MX2007011487A

MX2007011487A - Peptidos de factor de crecimiento mecanico y su uso.

Info

Publication number: MX2007011487A
Application number: MX2007011487A
Authority: MX
Inventors: Geoffrey Goldspink; Shi Yu Yang; Paul Goldspink
Original assignee: Ucl Business Plc
Priority date: 2005-03-18
Filing date: 2006-03-20
Publication date: 2009-02-16
Also published as: EA200702012A1; EA013230B1; US20060211606A1; BRPI0608450A2; WO2006097682A1; JP2008533114A; CN101300269A

Abstract

Esta invención se refiere a polipéptidos biológicamente activos derivados del péptido E que forma el C-término de la variante de empalme del factor I del crecimiento tipo insulina (IGF-I) conocida como factor de crecimiento mecánico (MGF). Estos péptidos se modifican para mejorar su estabilidad en comparación al péptido E que se presenta de forma natural.

Description

PEPTIDOS DE FACTOR DE CRECIMIENTO MECANICO Y SU USO Campo de la Invención Esta invención se refiere a polipéptidos biológicamente activos derivados del dominio E que forma el C-término de la variante de empalme del factor I de crecimiento tipo insulina (IGF-I, por sus siglas en inglés) conocida como factor de crecimiento mecánico (MGF, por sus siglas en inglés) . Estos péptidos se modifican para mejorar su estabilidad en comparación al péptido de dominio E que se presenta de forma natural.

Antecedentes de la Invención Los polipéptidos de IGF-I de mamífero tienen varias isoformas, que surgen como resultado del empalme alternativo de ARNm. En general, hay dos tipos de isoformas, las isoformas tipo hígado y las tipos no hígado. Las isoformas tipo hígado se pueden expresar en el hígado o en otro sitio pero, si se expresan en otro sitio, son equivalentes a aquéllas expresadas en el hígado. Tienen una acción sistemática y son las isoformas principales en los mamíferos. Las isoformas de tipo no hígado son menos comunes y algunas se cree que tienen una acción autocrina/paracrina . La isoforma de MGF a la cual se refiere esta invención es de este último tipo.

REF. : 186336 En el MGF (Yang et al., 1996; McKoy et al, 1999), el empalme alternativo introduce una inserción que cambia el cuadro de lectura de la porción C-terminal de la molécula. Esta inserción es de 49 pares de base de larga en el MGF humano. Una inserción de 52 pares de base tiene un efecto similar en MGF de rata y de conejo. El resultado es que MGF es ligeramente más largo que el IGF-I tipo hígado (debido a que el codón finalizador aparece después debido al cambio del cuadro de lectura) y a que el dominio E C-terminal tiene una secuencia diferente. También es más pequeño en conjunto debido a que carece de glicosilación . En el MGF humano, el C-término se forma por un dominio E de 24 aminoácidos, algunas veces llamado un péptido Ec (SEQ ID NO: 27) . En el MGF de rata y de conejo, los dominios E correspondientes, algunas veces llamados péptidos Eb, son de 25 aminoácidos de longitud (SEQ ID NOS: 13/14) . El IGF-I tipo hígado contiene en cambio un péptido Ea en el C-término. Las secuencias de los péptidos Ea y Ec/Eb no están relacionadas entre sí debido al cambio del cuadro de lectura analizado anteriormente. La presencia de una variante de empalme con lo que ahora se puede ver que es la C-terminal de MGF se señaló primero por Chew et al (1995), quien la identificó en el tejido hepático durante estudios en pacientes que padecen de cáncer de hígado, pero no la investigó para nada en términos de la función potencial o significado terapéutico. Goldspink y colaboradores han identificado ya el MGF para el uso contra trastornos del músculo esquelético, notablemente en distrofia muscular; para el uso contra trastornos de músculo cardiaco, notablemente en la prevención o limitación de daño miocardiaco en respuesta a isquemia o sobrecarga mecánica del corazón; para el tratamiento de trastornos neurológicos en general; y para la reparación de nervios en particular (WO 97/33997; WO 01/136483; WO 01/85781; WO 03/066082). Está llegando a ser cada vez más claro que el IGF-I tipo hígado y el MGF tiene diferentes papeles y funciones. De esta manera, Hill y Goldspink (2003) han mostrado que, en el músculo tibialis anterior de rata, se expresa rápidamente el MGF en respuesta a daño mecánico provocado por estimulación eléctrica o que resulta de la inyección de bupivacaína, pero que en su expresión entonces declina en el espacio de pocos días. Por el contrario, el IGF-I tipo hígado se favorece más lentamente y su incremento está en proporción con la declinación de la expresión de MGF. Además, Yang y Goldspink (2002) han mostrado, usando la línea de células musculares C2C12 como un modelo in vitro, que un péptido de 24 aminoácidos relacionado al péptido Ec del C-término de MGF humano, pero con histidina en la posición penúltima en lugar de la Arginina nativa, y una cisteína C-terminal adicional, tiene una actividad distinta en comparación a aquélla del IGF-I maduro ya que incrementa la proliferación de mioblastos pero inhibe la formación de miotubos. Dluzniewska et al (Septiembre del 2005) han demostrado también un fuerte efecto neuroprotector del péptido relacionado, nuevamente con histidina en la posición penúltima en lugar de la Arginina nativa y algunas modificaciones por medio de conversión de L-Arginina a D-Arginina en las posiciones 14 y 15, más la amidación C-terminal y la PEGilación.

Breve Descripción de la Invención Sin embargo, los presentes inventores han encontrado que el péptido Ec C-terminal nativo de MGF humano tiene una breve vida media en plasma humano. Por lo tanto, el establecimiento de modificaciones puede mejorar su potencial para el uso como un producto farmacéutico . Los inventores también han demostrado que los péptidos E C-terminales estabilizados de MGF tienen propiedades neuroprotectoras y cardioprotectoras , así como la capacidad para incrementar la resistencia del músculo esquelético distrófico y normal. Por consiguiente, la invención proporciona un polipéptido que comprende hasta 50 residuos de aminoácidos; el polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada del péptido E C-terminal de una isoforma de Factor de Crecimiento Mecánico (MGF) del Factor I de Crecimiento Tipo Insulina (IGF- I); el polipéptido que incorpora una o más modificaciones que le dan estabilidad incrementada en comparación al péptido E no modificado de MGF; y el polipéptido que posee actividad biológica. La invención también proporciona un polipéptido extendido que comprende un polipéptido de la invención, extendido por la secuencia de aminoácidos no tipo silvestre, N-terminal y/o C-terminal al polipéptido. La invención también proporciona una composición que comprende un polipéptido o polipéptido extendido de la invención y un portador. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido o polipéptido extendido de la invención y un portador f rmacéuticamente aceptable . La invención también proporciona un polipéptido o polipéptido extendido de la invención para el uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal . La invención también proporciona un método para tratar un trastorno muscular al administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un polipéptido 0 polipéptido extendido de la invención. El trastorno muscular puede ser, por ejemplo, un trastorno del músculo esquelético o un trastorno del músculo cardiaco. La invención también proporciona un método para tratar un trastorno neurológico al administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un polipéptido o polipéptido extendido de la invención. La invención también proporciona el uso de un polipéptido o polipéptido extendido de la invención en la elaboración de un medicamento para el uso en un tratamiento como se define anteriormente. La invención también proporciona un método para tratar un trastorno neurológico al administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de: Un polipéptido que comprende hasta 50 residuos de aminoácido, y polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada del péptido E C-terminal de una isoforma del factor de crecimiento mecánico (MGF) del factor 1 de crecimiento tipo insulina (IGF-I) , o un polipéptido extendido que comprende el polipéptido y extendido por la secuencia de aminoácidos no tipo silvestre N-terminal y/o C-terminal al polipéptido; y El polipéptido o polipéptido extendido que posee actividad biológica. La invención también proporciona un método para tratar un trastorno del músculo cardiaco al administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de: un polipéptido que comprende hasta 50 residuos de aminoácido, polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada del péptido E C-terminal de una isoforma del factor de crecimiento mecánico (MGF) del factor I de crecimiento tipo insulina (IGF-I) ; o un polipéptido extendido que comprende el polipéptido y extendido por la secuencia de aminoácidos no tipo silvestre N-terminal y/o C-terminal al polipéptido; y el polipéptido que posee actividad biológica. La invención también proporciona el uso de un polipéptido que comprende hasta 50 residuos de aminoácido, y polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada del péptido E C-terminal de una isoforma del factor de crecimiento mecánico (MGF) del factor I de crecimiento tipo insulina (IGF-I) , o un polipéptido extendido que comprende el polipéptido y extendido por la secuencia de aminoácidos no tipo silvestre N-terminal y/o C-terminal al polipéptido; y el polipéptido que posee actividad biológica; en la elaboración de un medicamento para el uso en el tratamiento de un trastorno neurológico o un trastorno del músculo cardiaco.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Alineación de secuencias, que muestra secuencias codificadas por parte de la secuencia de cada uno de MGF humano, de rata y de conejo e IGF-I tipo hígado, de humano, de rata y de conejo (aminoácidos 26 a 110 de SEQ ID NO: 2 y de 26 a 111 de SEQ ID NOS: 4 y 6; ver posteriormente) , y resaltando las diferencias entre MGF e IGF-I tipo hígado en el C-término; creado por inserción de 49 pares de base en MGF humano e inserción de 52 pares de base en MGF de rata/conejo, que conduce a un cambio del cuadro de lectura y divergencia en el C-término. Figura 2 : Efecto de sustitución de Alanina y el truncamiento C-terminal y C-terminal en la estabilidad y actividad biológica.- alineación adicional de secuencias, que compara secuencias modificadas de los péptidos 1-6 (SEQ ID NOS 15-20) y péptidos cortos 1-4 (SEQ ID NOS: 21-24), y que detalla el impacto de los cambios en la estabilidad como se mide por incubación en plasma humano y actividad biológica como se mide al probar en la línea de células musculares (ver ejemplos para detalles de procedimientos de prueba) . En la Figura, las primeras dos columnas del lado izquierdo identifican los péptidos y dan sus secuencias, identificando los cambios hechos por medio de sustitución. La tercera columna da los resultados de las pruebas para estabilidad (ver Ejemplo 5 para detalles) y la final en el lado derecho da los resultados de las pruebas para actividad biológica (nuevamente, ver Ejemplo 5 para detalles) . Figura 3A Y 3B muestran el incremento en resistencia de un músculo distrófico murino después de inyección de péptido estabilizado después de 3 semanas. Figura 3A Porcentaje de cambio en fuerza tetánica en músculo distrófico de ratones mdx después de inyección de péptido estabilizado (columna izquierda) e IGF (columna derecha) . Figura 3B Por ciento de cambio en fuerza tetánica en músculo distrófico de ratones mdx después de inyección de péptido estabilizado (columna izquierda) y control de vehículos con PBS (columna derecha) . Figura 4: Cardioprotección después de la administración de péptido estabilizado.- Comparación de fracciones de expulsión logradas después de la administración a corazón ovino infartado de péptido estabilizado (tercera columna, referida como "dominio Ec"), MGF de longitud completa (cuarta columna) , IGF-I maduro (segunda columna) y preparación de control (primera columna) . Figura 5: Datos de circuito de presión/volumen que muestran conservación de la función después de miocardia en fracción (MI) para ventrículo murino (superior derecha) normal (superior izquierda) e infartado (MI) , y se muestra el efecto del péptido estabilizado distribuido sistemáticamente al corazón MI (derecha fondo, referido como "péptido de MGF" ) y el corazón normal (fondo izquierda) . Todos los paneles muestran la presión (mm de Hg) en el eje Y, y las Unidades Relativas de Volumen en el eje X. Figura 6: Efectos neuroprotectores en sistema de corte de cerebro de rata.- de izquierda a derecha, porcentaje de células muertas después de tratamiento con péptido estabilizado (referido como "MGF") , IGF-I, TBH, TBH + péptido estabilizado (24 horas) , TBH + IGF-I (24 horas) , TBH + péptido estabilizado (48 horas) , TBH + IGF-I (48 horas) . Figura 7 : Transferencias Western que demuestran la mayor estabilidad del péptido estabilizado que incorpora conversión de Arginina desde la forma L a D y PEGilación N-terminal . - La estabilidad del péptido estabilizado en comparación a una correspondiente que carece de las conversiones de la forma L a D y PEGilación N- terminal se investigó por incubación en plasma humano fresco para una variedad de diferentes intervalos de tiempo. Entonces se usó la transferencia Western para valorar la supervivencia de cada péptido con respecto a estos intervalos de tiempo: A = 0 minutos; B = 30 minutos; C - 2 horas; D = 24 horas. Los resultados para el péptido con conversión L-D y PEGilación N-terminal se muestran a la derecha; aquéllos para el péptido que carece de la conversión de la forma L a D y la PEGilación N-terminal están a la izquierda. Las Figuras 8A-8B muestran los efectos de péptidos C-terminales de 8 aminoácidos en la proliferación de células musculares C2C12: Figura 8A Péptidos DMGF y CMGF: Se proporcionaron células C2C12 a 2000 células/concavidad, en un medio que contiene DMEM (1000 mg/L de glucosa) , más BSA (100 ug/ml) , más IGF-I (2 ng por mi) y se incubó durante 36 horas. Entonces se valoró la proliferación celular usando un ensayo de azul de Alamar. El grupo izquierdo de lecturas muestra los resultados para experimentos con concentraciones del péptido DMGF (ver Ejemplo 1.3.1 para detalles) de 2 , 5, 50 y 100 ng/ml. El grupo intermedio de lecturas muestra los resultados para experimentos con concentraciones del péptido CMGF (ver Ejemplo 1.3.1 para detalles) de 2 , 5, 50 y 100 ng/ml. El grupo izquierdo de lecturas muestra los resultados para experimentos con concentraciones de IGF-I solo (ver Ejemplo 1.5 para detalles) de 2, 5, 50 y 100 ng/ml. Los valores en el eje Y son fluorescencia (longitud de onda de excitación de 535 nm, medición a 590 nm; media más error estándar) en un ensayo de Azul de Alamar. Figura 8B Péptidos A2 , A4 , A6 y A8 : Células musculares C2C12 a 500 células/concavidad. Se llevó a cabo el cultivo durante 24 horas en FBS al 10 %, seguido por inanición durante 24 horas en BSA al 0.1 %, estimulación durante 24 horas y luego tratamiento con BrdU durante 5 horas. Se probaron concentraciones de 0.1, 1, 10 y 100 ng/ml de péptidos A2 , A4 , A6 y A8 , junto con 0.1, 1, 10 y 100 ng/ml de IGF-I (ver el conjunto derecho de resultados) . Se midió la incorporación de BrdU para valorar el nivel de proliferación celular lograda. También se proporcionaron controles que no contienen células, sólo medio, 5 % de FBS y sin BrdU. Los valores en el eje Y son para fluorescencia (absorbencia a 370 nm; media más error estándar a través de 4 concavidades) . La primera columna en la izquierda se refiere a un control en el cual no estuvieron presentes células. La siguientes cuatro se refieren al péptido A2 a concentraciones de 0.1, 1, 10 y 100 ng/ml. Las siguientes cuatro se refieren al péptido A4 a concentraciones de 0.1, 1, 10 y 100 ng/ml. Las tres centrales se refieren a controles que contienen sólo medio (med) , 5 % de FBS) y sin BrdU. Las siguientes cuatro se refieren al péptido A6 a concentraciones de 0.1, 1, 10 y 100 ng/ml. Las siguientes cuatro se refieren al péptido A8 a concentraciones de 0.1, 1.10 y 100 ng/ml. El grupo de la derecha de resultados se refiere a IGF-I (ver Ejemplo 1.5) a concentraciones de 0.1, 1, 10 y 100 ng/ml. Las Figuras 9A y 9B muestran el efecto en la proliferación en células HSMM Figura 9A Péptido A5 : Células HSMM a 500 células/concavidad. Se llevó a cabo el cultivo durante 24 horas en FCS al 10 %, seguido por dos lavados en medio libre de suero, estimulación durante 48 horas y luego tratamiento con BrdU durante 5 horas . Se probaron concentraciones de 0.1, 1, 10, 100 y 500 ng/ml del péptido A5 , en combinación con 2 ng/ml de IGF-I, junto con 0.1, 1, 10 y 100 ng/ml de IGF-I. Se midió la incorporación de BrdU para valorar el nivel de proliferación celular lograda. También se proporcionaron controles que contienen medio complementado con 2 ng/ml de IGF-I, sin células (BLK) , y FBS al 10 %. Los valores en el eje Y son para fluorescencia (absorbencia a 370 nm; media más error estándar a través de 4 concavidades) . Las primeras cinco columnas se refieren al péptido A5 a concentraciones de 0.1, 1, 10, 100 y 500 ng/ml. Las siguientes tres se refieren a IGF-I (ver Ejemplo 1.5) sólo a concentraciones de 100, 10 y 0.1 ng/ml. Las siguientes tres se refieren a controles que contienen FBS al io %, tinción de fondo y sin células respectivamente. * significa P < 0.05 en comparación al control con solo medio . Figura 9B Péptido A5 : Células HSMM a 500 células/concavidad. Se llevó a cabo el cultivo durante 24 horas en FCS al 10 %, seguido por dos lavados en medio libre de suero, estimulación durante 48 horas y luego tratamiento con BrdU durante 5 horas. Se probaron concentraciones de 0.1, 1, 10, 100 y 500 ng/ml del péptido A5 , en combinación con 2 ng/ml de IGF-I, junto con 0.1, 1, 10 y 100 ng/ml de IGF-I. Se midió la incorporación de BrdU para valorar el nivel de proliferación celular lograda. También se proporcionaron controles que contienen medio complementado con 2 ng/ml de IGF-I, sin células (BLK) , y FBS al 10 %. Los valores en el eje Y son para fluorescencia (absorbencia a 370 nm; media más error estándar a través de 4 concavidades) . Las primeras cinco columnas se refieren al péptido A5 a concentraciones de 0.1, 1, 10, 100 y 500 ng/ml. Las siguientes tres se refieren a IGF-I (ver Ejemplo 1.5) sólo a concentraciones de 100, 10 y 0.1 ng/ml. Las siguientes tres se refieren a controles que contienen FBS al 10 %, medio complementado con 2 ng/ml de IGF-I y sin células respectivamente. * significa P < 0.01 y ** significan P < 0.001 en comparación a control de medio que contiene 2 ng/ml de IGF-I. Las Figuras 10A-10B muestran el efecto en la proliferación en células HSMM Figura 10A Péptido A5 : Células HSMM a 500 células/concavidad. Se llevó a cabo el cultivo durante 24 horas en FCS al 10 %, seguido por dos lavados en medio libre de suero, estimulación durante 48 horas y luego tratamiento con BrdU durante 5 horas. Se probaron concentraciones de 0.1, 1, 10, 100 y 500 ng/ml del péptido A5 , con 0.1, 1, 10 y 100 ng/ml de IGF-I. Se midió la incorporación por BrdU para valorar el nivel de proliferación celular lograda. También se proporcionaron controles que contienen sólo medio, sin células (BLK) , tinción de fondo (BG) y FBS al 10 %. Los valores en el eje Y son para fluorescencia (absorbencia a 370 nm; media más error estándar a través de 4 concavidades) . Las primeras cinco columnas se refieren al péptido A5 e concentraciones de 0.1, 1, 10, 100 y 500 ng/ml.

La siguiente columna se refiere al control que contiene sólo medio. Las siguientes tres se refieren a IGF-I (ver Ejemplo 1.5) sólo a concentraciones de 100, 10 y 0.1 ng/ml. Las siguientes tres se refieren a controles que contienen FBS al 10 %, tinción de fondo y sin células respectivamente. * significa P < 0.05 en comparación a control con sólo medio . Figura 10B Péptido A5 : Células HSMM a 500 células/concavidad. Se llevó a cabo el cultivo durante 24 horas en FCS al 10 %, seguido por dos lavados en medio libre de suero, estimulación durante 48 horas y luego tratamiento con BrdU durante 5 horas. Se probaron concentraciones de 0.1, 1, 10, 100 y 500 ng/ml del péptido A5 , en combinación con 2 ng/ml de IGF-I, junto con 0.1, 1, 10 y 100 ng/ml de IGF-I. Se midió la incorporación de BrdU para valorar el nivel de proliferación celular lograda. También se proporcionaron controles que contienen medio complementado con 2 ng/ml de IGF-I, sin células (BLK) , tinción de fondo (BG) y FBS al 10 %. Los valores en el eje Y son para fluorescencia (absorbencia a 370 nm; media más error estándar a través de 4 concavidades) . Las primeras cinco columnas se refieren al péptido A5 a concentraciones de 0.1, 1, 10, 100 y 500 ng/ml. La siguiente columna se refiere al control que contiene medio complementado con 2 ng/ml de IGF-i únicamente. Las siguientes tres se refieren a IGF-I (ver Ejemplo 1.5) sólo a concentraciones de 100, 10 y 0.1 ng/ml. Las siguientes tres se refieren a controles que contienen FBS al 10 %, tinción de fondo y sin células respectivamente. * significa P < 0.1 en comparación al control de medio que contiene 2 ng/ml de IGF-I. Las Figuras 11A-11B muestran el efecto en la proliferación en células HSMM Figura 11A Péptido A5 : Células HSMM a 1000 células/concavidad. Se llevó a cabo el cultivo durante 24 horas en FCS al 10 %, seguido por dos lavados en medio libre de suero, estimulación durante 48 horas y luego tratamiento con BrdU durante 5 horas . Se probaron concentraciones de 0.1, 1, 10, 100 y 500 ng/ml del péptido A5 , junto con 0.1, 1, 10 y 100 ng/ml de IGF-I. Se midió la incorporación de BrdU para valorar el nivel de proliferación celular lograda.

Se proporcionaron también controles que contienen sólo medio, sin células (BLK) , tinción de fondo (BG) y FCS al 10 %. Los valores en el eje Y fueron para fluorescencia (absorbencia a 370 nm; media más error estándar a través de 4 concavidades) . Las primeras cinco columnas se refieren al péptido A5 a concentraciones de 0.1, 1, 10, 100 y 500 ng/ml . La siguiente columna se refiere al control que contiene sólo medio. Las siguientes tres se refieren a IGF-I (ver Ejemplo 1.5) sólo a concentraciones de 100, 10 y 0.1 ng/ml. Las siguientes tres se refieren a controles que contienen FCS al 10 %, tinción de fondo y sin células, respectivamente. Figura 11B Péptido A5 : Células HSMM a 1000 células/concavidad. Se llevó a cabo el cultivo durante 24 horas en FCS al 10 %, seguido por dos lavados en medio libre de suero, estimulación durante 48 horas y luego tratamiento con BrdU durante 5 horas . Se probaron concentraciones de 0.1, 1, 10, 100 y 500 ng/ml del péptido A5 en combinación con 2 ng/ml de IGF-I, junto con 0.1, 1, 10 y 100 ng/ml de IGF-I. Se midió la incorporación de BrdU para valorar el nivel de proliferación celular lograda. También se proporcionaron controles que contienen medio complementado con 2 ng/ml de IGF-I, sin células (BLK) , tinción de fondo (BG) y FBS al 10 %. Los valores en el eje Y son para fluorescencia (absorbencia a 370 nm; media más error estándar a través de 4 concavidades) . Las primeras cinco columnas se refieren al péptido A5 a concentraciones de 0.1, 1, 10, 100 y 500 ng/ml. La siguiente columna se refiere al control que contiene medio complementado con 2 ng/ml de IGF-I únicamente. Las siguientes tres se refieren a IGF-I (ver Ejemplo 1.5) sólo a concentraciones de 100, 10 y 0.1 ng/ml. Las siguientes tres se refieren a controles que contienen FBS al 10 %, tinción de fondo y sin células, respectivamente. * significa P < 0.1 en comparación al control de medio que contiene 2 ng/ml de IGF-I.

Información de Secuencia Las secuencias de ADN y de aminoácidos del ADN de MGF de humano, de rata y de conejo se dan en el listado de secuencias como SEQ ID NOS: 1/2, 3/4 y 5/6, respectivamente. Éstas se llaman secuencias de MGF de longitud completa ya que representan MGF maduro codificado por los exones 3/4/5/6 del gen de IGF-I, incluyendo la inserción de 49/52 pares de base que cambia el cuadro de lectura y crea el C-término característico de MGF. Los exones 1 y 2 son secuencias guía alternativas. Para comparación, las secuencias de ADN y de aminoácidos correspondientes del IGF-I tipo hígado de humano, rata y conejo se dan en SEQ ID NOS: 7/8, 9/10 y 11/12, respectivamente. Una comparación de las seis secuencias de aminoácidos, desde el comienzo de la secuencia codificada por el exon 4 hacia delante, se hace en la Figura 1. La secuencia del péptido Eb nativo de rata (25 aminoácidos; aminoácidos 87-111 de SEQ ID NO: 4) del C-término de MGF de rata se da como SEQ ID NO: 13. La secuencia del péptido Eb nativo de conejo (25 aminoácidos; aminoácidos 87-111 de SEQ ID NO: 6) del C-término de MGF de conejo se da como SEQ ID NO: 14. La secuencia del péptido Ec nativo de humano (24 aminoácidos; aminoácidos 87-110 de SEQ ID NO: 2) del C-término de MGF de humano se da como SEQ ID NO: 27. Las secuencias modificadas derivadas del péptido de SEQ ID NO: 27 se dan como SEQ ID NO: 28 a 32. En SEQ ID NO: 28, se reemplaza Serina con Alanina en la posición 5. En SEQ ID NO: 29, se reemplaza Serina con Alanina en la posición 12. En SEQ ID NO: 30, se reemplaza Serina con Alanina en la posición 18. En SEQ ID NO: 31, se reemplaza Arginina con Alanina en la posición 14. En SEQ ID NO: 32, se reemplaza Arginina con Alanina en la posición 14 y se reemplaza también Arginina con Alanina en la posición 15. El péptido Ec nativo de humano tiene Arginina en su posición penúltima. Una variante del péptido nativo con Histidina en la posición penúltima se ha sintetizado y se muestra en SEQ ID NO: 15. Este péptido también se describe como Péptido 1 en la Figura 2. SEQ ID NO: 26 representa la secuencia de MGF humano de longitud completa que incorpora Histidina en la posición penúltima en lugar de Arginina. SEQ ID NO: 25 es una secuencia de codificación de ADN para SEQ ID NO: 26, en la cual la Histidina en la posición penúltima se codifica por CAC y la secuencias restante es la misma como en SEQ ID NO: 1. Las secuencias modificadas derivadas del péptido de SEQ ID NO: 15 se dan como SEQ ID NOS: 16 a 24. Éstas se comparan al péptido de SEQ ID NO: 15 y otra en la Figura 2. En el Péptido 2 (SEQ ID NO: 16) , se reemplaza Serina con Alanina en la posición 5. En el Péptido 3 (SEQ ID NO: 17) , se reemplaza Serina con Alanina en la posición 12. En el Péptido 4 (SEQ ID NO: 18) , se reemplaza Serina con Alanina en la posición 18. En el Péptido 5 (SEQ ID NO: 19) , se reemplaza Arginina con Alanina en la posición 14. En el Péptido 6 (SEQ ID NO: 20) , se reemplaza Arginina con Alanina en la posición 14 y también se reemplaza Arginina con Alanina en la posición 15. En el péptido Corto 1 (SEQ ID NO: 21) , se remplaza Arginina con Alanina en la posición 14 y se remueven los dos aminoácidos C- terminales . En el péptido Corto 2 (SEQ ID NO: 22) , se remplaza Arginina con Alanina en la posición 14 y se remueven los cuatro aminoácidos C-terminales . En el péptido Corto 3 (SEQ ID NO: 23) , se remplaza Arginina con Alanina en la posición 14 y se remueven los tres aminoácidos N-terminales . En el péptido Corto 4 (SEQ ID NO: 24) , se remplaza Arginina con Alanina en la posición 14 y se remueven los cinco aminoácidos N-terminales . También incluyen cuatro secuencias peptídicas de 8 aminoácidos en el Listado de Secuencias. SEQ ID NO: 33 son los 8 aminoácidos C-terminales de la secuencia variante de SEQ ID NO: 15, que contiene Histidina en la posición penúltima. SEQ ID NO: 34 son los 8 aminoácidos C-terminales del C- término de MGF humano nativo de SEQ ID NO: 27, que contiene Arginina en la posición penúltima. SEQ ID NO: 35 es la secuencia de SEQ ID NO: 33 con Serina en la posición 2 sustituida con Alanina. Por lo tanto, esto corresponde a los 8 aminoácidos C-terminales de SEQ ID NO: 18 (Péptido 4) . SEQ ID NO: 36 es la secuencia de SEQ ID NO: 34 con Serina en la posición 2 sustituida con Alanina. Por lo tanto, esto corresponde a los 8 aminoácidos C-terminales de SEQ ID NO: 30. Para facilidad de referencia, estas secuencias también se describen en la siguiente tabla.

SEQ ID NO: Descripción ("aa" denota "aminoácido") 1 IGF-l-Ec humano de longitud completa (= MGF) (nucleotido y aminoácido) 2 IGF-l-Ec humano de longitud completa (= MGF) (sólo aminoácido) 3 IGF-l-Eb de rata de longitud completa (= MGF de rata) (nucleotido y aminoácido) 4 IGF-l-Eb de rata de longitud completa (= MGF de rata) (sólo aminoácido) 5 IGF-l-Eb de conejo de longitud completa (= MGF de conejo) (nucleotido y aminoácido) 6 IGF-l-Eb de conejo de longitud completa (= MGF de conejo) (sólo aminoácido) 7 IGF-1 tipo hígado humano de longitud completa (nucleotido y aminoácido) 8 IGF-1 tipo hígado humano de longitud completa (sólo aminoácido) 9 IGF-1 tipo hígado de rata de longitud completa (nucleotido y aminoácido) 10 IGF-1 tipo hígado de rata de longitud completa (sólo aminoácido) SEQ ID NO: Descripción ("aa" denota "aminoácido") 25 Secuencia de SEQ ID NO: 1 con Argl09 ? His (nucleótido y aminoácido) 26 Secuencia de SEQ ID NO: 2 con Argl09 - His (sólo aminoácido) 27 Péptido sintético que corresponde a, aa 87-110 de SEQ ID NO: 2 28 Péptido de SEQ ID NO: 27 con Ser5 ? Ala 29 Péptido de SEQ ID NO: 27 con Serl2 ? Ala 30 Péptido de SEQ ID NO: 27 con Serl8 ? Ala 31 Péptido de SEQ ID NO: 27 con Argl4 ? Ala 32 Péptido de SEQ ID NO: 27 con Argl4 ? Ala, Argl5 ? Ala 33 Péptido que corresponde a los 8 aminoácidos C- terminales de SEQ ID NO: 15 34 Péptido que corresponde a los 8 aminoácidos C- terminales de SEQ ID NO: 27 35 Péptido que corresponde a los 8 aminoácidos C- terminales de SEQ ID NO: 18 36 Péptido que corresponde a los 8 aminoácidos C- terminales de SEQ ID NO: 30 Descripción Detallada de la Invención Polipéptidos y Polipéptidos Extendidos de la Invención Polipéptidos de la invención Los polipéptidos de la invención son de hasta 50 residuos de aminoácido de longitud. Por ejemplo, pueden ser de hasta 10 aminoácidos de longitud, hasta 30 aminoácidos de longitud, por ejemplo, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 aminoácidos de longitud, o hasta 35, 40, 45 ó 50 aminoácidos de longitud. De manera preferente, son de 15 a 30 aminoácidos de longitud, de manera más preferente de 20 a 28, de manera más preferente 22, 23, 24 ó 25 aminoácidos de longitud. También se prefieren los polipéptidos de 5 a 10 aminoácidos de longitud, es decir, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos de longitud, especialmente aquéllos de 8 aminoácidos de longitud . Un polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos derivada del péptido E C- terminal de una isoforma de MGF de IGF-I. Una isoforma de MGF es, como se analiza anteriormente, una en la cual el empalme alternativo introduce en el ARNm una inserción que alarga y cambia el cuadro de lectura del péptido E C- terminal encontrado en el C- término de IGF-I para crear un péptido Ec o Eb. Típicamente, una isoforma de MGF tendrá al menos 80 %, de manera preferente 85 % ó 90 % de identidad de secuencia a uno de los MGF de SEQ ID NOS: 2, 4 ó 6. En el MGF humano (SEQ ID NOS: 1 y 2) , la inserción es de 49 pares de base y el péptido E C- terminal se conoce como un péptido Ec (SEQ ID NO: 27) , que es de 24 aminoácidos de longitud.

En el MGF de rata y de conejo (SEQ ID NOS: 3-6), la inserción de 49 pares de base y los péptidos E C-terminales se conocen como péptidos Eb, que son de 25 aminoácidos de longitud (SEQ ID NOS: 13 y 14). La secuencia de la invención se puede derivar de cualquiera de estos péptidos E C-terminales de MGF o de otro péptido E C-terminal del MGF de cualquier otra especie. La secuencia comprendida en el polipéptido de la invención y derivada del péptido E C-terminal de una isoforma de MGF se puede derivar del péptido E C-terminal de cualquier manera, en tanto que se cumplan los requerimientos de actividad biológica y estabilidad (ver posteriormente) . En particular, la secuencia se puede derivar del péptido E C-terminal de MGF en el sentido que tiene exactamente la secuencia del péptido E C-terminal (por ejemplo, SEQ ID NO: 13, 14, 27 ó 34) y no sólo está presente dentro de una molécula de MGF de longitud completa. También se puede derivar del péptido E C-terminal de MGF en el sentido que su secuencia se altera (ver "modificaciones" posteriormente) , nuevamente en tanto que se cubren los requerimientos para actividad biológica y estabilidad (ver posteriormente) . Hasta la longitud máxima de 50 aminoácidos, el polipéptido también puede comprender la secuencia nativa de MGF N-terminal a la secuencia derivada del péptido E C-terminal. De manera alternativa, cualquier secuencia adicional puede no ser derivada de MGF, es decir, puede ser cualquier secuencia, en tanto que nuevamente se cumplan los requerimientos de actividad biológica y estabilidad (ver posteriormente) . La secuencia derivada del péptido E C-terminal de MGF puede incluir al menos 10, al menos 15 o al menos 20 aminoácidos, por ejemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 aminoácidos en el caso del péptido Ec C-terminal de MGF humano o 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 aminoácidos en el caso del péptido Eb C- terminal de MGF de rata o conejo. De manera alternativa, puede incluir hasta 10 aminoácidos, de manera preferente 5 a 10 aminoácidos, es decir, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos, especialmente 8 aminoácidos . Los polipéptidos o polipéptidos extendidos de la invención se pueden montar conjuntamente para formar estructuras grandes que contienen dos o más polipéptidos de la invención, por ejemplo múltiples copias del mismo polipéptido o polipéptidos extendidos de la invención o una mezcla de diferentes. Dependiendo de la naturaleza de los polipéptidos y en particular de si contienen alguna conversión L-D (ver posteriormente) , estas estructuras se pueden elaborar como proteínas de fusión, normalmente por expresión recombinante por técnicas normales de ADN codificante, o montar de manera sintética, o expresar como proteínas de fusión y luego someter a modificaciones químicas apropiadas .

Polipéptidos Extendidos de la Invención Un polipéptido extendido de la invención comprende un polipéptido de la invención, extendido por secuencia tipo no silvestre. Por esto se quiere decir que cualquier secuencia de extensión es una secuencia no de MGF ya que, si el N-término o el C-término del polipéptido de la invención representan la secuencia nativa de MGF, entonces esta secuencia simplemente no se puede unir a ninguna secuencia que se una en el MGF nativo. Aparte de esto, una extensión puede tener cualquier secuencia. De esta manera, los polipéptidos de la invención se pueden extender en cualquiera o ambos del C- y N-términos por una secuencia de aminoácidos de cualquier longitud. Por ejemplo, una extensión puede comprender hasta 5, hasta 10, hasta 20, hasta 50, o hasta 100 ó 200 o más aminoácidos. Típicamente, cualquier extensión será corta, por ejemplo, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 Ó 10 aminoácidos de longitud. Una extensión puede contener, o consistir aún completamente de los aminoácidos de la forma D (ver posteriormente) , por ejemplo, para reducir el ataque por exopeptidasa . Por ejemplo, se puede extender un polipéptido por 1 a 5 aminoácidos de la forma D en uno o ambos extremos. Por ejemplo, en algunas modalidades se puede incorporar un residuo adicional de cisteina en el C-término.

Modificaciones Un polipéptido o polipéptido extendido de la invención se puede modificar de cualquier manera que incremente su estabilidad en comparación al péptido E no modificado que comprende una secuencia derivada del mismo. Se puede incrementar la estabilidad de varias maneras. Por ejemplo, se contempla que las modificaciones (por ejemplo, PEGilación u otras modificaciones químicas o la conversión de aminoácidos de la forma L-D) o los C- y/o N-términos de la proteína lo protegerán contra el ataque de exopeptidasa, puesto que lo ciclisarán, y esas modificaciones internas (por ejemplo, sustitución, supresión, inserción y conversión de la forma L-D interna) lo protegerán contra la escisión por endopeptidasas al romper sus sitios de escisión. Por ejemplo, se puede PEGilar, de manera preferente en el N-término al grado que se puede controlar la ubicación de la PEGilación, aunque la PEGilación en otros sitios, tal como el C-término o entre el C- y el N-términos también se contempla. La PEGilación comprende la unión covalente de PEG al polipéptido. Se puede usar cualquier tipo adecuado de PEG, por ejemplo, cualquier peso molecular adecuado, en tanto que el polipéptido PEGilado resultante satisfaga los requerimientos de actividad biológica y estabilidad (ver posteriormente) . Ya sea para lograr estabilización o de otro modo, los polipéptidos de la invención también pueden incorporar otras modificaciones químicas también, en lugar de, PEGilación. Estas modificaciones incluyen glicosilación, sulfatación, amidación y acetilación. En particular, los polipéptidos se pueden acetilar en el N-término y se prefieren o se amidan en el C- término o ambos. De manera alternativa o adicional, se pueden adicionar una o más porciones de ácido hexanoico o amino-hexanoico, de manera preferente una porción de ácido hexanoico o amino-hexanoico, normalmente en el N-término. Adicionalmente o de manera alternativa, el polipéptido o polipéptido extendido puede incluir uno o más aminoácidos de la forma D. En la naturaleza, los aminoácidos están en la forma F. La inserción de aminoácidos en la forma D puede mejorar la estabilidad. Típicamente, también se pueden usar unos pocos, por ejemplo, i, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos de la forma D. Sin embargo, se pueden usar más, por ejemplo de 5 a 10, de 10 a 15, de 15 a 20 ó 20 o más en tanto que el polipéptido PEGilado resultante satisfaga los requerimientos de actividad biológica y estabilidad (ver posteriormente) . Si se satisfacen estos requerimientos, el polipéptido completo se puede sintetizar aún usando los aminoácidos de la forma D. Se pueden usar aminoácidos de la forma D en cualquier posición en el polipéptido. En el polipéptido E C-terminal de MGF humano de SEQ ID NO: 27, se prefiere reemplazar una o ambas de las Argininas en las posiciones 14 y 15 con aminoácidos de la forma D. También se prefieren cambios correspondientes en las secuencias de rata y conejo de SEQ ID NOS: 13 y 14 (posiciones 14, 15 y 16, puesto que las secuencias de rata/conejo comprenden tres Argininas en sucesión en tanto que la humana sólo tiene dos) y en la secuencia variante de SEQ ID NO: 15. Los isómeros de péptidos estereoquímicos y/o direccionales también se pueden usar. Por ejemplo, se pueden usar retro-péptidos (RE) , en los cuales la secuencia de la invención se monta de los L-aminoácidos pero en orden inverso. De manera alternativa, se pueden usar péptidos retro- inversos (RI) , en los cuales se invierte la secuencia y se sintetiza de D-aminoácidos . De manera adicional o alternativa, se pueden incluir aminoácidos de la forma D en un extremo o en otro, o ambos, del polipéptido. Se contempla que esto ayudará a proteger contra el ataque de exopeptidasa . Esto se puede lograr al convertir los aminoácidos terminales, por ejemplo, los 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos terminales en uno o ambos extremos, de la secuencia derivada del péptido E C-terminal de MGF a la forma D. De manera alternativa o adicional, se puede logra al adicionar 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos adicionales de la forma D en uno o ambos extremos del polipéptido. Estos aminoácidos adicionales pueden corresponder o no a aquéllos que unen la secuencia derivada del péptido E C-terminal de MGF en el MGF nativo. Estos aminoácidos adicionales pueden ser cualquier aminoácido. Un posible aminoácido para la adición en la forma D de esta manera es Arginina. Por ejemplo, se puede adicionar el residuo de Arginina de la forma D al N-término, el C-término o ambos . En una modalidad, la secuencia del péptido E C-terminal nativo de MGF humano de SEQ ID NO: 27 se retiene pero las Argininas en las posiciones 14 y 15 de SEQ ID NO: 27 se convierten a la forma D y se proporciona la PEGilación. N- terminal. También se puede proporcionar amidación C- terminal. En otra modalidad, la secuencia de la variante del péptido E C-terminal de MGF humano de SEQ ID NO: 15 se retiene pero las Argininas 14 y 15 de SEQ ID NO: 15 se convierten a la forma D y se proporciona PEGilación N-terminal . En algunas modalidades adicionales, la secuencia de los 8 aminoácidos C-terminales de SEQ ID NO: 15 ó 27, es decir, la secuencia de SEQ ID NO: 33 ó 34, se usa y se proporciona PEGilación N- terminal o se adiciona una porción de ácido hexanoico o amino-hexanoico en el C- término. También se puede proporcionar amidación C-terminal. De manera alternativa o adicional, los polipéptidos de la invención también pueden incorporar otras modificaciones, por ejemplo truncamiento, inserción, supresión interna o sustitución. Con respecto al truncamiento, también se ha encontrado que son activos péptidos más cortos, en base a los ocho aminoácidos C- terminales de SEQ ID NO: 15. Sin embargo, los resultados en el Ejemplo 5 más adelante sugieren que la actividad de péptidos más largos relacionados al C- término de MGF puede ser bastante sensible al truncamiento, particularmente del N-término de los péptidos. En el N-término del péptido de SEQ ID NO: 15, el truncamiento por 3 aminoácidos conduce a pérdida de actividad en el modelo de células musculares usado en el Ejemplo 5. En el C- érmino del péptido de SEQ ID NO: 15, el truncamiento por cuatro aminoácidos conduce a pérdida de actividad en el modelo de células musculares, aunque no lo hace el truncamiento por dos. En el caso de las secuencias nativas del péptido E de humano, rata y conejo, y en la variante de SEQ ID NO: 15 y otros péptidos de la invención que tienen longitudes comparables a aquéllas de los péptidos nativos (por ejemplo, 18 o más aminoácidos) , se contempla por lo tanto que será posible truncar por 1, 2 ó 3 aminoácidos en el C-término sin pérdida de actividad. También se contempla que será posible truncar por 1 ó 2 aminoácidos en el N-término sin pérdida de actividad. Con respecto a la inserción, se pueden insertar tramos cortos de aminoácidos en la secuencia derivada de aquélla del péptido E C-terminal de MGF humano, en tanto que el polipéptido resultante satisfaga los requerimientos para actividad biológica y estabilidad (ver posteriormente) y comprenda menos de 50 aminoácidos. Cada inserción puede comprender, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos. Puede haber una o más, por ejemplo, 2, 3, 4 ó 5 de estas inserciones . Con respecto a la supresión interna, se pueden suprimir tramos cortos de aminoácidos de la secuencia interna derivada de aquélla del péptido E C-terminal de MGF humano, en tanto que el polipéptido resultante satisfaga los requerimientos para actividad biológica y estabilidad (ver posteriormente) . Se puede hacer una o más de estas supresiones, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 ó 5 supresiones, hasta un total de por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos . Con respecto a la sustitución, se puede sustituir en principio cualquier aminoácido del polipéptido por otro aminoácido, en tanto que el polipéptido resultante satisfaga los requerimientos para actividad biológica y estabilidad (ver posteriormente) . Se pueden hacer una o más de estas sustituciones, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, hasta 15 o hasta 20 sustituciones en total. De manera preferente, en la secuencia derivada del péptido E C-terminal de MGF, se harán no más de 10 sustituciones, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 sustituciones. De manera preferente, en la secuencia derivada del péptido E C-terminal de MGF, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 % o al menos 90 % de los residuos de aminoácido serán los mismos como en el péptido E C-terminal nativo de MGF del cual se deriva la secuencia. En un planteamiento preferido, se sustituyen residuos en uno o ambos extremos del polipéptido (residuos terminales) . Se contempla que esto protegerá contra ataque de exopeptidasa . De esta manera, por ejemplo, se puede preferir sustituir residuos en las posiciones N-terminales y C-terminales , o en las posiciones intermedias adyacentes a las terminales, o hasta 3, 4 ó 5 posiciones de uno o ambos extremos. Las sustituciones pueden incrementar la estabilidad o actividad biológica. Por ejemplo, los resultados analizados en el Ejemplo 5 y Figura 2 posterior indican que la sustitución en una o más de las posiciones 5, 12, 14 y 18 del péptido de SEQ ID NO: 15 puede incrementar la estabilidad. Los mismos resultados muestran que las sustituciones en las posiciones 12, 14 y 18 también pueden incrementar la actividad biológica. Las sustituciones en las posiciones 5, 12, 14 y 18 de los péptidos de SEQ ID NOS: 27 y 15, y en la posición 2 de SEQ ID NOS: 33 y 34 (que corresponden a la posición 18 de SEQ ID NOS: a5 y 27) , por lo tanto se prefieren. También se prefieren sustituciones correspondientes en las posiciones 5, 12, 15 y 19 de los péptidos E C-terminales de MGF de rata/conejo de SEQ ID NOS: 13 y 14. Ya sea en las posiciones 5, 12, 14 ó 18 de SEQ ID NOS: 27 ó 15, la posición 2 de SEQ ID NOS: 33 y 34, posiciones 5, 12, 15 y 19 de SEQ ID NOS 13 y 14, o en otro sitio, la sustitución del aminoácido nativo con Alanina es una opción preferida, como se muestra en el Ejemplo 5 y Figura 2. Sin embargo, igualmente se pueden usar otros aminoácidos . De manera alternativa o adicional, el polipéptido puede incluir sustituciones que no tengan un efecto significativo en la estabilidad o actividad biológica. Éstas serán típicamente sustituciones conservadoras. Se pueden hacer sustituciones conservadoras, por ejemplo de acuerdo a la siguiente tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y de manera preferente en la misma línea en la tercera columna se pueden sustituir entre Típicamente, las modificaciones de la secuencia de aminoácidos tal como conversiones L-D, sustituciones, inserciones y supresiones, en los polipéptidos de la invención se encontrarán en la secuencia de aminoácidos que se deriva del péptido E C-terminal de MGF. Sin embargo, donde el polipéptido contiene secuencia adicional de MGF, se puede encontrar de manera alternativa o adicional en esa secuencia adicional. Por ejemplo, si un polipéptido de la invención contiene secuencia adicional de MGF que es N- terminal a la secuencia del péptido E (por ejemplo, SEQ ID NO: 13, 14 ó 27) en el MGF nativo, se pueden encontrar modificaciones en esa secuencia. De manera alternativa o adicional, también se puede incrementar la estabilidad por ciclisación de los polipéptidos o polipéptidos extendidos de la invención. Se contempla que esto protegerá contra ataques de exopeptidasa. Los polipéptidos preferidos de la invención incluyen lo siguiente. (i) Un péptido que es de 24 aminoácidos de longitud y tiene la secuencia de SEQ ID NO: 15 pero se estabiliza al convertir las dos Argininas de SEQ ID NO 15 (posiciones 14 y 15) de la forma L a la forma D por PEGilación N-terminal. (ii) Un péptido como en (i) anterior pero que carece de PEGilación, es decir, que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 15 pero estabilizada al convertir las dos Argininas de SEQ ID NO 15 (posiciones 14 y 15) de la forma L a la forma D. (iii) Los péptidos descritos en el Ejemplo 5 y Figura 2 como Pptidos 2, 3, 4 y 5 (SEQ ID NOS: 16 a 19) . (iv) El péptido descrito en el Ejemplo 5 y Figura 2 como péptido Corto 1 (SEQ ID NO: 21) , que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 19 (en la cual Arginina en la posición 14 se reemplaza por Alanina) pero se trunca por 2 aminoácidos en el C-término. (v) Un péptido que corresponde a aquél de (i) anterior pero en base al péptido C-terminal humano nativo de SEQ ID NO: 27, que contiene Arginina en lugar de Histidina en la posición penúltima, es decir, un péptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 27 pero estabilizado al convertir las dos Argininas en las posiciones 14 y 15 de SEQ ID NO 27 desde la forma L hasta la forma D y por PEGilación N- terminal . (vi) Un péptido como en (v) anterior pero que carece de PEGilación, es decir, que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 27 pero estabilizado al convertir las dos Argininas en las posiciones 14 y 15 de SEQ ID NO 27 desde la forma L a la forma D. (vii) Péptidos que corresponden a aquéllos de (iii) anterior pero basados en el péptido C-terminal humano nativo de SEQ ID NO: 27, que contiene Arginina en lugar de Histidina en la posición penúltima; mostrado aquí como SEQ ID NOS: 28 a 31. (viii) Péptidos de cualquier de SEQ ID NOS 33-36 con PEGilación N-terminal o la unión de una porción de N-terminal de ácido hexanoico o amino-hexanoico . (ix) cualquiera de los péptidos de (i) , (ii) , (iii) , (iv) , (v) , (vi) , (vii) , o (viii) anteriores con amidación C-terminal, notablemente los péptidos de (ii) y (vi) anteriores con amidación C-terminal, es decir, péptidos que tienen las secuencias de SEQ ID NOS: 15 y 27, con conversión de L-Arginina a D-Arginina en las posiciones 14 y 15 y amidación C-terminal, pero que carecen de PEGilación. (x) Cualquiera de los péptidos de (i) , (ii) , (iii) , (iv) , (v) , (vi) , (vii) , (viii) o (ix) anteriores con un residuo de Cisteína adicional en el C-término. (xi) Cualquiera de los péptidos de (i) , (ii) , (iii) , (iv) , (v) , (vi) , (vii) , (viii) o (ix) anteriores con un residuo de Arginina de forma D adicional en el N-término. Las modificaciones de acuerdo a la invención pueden conferir ventajas adicionales así como estabilidad incrementada. Por ejemplo, pueden conferir actividad terapéutica incrementada o ser ventajosos desde un punto de vista inmunológico (por ejemplo, mediante inmunogenicidad reducida) . Esto aplica en particular a modificaciones que comprenden conversión de L-D y/o isomerismo estereoquímico y/o direccional (ver anteriormente) .

Actividad Biológica Los polipéptidos y polipéptidos extendidos de la invención tienen actividad biológica. Esta actividad se puede seleccionar de lo siguiente. La capacidad para incrementar la resistencia muscular en músculo esquelético distrófico y/o no distrófico de ratones, humanos u otros mamíferos (comparar Ejemplo 2 posterior) . De manera preferente, un polipéptido o péptido extendido de la invención será capaz de incrementar la resistencia muscular (por ejemplo como se mide por fuerza tetánica lograble máxima) por al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 50 %, al menos 75 % o al menos 100 % en músculo distrófico y/o no distrófico .

La capacidad cardioprotectora en ovejas, ratones, humanos u otros mamíferos (comparar Ejemplo 3 posterior) . De manera preferente, un polipéptido o polipéptido extendido de la invención tendrá la capacidad de impedir o limitar el daño miocardiaco en un corazón infartado o mecánicamente sobrecargado. Esto se puede medir por circuitos de presión/volumen o por referencia a la capacidad para incrementar la fracción de expulsión en comparación a un corazón infartado al cual no se administra el polipéptido o polipéptido extendido de la invención. De manera preferente, un polipéptido o polipéptido extendido de la invención tendrá la capacidad para incrementar la fracción de expulsión por al menos 1 %, al menos 2 %, al menos 3 %, al menos 4 %, al menos 5 %, al menos 6 %, al menos 7 %, al menos 8 %, al menos 9 % o por al menos 10 % o más. Capacidad neuroprotectora in vi tro o in vivo en ratones, gerbos, humanos u otros mamíferos (comparar Ejemplo 4 posterior) . De manera preferente, un polipéptido o polipéptido extendido de la invención tendrá la capacidad de reducir la muerte celular en cultivos hipocampales organotípicos de rata y/u otros modelos in vitro similares. De manera preferente, después de ¿la exposición a TBH u otro agente que induce estrés oxidativo o provoca daño de otra manera, un polipéptido o polipéptido extendido de la invención tendrá la capacidad de reducir la muerte celular en estos modelos por al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, o al menos 90 % o más. De manera alternativa o adicional, los polipéptidos o polipéptidos extendidos de la invención pueden tener capacidad neuroprotectora. Adicionalmente, los polipéptidos o polipéptidos extendidos de la invención pueden tener una o más propiedades biológicas características del MGF de longitud completa (por ejemplo, de SEQ ID NOS: 2, 4 ó 6) . Por ejemplo, los polipéptidos o polipéptidos extendidos de la invención pueden tener las propiedades funcionales de MGF identificadas en WO 97/33997. En particular, pueden tener la capacidad para inducir crecimiento de tejido de músculo esquelético. De manera similar, como se analiza en la presente, puede tener la capacidad de favorecer la síntesis de proteínas necesaria para la reparación del músculo esquelético y/o para activar las células satélite (madre) en el músculo esquelético. A este respecto, un método para valorar la actividad biológica es el método de Azul de Alamar como se analiza en el Ejemplo 5.2.2. Esto comprende poner en contacto un polipéptido con células mioblásticas mononucleadas y valorar el grado al cual les hace proliferar. Esto se puede clasificar de cualquier manera adecuada, por ejemplo, en una escala de 0 a 3 como se analiza en los Ejemplos. También se puede medir la actividad mediante ciclinas, tal como ciclina ID, que son marcadores tempranos de la división celular. También se puede medir la actividad mediante el uso de bromodesoxi-uridina (BrdU) . La BrdU se sustituirá por si misma por timidita durante la replicación de ADN y por lo tanto se puede usar para identificar células cuyo ADN se está sometiendo a replicación y para medir qué tanto está tomando lugar la replicación y la división celular. De manera alternativa o adicional, los polipéptidos o polipéptidos extendidos de la invención pueden tener las propiedades neurológicas identificadas anteriormente en la WO 01/136483. De esta manera, pueden tener la capacidad de efectuar el rescate de motoneuronas .

En particular, pueden ser capaces de reducir la pérdida de motoneuronas después de la avulsión de nervios por hasta 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 ó 100 % en un sujeto tratado en comparación a una situación equivalente en un sujeto no tratado. Se prefiere la reducción de la pérdida de motoneuronas por 70 % o más, u 80 % más (es decir, de 30 % o menos o 20 % o menos) . El grado de rescate se puede calcular usando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, una técnica conocida tal como estereología. Como una prueba específica, se pueden usar las técnicas usadas en WO 01/136483, que depende de la medición del rescate de motoneuronas en respuesta a la avulsión de nervio facial en ratas . De manera alternativa o adicional, los polipéptidos o polipéptidos extendidos de la invención pueden tener las propiedades identificadas en WO 03/060882, que es por decir la capacidad para prevenir o limitar el daño miocardiaco después de isquemia o sobrecarga mecánica al prevenir la muerte celular, o apoptosis, de las células musculares del miocardio. De manera preferente, un polipéptido o polipéptido extendido de la invención tendrá la capacidad de prevenir completamente la apoptosis en el área del músculo cardiaco al cual se aplica. Sin embargo, la apoptosis también puede ser sólo parcialmente prevenida, es decir, limitada. Se limita el daño si se logra alguna reducción del daño en comparación a aquél que tomaría lugar sin un tratamiento de la invención, por ejemplo, si el daño se reduce por 1 % o más, 5 % o más, 10 % o más, 20 % o más, 30 % o más, 50 % o más, 70 % o más, 80 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 98 % o más, o 99 % o más, como se mide por el número o proporción de células que mueren, o por el tamaño del área del músculo que pierde función, o por la capacidad completa del corazón para bombear sangre. En particular, la reducción del daño se puede estimar in vivo al determinar el rendimiento cardiaco, fracción de expulsión, etc., usando métodos mínimamente invasivos. También se pueden valorar marcadores tal como creatina-cinasa y troponina T en el suero. Estos son los parámetros usados en situaciones clínicas para determinar el grado de daño al músculo cardiaco después de la lesión. La capacidad para prevenir la apoptosis se puede medir por cualquier técnica adecuada. Por ejemplo, con referencia al Ejemplo 4 y las Figuras 3 y 6, se puede medir por la capacidad para prevenir la apoptosis en una línea de células musculares cardiacas o células tipo cardiacas, como se indica por fragmentación de ADN. La capacidad para prevenir la apoptosis, como se indica por la fragmentación de ADN, se puede probar al tratar las células con sorbitol u otro agente que coloca las células bajo estrés osmótico durante hasta, por ejemplo, 1, 2, 4, 6, 12, 24 ó 48 horas, de manera preferente de 12 a 24 horas, de manera más preferente 24 horas, e investigando si se puede observar el patrón de fragmentación asociado con la apoptosis . Un polipéptido de MGF de la invención expresado de esta manera reducirá típicamente, de manera preferente eliminará, la fragmentación de ADN bajo estas condiciones, en comparación a una célula no tratada después del tratamiento con sorbitol de 6 , 12 ó 24 horas. La ausencia de expresión, o baja expresión, de los genes que actúan como marcadores para la apoptosis también puede actuar como una indicación de prevención de apoptosis. Un marcador adecuado es el gen Bax. De manera similar, la expresión incrementada de los marcadores anti-apoptóticos en células transíectadas con MGF bajo condiciones apoptóticas se puede tomar como un signo que el polipéptido de la invención es prevensor de la apoptosis. Un gen marcador anti-apoptótico adecuado es Bcl2. La capacidad para prevenir la apoptosis también se puede medir por referencia a la capacidad de un polipéptido de MGF para prevenir una reducción en el número celular en células miocíticas in vi tro. Otra propiedad preferida de los polipéptidos y polipéptidos extendidos de la invención es la capacidad para inducir un fenotipo hipertrófico en células musculares cardiacas. En particular, esto se puede probar al valorar la capacidad para inducir un fenotipo hiepertrófico en cultivos de miocitos cardiacos primarios in vi tro. Un método preferido para determinar esto es probar un incremento en la expresión del ANF (Factor Natriurético Atrial) y/o bMHC (Cadena Pesada de Beta-Miosina) . El ANF es un gen marcador embriónico que se favorece en expresión en condiciones hipertróficas. La bMHC es una proteína contráctil importante en el músculo.

Estabilidad de Polipéptidos y Polipéptidos Extendidos de la Invención Los polipéptidos y polipéptidos extendidos de la invención tienen estabilidad incrementada en comparación a los péptidos E C-terminales nativos de MGF que contienen secuencias derivadas de los mismos. Esta comparación se hace entre el polipéptido o polipéptido extendido de la invención y el péptido E C-terminal nativo de MGF en su forma no modificada, aislada (por ejemplo, una forma no modificada de SEQ ID NO: 13, 14, 27 ó 34, separada del resto de la molécula de MGF y en forma aislada como un 24 -mero (SEQ ID NO: 27), 25-mero (SEQ ID NOS 13/14) u 8-mero (SEQ ID NO 34)) . También se pueden hacer comparaciones con las secuencias que contienen Histidina de SEQ ID NO: 15 y 33. Se puede incrementar la estabilidad por cualquier grado mediante las modificaciones analizadas en la presente. Se puede valorar la estabilidad en términos de la vida media en plasma humano o por cualquier otra técnica adecuada. En particular, se puede medir la estabilidad al valorar la susceptibilidad de los péptidos a la escisión proteolítica en plasma humano fresco de acuerdo a la técnica del Ejemplo 5.1 posterior, en el cual el plasma se almacenó hasta el uso a -70°C, se adicionaron 10 µ de péptido a 2 mi de plasma, más 7 mi de PBS y la mezcla se incubó a 37°C durante diferentes intervalos de tiempo. Entonces se usó transferencia Western para detectar cada péptido sobre estos intervalos de tiempo. (En la Figura 7: A = 0 minutos; B = 30 minutos; C = 2 horas; D = 24 horas. Los resultados para el péptido con conversión L-D y la PEGilación N-terminal se muestran a la derecha; aquéllos para el péptido que carece de las conversiones de la forma L a D y PEGilación N-terminal están a la izquierda) . Se puede detectar relativamente poco del péptido que carece de conversión de L-D y PEGilación después de 30 minutos, muy poco después de 2 horas y nada o casi nada después de 24 horas. En contraste, el péptido con conversión de L-D y PEGilación se puede detectar en mucha mayor abundancia y 2 horas y 24 horas . Otras mediciones de la estabilidad se pueden basar en la determinación de la pérdida de la actividad biológica durante el tiempo. Esto se puede hacer por cualquier método adecuada, por ejemplo, mediante un ensayo in vi tro para cualquiera de las mediciones de la actividad biológica analizadas en la presente. De manera cuantitativa, en términos relativos, los polipéptidos preferidos o polipéptidos extendidos preferidos de la invención pueden tener vidas medias que se incrementan por al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 80 %, al menos 100 %, al menos 200 % o al menos 500 % o más en comparación al péptido E C- terminal no modificado, correspondiente, de MGF. De manera cuantitativa, en términos absolutos, los polipéptidos preferidos o polipéptidos extendidos preferidos de la invención pueden tener vidas medias de al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 4 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas, al menos 24 horas o al menos 48 horas o más . De manera alternativa, se pueden usar mediciones cualitativas o semicuantitativas de estabilidad, como en el Ejemplo 5 y la Figura 2, por ejemplo al clasificar la estabilidad de los polipéptidos o polipéptidos extendidos en una escala de 0 a 3. En esta escala, el polipéptido de SEQ ID NO: 15 se clasifican 1. Ciertos polipéptidos modificados diferentes de la invención se clasifican 2 ó 3. Un polipéptido o polipéptido extendido de la invención se clasificará en general más altamente en esta escala que el péptido E C-terminal nativo correspondiente de MGF.

Péptidos Adicionales de la Invención En tanto que se estabilizarán muchos de los péptidos de la invención, como se analiza anteriormente, bajo ciertas circunstancias puede ser posible hacer uso de polipéptidos no estabilizados, incluyendo los polipéptidos nativos de SEQ ID NOS: 13, 14, 27 y 34 o la variante que contiene Histidina de SEQ ID NO: 15 y 33. En el tratamiento de trastornos neurológicos y cardiacos de acuerdo con la invención, puede ser deseable que el polipéptido o polipéptido extendido de la invención se degrade de üna manera relativamente rápida, es decir, ejerza su efecto durante un periodo relativamente corto de tiempo. Por lo tanto, la estabilización no se requerirá necesariamente en el contexto de estos tratamientos. En tanto que no se requiere la estabilización, se prefiere usar los polipéptidos nativos de SEQ ID NOS: 13, 14, 27 y 34 o la variante que contiene Histidina de SEQ ID NO: 15 ó 33 sin modificaciones estabilizantes. Sin embargo, también se pueden usar polipéptidos modificados. Cualquiera de las modificaciones analizadas en la presente se puede aplicar excepto que, en este aspecto, no se requiere que estas modificaciones den por resultado estabilidad incrementada .

Tratamientos de Acuerdo con la Invención Se pueden usar los polipéptidos y polipéptidos extendidos de la invención para tratar varias condiciones. Ampliamente, éstas se descomponen en tres áreas: trastornos del músculo esquelético, trastornos del músculo cardiaco y trastornos neurológicos. Sin embargo, debido a que son interdependientes la función nerviosa y muscular, puede haber algún traslape entre estas categorías, por ejemplo, en el área de trastornos neuromusculares . En general, los trastornos neurológicos se pueden dividir en dos categorías, trastornos neurogénicos donde la falla está en el sistema nervioso mismo y trastornos neurológicos biogénicos o relacionados al músculo. Ambos se pueden tratar de acuerdo a la invención. Los trastornos del músculo esquelético que son susceptibles a tratamiento de acuerdo a la invención incluyen distrofia muscular, incluyendo pero no limitada a distrofia muscular de Duchenne o Becker, Distrofia Muscular Facioescapulohumeral (FSHD) , distrofia muscular congénita (CMD) y distrofias autosomales, y emaciación y debilidad del músculo esquelético, progresiva, relacionada; atrofia muscular, incluyendo pero no limitada a atrofia por desuso, atrofia inducida por glucocorticoides , atrofia muscular en humanos envejecidos y atrofia muscular inducida por lesiones de la médula espinal o enfermedades neuromusculares; caquexia, por ejemplo caquexia asociada con, cánceres, SIDA, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , enfermedades inflamatorias crónicas, lesión por quemadura, etc.; debilidad muscular, especialmente en ciertos músculos tal como el esfínter urinario, esfínter anal y músculos de piso pélvico; sarcopenia y debilidad en la vejez. La invención también encuentra aplicación en reparación del músculo después de trauma. Por lo que respecta a trastornos neurológicos , es una posibilidad el tratamiento de trastornos neurodegenerativos. También es una posibilidad el tratamiento de trastornos de motoneuronas , especialmente trastornos neurodegenerativos de las motoneuronas. Los ejemplos de trastornos neurológicos (incluyendo neuromusculares) incluyen esclerosis lateral amiotrófica; atrofia muscular espinal; atrofia muscular espinal progresiva; atrofia muscular infantil o juvenil, poliomielitis o síndrome post-polio; un trastorno provocado por exposición a una toxina, trauma de motoneuronas, una lesión de motoneuronas o daño a nervios; una lesión que afecte las motoneuronas; y pérdida de motoneuronas asociada con envejecimiento; distrofia muscular autosomal así como enlazada a sexo; enfermedad de Alzheimer; enfermedad de Parkinson; neuropatía diabética; neuropatías periféricas; ataque embólico y hemorrágico ; y daño cerebral relacionado a alcohol. También se pueden usar polipéptidos y polipéptidos extendidos de la invención para mantenimiento del sistema nervioso central (CNS) . La invención también encuentra aplicación en reparación de nervios después de trauma. También se puede tratar el daño en nervios de acuerdo a la invención. En esta modalidad, el polipéptido o polipéptido extendido se localizará típicamente alrededor de los sitios de este daño para efectuar la reparación, por ejemplo por medio de la colocación de un conducto alrededor de los dos extremos de un nervio periférico cortado (comparar WO 01/85781) . Con respecto a los trastornos cardiacos, se pueden mencionar enfermedades donde la promoción de la síntesis de proteínas del músculo cardiaco es un tratamiento benéfico, cardiomiopatías ; falla cardiaca aguda o ataque agudo que incluye miocarditis o infarto al miocardio; hipertrofia cardiaca patológica; y falla cardiaca congestiva. También se pueden usar los polipéptidos y polipéptidos extendidos de la invención para mejorar el rendimiento cardiaco al incrementar el volumen de pulsación cardiaca. En particular, se pueden usar los polipéptidos y polipéptidos extendidos de la invención para la prevención de daño miocardiaco después de isquemia y/o sobrecarga mecánica. En este caso, se administrarán en general tan rápidamente como sea posible después del comienzo de la isquemia o sobrecarga mecánica al corazón, por ejemplo tan pronto como se haya diagnosticado un ataque cardiaco que resulte de isquemia. De manera preferente, se administrarán en el espacio de 5 , 10, 15, 30 ó 60 minutos, o en el espacio de 2 ó 5 horas. De manera preferente, la isquemia o sobrecarga mecánica en respuesta a lo cual se administra el polipéptido o polinucleótido de MGF es una condición temporal. En una modalidad particularmente preferida, el polipéptido o polipéptido extendido de la invención se administra en respuesta a un ataque cardiaco. El tratamiento de la invención será particularmente efectivo a ayudar a las víctimas de ataque cardiaco a hacer una buena recuperación; y regresar a un estilo de vida normal, activo. Bajo algunas circunstancias, puede ser deseable usar los polipéptidos y polipéptidos extendidos de la invención en combinación con otros agentes farmacéuticamente activos. Por ejemplo, se pueden usar los polipéptidos y polipéptidos extendidos de la invención junto con IGF-I (ver ejemplos 1.5, 7 y 8) . Estos usos combinados pueden comprender la coadministración de los polipéptidos o polipéptidos extendidos de la invención en un portador o excipiente individual farmacéuticamente aceptable con el otro agente o agentes farmacéuticamente activos, o pueden comprender inyección separada, secuencial o simultánea, en el mismo sitio o en diferentes sitios.

Producción de Polipéptidos y Polipéptidos Extendidos de la Invención Se pueden producir polipéptidos y polipéptidos extendidos de la invención por técnicas normales . Típicamente, se obtendrán por técnicas normales de síntesis de péptidos, más modificaciones químicas apropiadas (por ejemplo, PEGilación) a la secuencia resultante de aminoácidos, si es necesario. Donde no haya aminoácidos de la forma D, los polipéptidos y polipéptidos extendidos se pueden obtener en cambio mediante expresión recombinante en una célula hospedadora a partir del ADN apropiado de codificación, nuevamente por técnicas normales. También se puede llevar a cabo el aislamiento y purificación a cualquier grado deseado, por técnicas normales. Los polipéptidos y polipéptidos extendidos de acuerdo a la invención se aislarán o purificarán en general, ya sea de manera completa o parcial. Una preparación de un polipéptido o polipéptidos extendidos aislados es cualquier preparación que contenga el polipéptido o polipéptido extendido a una mayor concentración que la preparación de la cual se produjo. En particular, donde el polipéptido o polipéptido extendido se obtiene de manera recombinante, el polipéptido o polipéptido extendido se habrá extraído típicamente de la célula hospedadora y los componentes celulares principales se remueven. Un polipéptido o polipéptido extendido en forma purificada formará en general parte de una preparación en la cual más del 90 %, por ejemplo hasta 95 ¾, hasta 98 ¾ o hasta 99 % del material de polipéptido en la preparación es aquél de la invención. Las preparaciones aisladas y purificadas frecuentemente serán soluciones acuosas que contienen el polipéptido o polipéptido extendido de la invención. Sin embargo, el polipéptido o polipéptido extendido de la invención se puede purificar o aislar en otras formas, por ejemplo, como cristales u otras preparaciones secas.

Composiciones, Formulaciones, Administración y Dosis Los polipéptidos y polipéptidos extendidos de la invención se proporcionan de manera preferente en la forma de composiciones que comprenden el polipéptido o polipéptido extendido y un portador. En particular, esta composición puede ser una composición farmacéutica que comprende el polipéptido o polipéptidos extendidos y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Se puede usar cualquier formulación farmacéutica adecuada. Por ejemplo, las formulaciones adecuadas pueden incluir soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostatos , antibióticos bactericidas y solutos que vuelven isotónica la formulación con los fluidos corporales del receptor propuesto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes . Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitaria o de múltiples dosis. Por ejemplo, se pueden almacenar ampolletas y frascos sellados en una condición congelada o secada por congelación ( liofilizada) que requiere sólo la adición del portador líquido estéril, por ejemplo agua para inyección, inmediatamente antes del uso. Se debe entender que además de los ingredientes mencionados de manera particular anteriormente, las formulaciones de esta invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica habiendo considerado el tipo de formulación en cuestión. Se prefieren soluciones acuosas y no acuosas, libres de pirógenos, estériles. En general, se adaptarán las formulaciones, por técnicas normales de formulación, a los modos de administración analizados anteriormente. El polipéptido de la invención se puede administrar por cualquier ruta adecuada adaptada a la condición que se trate, por ejemplo, administración tópica, cutánea, parenteral, intramuscular, subcutánea o transdérmica ; o por inyección directa en la corriente sanguínea o aplicación directa a tejidos mucosos. La inyección probablemente va a ser la ruta preferida bajo muchas circunstancias, por ejemplo inyección subcutánea, intramuscular parental o intravenosa. Frecuentemente se preferirá la inyección intravenosa bajo muchas circunstancias clínicas. La llamada inyección "sin aguja" o administración transcutánea puede ser posible bajo algunas circunstancias. En el tratamiento de los trastornos del músculo esquelético, la inyección intravenosa e intramuscular son rutas preferidas. También se contempla la administración tópica, por ejemplo, mediante parches, para fortalecer los músculos del abdomen o para otros propósitos. En el tratamiento de trastornos del músculo cardiaco, la distribución será en general intravenosa. Bajo circunstancias clínicas apropiadas (por ejemplo en unidades cardiacas especializadas) también puede ser posible la distribución directa al corazón, por ejemplo usando un llamado sistema de inyección "sin aguja" para la distribución del polipéptido al corazón. Los polipéptidos y polipéptidos extendidos de la invención se pueden distribuir en cualquier dosis adecuada, y usando cualquier régimen adecuado de dosificación. Las personas expertas en la técnica apreciarán que se puede adaptar la cantidad y régimen de dosis para asegurar el tratamiento óptimo de la condición particular, dependiendo de numerosos factores. Algunos de estos factores pueden ser la edad, sexo y condición clínica del sujeto que se va a tratar. En base a la experiencia de los inventores, se contempla que serán efectivas dosis en la región de 0.2 a 10 mg, por ejemplo de 0.2 a 08 mg, de manera preferente cerca de 0.5 mg. Por ejemplo, se puede usar una solución que contiene el polipéptido o polipéptido extendido a una concentración de 1 mg/ml en una cantidad de 0.1 a 1 mi . Se pueden dar dosis individuales o múltiples, dependiendo de la aplicación en cuestión y de las circunstancias clínicas . Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

Ej emplos 1. Péptidos 1.1 Péptidos de Ejemplos 2, 3, 4 y 6 El péptido usado en los ejemplos 2, 3, 4 y 6 tienen la secuencia de SEQ ID NO: 15, en la cual la Arginina penúltima de la secuencia nativa (ver SEQ ID NOS: 1, 2 y 27) se reemplaza por Histidina, estabilizado por el uso de la forma D de Arginina en lugar de la forma L que se presenta de forma natural en las posiciones 14 y 15 y la unión covalente del N-término a un derivado de polietilenglicol (PEG) (O'O-bis (2-aminopropil) polietilenglicol 1900) (Jeffamine) mediante un puente de ácido succínico, y amidado en el C- término. 1.2 Péptidos de Ejemplo 5 Los péptidos del Ejemplo 5 se obtuvieron de Alta Biosciences, Birmingham, RU, habiendo sido sintetizados mediante técnicas normales usando un sintetizador de péptidos. Estos péptidos están sin PEGilar y están libres de la conversión de L-D y de la amidación C-terminal. También, un péptido que corresponde a aquél de 1.1 anterior, con las mismas conversiones de L-D, pero sin PEGilación, también se ha probado para estabilidad (ver 5.2.3 posterior). Este péptido se sintetizó mediante técnicas normales usando un sintetizador de péptidos . El producto se purificó por HPLC y se analizó por MALDI-MS. 1.3 Péptidos de Ejemplo 7 1.3.1 Péptidos de Ejemplo 7.1 Los péptidos del Ejemplo 7.1 tienen la secuencia de 8 aminoácidos Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys (SEQ ID NO: 33) , más modificaciones para mejorar la estabilidad. En el péptido referido como DMGF en la Figura 8, se logró la estabilización mediante la PEGilación N-terminal como en 1.1 anterior. En el péptido referido como CMGF en la Figura 8, se logró la estabilización mediante la unión N-terminal de ácido hexanoico. También se amidaron tanto DMGF como CMGF en el extremo C-terminal. 1.3.2 Péptidos de Ejemplo 7.2 En el Ejemplo 7.2, los péptidos A2 , A4 y A6 tienen la secuencia Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-Arg-Lys (SEQ ID NO: 34) . Se amidaron los péptidos A2 , A4 y A6 en el C-término. El péptido A2 está sin modificar en el N-término. El péptido A4 tiene una porción de ácido hexanoico unida al N término. El péptido A6 tiene una porción de ácido amino hexanoico unida al N-término. El péptido A8 tiene la secuencia Gly-Ser-Thr-Phe Glu-Glu-His-Lys (SEQ ID NO: 33) , amidada en el C-término con ácido hexanoico unido al N-término. 1.4 Péptido de Ejemplo 8 El péptido usado en el Ejemplo 8 tiene la secuencia de SEQ ID NO: 15, en la cual la Arginina penúltima de la secuencia nativa (ver SEQ ID NOS: 1, 2 y 27) se reemplaza por Histidina, estabilizado por el uso de la forma D de Arginina en lugar de la forma L que se presenta de forma natural en las posiciones 14 y 15 y amidada en el C-término. El péptido usado en el Ejemplo 8 no se pegiló. 1.5 Péptido de IGF-I Para comparación, se ha usado el péptido de IGF-I. Éste es el dominio de unión del receptor de IGF-I codificado por los Exones 3 y 4 que es común a todas las variantes de empalme y es de aproximadamente 70 aminoácidos de longitud. En los ejemplos 1-4, se obtuvo de PreproTech, EC, RU. En el Ejemplo 6, se obtuvo de Sigma-Aldrich (ER2 IGF-I). También se usó el péptido de IGF-I en el Ejemplo 7. 2. Inyección de Péptido Estabilizado en Músculo Distrófico Usando inyecciones intramusculares (inyecciones dos veces por semana de 25 µ? que contienen 17 µg del péptido químicamente estabilizado) , se incrementó la resistencia muscular por más de 25 % en el espacio de pocas semanas en el músculo anterior tibialis de ratones no distróficos. Este músculo no se enfermó como el músculo de ratones mdx (ver posteriormente) , aunque es posible que se dañara físicamente por las inyecciones repetidas. Se registraron incrementos mayores, de hasta aproximadamente 35 % (Figuras 3A, 3B) , para inyecciones intramusculares (dos por semana durante tres semanas) en los músculo distróficos del ratón mdx, que tiene el mismo tipo de mutación como aquél en la distrofia muscular Duchenne humana. Las inyecciones de IGF-I condujeron sólo a un incremento de aproximadamente 5 %, como se muestra en la Figura 3A. En la misma base, los resultados de una comparación entre el péptido estabilizado y un control con sólo vehículo de PBS se muestran en la Figura 3B. Estos datos con relación a la protección del músculo y la reparación muestran que el péptido estabilizado es efectivo en el incremento de la resistencia del músculo distrófico y no distrófico. 3. Cardioprotección y Reparación Miocardiaca por Péptido Estabilizado Se indujo el infarto al miocardio (MI) en corazones de ovino al catetizar una ramificación marginal de la arteria coronaria circumflex y al inyectar un pequeño bolo de microesferas para inducir isquemia localizada. Se inyectó el MGF de longitud completa (péptido C- terminal nativo más secuencia codificada por exones 3 y 4 y común a MGF e IGF-I tipo hígado) o péptido estabilizado (200 nm, intracoronario) 15 minutos después usando el mismo catéter en tanto que el animal aún estaba bajo el anestésico. Como un control, se usó IGF-I madura tipo hígado. El uso del péptido estabilizado solo, se encontró que incrementa marcadamente el porcentaje de miocardio viable y la fracción de expulsión como se mide por ecocardiografía y análisis computarizado de la función de expulsión después del MI. El MGF de longitud completa también tiene un efecto significante, aunque más pequeño. El IGF-I maduro tipo hígado tiene un efecto mucho más pequeño. Los resultados se dan en la Figura 4, que muestra el porcentaje de cambio en la fracción de expulsión en el día 6 en comparación a la fracción de expulsión en el día 1 antes de que se llevara a cabo el procedimiento. De esta manera, el péptido estabilizado fue muy efectivo en la protección del miocardio del daño isquémico.

Se llevaron a cabo experimentos adicionales en ratones. En estos estudios, el MI se produjo al ligar la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) del corazón murino. Esto provoca dilatación del ventrículo izquierdo, el progreso del cual conduce a falla cardiaca. El péptido estabilizado, administrado de manera sistémica, mejoró notablemente la resistencia y función del corazón como se mide por los circuitos de presión/volumen (Figura 5) que demuestran la capacidad del corazón para bombear sangre y la dilatación que resulta cuando el corazón dañado no puede hacer frente por más tiempo al retorno venoso. Esto se mejora notablemente por la administración sistémica del péptido estabilizado, a través del cual se protege el músculo de la pared miocardiaca y se incrementa en espesor. Por lo tanto, existe potencial considerable para tratamiento de pacientes inmediatamente después de un ataque cardiaco . 4. Neuroprotección por Péptido Estabilizado Después de Isquemia y Daño General 4.1 Efecto Neuroprotector in vitro El efecto neuroprotector del péptido estabilizado se demostró in vitro usando el modelo bien caracterizado de muerte neuronal selectiva en cultivos hipocampales organotipicos de rata.

Se prepararon cortes hipocampales a partir de ratas Wistar de 7-10 días de edad de acuerdo al método de Stoppini et al (1991) con modificaciones menores de acuerdo a Sarnowska (2002). De forma breve, se anestesiaron las ratas con Vetbutal, se enfriaron en hielo y se decapitaron. Los cerebros se removieron rápidamente a la solución de trabajo enfriada con hielo, pH 7.2; 96 % de HBSS/HEPES-(libre de Ca2+ y Mg2+) que contiene 2 mmol/L de L-glutamina, 5 mg/ml de glucosa, 1 % de amfotericina B, 0.4 % de penicilina-estreptomicina. Se separaron los hipocampos y se cortaron en cortes de 400 µ?? usando cortador de tejido Macllwain. Las membranas de illicell-CM (Millipore) en placas de 6 concavidades se pre-equilibraron con 1 mi de medio de cultivo, pH 7.2: 50 % de DMEM, 25 % de HBSS/HEPES, 25 % de HS, 2 mmol/L de L-glutamina, 5 mg/ml de glucosa, 1 % de amfotericina B, 0.4 % de penicilina-estreptamicina en una ambiente húmedo de aire y 5 % de C02 a 32°C durante 30 minutos. Cuatro cortes seleccionados se colocaron en cada membrana. Los cortes se cultivaron durante dos semanas a 32°C en atmósfera de C02 al 5 % de 100 % de humedad. La viabilidad de los cortes se verificó diariamente bajo microscopía de luz y se evalúa adicionalmente en el día del experimento por tinción con yoduro de propidio y se observó bajo microscopio fluorescente (Zeiss Axiovert 25) con una cámara MC-10095 (Cari Zeiss Jena GmbH) a fin de registrar la captación inicial de PI (Sarnowska, 2002). Se indujo estrés oxidativo después de 14 días en cultivo al adicionar TBH 30 mM ( ter-butil-peróxido) durante 3 horas. Después de ese tiempo, los cortes se transfirieron al medio fresco de cultivo. La muerte celular resultante se valoró 24 y 48 horas después del comienzo del experimento . El péptido estabilizado o, para el propósito de comparación, se adicionó IGF-1 recombinante al medio de cultivo a la concentración final de 100 ng/ml al comienzo del experimento y estuvo continuamente presente en el medio . A fin de investigar una ruta en la cual actúa el MGF, se incluyó un anticuerpo de bloqueo anti-receptor de IGF-1 (AB-1) (Oncogen) especifico en el medio 1 hora antes de que los cortes se expusieran a TBH y MGF o péptido de IGF-1. La concentración del anticuerpo (1000 ng/ml) se usó de acuerdo a la recomendación del fabricante. Para obtener imágenes detalladas de los cortes, se usó un microscopio confocal de exploración láser (Zeiss LSM 510) . Se usó un láser de helio-neón (543 nm) para la excitación de yoduro de propidio (PI) . Después de la adquisición, se procesaron imágenes usando el paquete de software Zeiss LSM 510 v. 2.8. Se realizó la medición cuantitativa del deterioro de tejido usando el analizador de imagen KS 300 (Cari Zeiss Jena GmbH) . Se cuantificó el daño celular en imágenes de fluorescencia de los cultivos teñidos con PI 24 y 48 horas después de la estimulación con TBH. El grado relativo de muerte celular se calculó a partir de cada región CAI estandarizada como sigue: % de células muertas = (intensidad fluorescente experimental (FI)-FI de fondo) /(FI máximo-FI de fondo) x 100, donde FI máximo se obtuvo al aniquilar todas las células con exposición a glutamato 100 mM. Se repitieron todas las mediciones para 5 preparaciones independientes de cultivo y se usaron 8 cortes para cada condición experimental. El significado estadístico de las diferencias entre los resultados, se calculó usando Anova unidireccional seguido por prueba de Dunnet, (GraphPad Prism 3.02). Se aislaron cortes de cerebro de rata después de la inducción de daño localizado por TBH (hidroperóxido de ter-butilo) como se analiza anteriormente. Se determinó la muerte celular resultante en los cortes cerebrales tratados y no tratados. Esto se ilustra en la Figura 6. En la ausencia del péptido de tratamiento, TBH provocó cerca de 60 % de las células que se murieron en el espacio de 24 horas pero, después del tratamiento con el péptido estabilizado (100 ng/ml), se observó 85 % de protección. El péptido del dominio de receptor de IGF-I (rIGF-I), que también es parte del MGF de longitud completa, también fue neuroprotector (como se indica anteriormente) . Sin embargo, esto fue a un menor grado (72 %) y el efecto protector de IGF-1 sólo fue perceptible durante hasta 24 horas, en tanto que el péptido estabilizado funcionó significativamente por más tiempo puesto que su efecto neuroprotector aún se observó claramente después de 48 horas. 4.2. Efecto Neuroprotector en Modelo de Gerbo Se llevaron a cabo otros experimentos usando un modelo de gerbo de isquemia cerebral. Para valorar la neuroprotección, se llevó a cabo la microscopía confocal en el cerebro después de la administración del péptido estabilizado o el dominio de unión al receptor de IGF-I. En el cerebro de gerbo, la ligación bilateral de las arterias carótidas comunes produce invariablemente lesiones hipocampales específicas. En la región CAI, las neuronas piramidales empiezan a morir 3-4 días después de la isquemia . Se usaron gerbos mongoles machos que pesan 50-60 g. El ataque isquémico se realizó por 5 min. La ligación de las arterias carótidas comunes bajo halotano en anestesia de N20:02 (70:30) en condiciones normotérmicas estrictamente controladas como se describe anteriormente ( Domanska-Janik et al., 2004). El flujo sanguíneo cerebral se monitorizó continuamente por flujometria Doppler láser (Muro, Inc.). Un grupo de animales recibió péptido estabilizado o IGF-1 (1 µg µl en PBS) por inyección a una dosis de 25 µg directamente a la arteria carótida izquierda inmediatamente en la reperfusión. Se inyectaron animales operados simulados con la misma dosis del péptido. Usualmente, 10-15 minutos después del procedimiento, los animales tratados se levantaron en sus patas y se comportaron como no tratados. A los animales se les dejó un periodo de recuperación de una semana, luego se trataron por perfusión con paraformaldehido al 4 % enfriado con hielo en PBS bajo anestesia de pentobarbital . La evaluación histológica se realizó en secciones de 10 mm de grueso incrustadas en parafina y fijadas, teñidas por hematoxilina/eosina . El grado de daño celular en la región hipocampal CAI se cuantificó, bajo un Zeiss Axioscop 2, como el número medio de las neuronas intactas persistentes en las secciones coronales. Al menos tres campos definidos de 300 µt? de la región CAI se capturaron usando una cámara MC 10095 (Cari Zeiss Jena GmbH) y se cortaron en un sistema de análisis de imágenes asistido por computadora (KS 300, Cari Zeiss Jena GmbH) . En animales de control, el número medio de neuronas morfológicamente intactas por 300 µp? de longitud clasificadas en la región CAI fue de 121.25 ± 12.5 (media ± SD, n = 5) . En contraste a los animales no tratados, donde sólo cerca de 12 % (15.2 ± 5, n = 7) de las neuronas sobrevivió al episodio isquémico, la inyección (bolo individual de 25 µg) del péptido C-terminal de MGF estabilizado en la arteria carótida izquierda, inmediatamente después de la re-perfusión, proporcionó una neuroprotección muy significativa. Se puntuaron 83.2 ± 25 (n = 10) neuronas en el lado inyectado (74.5 % de valor de control no operado) y 65.8 ± 30 (n = 10) en el lado contralateral (54 % del valor de control no operado) . De esta manera, el tratamiento con el péptido C-terminal estabilizado de MGF permitió que una alta proporción de las neuronas hipocampales de CAI sobreviviera al ataque isquémico. En la mayoría de los animales, el efecto protector fue perceptible bilateralmente en tanto que fue principalmente evidente en una mayoría en el lado inyectado (izquierdo) . En contraste, la inyección similar de 25 µg del péptido de IGF-1 tuvo poca influencia en la supervivencia post-isquémica de neuronas de CAI; 7 días después del ataque, hubo 19.2 ± 7.3 neuronas (n = 5) dejadas, que es sólo 15.8 % del número de células neuronales de control y no significativamente diferente del grupo post-isquémico no tratado . 5. Actividad Biológica y Estabilidad de Péptidos Modificados 5.1 Péptido Estabilizado por Conversión de L-D y PEGilación N-terminal El péptido usado en los ejemplos 2, 3 y 4 anteriores tienen la secuencia de SEQ ID NO: 15 (que corresponde a aquélla del péptido Ec humano de MGF (SEQ ID NO: 27), excepto que la Arginina en la penúltima posición se reemplaza por Histidina) estabilizado por el uso de la forma D de Arginina en las posiciones 14 y 15 en lugar de la forma L que se presenta de forma natural y la unión covalente del N-término a polietilenglicol (PEG), y amidado en el C-término . La actividad biológica de este péptido se confirma en los E emplos 2, 3 y 4. Su estabilidad se demuestra por la Figura 7. La estabilidad de los péptidos con y sin PEGilación y conversión de L-D de Arginina en las posiciones 14 y 15 se investigó al valorar la susceptibilidad de los péptidos a la escisión proteolitica en plasma humano fresco. El plasma se almacenó hasta que se usó a -70°C.

Se adicionaron 10 µg de péptido a 2 mi de plasma, más 7 mi de PBS. Esta mezcla se incubó a 37°C durante diferentes intervalos de tiempo. La transferencia Western con un anticuerpo policlonal que tiene especificidad a los péptidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 también se usó para detectar cada péptido durante estos intervalos de tiempo. (En la Figura 7: A = 0 minutos; B = 30 minutos; C = 2 horas; D = 24 horas. Los resultados para el péptido con conversión de L-D y PEGilación N-terminal se muestran a la derecha; aquéllas para el péptido que carece de las conversiones de la forma L a D y PEGilación N-terminal están a la izquierda) . Se puede detectar relativamente poco del péptido que carece de conversión de L-D y PEGilación después de 30 minutos, muy poco después de 2 horas y nada o casi nada después de 24 horas. En contraste, el péptido con conversión de L-D y PEGilación se puede detectar en abundancia aún después de 24 horas. 5.2. Péptidos Adicionales.- Reemplazo de Serina o Arginina con Alanina y Truncamiento C-terminal y N-terminal 5.2.1 Péptidos Adicionales En la presente, la secuencia del péptido Ec humano nativo del C-término de MGF humano se da como SEQ ID NO: 27.

En el péptido de SEQ ID NO: 15, el penúltimo aminoácido, que es Arginina en el péptido nativo (ver SEQ ID NOS: 2 y 27) se reemplaza con Histidina. El péptido de SEQ ID NO: 15 se describe como Péptido 1 en la Figura 2. Las secuencias modificadas adicionales derivadas de la secuencia de SEQ ID NO: 15 se dan como SEQ ID NOS: 16 a 24 y en comparación a aquélla de SEQ ID NO: 15 en la Figura 2, donde se refieren como péptidos 2-6 y péptidos Cortos 1-4. En el Péptido 2 (SEQ ID NO: 16), se reemplaza Serina con Alanina en la posición 5. En el Péptido 3 (SEQ ID NO: 17), se reemplaza Serina con Alanina en la posición 12. En el Péptido 4 (SEQ ID NO: 18), se reemplaza Serina con Alanina en la posición 18. En el Péptido 5 (SEQ ID NO: 19), se reemplaza Arginina con Alanina en la posición 14. En el Péptido 6 (SEQ ID NO: 20), se reemplaza Arginina con Alanina en la posición 14 y también se reemplaza Arginina con Alanina en la posición 15. En el péptido Corto 1 (SEQ ID NO: 21), se reemplaza Arginina con Alanina en la posición 14 y se remueven los dos aminoácidos C-terminales . En el péptido Corto 2 (SEQ ID NO: 22), se reemplaza Arginina con Alanina en la posición 14 y se remueven los cuatro aminoácidos C-terminales. En el péptido Corto 3 (SEQ ID NO: 23) , se reemplaza Arginina con Alanina en la posición 14 y se remueven los tres aminoácidos N-terminales . En el péptido Corto 4 (SEQ ID NO: 24), se reemplaza Arginina con Alanina en la posición 14 y se remueven los cinco aminoácidos N-terminales. 5.2.2 Actividad Biológica para Péptidos Adicionales Se determina la actividad biológica usando un sistema in vitro al medir la capacidad de los péptidos C- terminales para inducir mioblastos mononucleados (células satelitales) para replicarse. Se determina el número celular usando el método de Azul de Alamar. Esto se valora en una escala de 0 a 3 y los resultados se muestran en la Figura 2. 0 = ningún incremento medible en número celular a 6 horas. 1 = incremento significativo en número celular a 4 horas . 2 = incremento significativo en número celular a 2 horas . 3 = incremento significativo en número celular a 1 hora . El significado estuvo a nivel de P > 0.05 usando la prueba T. El péptido (Péptido 1) de SEQ ID NO: 15 mostró poca o ninguna actividad debido a su corta vida media. El Péptido 2 (SEQ ID NO: 16) y el Péptido Corto 1 (SEQ ID NO: 21) punteó 1 en la escala de actividad. Los péptidos 4 y 5 (SEQ ID NOS: 18 y 19) puntearon 2 en la escala de actividad.

El Péptido 3 (SEQ ID NO: 17) punteó 3 en la escala de actividad. El péptido 6 (SEQ ID NO: 20) y los péptidos Cortos 2, 3 y 4 (SEQ ID NOS: 22, 23 y 24) no exhibieron actividad medible (puntuación de cero) . 5.2.3 Estabilidad de Péptidos Adicionales La estabilidad de cada péptido se determinó al introducirlo en plasma humano fresco y usando transferencia Western como se analiza en el Ejemplo 5.1 anterior. Al igual que la actividad biológica, se clasificó la estabilidad a una escala de 0 a 3. Los resultados se muestran en la Figura 2. Se determinó la estabilidad como la cantidad del péptido que permaneció intacto y unido al anticuerpo especifico de la siguiente manera: 1 = pérdida marcada de unión detectable de anticuerpo por 1/2 horas. 2 = pérdida marcada de unión detectable por 2 horas . 3 = ninguna pérdida marcada de unión de anticuerpo por 24 horas. El péptido (Péptido 1) de SEQ ID NO: 15 punteó 1. El Péptido 6 (SEQ ID NO: 20) también punteó 1. Los Péptidos 3 y 4 (SEQ ID NOS: 17 y 18) puntearon 2. Los Péptidos 2 y 5 (SEQ ID NOS: 16 y 19) puntearon 3. El péptido de los Ejemplos 1-4 también punteó 3 en esta escala. El mismo péptido, pero que carece de PEGilación, también punteó 3 en esta escala. Los péptidos Cortos 1-4 aún no se han probado, aunque los péptidos Cortos 2 a 4 parecen carecer de cualquier manera de actividad biológica . 6. Efectos de Péptido Estabilizado en Proliferación de Células Satelitales Musculares en Músculo Humano Distrófico, con ALS y Saludable El péptido estabilizado de 1.1 anterior se usó en estos experimentos. Se hicieron comparaciones con el péptido de IGF-I de 1.3 anterior. 6.1 Sumario Se derivaron cultivos de células primarias de músculo humano de biopsia de pacientes con distrofia muscular congénita (CMD) , con distrofia facioscapulohumeral (FSHD) y enfermedad de neuronas motoras o esclerosis lateral amiotrófica (ALS) asi como de músculo saludable usando ensayos de proliferación/diferenciación. Los cultivos celulares se trataron con los dos péptidos y se usaron técnicas de inmunocitoquimica para detectar células que expresen el marcador de diferenciación, desmina, y el número total de núcleos usando DAPI. Se usaron ensayos de creatina-fosfocinasa (CPK) y proteina para determinar la diferenciación biogénica después del tratamiento con el péptido. El péptido estabilizado incrementó considerablemente la proliferación de células madre (positivas a desmina) para músculo normal (no enfermo) (de 38.4 ± 2.5 % a 57.9 ± 3.2 % en extremidad normal (no enferma) y de 49.8 ± 2.4 % a 68.8 ± 3.9 % para biopsias de músculo craneofacial (no enfermo) ) . Aunque los números iniciales de células madre musculares fueron menores en pacientes con emaciación muscular, el péptido estabilizado aún indujo un incremento (CMD 10.4 ± 1.7 % a 17.5 ± 1.6 %; FSHD 11.7 ± 1.3 % a 20.4 ± 2.1 % y ALS 4.8 ± 1.1 % a 7.2 ± 0.8 %). Los resultados también confirmaron que el péptido estabilizado no tiene efecto en la formación de miotubos pero que incrementa la proliferación de células progenitoras mioblásticas , en tanto que el IGF-I maduro indujo diferenciación. 6.2 Aislamiento de células derivadas de músculo humano Se aislaron cultivos de células musculares primaras humanas como se describe anteriormente [Le is et al., 2000; Sinanan et al., 2004]. De forma breve, después del consentimiento informado, se obtuvieron biopsias del músculo craneofacial (masetero) de pacientes adultos saludables y con CMD durante cirugía electiva en The Eastman and Middlesex Hospitals, Londres, RU . Se obtuvieron muestras del músculo de extremidad inferior humana (vastus lateralis) de pacientes adultos anuentes saludables con FSHD y ALS por biopsia de aguja bajo anestesia local en el Royal Free Hospital, Londres, RU . Las mezclas se mezclaron de varios pacientes con el mismo trastorno para obtener suficientes números celulares en los cultivos primarios. Estos se lavaron con antibiótico (penicilina, 100 U/ml; estreptomicina, 100 µq/ml; fungizona, 2.5 g/ml; Invitrogen) complementado con DMEM (alto contenido de glucosa; Invitrogen), se picaron con tijeras y los fragmentos de tejido se colocaron en matraces de cultivo T150 cm2 (Helena Biosciences) revestidos con gelatina al 0.2 % (Sigma-Aldrich) . Se incubaron los cultivos de explantar en medios de crecimiento que contienen suero (sGM), compuesto de DMEM, 20 % de FCS ( PAA Laboratories), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 µg/ml) (Invitrogen), y se mantuvieron a 37°C en aire humidificado al 95 % con 5 % de C02. La primera onda de migración de células mononucleares de la explanta se designó la D-onda y esta población se usó a todo lo largo de este estudio. Se recolectaron enzimáticamente las células migratorias de músculo humano usando tripsina-EDTA (Invitrogen) y se sub-cultivarón en sGM hasta 70-80 % de confluencia. El número de pasada x (Px), se definió como la x-ésima recolección secuencial de células subconfluentes . Todos los experimentos se realizaron usando cohortes P3- 5 . Las células expandidas entonces se almacenaron bajo condiciones criogénicas hasta que se usaron en los experimentos descritos más adelante. Al menos 6 corridas se hicieron para cada uno de los tratamientos usados para cada cultivo muscular enfermo asi como para los dos tipos de músculo saludable. 6.3 Determinación de la población de células progenitoras (Madre) miogénicas in vitro Se realizó la valoración del número de precursores biogénicos como se describe anteriormente (Sinanan et al., 2004). Las células se re-colocaron en placa en cubreobjetos de 13 MI revestidos con gelatina (0.2 %) a una densidad inicial de 4.5 x 103 células era"2. Para evitar efectos confundidores de IGF y proteina relacionada en FCS, las células se cultivaron en medio definido libre de suero (dGM) ; DMEM complementado con EGF (10 ng/ml), bFGF (2 ng/ml), insulina (5 ng/ml), holo-transferrina (5 µg/ml), selenita sódica (5 ng/ml) , dexametasona (390 ng/ml) , vitamina C (50 µg/ml), vitamina H (D-biotina; 250 ng/ml), vitamina E (Trolox; 25 µg/ml) (Sigma-Aldrich), albumax-1 (0.5 mg/ml) ( Invitrogen) , fetuina (500 µg/ml) (Clonetics/BioWhittaker), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 µg/ml) (Invitrogen). Después de permitir 24 horas la adherencia, el péptido estabilizado (10 ng/ml) con y sin rIGF-I, (10 ng/ml) y con y sin anticuerpo monoclonal de IGF-I-receptor (Ab-1, 100 µg/ml, Oncogene) se adicionaron en dGM como es apropiado. Los péptidos usados fueron (ver 1.1 y 1.3 anterior) el péptido estabilizado relacionado al dominio E del péptido Ec de IGF-I/MGF [24 residuos de aminoácido] sintetizado como se describe anteriormente [ Dluzniewska et al, 2005] y péptido de IGF-I humano [70 residuo de aminoácido] (Sigma-Aldrich ER2 IGF-I) . Todos los medios se reemplazaron cada 2-3 días. Los cultivos se muestrearon en varios puntos de tiempo para análisis inmunocitoquimico . 6.4. Inmunocitoquimica En los puntos de tiempo apropiados, las células se fijaron con metanol durante 10 minutos (-20°C), seguido por permeabili zación con detergente con Triton-X100 al 0.5 % durante 10-15 minutos. Entonces se incubaron las células durante 60 minutos con un anticuerpo anti-desmina (1:100; clone D33, DAKO, Glostrup, Dinamarca), diluido en solución dilusora de anticuerpo (ADS; PBS plus 10 % de FCS, 0.025 % de azida sódica, 0.1M de lisina) . Se usó para visuali zación un anticuerpo especifico de clase anti-IgG de ratón conjugado a FITC (1:200; Jackson ImmunoResearch Laboratories/Stratech Scientific) . Se identificaron los núcleos por introducción de la sonda de unión al ADN de ranura menor fluorescente, DAPI (1.0 ng/ml; Sigma-Aldrich), en el paso final de incubación de anticuerpo. Los cubreobjetos se montaron con el agente anti-desvanecimiento basado en glicerol, Citifluor (Citifluor Ltd) , y se sellaron con barniz claro de uñas. Se visualizaron la fluorescencia y morfología asociada a células por la epi-fluorescencia y microscopía de contraste por modulación Leica (LMC) , respectivamente, usando un microscopio invertido Leica DMIRB equipado con un software de procesamiento de imágenes Leica FW4000. Para el ensayo de proliferación, se contaron en un campo todas las células positivas fluorescentes azules y verdes. Al menos 30 campos en cada cubreobjeto se contaron de una manera sistemática; por lo tanto se contaron al menos 100 células en cada cubreobjeto. El número de células se comparó como el porcentaje de células positivas a desmina al número total de células positivas a DAPI . 6.5 Ensayo de Creatina-Fos focinasa (CPK) Este ensayo se realizó usando los protocolos anteriormente publicados [Auluck et al., 2005]. La medición de CPK permite la comparación cuantitativa de la miogénesis [Goto et al., 1999], puesto que es un marcador de la formación de miotubos. La enzima CPK cataliza la fosforilación reversible de adenosina-5-difosfato (ADP) para formar adenosina-5-trifosfato (ATP) y creatina libre. La reacción se puede seguir en cualquier dirección al medir la formación de fósforo inorgánico, un producto final de la reacción que es proporcional a la actividad de CPK. Esto se inhibió usando el método colorimétrico basado en el procedimiento de generación de fosfato inorgánico [Fiske y Subbarow, 1925] . Esto entonces se expresó en términos del contenido de proteina en cultivo. Los cultivos de células musculares humanas primarias anteriormente expandidos se re-colocaron en placa a 10 x 104 células/concavidad en placas de 96 concavidades revestidas con 0.2 % de gelatina. Se cultivaron las células hasta 70/80 % confluentes en sGM luego el medio cambió al medio de diferenciación (DM; DMEM, 2 % de FCS, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 µg/ml)) que contiene el péptido estabilizado [24 residuos de aminoácido] sintetizados como se describe anteriormente [ Dluzniewska et al, 2005] y/o péptido de IGF-I humano [70 residuos de aminoácido] ( Sigma-Aldrich IGF-I ER2). Después de 48 horas, las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo y luego se almacenaron congeladas en amortiguador de glicina 0.5 mM (pH 6.75) a -70°C. Las células fijadas se lisaron por descongelación rápida y equipo de ensayo de CPK de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Sigma-Aldrich).

La concentración de proteina de cada muestra se determinó contra una curva normal de albúmina usando el equipo Pierce Micro BCA (PerBio Science, RU Ltd., Northumberland, RU) . 6.6 Análisis Estadístico Se aplicó la prueba de ANOVA unidireccional usando StatView 4.51 (SAS Institute Inc., Cherwell Scientific Publishing Ltd, Oxford, RU) seguido por la prueba post hoc PLSD de Fisher's. p < 0.05 se consideró significante. Los datos se mezclaron para todas las corridas (mínimo de 6) para los 4 tipos de experimentos para cada condición incluyendo los dos tipos de músculo saludable y se presentan como media ± s.d. 6.7 La Proporción de Precursores Biogénicos en Cultivos Primarios Musculares Humanos Se determinó el porcentaje de células biogénicas (positivas a desmina) de todos los músculos probados (ver tabla posterior) . El músculo normal (no enfermo) contuvo una proporción significativa de células positivas a desmina en tanto que el músculo enfermo contuvo una proporción mucho menor de células biogénicas.

Tabla.- Cultivos de músculo primario humano derivados de diferentes fuentes de músculos que contienen diferentes proporciones de células biogénicas (positivas a desmina) antes de la adición de los péptidos.

Tipo de músculo Células positivas a desmina como porcentaje de células totales en cultivo primario Craneofacial normal (no enfermo) 49.8 ± 2.4 % Extremidad normal (no enferma) 38.4 ± 2.5 % Extremidad de CMD 10.4 ± 1.7 % Extremidad de ALS 4.8 ± 1.1 % Extremidad de FSHD 11.7 ± 1.3 % 6.8 Efecto en Células Progenitores de Músculo Primario Humano Normal (No Enfermo) El péptido estabilizado incrementó la proliferación (cambios en la proporción de núcleos asociados a desmina a núcleos totales) de manera significativa en cultivos primarios craneofaciales (maseteros) normales desde 49.8 ± 2.4 % a 68.8 ± 3.9 %; p < 0.0001) . IGF-I también indujo un incremento moderado (desde 49.8 ± 2.4 % a 58.4 ± 4.2 %; p < 0.0001) . De manera interesante, se encontró que el efecto del péptido estabilizado en la relación de proliferación de células positivas a desmina se inhibió cuando se adicionó IGF-I (desde 68.8 ± 3.9 % a 59.5 ± 4.2 % ; 0 < 0.0001) . El efecto visto en los cultivos primarios de extremidad inferior (cuadríceps) normales fue similar a aquél visto con músculo craneofacial. El péptido estabilizado incrementó significativamente la proliferación de células progenitoras musculares (desde 38.4 + 2.5 % a 57.9 ± 3.2 %; p < 0.0001). El IGF-I sólo tuvo un efecto menor en la proliferación (desde 38.4 ± 2.5 % a 47.1 ± 3.5 %; p < 0.0001) pero IGF-I anuló completamente la respuesta al péptido estabilizado cuando se adicionaron los dos péptidos en combinación (desde 57.9 ± 3.2 % a 38.8 ± 0.6 % ; 0 < 0.0001) . 6.9 Efecto en Proliferación de Células Derivadas de Músculo Primario Humano en Estado de Enfermedad Después de la observación que el péptido estabilizado puede incrementar de manera reproducible y significante el número de células positivas a desmina en músculo normal, se investigó el efecto del músculo con estado de enfermedad. En cultivos primarios derivados de distrofia muscular congénita (C D) , el péptido estabilizado incrementó significativamente la proliferación de células progenitoras musculares (desde 10.4± 1.7 % a 17.5 + 1.6 %; p < 0.0001), en tanto que IGF-I tiene un efecto pequeño (10.4 ± 1.7 % a 13.2 ± 1.7 % ; p = 0.005). Cuando se combinan ambos péptidos el efecto inhibidor se observó nuevamente como para el músculo normal, con el efecto del péptido estabilizado que se redujo a niveles de control (desde 1.75 ± 1.6 % a 13.1 ± 1.2 %; p = 0.0001). Los efectos del péptido estabilizado en la proliferación celular de células musculares de esclerosis lateral amiotrófica - (ALS) y FSHD (produjo resultados similares. El péptido estabilizado incrementó los números de células que expresan desmina notablemente en estos trastornos (ALS desde 4.8 ± 1.1 % a 7.2 ± 0.8 %; p = 0.0002, FSHD desde 11.7 ± 1.3 % a 20.4 ± 2.1 % ; p < 0.0001) . Como fue el caso para el músculo normal, el IGF-I tiene nuevamente un efecto insignificante (ALS desde 4.8 + 1.1 % a 4.7 ± 1.4 %; p = 0.7719, FSHD desde 11.7 ± 1.3 % a 14.1 ± 1.6 % ; P = 0.0107)). Cuando ambas isoformas se usaron conjuntamente, el incremento de la expresión de desmina inducido por MGF se inhibió nuevamente (ALS desde 7.2 ± 0.8 % a 5.3 ± 1.0 % ; p = 0.0024, FSHD desde 20.4 ± 2.1 % a 14.5 ± 1.4 % ; p < 0.0001). 6.10 Proliferación Incrementada de Células Progenitoras por Dominio E de MGF con Relación al Receptor de IGF-I El músculo normal, el incremento en la proliferación inducido por el péptido estabilizado no se inhibió por la presencia de un anticuerpo anti-IGFIR (68.8 ± 3.9 % en MGF tratado y 71.1 ± 6.2 % en MGF más células tratadas con Ab-I; p = 0.2472) . También se observó el mismo efecto tanto para el músculo de CMD como para ALS (17.5 ± 1.6 % vs. 16.7 ± 1.8 %; p = 0.4589 para CMD; 7.2 ± 0.8 % vs . 6.5 ± 0.8 %; p = 0.2933 para ALS). Esto indica que la acción del dominio E de MGF no comprende el receptor de IGF-I . 6.11 Efectos de Dominio E de MGF en la Prevención de Diferenciación Terminal En los ensayos de CPK de 6.4 anterior, el péptido estabilizado no facilita la diferenciación de mioblastos primarios ni la formación del miotubos. En contraste, IGF-I a una concentración de 10 ng/ml estimula aparentemente la formación de miotubos puesto que los números de células que expresan desmina se disminuye por la adición de IGF-I en esta etapa de la miogénesis. En realidad, en la presencia de 10 ng/ml de IGF-I, el péptido estabilizado actuó como un agonista, y de una manera dependiente de la dosis, previno la diferenciación al estado competente de fusión de mioblastos. La disminución de 100 ng/ml del péptido estabilizado con 10 ng/ml de IGF-I sistémico fue menor que 10 ng/ml de MGF con la misma dosis de IGF-I. 6.12 Conclusiones El péptido estabilizado indujo proliferación de células progenitoras de manera significativa en cultivo de músculo primario de pacientes con CMD, FSHD y ALS asi como en individuos saludables. El péptido estabilizado no afecta la formación de miotubos, un proceso que acelera significativamente IGF-I. Esto demuestra que el dominio E de MGF biológicamente activo tiene una actividad distinta en comparación a IGF-I maduro. Nuestros hallazgos indican que las diferentes acciones de las isoformas de IGF-I se median probablemente mediante receptores diferentes. El bloqueo del receptor de IGF-I proporciona evidencia que el dominio E de MGF incrementa la proliferación de células satelitales mediante una diferente ruta de señalización a IGF-I, y que la activación inicial de células satelitales es un proceso separado del que se ve influenciado por el IGF-I maduro. Se ha propuesto que la emaciación muscular en condiciones neurológicas y el envejecimiento son debido a una pérdida de células satelitales. Se ha demostrado que la relación de células progenitoras (positivas a desmina) a los mioblastos totales de pacientes con CMD, FSHD y ALS es baja en comparación a la relación de mioblastos de individuos saludables. De esta manera, es discutible si los músculos se degeneran debido a la carencia de células satelitales o debido a la incapacidad para expresar algún factor para la activación de células satelitales. Anteriormente se ha demostrado que las personas de edad avanzada son incapaces de expresar MGF a los niveles requeridos para mantener el músculo [Hameed et al., 2004], con hallazgos similares para pacientes con FSHD y ALS (hallazgos no publicados ) .

La emaciación muscular es una de las causas principales de muerte en pacientes con ciertas enfermedades neuromusculares . La pérdida de músculo se puede enlazar a la incapacidad para expresar MGF, y que el músculo de ratón distrófico mdx, un modelo para Distrofia Muscular humano de Duchenne, son incapaces de producir MGF aún durante estímulos mecánicos [Goldspink et al., 1996]. De Barí et al, encontraron que cuando se introdujeron células madre mesenquimales en músculos distróficos de ratón mdx, la expresión sarcolemmal de distrofina y también se restauró la expresión de MGF [De Bari et al., 2003]. Por lo tanto, la producción de MGF puede depender de la conformidad de la membrana celular y comprende posiblemente algún tipo de mecanismo de mecanotraducción, por ejemplo, el complejo de distrofina. Se ha conocido durante algún tiempo que el IGF-I es un factor neurotrófico, y posee aplicaciones clínicas potenciales para trastornos neurodegenerativos, particularmente ALS. Usando modelos de animal, se ha usado la distribución sistémica de IGF-I recombinante humano (IGF-I maduro) en modelos de animal y para tratar pacientes con ALS. Más recientemente, se reportó que el ejercicio, cuando se combina con terapia génica de IGF-I por el vector AAV2, tiene efectos sinérgicos en el tratamiento de un modelo de animal de ALS [Kaspar et al., 2005].

Sin embargo, los datos presentados aquí indican que es la actividad del MGF, no aquélla del IGF-I ordinario, la que será mayor para el uso en el tratamiento de emaciación muscular, debido a que ofrece un método efectivo para reabastecer la mezcla de células satelitales (madre) musculares que se requieren para el mantenimiento de reparación de músculos. Esto soporta el uso de péptidos de la invención como agentes terapéuticos para la degeneración muscular en trastornos tal como CMD, FSHD y ALS en los cuales hay un deterioro aparente en la expresión de la variante de empalme de MGF. También está el potencial de usar péptidos de la invención para multiplicar las células satelitales musculares en cultivo para propósitos de terapia celular . 7. Ensayos de Proliferación Celular con Péptidos de 8 Aminoácidos 7.1 Péptidos de DMGF y CMGF Los péptidos de 8 aminoácidos descritos en 1.3.1 anterior y referidos en la Figura 8A como DMGF y CMGF se probaron para la capacidad para inducir proliferación de células musculares C2C12 a una densidad de 2000 células por concavidad en un medio que contiene DMEM (1000 mg/L de glucosa), BSA (100 ug/ml) e IGF-I (2 ng por mi). Se probaron concentraciones de 2, 5, 50 y 100 ng/ml de DMGF y CMGF (ver los conjuntos izquierdo e intermedio de resultados en la Figura 8), junto con 2, 5, 50 y 100 ng/ral de IGF-I solo (ver el conjunto derecho de resultados en la Figura 8). Después de 36 horas de incubación, se usó un ensayo de Azul de Alamar para valorar el nivel de proliferación celular lograda. También se proporcionó un control que contiene sólo el medio. Tanto DMGF como CMGF indujeron proliferación celular. Los resultados se muestran en la Figura 8A en términos de fluorescencia en el ensayo de Azul de Alamar. Todos los valores para DMGF y CMGF, y aquéllos para IGF-I solo, fueron estadísticamente diferentes al valor de control para el medio únicamente. Se observaron niveles crecientes de proliferación con concentración creciente de DMGF/CMGF. 7.2 Péptidos A2, A4 , A6 y A8 Los péptidos de 8 aminoácidos descritos en 1.3.2 anterior y referidos en la Figura 8B como A2, A4, A6 y A8 se probaron para la capacidad para inducir proliferación de células musculares C2C12 a una densidad de 500 células por concavidad. Se llevó a cabo el cultivo durante 24 horas en FBS al 10 %, seguido por inanición durante 24 horas en BSA al 0.1 %, estimulación durante 24 horas y luego tratamiento con BrdU durante 5 horas. Se probaron concentraciones de 0.1, 1, 10 y 100 ng/ml de los péptidos A2, A4 , A6 y A8 , junto con 0.1, 1, 10 y 100 ng/ml de IGF-I (ver el conjunto derecho de resultados en la Figura 8B) . Se midió la incorporación de BrdU para valorar el nivel de proliferación celular lograda. También se proporcionaron controles que no contienen células, sólo medio, 5 % de FBS y sin BrdU. Los péptidos A2, A4 , A6 y A8 indujeron proliferación celular. Los resultados se muestran en la Figura 8 en términos de fluorescencia (absorbencia a 370 nm; media más error estándar a través de 4 concavidades) . 8. Ensayos de Proliferación Celular con Células Primarias Humanas (HSMM) El péptido de 24 aminoácidos descrito en 1.4 anterior y referido en las Figuras 9-11 como A5 se probó para la capacidad para inducir proliferación de células progenitoras musculares humanas (Cambrex) . Éstas son células musculares humanas primarias comercialmente disponibles, es decir, células madre (progenitoras) musculares humanas. Algunas veces también se conocen como mioblastos de músculo esquelético humano (HSMM) . Se obtuvieron células de un sujeto varón de 39 años de edad. Se llevó a cabo el cultivo durante 24 horas en 200 µ? de medio SkGM2 complementado con hEGF, L-Glut, dexametasona , antibióticos y 10 % de FCS. El medio de cultivo entonces se removió y las células se lavaron dos veces en medio libre de suero . Se probó A5 para la capacidad para inducir proliferación de HSMM Cambrex a una densidad de 500 (Figuras 9 y 10) ó 1000 (Figura 11) células por concavidad en el medio SkGM2 Cambrex complementado con hEGF, L-Glut, dexametasona y antibióticos. Se probaron concentraciones de 0.1, 1, 10, 100 y 500 ng/ml de A5 (ver el conjunto derecho de resultados de las Figuras 9A, 10A y 11A) , junto con 0.1, 10 y 100 ng/ml de IGF-I solo (ver los resultados en las Figuras 9A, 10A y 11A) . También se probaron concentraciones de 0.1, 1, 10, 100 y 500 ng/ml de A5 en la presencia de 2 ng/ml de IGF-I (ver el conjunto izquierdo de resultados de las Figuras 9B, 10B y 11B) .. Después de 48 horas de incubación, las células se trataron con BrdU durante 5 horas. Se midió la incorporación de BrdU para valorar el nivel de proliferación celular lograda. También se proporcionaron controles que no contienen células, sólo medio, 5 % de FBS y sin BrdU. IGF-I solo no tiene efecto significativo en la proliferación de HSMM a ninguna dosis (ver Figuras 9-11) .

Después de 48 horas, el péptido A5 tiene un efecto significante (P < 0.1) en la proliferación de HSMM cuando se usa en aislamiento a dosis de 10 ng/ml y por abajo (Figuras 9A y 10A) . La adición de 2 ng/ml de IGF-I al medio en combinación con A5 dio por resultado un efecto significativo en la proliferación de HSMM a un nivel mayor de confianza (P < 0.001; Figuras 9B, 10B y 11B) . Conforme las células estuvieron creciendo comparativamente más lento, se recomienda incrementar el periodo de incubación con péptido a 72 horas. En segundo lugar, la señal se mejoró al incrementar el tiempo de exposición a BrdU.

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Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Polipéptido que comprende hasta 50 residuos de aminoácido; caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos derivada del péptido E C- terminal de una isoforma del- Factor de Crecimiento Mecánico (MGF) del Factor i de Crecimiento Tipo Insulina (IGF-I) ; el polipéptido incorpora una o más modificaciones que le dan estabilidad incrementada en comparación al polipéptido E no modificado de MGF; y el polipéptido posee actividad biológica. 2. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la actividad biológica se selecciona de la capacidad para incrementar la resistencia muscular, capacidad cardioprotectora y capacidad neuroportectora . 3. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque al menos una de estas modificaciones es a la secuencia de aminoácidos que se deriva del péptido E C-terminal. 4. Polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las modificaciones incluyen una o más conversiones de un aminoácido de forma L al aminoácido correspondiente de forma D. 5. Polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las modificaciones incluyen PEGilación o la adición de una porción de ácido hexanoico o amino-hexanoico . 6. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la PEGilación o la adición de ácido hexanoico o amino-hexanoico es en la N-terminal . 7. Polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las modificaciones incluyen ciclización del polipéptido. 8. Polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las modificaciones incluyen la sustitución de uno o más aminoácidos . 9. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la sustitución incluye el reemplazo con Alanina de un aminoácido diferente de Alanina . 10. Polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el péptido E C- terminal es el péptido Eb de Rata de SEQ ID NO: 13 o el péptido Eb de Conejo de SEQ ID NO: 14. 11. Polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el péptido E C-terminal es el péptido Ec humano de SEQ ID NO: 27 o el péptido de SEQ ID NO: 15. 12. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque las modificaciones incluyen PEGilación o la adición de una porción de ácido hexanoico o amino-hexanoico . 13. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la PEGilación o adición de una porción de ácido hexanoico o amino-hexanoico es en la N- terminal. 14. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque las modificaciones incluyen una o más conversiones de un aminoácido de la forma L al aminoácido correspondiente de la forma D. 15. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque uno o ambos de los residuos de Arginina en las posiciones 14 y 15 de SEQ ID NO: 27 ó 15 está en la forma D. 16. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque ambos de los residuos de Arginina en las posiciones 14 y 15 de SEQ ID NO: 27 ó 15 están en la forma D. 17. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque estas modificaciones incluyen la sustitución de uno o más aminoácidos. 18. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la sustitución está en la posición 5, 12, 14 ó 18. 19. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la sustitución incluye el reemplazo con Alanina de un aminoácido diferente de Alanina. 20. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la sustitución de Alanina es una o más de (a) Serina a Alanina en la posición 5, (b) Serina a Alanina en la posición 12, (c) Arginina a Alanina en la posición 14 y (d) Serina a Alanina en la posición 18 de SEQ ID NO: 15 ó 27. 21. Polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el péptido C-terminal es el polipéptido de SEQ ID NO: 33 ó 34. 22. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque las modificaciones incluyen PEGilación o la adición de una porción de ácido hexanoico o amino-hexanoico . 23. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la PEGilación o la adición de una porción de ácido hexanoico o araino-hexanoico es en la N- terminal . 24. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque estas modificaciones incluyen la sustitución de uno o más aminoácidos. 25. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la sustitución es en la posición 2. 26. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la sustitución incluye el reemplazo con Alanina de un aminoácido diferente de Alanina. 27. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la sustitución de Alanina es una o más de (a) Serina a Alanina en la posición 2. 28. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque cuya secuencia es aquélla de SEQ ID NO: 33, 34, 35 ó 36. 29. Polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las modificaciones incluyen el truncamiento por uno o dos aminoácidos del C-término de la secuencia de aminoácidos que se deriva del péptido E C-terminal. 30. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque cuya secuencia es aquélla del polipéptido de SEQ ID NO: 21. 31. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque cuya secuencia es aquélla del polipéptido de SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 28, 29, 30 ó 31. 32. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque cuya secuencia es aquélla de SEQ ID NO: 15 ó 27, pero que está PEGilada en el N-término y en donde ambos de los residuos de Arginina en las posiciones 14 y 15 de SEQ ID NO: 15 ó 27 están en la forma D. 33. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque cuya secuencia es aquélla de SEQ ID NO: 15 ó 27, en donde ambos de los residuos de Arginina en las posiciones 14 y 15 de SEQ ID NO: 15 ó 27 están en la forma D, y que no están PEGilados . 34. Polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque está amidado en el C-termino. 35. Polipéptido extendido, caracterizado porque comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, extendido por la secuencia de aminoácidos no tipo silvestre N-terminal y/o C-terminal al polipéptido de la reivindicación 1. 36. Polipéptido extendido de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la extensión comprende un residuo de cisteína en el C-término y/o un residuo de D-arginina en el N-Término. 37. Polipéptido o polipéptido extendido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque cuya estabilidad, como se mide por la vida media en plasma humano, es al menos 10 % mayor que aquélla del péptido E no modificado. 38. Polipéptido o polipéptido extendido de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque cuya estabilidad, como se mide por la vida media en plasma humano, es al menos 50 % mayor que aquélla del péptido E no modificado . 39. Polipéptido o polipéptido extendido de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque cuya estabilidad, como se mide por la vida media en plasma humano, es al menos 100 % o más que aquélla del péptido E no modificado . 40. Polipéptido o polipéptido extendido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque cuya vida media en plasma humano es al menos 2 horas . 41. Polipéptido o polipéptido extendido de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque cuya vida media en plasma humano es al menos 12 horas o al menos 24 horas. 42. Composición, caracterizada porque comprende un polipéptido o polipéptido extendido, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un portador. 43. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un polipéptido o polipéptido extendido, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41 y un portador farmacéuticamente aceptable. 44. Polipéptido o polipéptido extendido, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, caracterizado porque es para el uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal . 45. Método para tratar un trastorno muscular, caracterizado por la administración a un paciente en necesidad del mismo de una cantidad efectiva de un polipéptido o polipéptido extendido, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41. 46. Método, de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el trastorno muscular es un trastorno del músculo esquelético. 47. Método, de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el trastorno muscular es distrofia muscular o emaciación o debilidad relacionada progresiva del músculo esquelético, atrofia muscular, caquexia, debilidad muscular; sarcopenia o debilidad en un sujeto de edad avanzada; o en donde el polipéptido o polipéptido extendido se administra para el propósito de reparación muscular después de trauma. 48. Método, de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la distrofia muscular es distrofia muscular de Duchenne o Becker, distrofia muscular facioescapulohumeral (FSHD) , o distrofia muscular congénita (CMD) ; la atrofia muscular es atrofia por desuso, atrofia inducida por glucocorticoides , atrofia muscular en un sujeto envejecido o atrofia muscular inducida por lesión de médula espinal o enfermedad neuromuscular; la caquexia está asociada con cáncer, SIDA, Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (COPD) , una enfermedad inflamatoria crónica o lesión por quemadura; o la debilidad muscular está en el esfínter urinario, esfínter anal o músculos del piso pélvico. 49. Método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el trastorno muscular es un trastorno del músculo cardiaco. 50. Método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el polipéptido o polipéptido extendido se administra para el propósito de prevención o limitación de daño miocardiaco en respuesta a isquemia o sobrecarga mecánica del corazón; para promover la síntesis de músculo cardiaco; para mejorar el rendimiento cardiaco al incrementar el volumen de la pulsación cardiaca; para tratar una cardiomiopatía; en respuesta a una falla cardiaca aguda o ataque agudo al corazón; para tratar hipertrofia cardiaca patológica; o para tratar falla cardiaca congestiva. 51. Método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la falla cardiaca aguda o ataque agudo comprende miocarditis o infarto a miocardio. 52. Método para tratar un trastorno neurológico, caracterizado por la administración a un paciente en necesidad del mismo en una cantidad efectiva de un polipéptido o polipéptido extendido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41. 53. Método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el polipéptido o polipéptido extendido se administra para el propósito de prevención de pérdida neuronal asociada con un trastorno de, o daño a, el sistema nervioso, o para el mantenimiento del sistema nervioso central (CNS) . 54. Método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la pérdida neuronal se asocia con un trastorno neurodegenerativo, daño a nervios o isquemia. 55. Método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el trastorno es esclerosis lateral amiotrófica; atrofia muscular espinal; atrofia muscular espinal progresiva; atrofia muscular infantil o juvenil; poliomielitis o síndrome post-polio; un trastorno provocado por exposición a una toxina, trauma a motoneuronas , una lesión de motoneuronas o daño a nervios; una lesión que afecte las motoneuronas; pérdida de motoneuronas asociada con envejecimiento; distrofia muscular autosomal o enlazada al sexo,- enfermedad de Alzheimer; enfermedad de Parkinson; neuropatía diabética; una neuropatías periférica; un ataque embólico o hemorrágico; daño cerebral relacionado a alcohol; 0 en donde el polipéptido o polipéptido extendido se administra para el propósito de reparación de nervios después de trauma. 56. Uso de un polipéptido o polipéptido extendido, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, en la elaboración de un medicamento para el uso en un tratamiento como se define en cualquiera de las reivindicaciones 45 a 55. 57. Método para tratar un trastorno neurológico, caracterizado por la administración a un paciente en necesidad del mismo de una cantidad efectiva de: un polipéptido que comprende hasta 50 residuos de aminoácido, el polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada del péptido E C-terminal de una isoforma del Factor de Crecimiento Mecánico (MGF) del Factor 1 de Crecimiento Tipo Insulina (IGF-I) ; o un polipéptido extendido que comprende el polipéptido y extendido por una secuencia de aminoácidos no tipo silvestre N-terminal y/o C-terminal al polipéptido; y el polipéptido o polipéptido extendido que posee actividad biológica. 58. Método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque la actividad biológica es capacidad neuroportectora . 59. Método de conformidad con la reivindicación 57 ó 58, caracterizado porque el polipéptido o polipéptido extendido se administra para el propósito de prevención de pérdida neuronal asociada con un trastorno de, o daño a, el sistema nervioso, o para el mantenimiento del sistema nervioso central (CNS) . 60. Método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la pérdida neuronal se asocia con un trastorno neurodegenerativo, daño a nervios o isquemia. 61. Método de conformidad con la reivindicación 57 ó 58, caracterizado porque el trastorno es esclerosis lateral amiotrófica; atrofia muscular espinal; atrofia muscular espinal progresiva; atrofia muscular juvenil o infantil; poliomielitis o síndrome post-polio; un trastorno provocado por exposición a una toxina, trauma de motoneuronas , una lesión de motoneuronas o daño a nervios; una lesión que afecte las motoneuronas; pérdida de motoneuronas asociada con envejecimiento; distrofia muscular autosomal o enlazada al sexo; enfermedad de Alzheimer; enfermedad de Parkinson; neuropatía diabética; una neuropatía periférica; un ataque embólico o hemorrágico ; daño cerebral relacionado a alcohol; o en donde el polipéptido o polipéptido extendido se administra para el propósito de reparación de nervios después de trauma. 62. Método para tratar un trastorno del músculo cardiaco, caracterizado por la administración a un paciente en necesidad del mismo de una cantidad efectiva de: un polipéptido que comprende hasta 50 residuos de aminoácido, el polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada del péptido E C-terminal de una isoforma de Factor de Crecimiento Mecánico (MGF) de Factor I de Crecimiento Tipo Insulina (IGF-I) ; o un polipéptido extendido que comprende el polipéptido y extendido por la secuencia de aminoácidos no tipo silvestre N-terminal y/o C-terminal al polipéptido; y el polipéptido que posee actividad biológica. 63. Método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la actividad biológica es capacidad cardioprotectora . 64. Método de conformidad con la reivindicación 62 ó 63, caracterizado porque el polipéptido o polipéptido extendido se administra para el propósito de prevención o limitación de daño miocardiaco en respuesta a isquemia o sobrecarga mecánica del corazón; para promover la síntesis de músculo cardiaco; para mejorar el rendimiento cardiaco al incrementar el volumen de la pulsación cardiaca; para tratar una cardiomiopatía; en respuesta a falla cardiaca aguda o ataque agudo al corazón; para tratar hipertrofia cardiaca patológica; o para tratar falla congestiva del corazón. 65. Método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque la falla aguda del corazón o ataque agudo comprende miocarditis o infarto a miocardio. 66. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 57 a 65, caracterizado porque el péptido E C-terminal es el péptido Eb de Rata de SEQ ID NO: 13, el péptido Eb de Conejo de SEQ ID NO: 14, el péptido Ec humano de SEQ ID NO: 27, el péptido de SEQ ID NO: 15 o el péptido de SEQ ID NO: 33 ó 34. 67. Método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque el polipéptido o polipéptido extendido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 13, 14, 15, 27, 33 ó 34. 68. Método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la secuencia del polipéptido es aquélla de la secuencia de SEQ ID NO: 13, 14, 15, 27, 33 ó 34. 69. Uso de un polipéptido o polipéptido extendido, de conformidad con las reivindicaciones 57, 58, 62, 63, 66, 67 ó 68 en la elaboración de un medicamento para el uso de un tratamiento como se define en cualquiera de las reivindicaciones 59, 60, 61, 64 ó 65. 70. Polipéptido, cuya secuencia es aquélla de SEQ ID NO: 27, caracterizado porque uno o ambos de los residuos de Arginina en las posiciones 14 y 15 de SEQ ID NO: 27 está en la forma D. 71. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque ambos de los residuos de Arginina en las posiciones 14 y 15 de SEQ ID NO: 27 está en la forma D. 72. Polipéptido, caracterizado porque cuya secuencia es aquélla de SEQ ID NO: 33, 34, 35 ó 36. 73. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 70, 71 ó 72, caracterizado porque además comprende de uno a cinco aminoácidos adicionales en el C-término y/o de uno a cinco aminoácidos adicionales en el N-término . 74. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque uno o más de estos aminoácidos adicionales es un aminoácido de forma D. 75. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el aminoácido adicional de forma D está presente en el N-término. 76. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el aminoácido adicional de la forma D es D-Arginina. 77. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque no están presentes aminoácidos adicionales en el C-término. 78. Polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 70 a 74, caracterizado porque un aminoácido adicional está presente en el C-término y es cisteina . 79. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque no están presentes aminoácidos adicionales en el N-término. 80. Polipéptido, caracterizado porque cuya secuencia es aquélla de SEQ ID NO: 15 ó 27, más un residuo adicional de cisteina en el C-término y opcionalmente uno a cuatro aminoácidos adicionales en el C-término y/o uno a cinco aminoácidos adicionales en el N-término. 81. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque uno o ambos de los residuos de Arginina en las posiciones 14 y 15 de SEQ ID NO: 15 ó 27 está en la forma D. 82. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque ambos de los residuos de Arginina en las posiciones 14 y 15 de SEQ ID NO: 27 ó 15 está en la forma D. 83. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 80, 81 u 82, caracterizado porque uno o más de estos aminoácidos adicionales es un aminoácido de forma D. 84. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque un aminoácido de forma D está presente en el N-término. 85. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque un aminoácido de forma D es D-Arginina. 86. Polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 70 a 85, caracterizado porque está amidado en el C-término. 87. Polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 70 a 86, caracterizado porque está PEGilado, o al cual se une una porción de ácido hexanoico o amino-hexanoico . 88. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque la PEGilación o la unión de una porción de ácido hexanoico o amino-hexanoico es en el N- término. 89. Polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 70 a 88, caracterizado porque no está PEGilado .