotrofina-3) y NT-4 (neurotrofina-4) también median en actividades de orden superior adicionales, tales como el aprendizaje, la memoria y el comportamiento, además de sus funciones establecidas para la supervivencia celular. Por lo tanto, los agentes de la presente descripción se pueden utilizar como potenciadores cognitivos, para mejorar el aprendizaje, especialmente en pacientes que padecen demencias o traumatismos. La enfermedad de Alzheimer, que ha sido identificada por los “National Institutes of Aging” por representar más del 50% de las demencias en los ancianos, es también la cuarta o quinta causa principal de muerte en los estadounidenses mayores de 65 años de edad. Cuatro millones de estadounidenses, el 40% de los estadounidenses mayores de 85 años (el segmento de crecimiento más rápido de la población estadounidense), tienen la enfermedad de Alzheimer. El veinticinco por ciento de todos los pacientes con la enfermedad de Parkinson también padecen una demencia de tipo enfermedad de Alzheimer. Y en aproximadamente el 15% de los pacientes con demencia, la enfermedad de Alzheimer y la demencia multiinfarto coexisten. La tercera causa más común de demencia, tras la enfermedad de Alzheimer y la demencia vascular, es la pérdida cognitiva debida a una enfermedad cerebral orgánica relacionada directamente con el alcoholismo, que se da en aproximadamente el 10% de los alcohólicos. Sin embargo, la anomalía más consistente para la enfermedad de Alzheimer, así como para la demencia vascular y la pérdida cognitiva debida a enfermedad cerebral orgánica relacionada con el alcoholismo, es la degeneración del sistema colinérgico procedente del cerebro anterior basal (BF, del inglés "basal forebrain") y dirigida al códex y al hipocampo (Bigl et al. en Brain Cholinergic Systems, M. Steriade y D. Biesold, compiladores, Oxford University Press, Oxford, pág. 364-386 (1990)). Y existe una serie de otros sistemas neurotransmisores afectados por la enfermedad de Alzheimer (Davies Med. Res. Rev. 3: 221 (1983)). Sin embargo, la pérdida cognitiva, relacionada por ejemplo, con la degeneración del sistema neurotransmisor colinérgico, no está limitada a individuos que padecen demencia. También se ha observado en adultos por lo demás sanos y en ratas. Los estudios que comparan el grado de pérdida de capacidad de aprendizaje con el grado de reducción del flujo sanguíneo cerebral cortical en ratas maduras, muestran una buena correlación (Berman et al. Neurobiol. Aging 9:691 (1988)). En el alcoholismo crónico, la enfermedad cerebral orgánica resultante, como la enfermedad de Alzheimer o el envejecimiento normal, también se caracteriza por reducciones difusas del flujo sanguíneo cerebral cortical en aquellas regiones del cerebro de las que surgen las neuronas colinérgicas (cerebro anterior basal) y en las que se proyectan (córtex cerebral) (Lofti et al., Cerebrovasc. and Brain Metab. Rev 1:2 (1989)). Tales demencias se pueden tratar mediante la administración de agentes de la presente descripción.
Es un objeto de la presente descripción utilizar los agentes de la misma para tratar la esclerosis múltiple. Los agentes de la presente descripción se pueden usar solos o en combinación con otros medicamentos. Ejemplos de tales compuestos incluyen y no se limitan a: interferón beta (por ejemplo, beta-1a y/o beta-1b), acetato de glatiramer (Copaxone, una mezcla de polipéptidos que puede proteger importantes proteínas de la mielina mediante su sustitución como diana del ataque del sistema inmune), mitoxantrona y natalizumab (Tysabri), corticosteroides y anticuerpos monoclonales.
Además, los agentes de la presente descripción se pueden emplear en el tratamiento de lesiones de la médula espinal y/o en combinación con otro tratamiento aplicado después de lesiones de la médula espinal. Ejemplos actuales de tales agentes incluyen y no se limitan al fármaco esteroide metilprednisolona, administrado al cabo de las primeras 8 horas después de la lesión para reducir el daño a las células nerviosas.
Además, los agentes de la presente descripción se pueden usar en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (PD) y o en combinación con otros medicamentos administrados en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson; tales agentes incluyen y no se limitan a: levodopa, carbidopa, benserazida, talcopone, entacapona, mucuna pruriens, agonistas de dopamina tales como bromocriptina, pergolida, pramipexol, ropinirol, cabergolina, apomorfina y lisurida, inhibidores de MAO-B tales como selegilina y rasagilina. Además otros tratamientos no farmacológicos, tales como intervenciones quirúrgicas, terapia del habla y ejercicio físico han mostrado ser moderadamente eficaces y el agente de la presente descripción se puede emplear también en combinación con estos métodos de terapia. Además, los agentes de la presente descripción se pueden usar en combinación con métodos que emplean terapia génica y/o celular, tales como la implantación de células modificadas genéticamente para producir dopamina o células madre que se transforman en células productoras de dopamina, o los agentes se pueden utilizar en combinación con una infusión de GDNF (factor neurotrófico derivado de la glía). Esto implica la infusión de GDNF en los ganglios basales usando catéteres implantados quirúrgicamente. Además, el tratamiento con agentes neuroprotectores tales como fármacos apoptóticos (CEP 1347 y CTCT346), lazaroides, agentes bioenergéticos y/o antiglutamatérgicos, en combinación con los agentes descritos anteriormente en este documento, están dentro del alcance de la presente descripción.
En aún otra realización, los agentes de la descripción actual se pueden usar en el tratamiento del ictus. Además, los agentes de la presente descripción se pueden utilizar en combinación con medicamentos empleados en el tratamiento del ictus, tales como medicamentos antiplaquetarios (por ejemplo, aspirina, clopidogrel y dipiridamol) o una medicación anticoagulante tal como warfarina o el activador del plasminógeno tisular, tPA. El método para despejar un vaso sanguíneo bloqueado mediante una trombectomía mecánica, también se puede usar en combinación con agentes de la presente descripción.
Además, los agentes de la presente descripción se utilizan preferentemente para tratar la neuropatía, y especialmen
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Métodos de administración
Los agentes usados en los métodos de la presente descripción se administran generalmente a un animal en forma de una composición farmacéutica adecuada. De acuerdo con ello, la presente descripción se refiere también a una composición farmacéutica que comprende un agente tal como se define en esta memoria. Tales composiciones contienen típicamente el agente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal y como se usa en este documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se entiende que incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio
o agente convencional sea incompatible con el agente, está contemplado su uso en las composiciones. También se pueden incorporar en las composiciones compuestos activos suplementarios.
Una composición farmacéutica se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías adecuadas de administración incluyen la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosal y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis, fabricados en vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL.TM. (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que se pueda inyectar fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe estar protegida contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Una prevención de la acción de microorganismos se puede conseguir mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos en la composición, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio. Una absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el agente en la cantidad requerida en un disolvente apropiado, con uno o una combinación de ingredientes mencionados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el agente en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de los mencionados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución del mismo previamente esterilizada por filtración.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Se pueden incluir en cápsulas de gelatina o comprimir en comprimidos. Para los fines de una administración terapéutica oral, el agente se puede incorporar con excipientes y usar en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas, las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo fluido para uso como un enjuague bucal, en donde el compuesto en el vehículo fluido se aplica oralmente y se agita y se expectora o se traga. Los agentes de unión farmacéuticamente compatibles, y/o los materiales adyuvantes se pueden incluir como parte de la composición. Los comprimidos, las píldoras, las cápsulas, los trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un agente deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.
Para la administración mediante inhalación, los compuestos se administran en forma de una pulverización en aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.
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de adenovirus se pueden utilizar. El genoma de un adenovirus se puede manipular de tal manera que codifique y exprese un producto génico de interés pero que se inactiva en términos de su capacidad para replicarse en un ciclo de vida viral lítico normal. Véase, por ejemplo, Berkner et al. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; y Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155. Los vectores adenovíricos adecuados, obtenidos a partir de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 dl324 u otras cepas de adenovirus (por ejemplo, Ad2, Ad3, Ad7, etc.) son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los adenovirus recombinantes pueden ser ventajosos en ciertas circunstancias en las que no son capaces de infectar células que no se dividen. Además, la partícula de virus es relativamente estable y susceptible de purificación y concentración, y como anteriormente, se puede modificar con el fin de afectar al espectro de infectividad. Además, el ADN adenovírico introducido (y el ADN extraño contenido en el mismo) no está integrado en el genoma de una célula hospedadora sino que permanece episomal, evitando de este modo problemas potenciales que pueden tener lugar como resultado de una mutagénesis por inserción, en situaciones en las que el ADN introducido se integra en el genoma del hospedador (por ejemplo, ADN retrovírico). Por otra parte, la capacidad portadora del genoma adenovírico para ADN extraño es grande (hasta 8 kilobases), en relación con otros vectores de administración de genes (Berkner et al. citado anteriormente; Haj-Ahmand y Graham (1986) J. Virol. 57:267). En la mayoría de los vectores adenovíricos con una replicación defectuosa que están actualmente en uso y, por lo tanto, están favorecidos por la presente descripción, se delecionan genes completos o partes de los genes virales E1 y E3, pero se conserva tanto como un 80% del material genético adenovírico (véase, por ejemplo, Jones et al. (1979) Cell 16:683.; Berkner et al., supra; y Graham et al. en Methods in Molecular Biology, E.J. Murray, compilador (Humana, Clifton, NJ, 1991) vol. 7, págs. 109-127). La expresión del gen de interés comprendido en la molécula de ácido nucleico, puede estar bajo el control, por ejemplo, del promotor E1A, el promotor tardío principal (MLP) y secuencias líder asociadas, el promotor E3, o secuencias añadidas de manera exógena.
Aún otro sistema de vector viral útil para la administración de los agentes de la descripción, es el virus adenoasociado (VAA). El virus adenoasociado es un virus defectuoso natural que requiere otro virus, tal como un adenovirus o un virus del herpes, como virus auxiliar para una replicación eficaz y un ciclo de vida productivo. (Para una revisión, véase Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158:97-129). Los virus adenoasociados muestran una alta frecuencia de integración estable (véase, por ejemplo, Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; y McLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62:1963-1973). Los vectores que contienen tan solo 300 pares de bases de VAA se pueden empaquetar y se pueden integrar. El espacio para ADN exógeno se limita a aproximadamente 4,5 kb. Un vector VAA tal como el descrito en Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 se puede emplear para introducir ADN en linfocitos T. Una variedad de ácidos nucleicos se han introducido en diferentes tipos de células usando vectores VAA (véase, por ejemplo, Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51:611-619; y Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790). Otros sistemas de vectores virales que pueden ser útiles para la administración de los agentes de la descripción, se obtienen a partir de virus herpes, virus vaccinia y varios virus de ARN.
Debe entenderse que tales tratamientos también pueden comprender la administración de más de un agente, en cuyo caso los agentes se pueden administrar bien de forma concurrente y/o por separado.
Animales
En un aspecto de la presente descripción, los agentes capaces de inhibir la unión entre una proneurotrofina y un receptor con dominio Vps10p se administran a un animal. Dicho animal es preferiblemente cualquier animal que exprese una proteína de la familia de proneurotrofinas, más preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un animal doméstico y lo más preferiblemente un ser humano.
Métodos para el escrutinio de un compuesto que altera la unión de al menos una proneurotrofina con un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p
También se describe en el presente documento un método in vitro para el escrutinio de un compuesto que altera la unión de al menos una proneurotrofina con un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p, comprendiendo dicho método preferiblemente las etapas de:
a) proporcionar un ensayo para medir la unión de una proneurotrofina con el sitio de unión del receptor sortilina que comprende SEQ ID NO. 25 o cualquier variante o fragmento de la misma (incluyendo SEQ ID NOs: 26 a 28),
b) añadir el compuesto que se va a analizar al ensayo, y
c) determinar la cantidad de proneurotrofina unida al receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p, y
d) comparar la cantidad determinada en la etapa c) con una cantidad medida en ausencia del compuesto que se va a someter ensayo,
e) en donde una diferencia en las dos cantidades identifica un compuesto que altera la unión de las proneurotrofinas con el receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p.
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En una realización preferida de este método de escrutinio, la proneurotrofina se puede seleccionar a partir de pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT-3 o pro-NT-4/5. Más preferiblemente, la proneurotrofina es pro-NGF o pro-BDNF. En una realización preferida de este método de escrutinio, el receptor se selecciona a partir de SorLA, sortilina, SorCS1, SorCS3 o SorCS2. Incluso más preferiblemente, el receptor es sortilina. En otra realización del método de escrutinio, la proneurotrofina es capaz de unirse a una parte extracelular del receptor. En una realización, el receptor puede ser un receptor que se expresa en una célula, dentro de la membrana plasmática y/o se presenta sobre una membrana plasmática. La célula usada en el método de escrutinio se puede seleccionar preferiblemente a partir de cultivos primarios de células neuronales, líneas celulares obtenidas a partir de neuronas, células transfectadas capaces de expresar el receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p, neuronas periféricas y neuronas centrales. Preferiblemente, las células son líneas celulares inmortalizadas.
Los ensayos que se pueden emplear para medir la unión de una proneurotrofina a un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p, son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, ensayos de dos híbridos de levadura, métodos de unión competitiva, tales como RIAs, ELISAs y otros similares. Otros ensayos son la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), la resonancia de plasmón superficial (Biacore), los ensayos de transferencia Western, la inmunohistoquímica. Los resultados de los estudios de unión pueden analizarse usando cualquier representación gráfica convencional de los datos de la unión, tal como el análisis de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci., 51:660-672 [1949]; Goodwin et al., Cell, 73:447-456 [1993]), y otros similares.
Además se proporciona en esta memoria un método para determinar el efecto de un agente sobre la actividad de proneurotrofinas en células que presentan un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p. Dicho método comprende las etapas de:
b) administrar dicho agente a un mamífero que expresa el receptor,
c) medir la actividad de las proneurotrofinas en dicho mamífero,
d) comparar la medición de la etapa b) con una medición obtenida en ausencia del compuesto que está siendo evaluado,
e) en donde la diferencia entre las dos mediciones identifica el efecto de dicho agente sobre la actividad de las proneurotrofinas sobre células que presentan receptores de la familia de receptores con dominio Vps10p.
El mamífero puede expresar el receptor de forma natural o puede estar transfectado con el gen natural del receptor.
La actividad de dichas proneurotrofinas en dicho mamífero puede medirse mediante una o varias de las siguientes mediciones:
a) medir el nivel de expresión de un gen diana de respuesta a neurotrofina, tal como ARNm o proteína en tejidos del mamífero,
b) medir el nivel de expresión de un receptor tal como se ha definido en la presente memoria, como ARNm o proteína en tejidos del mamífero,
c) medir la unión o el transporte mediados por el receptor, de proneurotrofinas unidas al receptor,
d) medir la captación de proneurotrofinas al interior de las células de dicho mamífero,
e) medir la transducción de señales desde dicho receptor o un receptor relacionado en células de dicho mamífero.
El receptor relacionado puede ser el receptor p75 o el receptor TrkA.
En una realización preferida de dicho método, el método comprende además la administración de dicho agente a un mamífero que carece de la expresión de dicho receptor. Dicho mamífero que carece de la expresión de dicho receptor puede carecer únicamente de la expresión de dicho receptor en uno o varios tejidos seleccionados, y/o puede presentar un nivel reducido de expresión de dicho receptor.
Los métodos para medir la expresión de ARNm o proteína del receptor en los tejidos del mamífero son bien conocidos por los expertos en la técnica y se han descrito con anterioridad. Los métodos para medir la unión o el transporte mediados por el receptor, de neurotrofinas y/o proneurotrofinas unidas al receptor, también son conocidos por los expertos en la técnica: dichos métodos incluyen, aunque sin restricción, el escrutinio de dos híbridos de levadura, el escrutinio de RTM de Biacore, la reticulación UV y la inmunoprecipitación.
Los métodos para medir la captación de proneurotrofinas en células de un mamífero también son bien conocidos por los expertos en la técnica: dichos métodos incluyen, aunque sin restricción, un método en el que la captación de proneurotrofina se mide en células que presentan el receptor y en células que no presentan el receptor. La proneurotrofina está marcada preferiblemente, por ejemplo, de forma radioactiva o fluorescente.
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Además se proporciona un método para modular el transporte de al menos una neurotrofina y/o proneurotrofina fuera de, o hacia el interior de una línea celular o neurona de un animal, comprendiendo dicho método la administración a dicho animal de una cantidad suficiente de un agente capaz de unirse a un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p. Dicha modulación puede comprender un aumento del transporte anterógrado de la neurotrofina y/o la proneurotrofina en la neurona. La modulación puede comprender de forma alternativa un descenso del transporte anterógrado de la neurotrofina y/o la proneurotrofina en la neurona. En otra realización preferida, la modulación comprende un aumento del transporte retrógrado de la neurotrofina y/o la proneurotrofina en la neurona. En otra realización preferida, la modulación comprende un descenso del transporte retrógrado de la neurotrofina y/o la proneurotrofina en la neurona. La modulación puede llevarse a cabo mediante un agente, tal y como se ha descrito anteriormente.
Bancos de agentes
En la presente descripción se pueden emplear bancos de compuestos para escrutar agentes capaces de inhibir la unión entre un receptor con dominio Vps10p y una proneurotrofina.
Tal y como se usa en este documento, el término "banco" se refiere a una colección de entidades moleculares o compuestos de ensayo también denominados en esta memoria "miembros del banco".
En realizaciones preferidas, el banco es un banco combinatorio. Ejemplos no limitantes de bancos combinatorios que se pueden utilizar y métodos para producir tales bancos se proporcionan en: Comprehensive Survey of Combinatorial Library Synthesis: 1998 Roland E. Dolle y Kingsley H. Nelson, Jr. J. Comb. Chem., 1999, págs. 235 -282; Comprehensive Survey of Combinatorial Library Synthesis: 1999 Roland E. Dolle J. Comb. Chem., 2000, págs. 383 433; Comprehensive Survey of Combinatorial Library Synthesis: 2000 Roland E. Dolle J. Comb. Chem., 2001, págs. 477 -517; Comprehensive Survey of Combinatorial Library Synthesis: 2001 Roland E. Dolle J. Comb. Chem., 2002, págs. 369 -418 y Comprehensive Survey of Combinatorial Library Synthesis: 2002 Roland E. Dolle J. Comb. Chem., 2003, págs. 693 -753. La persona experta apreciará que estos protocolos se pueden adaptar fácilmente a las necesidades específicas de una realización particular de la presente descripción.
En una realización, estas entidades moleculares pueden ser oligómeros naturales (oligómeros de elementos básicos que se producen en la naturaleza) tales como péptidos, glicopéptidos, lipopéptidos, ácidos nucleicos (ADN o ARN) u oligosacáridos. A modo de ejemplo, un oligómero natural puede ser cualquier péptido que consiste en un aminoácido de origen natural, incluso si dicho péptido comprende una secuencia que no está presente en la naturaleza. Los bancos pueden comprender diferentes oligómeros naturales o los bancos pueden comprender solo un tipo de oligómero natural, por ejemplo, el banco puede ser un banco de péptidos. En otra realización, pueden ser oligómeros no naturales (oligómeros que comprenden uno o varios elementos básicos que no están presentes en la naturaleza) tales como péptidos, glicopéptidos, ácidos nucleicos (ADN o ARN) u oligosacáridos modificados químicamente, y similares. Dicha modificación química puede ser, por ejemplo, el uso de elementos básicos no naturales conectados por el enlace natural que une las unidades (por ejemplo, un enlace péptido amida), el uso de elementos básicos naturales con unidades enlazantes modificadas (por ejemplo, oligoureas como se describe en Boeijen et al, 2001, J. Org. Chem., 66: 8454-8462; oligosulfonamidas como se describe en Monnee et al, 2000, Tetrahedron Lett., 41: 7991-95), o combinaciones de las mismas (por ejemplo, amidas de estatina como se describe en Dolle et al, 2000, J. Comb. Chem., 2: 716-31). Los oligómeros no naturales preferidos incluyen oligómeros que comprenden elementos básicos no naturales conectados entre sí por una unión con enlaces de origen natural. Dichos oligómeros, por lo tanto, pueden comprender una mezcla de elementos básicos de origen natural y no natural unidos entre sí por enlaces de origen natural. A modo de ejemplo, el oligómero puede comprender aminoácidos de origen natural y elementos básicos no naturales unidos por enlaces peptídicos, p. ej., PNA o LNA. Por tanto, en una realización, los oligómeros preferidos comprenden aminoácidos modificados o miméticos de aminoácidos. Otros oligómeros no naturales preferidos incluyen, por ejemplo, oligoureas, poliazatidas, oligómeros con enlaces C-C aromáticos y oligómeros con enlaces C-N aromáticos. Todavía otros oligómeros preferidos comprenden una mezcla de elementos básicos naturales y no naturales y enlaces de unión naturales y no naturales. Por ejemplo, el oligómero no natural puede ser cualquiera de los oligómeros mencionados en revisiones recientes, véanse: Graven et al., 2001, J. Comb. Chem., 3: 44152; St. Hilaire et al., 2000, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 39: 1162-79; James, 2001, Curr. Opin. Pharmacol., 1: 540-6; Marcaurelle et al., 2002, Curr. Opin. Chem. Biol., 6: 289-96; Breinbauer et al., 2002, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 41: 2879-90. Los bancos también pueden comprender oligómeros cíclicos, por ejemplo, oligómeros naturales cíclicos, tales como péptidos cíclicos u oligómeros no naturales cíclicos. En ciertas realizaciones, puede ser ventajoso usar los bancos de oligómeros cíclicos debido a la estructura rígida. Esto puede dar como resultado una selectividad y afinidad mayores.
En aún otra realización, las entidades moleculares pueden comprender moléculas no oligoméricas tales como peptidomiméticos u otras moléculas orgánicas pequeñas. Los peptidomiméticos son compuestos que imitan la acción de un mensajero peptídico, tales como peptidomiméticos bicíclicos de tiazolidina lactama de L-propil-L-leucil-glicinamida (Khalil et al., 1999, J. Med. Chem., 42: 2977-87). En una realización preferida, el banco comprende o, incluso más preferiblemente, consiste en moléculas orgánicas pequeñas. Las moléculas orgánicas pequeñas son compuestos no oligoméricos de menos de aproximadamente 600 unidades de masa que contienen cualquiera entre una variedad de posibles grupos funcionales y son el producto de una síntesis química, o se aíslan de la naturaleza, o se aíslan de la naturaleza y a continuación se modifican químicamente, e incluyen, por ejemplo, inhibidores de cinasa basados en
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de 100 a 600 segundos y de 600 a 1000 segundos, respectivamente -y se calcularon los valores Kd correspondientes a unión de pro-NGF a ~ 12 nM para p75, ~ 15 nM para TrkA y ~ 5 nM para sortilina. El proNGF humano recombinante fue producido y purificado en E. coli tal como se ha descrito (Rattenholl et al., Eur. J. Biochem. (2001) 268: 3296-3303). El resto de reactivos fueran como se ha descrito en la leyenda de la figura 2. Todos los datos proporcionados en esta figura fueron obtenidos por mediciones de resonancia de plasmones de superficie (análisis Biacore).
Figura 4: Caracterización de la unión del propéptido de proNGF a p75, TrkA y sortilina, determinada mediante análisis de plasmón superficial (BIAcore). Se midió la unión de propéptido 25-500 nM a 91,5 fmol/mm2 de proteína quimérica p75-IgG-Fc inmovilizada (panel superior), a 66 fmol/mm2 de TrkA-IgG-Fc inmovilizada (panel del medio) y a 51 fmol/mm2 de dominio extracelular de sortilina purificada (panel inferior). Se registraron las tasas de arranque (on) y apagado (off) -de 100 a 600 segundos y de 600 a 1000 segundos, respectivamente -y se calcularon los valores Kd correspondiente a propéptido de proNGF correspondientes a ~ 8 nM para sortilina. No se produjo una unión detectable con p75 y TrkA. El propéptido de NGF humano expresado en E. coli fue suministrado por Elisabeth Schwarz, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Halle/Saale, Alemania. El resto de reactivos fueron como se ha descrito en las leyendas de las figuras 2 y 3. Todos los datos proporcionados en esta figura se obtuvieron por medio de mediciones de resonancia de plasmón de superficie (análisis Biacore).
Figura 5: Este ejemplo de referencia que no forma parte de la presente invención, demuestra que es posible inhibir la unión de una proneurotrofina a un receptor con dominio Vps10p. La figura del ejemplo de referencia muestra la inhibición de la unión de proNGF a sortilina inmovilizada mediante neurotensina tal y como se mide por análisis de Biacore. La unión de proNGF 200 nM a 51 fmol/mm2 de sortilina inmovilizada es inhibida por ~ 45% después de la coinyección con neurotensina 10 µM. La unión de neurotensina sola se muestra para comparación. La neurotensina se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Todos los demás productos eran como se ha indicado anteriormente. Todos los datos proporcionados en esta figura se obtuvieron por medio de mediciones de resonancia de plasmón de superficie (análisis Biacore).
Figura 6: Este ejemplo de referencia que no forma parte de la presente invención, demuestra que es posible inhibir la unión de una proneurotrofina a un receptor con dominio Vps10p. La figura del ejemplo de referencia muestra la unión de proNGF a sortilina inmovilizada mediante RAP (proteína asociada a receptor), el propéptido de proNGF y el propéptido de sortilina. Los inhibidores se ligaron previamente a sortilina y después se realizó una inyección conjunta con proNGF 200 nM. Se han corregido los valores base correspondientes a las señales obtenidas en presencia de cada uno de los inhibidores. La unión máxima a proNGF se mide sin preincubación con los respectivos inhibidores. La unión de proNGF 200 nM a 51 fmol/mm2 de sortilina inmovilizada se inhibe en un ~65% por RAP 10 μM, en un ~85% por 5 μM del propéptido de proNGF y en un ~65% por 5 μM del propéptido de sortilina. Todos los datos proporcionados en esta figura se obtuvieron por medio de mediciones de resonancia de plasmón de superficie (análisis Biacore).
Figura 7: Caracterización de la unión de BDNF y el prodominio de proBDNF a sortilina purificada, determinada mediante resonancia de plasmón superficial (BIAcore). El BDNF humano recombinante maduro procedía de Promega (#G1491) y el prodominio de BDNF humano fusionado a GST (glutatión S-transferasa) se produjo en E. coli y se purificó mediante cromatografía de afinidad glutatión-sefarosa. La unión, del prodominio de proBDNF (una proteína de fusión con GST, panel del medio) o de BDNF (panel inferior) se midió a 94 fmol/mm2 de dominio extracelular de sortilina purificada inmovilizada. El experimento se llevó a cabo esencialmente como se ha descrito en las figuras 2
4. Se registraron las tasas de arranque (on) y apagado (off) -de 100 a 600 segundos y de 600 a 10000 segundos, respectivamente -y se calcularon los valores Kd para la unión del ligando a ~58 nM para el prodominio de GST de proBDNF y ~40 nM para BDNF maduro. Otras preparaciones de BDNF maduro han mostrado valores Kd para la unión de ligando a 10 nM. Todos los datos proporcionados en esta figura se obtuvieron por medio de mediciones de resonancia de plasmón de superficie (análisis Biacore).
Figura 8: Caracterización funcional de prodominios de neurotrofina recombinante marcada con his-S. A. Tinción de Coomassie de los polipéptidos purificados de pro-dom-NGF (residuos Glu1-Arg102) y pro-dom-BDNF (residuos Ala1-Arg110) clonados en el vector pET-30 fXa/LIC (Novagen) que añade los dos marcadores N-terminales poli-histidina y S-péptido. B, C. La presencia de ambos marcadores se verifica por transferencia Western y la detección mediante el uso de un anticuerpo primario contra histidina, seguido de incubación con anticuerpo secundario conjugado con HRP
(B) o con una versión conjugada directamente con HRP de S-proteína (C). D, E. Análisis de resonancia de plasmón superficial de la unión de los pro-dominios bacterianos de NGF (D) y BDNF (E) con el dominio extracelular inmovilizado de sortilina.
Figura 9: Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las cuatro neurotrofinas de mamífero. Un alineamiento de las secuencias de NGF, BDNF, NT-3 y NT-4/5, que muestra un alto grado de conservación de la parte madura, y mucha menos conservación de secuencia entre los pro-dominios. Los residuos conservados estrictamente se resaltan sobre un fondo negro, y los residuos conservados en parte sobre un fondo gris.
Figura 10: Análisis de manchas de la unión de pro-dom-NGF/BDNF a receptores con Vps10p incluyendo sortilina y detección con HRP-S-proteína. Las membranas que contienen péptidos solapantes de 16-meros de los cinco receptores humanos que contienen dominio Vps10p (sortilina, SorLA, SorCS1, SorCS2 y SorCS3) se incubaron en pre
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS60019B1 (sr) * 2006-12-21 2020-04-30 H Lundbeck As Modulacija aktivnosti proneurotrofina
KR101614558B1 (ko) 2008-04-27 2016-04-22 하. 룬드벡 아크티에셀스카브 인간 소르틸린의 결정 구조 및 소르틸린에 대한 리간드를 확인하기 위한 이의 용도
US9084745B2 (en) 2008-05-22 2015-07-21 H. Lundback A/S Modulation of the Vps10p-domain for the treatment of cardiovascular disease
DK2732823T3 (da) * 2008-06-25 2019-09-16 H Lundbeck As Modulering af TrpV : Vps10p-domæne-receptorsystemet til behandlingen af smerte
CN102439041B (zh) 2008-12-19 2016-05-04 H.隆德贝克有限公司 用于治疗精神和行为障碍的对Vps10p-结构域受体家族的调节
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
US9783602B2 (en) 2010-12-01 2017-10-10 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
WO2013156031A2 (en) * 2012-04-17 2013-10-24 Aarhus Universitet SorCS1 FOR USE IN THE TREATMENT OF OBESITY AND OVERWEIGHT
US20160220639A1 (en) * 2013-09-11 2016-08-04 New York University Methods and compositions for treating bone diseases
CN104774264B (zh) * 2014-01-15 2018-09-14 上海易乐生物技术有限公司 抗人proBDNF单克隆抗体及其在疼痛中的作用
WO2016164608A1 (en) 2015-04-07 2016-10-13 Alector Llc Methods of screening for sortilin binding antagonists
WO2016164637A1 (en) 2015-04-07 2016-10-13 Alector Llc Anti-sortilin antibodies and methods of use thereof
GB201512215D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
US11259554B2 (en) * 2015-12-16 2022-03-01 Diet4Life Aps Dietary peptides
US10894833B2 (en) 2017-07-20 2021-01-19 H. Lundbeck A/S Agents, uses and methods for treatment
US11833187B2 (en) 2017-10-23 2023-12-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Materials and methods for extracellular vessicle-associated diseases
SI3618928T1 (sl) 2018-07-13 2023-04-28 Alector Llc Protitelesa proti sortilinu in postopki za uporabo le-teh
GB202213124D0 (en) * 2022-09-08 2022-10-26 Univ Helsinki Psychiatric disorder

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5604202A (en) * 1990-11-13 1997-02-18 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University, A Division Of Yeshiva University Use of NGF growth factors to treat drug-induced neuropathy
WO1993008809A1 (en) * 1991-11-08 1993-05-13 The University Of Southern California Compositions containing k-252 compounds for potentiation of neurotrophin activity
US5468872A (en) * 1993-09-16 1995-11-21 Cephalon, Inc. K-252a functional derivatives potentiate neurotrophin-3 for the treatment of neurological disorders
US6291247B1 (en) * 1994-05-11 2001-09-18 Queen's University At Kingston Methods of screening for factors that disrupt neurotrophin conformation and reduce neurotrophin biological activity
US5728803A (en) * 1994-06-03 1998-03-17 Genentech, Inc. Pantropic neurotrophic factors
GB9608335D0 (en) * 1996-04-23 1996-06-26 Univ Kingston Method of enhancing ngf-mediated neurite growth with low molecular weight analoues of p.75 ngfr 367-379
AU7214998A (en) 1997-04-11 1998-11-11 Regents Of The University Of California, The Ngf for the prevention of demyelination in the nervous system
EP0994188B1 (de) 1998-10-09 2004-01-07 Scil proteins GmbH Verfahren zur Gewinnung von aktivem Beta-NGF
IT1305294B1 (it) 1999-01-29 2001-05-04 Alessandro Lambiase Uso del nerve growth factor nella terapia di patologie a carico deitessuti intraoculari.
SE9904863D0 (sv) 1999-12-30 1999-12-30 Medscand Medical Ab New use
IL142707A0 (en) * 2000-04-27 2002-03-10 Pfizer Prod Inc Methods of treating obesity using a neurotensin receptor ligand
US7507799B2 (en) 2001-05-25 2009-03-24 Cornell Research Foundation, Inc. High affinity ligand for p75 neurotrophin receptor
US7319090B2 (en) * 2002-11-27 2008-01-15 University Of North Carolina At Chapel Hill Methods of treating cerebral ischemia
US20060179492A1 (en) * 2002-12-09 2006-08-10 The Regents Of The University Of California Method of inhibiting neural transmission mediated by serotonin-2a and enhancing sensorimotor gating
US8066997B2 (en) * 2002-12-20 2011-11-29 Anders Nykjaer Modulation of activity of neurotrophins
US20060216292A1 (en) * 2003-09-05 2006-09-28 Cellzome Ag Treatment of neurodegenerative diseases
EP1682170A2 (en) * 2003-11-07 2006-07-26 Lay Line Genomics SpA Compositions able to prevent neurodegenerative processes and methods of assaying the same
RS60019B1 (sr) * 2006-12-21 2020-04-30 H Lundbeck As Modulacija aktivnosti proneurotrofina
DK2732823T3 (da) * 2008-06-25 2019-09-16 H Lundbeck As Modulering af TrpV : Vps10p-domæne-receptorsystemet til behandlingen af smerte

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