CN113476589A - 肽在制造用于治疗神经退行性疾病的组合物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肽在制造用于治疗神经退行性疾病的组合物中的用途，其中所述组合物包含：药物有效量的由氨基酸序列SEQ ID NO:1组成的肽，其中所述神经退行性疾病是脑疾病、脊髓损伤、外周神经损伤、外周神经疾病、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿病、脊髓小脑变性和多发性神经病中的任一种。根据本发明，所述肽对神经退行性疾病显示预防和治疗效果，因此可以提供一种治疗神经退行性疾病的新方法。

Description

肽在制造用于治疗神经退行性疾病的组合物中的用途
本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/KR2016/012613，中国国家申请号为201680074827.4，申请日为2016年11月3日，发明名称为“具有神经元损失预防和再生效果的肽以及包含该肽的组合物”。
技术领域
本发明涉及肽在制造用于治疗神经退行性疾病的组合物中的用途，以及对神经元再生和预防神经元损失有效的肽以及包含它的组合物，并且更具体地涉及用于预防和治疗脑血管或神经退行性疾病的组合物，其包含端粒酶衍生肽，并且对神经元再生和预防神经元损失有效，从而预防和治疗由神经元损失引起的疾病。
背景技术
神经元细胞是由神经干细胞(NSC)分化产生的各种类型的细胞。NSC分化成构成神经系统的各种类型，如神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
存在指示NSC分化成神经元的各个步骤的标志物，所述步骤包括：增殖、分化、迁移、靶向和突触发生。双皮质素(Doublecortin，DCX)是在神经祖细胞中表达的蛋白质，并且指示未成熟的神经元，神经元特异性III类β微管蛋白(TuJ1)指示在新生成的未成熟的有丝分裂后神经元中表达的活跃分裂的神经祖细胞或活跃分裂的神经元，并且神经元核抗原(NeuN)是在有丝分裂后的细胞中表达的核蛋白，并指示成熟的神经元。根据这些标志物的表达水平，可以确定神经元是否分化或增殖，并发生正常增殖。
神经元损伤导致各种症状，并且脑神经细胞损伤可能导致认知障碍和黄斑变性。在指示神经元损伤的标记物中，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是在包括星形胶质细胞的中枢神经系统中表达的蛋白质，并且用于形成星形胶质细胞的细胞骨架。这种蛋白质的异常表达诱导神经胶质增生，导致认知障碍。此外，半乳糖神经酰胺酶(GalC)是去除半乳糖的酶，可作为少突胶质细胞标志物，并指示NSC已分化成少突胶质细胞。通过这些标志物，可以确定NSC是否受损以及少突胶质细胞是否再生。
神经功能异常称为神经疾病，如中风、脑肿瘤、帕金森病、癫痫、偏头痛、睡眠障碍或痴呆。
在神经疾病中，中风是脑血管疾病，其由于脑血管的病理变化而导致脑异常，导致由栓塞或血栓形成引起的腔内闭塞或血管破裂。这种中风是脑血管堵塞或爆裂产生的疾病，分为两种类型，例如脑梗塞和脑出血。脑梗塞被称为缺血性脑血管疾病，其原因是由于脑血管阻塞导致血液和氧气难以供应给脑，导致脑细胞死亡。同时，脑出血被称为出血性脑血管疾病，其中因脑血管破裂和出血导致脑损伤。脑梗塞和脑出血导致脑失去其功能，造成偏瘫、言语和意识障碍，并且在严重时导致死亡。
缺血性脑血管疾病是由海马体CA1区域的延迟性神经元死亡引起的疾病，因为由于脑血流量减少而难以向脑细胞供应氧和葡萄糖(Kirino,Brain Res.,239,p57-69,1982)。此外，缺血性脑病又细分为血栓形成、栓塞、短暂性缺血性发作和小梗塞(lacume)。
缺血性损伤如中风的分子生物学机制是，当向实质(parenchyma)的特定部分的血液供应被阻断时，由于氧气和葡萄糖供应中断而不可能提供足够的ATP以维持细胞内离子通道，并且通过诱导N-甲基-D-天冬氨酸(NDMA)受体、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑-丙酸(AMPA)和代谢型谷氨酸受体的连续激活来提高钙离子的细胞内摄取(Science,244,p1360-1362,1989)。已知通过过量释放谷氨酸和天冬氨酸产生包括自由基的细胞毒性分子，钙的细胞内摄取通过破坏细胞结构如DNA和细胞膜来促进神经元细胞的死亡。
缺血性中风是单一疾病死亡的头号原因，并且治疗需要大量的社会经济成本。中风是一种老年人发病率高的疾病，但最近30至40岁人中中风发病率占中风病人总数的约1/4，这意味着中风在向更年轻的人蔓延。但是，尚未开发出对预防中风引起的神经元损伤有重要作用的药物。对于绝大多数患者来说，没有明显的治疗方法，因此只关注保守治疗和二级预防治疗，但会产生严重的后遗症。因此，正在进行研究以通过开发新疗法使因中风导致的脑细胞死亡最小化而减少这种后遗症。使用迄今为止已经开发出用于保护神经元免于中风的药物来阻断中风引起的细胞凋亡途径的某些位点。然而，由于中风导致的神经元凋亡通过各种途径发生，所以这种药物对中风不是很有效。最近，有关靶向治疗的研究取得进展，从而通过调节与病理机制有关的各种因素来确定缺血性中风的确切病理，并将脑神经细胞的死亡降至最低。
在本发明中，确认了端粒酶衍生肽具有抑制由氧-葡萄糖缺乏(OGD)引起的神经细胞凋亡的效果，所述氧-葡萄糖剥夺(OGD)是PEP1缺血性中风的体外模型，已知具有抗癌或抗炎作用。在针对多种疾病的众多临床试验中，PEP1的毒性已经被测试，并且鉴定出PEP1在副作用方面稳定。迄今为止，作为缺血性中风的治疗剂提出的各种药物在治疗目标或发生时间方面非常有限，并且具有出血的副作用，但是PEP1表现出意想不到的显著的神经保护作用。
在神经疾病中，由脑或外周神经细胞变性、减少或凋亡或由于环境或遗传原因造成的这些细胞的损伤或排斥引起的神经退行性疾病包括；痴呆、帕金森病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿病、脊髓小脑变性、肌萎缩性侧索硬化症、多发性神经病、脊髓损伤和脑血管疾病。在治疗这些神经疾病时，补充由神经元损伤所导致的神经递质或使神经元再生是该治疗的核心。
痴呆指的是一系列综合征，例如通常在显示出脑细胞损伤的脑部疾病患者中发现的认知功能逐渐降低，和伴随该损伤的脑细胞减少。脑细胞减少是衰老的过程，但引起痴呆的疾病导致脑细胞快速减少，导致脑功能异常。根据2012年痴呆患病率的调查结果，65岁以上老年人中痴呆患病率为9.18％。由于快速老龄化，痴呆患病率持续上升，估计其每20年将增加约2倍，例如，从2012年的约540,000人增加到2030年的约127万人，到2050年约为271万人。据估计，阿尔茨海默氏症痴呆占痴呆症的主要原因的一半以上。继阿尔茨海默病之后的痴呆症第二原因是血管性认知障碍，包括血管性痴呆。
最近，阿尔茨海默氏症患者的数量趋于在增加，并且也成为给患者及其家属带来很大的痛苦的社会问题。
阿尔茨海默病是一种退行性脑疾病，其特征在于大脑皮质中的神经元损失和异常蛋白质侵入，并导致大脑皮层萎缩(顶叶和颞叶)，并且是痴呆最常见的原因之一。虽然病因仍不清楚，但在病理学上阿尔茨海默氏病的特征在于异常淀粉样蛋白浸润和由死亡的神经元和神经元外部炎性细胞组成的β-淀粉样蛋白斑块，并且神经元内由过度磷酸化的tau蛋白组成的神经原纤维缠结(NFT)的浓缩。
在阿尔茨海默病(AD)中显示的神经退行的早期阶段，显示突触毒性和嗜中性粒细胞减少，神经递质异常，β-淀粉样蛋白(Aβ)的细胞外积累(淀粉样蛋白/老年斑块)，细胞内NFT和神经胶质增生，并且在其后期阶段显示显著的神经损失和相关的脑萎缩。在早期阶段，这种神经退行的影响局限于内嗅皮层和海马体，并出现认知和记忆障碍。随着AD进展，高达80％的海马体神经元死亡，并且根据AD症状的进展，显示认知障碍和日常生活障碍，导致整体临床总体印象评分降低。
根据AD的病因，AD分为家族性AD和散发性AD。已知家族性AD占约1％至5％的病例。大多数AD不显示常染色体遗传，而在散发性AD中，环境和遗传因素被认为充当危险因素。在家族性AD的情况下，对于患有常染色体显性或家族性早发性AD的患者，已经提出了以下四种基因的突变与AD发作之间的相关性。这四种基因包括：淀粉样蛋白前体蛋白(APP)、早老素1(PS1)早老素2(PS2)和载脂蛋白E(ApoE)。与APP和PS蛋白相关的突变可能导致Aβ肽、特别是更具有淀粉样性的形式Aβ42的产生增加，Aβ42是老年斑块的主要成分。
虽然AD的致病机制和病因还没有被准确揭示，但是已经提出了与神经递质水平的降低或增加相关的神经递质假说，与β-淀粉样蛋白沉积相关的淀粉样蛋白假说或与tau过度磷酸化相关的tau假说，作为除基因突变之外的另一种致病机制。
在AD致病机制中，神经递质假说认为两种类型的神经递质如乙酰胆碱和谷氨酸盐与AD有关。乙酰胆碱(Ach)激活肌肉，并且帮助兴奋、短期记忆和学习。AD患者表现出低水平的Ach。谷氨酸盐作为大脑中最常见的神经递质参与学习和记忆。随着AD患者的脑细胞死亡，释放过量的谷氨酸盐。过量的谷氨酸盐过度地刺激健康的脑细胞，因此出现称为兴奋性中毒的现象，从而损伤或杀死神经元，导致显示有害作用。作为AD疗法，诸如多奈哌齐(商品名：Aricept)、雷司替明(商品名：Exelon)、加兰他敏(商品名：Razadyne)和美金刚胺(商品名：Namenda)等胆碱能神经系统调节药物具有改善降低的信号传导功能的机制，而作为谷氨酸盐神经递质，主要使用具有抑制神经元损伤的NMDA受体拮抗剂机制的美金刚胺。但是，这些药物的功效仅足以改善症状。
目前还没有能够从根本上治疗AD的药物。目前可商购的药物可有效缓解症状并延缓进展。用于AD的常规治疗剂，例如多奈哌齐、雷司替明、加兰他敏和美金刚胺通过调节神经递质具有功效。多奈哌齐、雷司替明和加兰他敏是增加脑内乙酰胆碱浓度的乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物。这些药物是流行的治疗剂，用于抑制参与乙酰胆碱降解的乙酰胆碱酯酶，并改善AD患者的认知功能。然而，作为胆碱酯酶抑制剂的常见副作用，已知由增加的乙酰胆碱导致的恶心、呕吐、腹泻、食欲不振、肌肉痉挛和睡眠障碍，并且这些药物仅稳定或暂时减轻AD症状，但不预防症状，因此，它们不是根本性的治疗剂。美金刚胺调节另一种神经递质谷氨酸盐，并用于作为非竞争性NMDA拮抗剂而防止由谷氨酸盐产生的细胞毒性，并用于治疗中度和重度AD患者。作为兴奋性神经递质的谷氨酸盐激活NMDA受体，并且当受体过度活化时，由于过量摄入脑神经细胞的钙，细胞被破坏。在AD患者中，由于谷氨酸盐过量分泌，即使在稳定期，NMDA受体的钙离子通道也始终开放，从而向细胞中引入过量的钙，并且美金刚胺在位于NMDA受体中的钙通道中用作具有低亲和力的拮抗剂来阻断细胞内钙的摄取并预防脑神经细胞的破坏。但是，美金刚胺也已知有副作用，如头晕，头痛等。
淀粉样蛋白假说假定细胞外淀粉状蛋白β(Aβ)聚集或Aβ去除减少是导致毒性事件并引起神经元变性的疾病的主要原因。Aβ由1型细胞膜(整合膜)糖蛋白，淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的蛋白水解产生。APP降解为Aβ通过两种主要途径进行，即淀粉样蛋白生成途径和非淀粉样蛋白生成途径，并且通过称为(α)、(β)和(γ)分泌酶的酶基团进行切割。由γ-分泌酶活性引起的APP加工涉及Aβ1-40和Aβ1-42释放的最后步骤。早老素1(PS1)和早老素2(PS2)中的每一个都有助于形成分泌酶复合物。已知Aβ以两种主要类型存在，例如Aβ1-40和Aβ1-42(两者具有共同的N端或不同的C端)。在正常环境中，Aβ1-40通过用α-γ-分泌酶降解而形成。Aβ1-40具有较低的聚集或毒性可能性。然而，在致病环境中，发生通过β-γ-分泌酶的降解，产生Aβ1-42。Aβ1-42是AD患者大脑中最常见的类型。支持淀粉样蛋白假说的一个证据是，载脂蛋白改善了β-淀粉样蛋白的降解，但是对某些亚型如APOE4的降解作用很弱，导致脑中淀粉样蛋白沉积过多。基于淀粉样蛋白假说，尝试开发靶向淀粉状蛋白β肽的抗体作为AD治疗剂。迄今为止，针对作为识别β淀粉样肽的抗体治疗剂引起了关注的巴匹珠单抗(bapineuzumab，Pfizer)、索拉珠单抗(solanezumab，Lilly)和基于免疫球蛋白的药物如Gammagard(Baxter)的临床3期试验都未能成功。
如上所述，β淀粉状蛋白的不溶性纤维状聚集体是AD的神经病理学代表性标志物，但与人脑功能障碍的相关性未被清楚解释。最近，就AD发病而言，作为关于β淀粉状蛋白作用的新假说，已经进行了关于β淀粉状蛋白的可溶性聚集体(寡聚体)的细胞毒性作用的研究。已经在动物模型中对淀粉样蛋白-β寡聚体如淀粉样蛋白-β二聚体、淀粉样蛋白-β三聚体和Aβ56对认知能力的影响进行了研究。有强有力的证据表明，当淀粉样β蛋白二聚体和Aβ56注射到健康的幼鼠时，脑功能受损。
Tau假说假设tau过度磷酸化是AD的主要原因。在AD患者的大脑中，过磷酸化的tau是NFT的主要成分。NFT是在AD和其他tau相关疾病中含有tau的纤维状聚集体。在正常环境中，tau是可溶的，并且通常存在于维持微管和囊泡运输的组装和稳定性的轴突中。据报道，微管相关的tau蛋白在哺乳动物大脑的正常神经激活中起主要作用。同时，在AD和tau相关的病理环境中，由于tau激酶和磷酸酶的活性之间的不平衡，发生tau过度磷酸化，并且tau的形态发生改变。根据这样的变化，tau蛋白变得不溶，对微管具有降低的亲和力，并且从微管脱离，导致通过自聚集形成双螺旋长丝结构。这些长丝聚集成NFT，并中断和抑制轴突运输。在编码tau、微管相关蛋白tau(MAPT)的基因所在的17号染色体上发现的约30种以上的突变与家族性AD(FAD)和帕金森病有关。另外，在MAPT中证实的突变减少了tau蛋白与微管的连接，并且增加了聚集成异常长丝的趋势。这对应于AD中的tau病理症状。这样的结果支持这样的假设，即功能失调的tau蛋白是神经退行性疾病的主要原因。
家族性AD(FAD)突变的确认已经允许形成AD动物模型。已经使用突变的APP、PS1和MAPT基因开发了目前使用的动物模型。
作为用于开发神经退行性疾病包括AD的治疗剂的效果和效力测试的动物模型，存在小鼠(3XTg-AD小鼠模型)，其中特定的三个基因(APP、Tau、PS1)突变以沉积淀粉状蛋白β并诱导NFT。具有三种突变基因的小鼠随时间推移显示包括AD症状的神经元损伤相关疾病的进展。已知在向神经元损伤诱导动物注射所开发的药物后，观察到神经元破坏抑制和再生作用，并与未注射的对照组进行比较，从而测定治疗剂候选物的效果和功效。
本发明的肽(以下称为PEP1)是由存在于端粒酶的催化区域中的16个主要氨基酸组成的肽，已知具有抗炎和抗氧化作用。由于通过动物试验揭示了本发明的肽可有效预防和恢复作为神经退行性疾病的根本原因的神经元损失，预计PEP1将显示出超出在神经退行性疾病的预防和治疗中常规治疗剂限度(即，简单缓解症状)的对神经疾病预防和治疗的效果。
本发明提供用于预防和恢复神经元损失的组合物，其包含源自端粒酶逆转录酶的肽。具体而言，本发明提供用于预防和恢复神经元损失的组合物，其包含由人端粒酶逆转录酶(hTERT)衍生的肽，其由氨基酸组成。更具体地说，本发明提供了一种由16个氨基酸组成的hTERT衍生肽PEP1，作为预防和恢复神经元损失的组合物。
[现有技术文件]WO 2010128807 A2
发明内容
技术问题
在此背景下，本发明人努力开发一种用于预防和恢复神经元损失的组合物，该组合物在预防和恢复神经元损失方面非常有效，而没有副作用，因此完成了本发明。
本发明旨在提供一种用于预防和恢复神经元损失的组合物，其是对由神经元损失引起的神经退行性疾病有效的根本治疗剂，而没有副作用。
技术方案
根据本发明的一个方面，提供了一种用于预防和恢复神经元损失的组合物，所述组合物包含：药物有效量的选自由包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的肽、与该氨基酸序列具有至少80％序列同源性的肽和其片段组成的组中的一种或多种。
根据本发明的另一个方面，提供了用于预防神经元损失和使神经元再生的选自由包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的肽、与该氨基酸序列具有至少80％序列同源性的肽和其片段组成的组中的一种或多种。
根据本发明的再一个方面，提供了自由包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的肽、与该氨基酸序列具有至少80％序列同源性的肽和其片段组成的组中的一种或多种在制备预防和恢复神经元损失的组合物中的应用。
关于本发明的组合物，所述片段可以是由三个以上氨基酸组成的片段。
关于本发明的组合物，所述组合物用于预防、治疗、减轻和改善由神经元损失和再生无能引起的疾病，或用于预防、治疗、减轻和改善所述疾病的后遗症。
关于本发明的组合物，所述由神经元损失和再生无能引起的疾病可以是脑血管疾病或神经退行性疾病。
关于本发明的组合物，所述脑血管疾病可以是缺血性脑血管疾病或出血性脑血管疾病。
关于本发明的组合物，所述神经退行性疾病可以是脑疾病(cerebropathia)、脊髓损伤、外周神经损伤、外周神经疾病、肌萎缩性侧索硬化、痴呆、亨廷顿病、帕金森病、AD样疾病、脊髓小脑变性和多发性神经病中的任一种。
关于本发明的组合物，所述组合物可以与一种或多种神经疾病用治疗剂共同施用。
关于本发明的组合物，所述AD样疾病可以显示出包括痴呆、认知障碍和记忆丧失中任一种。
关于本发明的组合物，所述AD样疾病可以是早期、进行性或严重的AD样疾病。
关于本发明的组合物，SEQ ID NO:1的肽作为药物活性成分可以以0.0001至100mg/kg/天的剂量施用。
关于本发明的组合物，SEQ ID NO:1的肽作为药物活性成分可以以0.01至200mg的剂量施用。
关于本发明的组合物，SEQ ID NO:1的肽作为药物活性成分可以每一周至每四周施用一次，总共施用四次以上。
关于本发明的组合物，包含SEQ ID NO:1的肽作为药物活性成分的组合物可以口服、直肠内、经皮、静脉内、肌内、腹膜内、髓内、鞘内、皮内或皮下施用。
根据本发明的再一个方面，提供了一种预防和恢复神经元损失的方法，所述方法包括：对需要本发明组合物的受试者施用药物有效量的本发明组合物。
根据本发明的再一个方面，提供了一种预防和恢复神经元损失的试剂盒，其包含：指示对需要本发明组合物的受试者每一周至每四周施用一次包含0.01至200mg的作为药物活性成分的SEQ ID NO:1的肽的本发明的用于预防和恢复神经元损失的组合物的说明书。
有益效果
由于具有本发明序列编号的序列的肽、与所述序列具有80％同源性的肽或其片段可有效预防神经元损失和使神经元再生，本发明提供了一种用于预防和治疗由神经元损失或再生无能引起的疾病的方法。
附图说明
图1是表示在用各浓度(0、2.5、5、10、20或40μM)的Aβ25-35(β-淀粉样蛋白25-35)处理NSC时相对于对照组(0μM)的使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定细胞活力和使用BrdU染色测定细胞活性的结果的图表。
图2是表示在用各浓度(0、1、10、50、100或200μM)的PEP1处理NSC时相对于对照组(0μM)的使用CCK-8测定细胞活力和使用BrdU染色测定细胞活性的结果的图表。
图3是吸光度图，其显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1、10、50或100μM)处理时相对于对照组的使用CCK-8、MTT和LDH测定细胞活力的结果。
图4是吸光度图，其显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1、10、50或100μM)处理时测定细胞增殖的结果。
图5是显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1、10、50或100μM)处理时通过DAPI和TUNEL染色确认的凋亡的图。
图6是显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1、10或50μM)处理时由集落形成单位(CFU)计数法测定的细胞集落计数的图。
图7是显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1、10、50或100μM)处理时，通过TUNEL染色评估的处理前和处理后的凋亡的图像。
图8是吸光度图，其显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1、10、50或100μM)处理时，通过TUNEL染色评估的处理前、后的凋亡细胞百分比。
图9是显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1、10或50μM)处理时，使用QCM-24孔细胞迁移试剂盒观察细胞迁移能力的细胞迁移测定结果的图。
图10和图11是PEP1用FITC标记并处理0至24小时后线粒体染色和细胞膜染色结果的图像，以观察在10μM的PEP1处理后PEP1穿透进入NSC的过程。
图12和13是PEP1用FITC标记并处理0至24小时后核染色结果的图像，以观察经过20μM的Aβ25-35处理过的NSC用1μM的PEP1处理后，PEP1穿透进入经β-淀粉样蛋白处理的NSC中的过程。
图14至16是显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1、10或50μM)处理时，在DCFH-DA染色后测定DCF荧光值以检测活性氧物质(ROS)产生的结果的图。
图17是显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1、10或50μM)处理时，使用8-OHdG ELISA试剂盒评估线粒体氧化性DNA损伤程度的结果的图。
图18是显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1、10或50μM)处理时，使用ELISA读板器观察线粒体膜电位的结果的图。
图19和图20是当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1、10或50μM)处理时，使用JC-1试剂盒观察线粒体细胞膜电位的结果，其中在FITC波长处观察到死细胞或不健康的细胞(图19)，并且在罗丹明波长和德克萨斯红波长处观察到健康细胞(图20)。
图21是显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1、10或50μM)处理时的ATP浓度(nmol/μL)的图。
图22是显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1、10或50μM)处理时，为评估PEP1在蛋白质组方面对细胞内蛋白质表达水平的影响而进行的抗体微阵列结果的图像。
图23是表示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1、10或50μM)处理时，在每种条件下表达和减少的细胞内蛋白质的表。
图24是当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0或10μM)处理时，评估细胞内蛋白质表达水平的微阵列结果的一组图像。
图25是显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0或10μM)处理时，表达和降低的细胞内蛋白质的表格。
图26和27是显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1、10或50μM)处理时，使用免疫染色评估的Ki67、PI3K、Ser473、Ser9和HMGB-1的表达的图(图26)，和数字化结果的图表(图27)。
图28和29是显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1、10或50μM)处理时，使用免疫染色评估的Bax、细胞色素c和半胱天冬酶-3的表达的图像(图28)，和数字化结果的图表(图29)。
图30是显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1或10μM)处理时，HMGB-1随时间的表达的图像。
图31和图32是显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1或10μM)处理时，使用免疫染色来测定PI3K、Ser473、Akt、Ser9和Bcl-2的表达的结果的图像(图31)，和数字化结果的图表(图32)。
图33和图34是显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35以及各浓度的PEP1(0、1或10μM)处理时，使用免疫染色测定PARP、Bax、细胞色素-c、半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3的表达的结果的图像(图33)，和数字化结果的图表(图34)。
图35是显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35处理并用各浓度的PEP1(0、1或10μM)共处理然后以被称为PIK3抑制剂的LY294002处理时，观察细胞活力的结果的图。
图36至48是显示当NSC用0μM(对照)和20μM的Aβ25-35处理并用各浓度的PEP1(0或1μM)共处理时，在碱性FGF(bFGF)存在或不存在下，使用DAPI染色和免疫染色的Nestin、Ki67、GFAP、NeuN、DCX和Tuj1(其是NSC的分化和分裂步骤的标志物)的表达的图像和图表。
图49是显示1μg的hTERT在人NSC中过表达后，标记有GFP的穿梭载体和TERT的一组图像。
图50至54显示：在人NSC以20μM Aβ25-35处理后，比较1μg hTERT过表达与1μMPEP1处理的微整列图像(图50)，在穿梭载体和hTERT用GFP标记之后显示TERT表达的电泳图像(图51)，显示因过表达的hTERT和PEP1而增加或减少的蛋白质列表(图52)，在人NSC用0或20μM的Aβ25-35处理并用各浓度的PEP1(0、1、10或50μM)共处理后显示TERT表达的图(图53)，和数字化结果的图表(图54)。
图55是显示对照组(盐水和1mg/kg乱序肽(Scramble pepetide))和用不同浓度的PEP1(0.01、0.1和1mg/kg)和常规药物多奈哌齐(1mg/kg)处理的组的动物模型的海马体和全脑中的NeuN表达的蛋白质印迹结果的图像，和数字化结果的图表。
图56是显示对照组(盐水和1mg/kg乱序肽)和用不同浓度的PEP1(0.01、0.1和1mg/kg)和常规药物多奈哌齐(1mg/kg)处理的组的动物模型的海马体和全脑中的DCX表达的蛋白质印迹结果的图像，和数字化结果的图表(图56)。
图57是通过对在对照组(盐水和1mg/kg乱序肽)和用不同浓度的PEP1(0.01、0.1和1mg/kg)和常规药物多奈哌齐(1mg/kg)处理的组的动物模型的室下区(SVZ)中的神经组织进行免疫染色而显示DCX和NeuN表达的图像。
图58是显示对照组(盐水和1mg/kg乱序肽)和用不同浓度的PEP1(0.01、0.1和1mg/kg)和常规药物多奈哌齐(1mg/kg)处理的组的动物模型的海马体和全脑中的Tuj1表达的蛋白质印迹结果的图像，和数字化结果的图表。
图59是通过对在对照组(盐水和1mg/kg乱序肽)和用不同浓度的PEP1(0.01、0.1和1mg/kg)和常规药物多奈哌齐(1mg/kg)处理的组的动物模型的室下区(SVZ)中通过的神经组织进行免疫染色而显示Tuj1表达的图像。
图60是显示对照组(盐水和1mg/kg乱序肽)和用不同浓度的PEP1(0.01、0.1和1mg/kg)和常规药物多奈哌齐(1mg/kg)处理的组的动物模型的海马体和全脑中的GFAP表达的蛋白质印迹结果的图像，和数字化结果的图表。
图61是显示对照组(盐水和1mg/kg乱序肽)和用不同浓度的PEP1(0.01、0.1和1mg/kg)和常规药物多奈哌齐(1mg/kg)处理的组的动物模型的海马体和全脑中的GalC表达的蛋白质印迹结果的图像，和数字化结果的图表。
图62是通过对在对照组(盐水和1mg/kg乱序肽)和用不同浓度的PEP1(0.01、0.1和1mg/kg)和常规药物多奈哌齐(1mg/kg)处理的组的动物模型的SVZ中的神经组织免疫染色而显示DCX和NeuN表达的图像。
图63是显示对照组(盐水和1mg/kg乱序肽)和用不同浓度的PEP1(0.01、0.1和1mg/kg)和常规药物多奈哌齐(1mg/kg)处理的组的动物模型的海马体和全脑中的单体β-淀粉样蛋白表达的蛋白质印迹结果的图像，和数字化结果的图表。
图64是显示对照组(盐水和1mg/kg乱序肽)和用不同浓度的PEP1(0.01、0.1和1mg/kg)和常规药物多奈哌齐(1mg/kg)处理的组的动物模型的海马体和全脑中的寡聚体β-淀粉样蛋白表达的蛋白质印迹结果的图像，和数字化结果的图表。
图65是显示对照组(盐水和1mg/kg乱序肽)和用不同浓度的PEP1(0.01、0.1和1mg/kg)和常规药物多奈哌齐(1mg/kg)处理的组的动物模型的海马体和全脑中的作为指示NFT产生的标志物的tau表达的蛋白质印迹结果的图像，和数字化结果的图表。
图66是通过对在对照组(盐水和1mg/kg乱序肽)和用不同浓度的PEP1(0.01、0.1和1mg/kg)和常规药物多奈哌齐(1mg/kg)处理的组的动物模型中的神经组织进行免疫染色而显示神经元中NFT(以Tau测定)和β-淀粉样蛋白表达的图。
图67是显示对照组(盐水和1mg/kg乱序肽)和用不同浓度的PEP1(0.01、0.1和1mg/kg)和常规药物多奈哌齐(1mg/kg)处理的组的动物模型的被动回避测试结果的图表，评价为好(阴影线(hatched))和坏(未加阴影线)。
图68是显示对照组(盐水和1mg/kg乱序肽)和用不同浓度的PEP1(0.01、0.1和1mg/kg)和常规药物多奈哌齐(1mg/kg)处理的组的动物模型的被动回避测试的响应时间(单位为秒)的图。
图69是显示对照组(盐水和1mg/kg乱序肽)和用不同浓度的PEP1(0.01、0.1和1mg/kg)处理的组的动物模型的Y-迷宫测试结果的图。
图70是显示重度AD动物模型的被动回避测试以评估停留在明亮房间中的受试者的数量比率的结果的图。
图71是显示用于评估自发改变的重度AD动物模型的Y-迷宫测试结果的图。
具体实施方式
本发明可以具有各种修改和实施方式，因此下面将进一步详细描述本发明。然而，本发明不限于具体实施方式，并且应该理解的是，本发明包括包含在本发明的技术构思和范围内的所有修改、等同物和替代物。为了说明本发明，如果确定相关技术的详细描述可能使本发明的要点变得模糊，则将省略其详细描述。
在神经疾病中，神经元变性、耗竭或凋亡导致各种病理症状。由神经元损失和再生无能引起的疾病包括脑血管疾病如缺血性中风，和神经退行性疾病如痴呆和AD。迄今为止所开发的神经退行性疾病用治疗药只是改善症状的药物，但不能改变疾病的进展。为此，需要开发作为根本疗法的神经保护药物或神经再生疗法。另外，为保护神经元免于缺血性中风而开发的药物被设计为只阻断由中风诱发的凋亡途径的特定部分，但中风引起的神经元凋亡通过各种途径完成。因此，这些药物不提供根本的解决方案。为此，需要通过同时调整与缺血性中风有关的各种因素来最小化脑细胞死亡的目标疗法。
端粒是位于染色体每个末端的重复遗传物质，已知其预防相应染色体的损伤或偶联到不同染色体。端粒随着细胞分裂逐渐缩短，在一定数量的细胞分裂后变得非常短，并且细胞最终停止分裂并死亡。另一方面，已知端粒的延伸延长了细胞的寿命。作为一个实例，已知在癌细胞中分泌了称为端粒酶的酶以预防端粒的缩短，导致癌细胞的稳定增殖而不会死亡。虽然PEP1(一种端粒酶衍生肽)已开发为包括胰腺癌在内的多种类型癌症的抗癌剂，但已经揭示PEP1参与抗炎、抗氧化、细胞渗透性和主要细胞内信号传导以及具有抗癌作用。鉴于PEP1的细胞内功能，已经研究了除了用作现有的抗癌剂之外还使用新的适应症的可能性。发明人证实，端粒酶衍生肽具有抑制引起神经元疾病的炎症作用的机制，并且对于预防神经元损失和使神经元再生是有效的，从而完成了本发明。更具体地说，在本发明中，通过AD动物模型试验，证实PEP1减少被推测为AD起因的β-淀粉状蛋白的聚集，并且减少了由tau蛋白的过度磷酸化形成的NFT。此外，在本发明中，证实了PEP1通过各种神经元标志物的表达水平对神经元的分化和增殖具有积极作用。
在本发明的一方面，SEQ ID NO:1的肽(PEP1)、SEQ ID NO:1的肽的片段、或与该肽序列具有至少80％序列同源性的肽包括由端粒酶、特别是人端粒酶衍生的肽。
本文公开的肽可以包括具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的肽。另外，本文所述的肽可以包括与SEQ ID NO:1的肽或其片段具有1个或更多个氨基酸，2个或更多个氨基酸，3个或更多个氨基酸，4个或更多个氨基酸，5个或更多个氨基酸，6个或更多个氨基酸，或7个或更多个氨基酸的差异的肽。
在本发明的一方面，氨基酸的变化是改变肽的物理化学特性的性质。例如，可以改变氨基酸以改善热稳定性，改变底物特异性，和改变肽的最适pH。
本文使用的术语“氨基酸”不仅包括天然引入肽中的22种标准氨基酸，而且还包括D-异构体和修饰的氨基酸。因此，在本发明的一个方面中，肽可以是包含D-氨基酸的肽。另一方面，在本发明的另一方面，所述肽可以包括进行了翻译后修饰的非标准氨基酸。翻译后修饰的实例包括磷酸化，糖基化，酰化(例如乙酰化，肉豆蔻酰化和棕榈酰化)，烷基化，羧化，羟基化，糖化，生物素化，泛素化，化学性质的变化(例如β-去除脱酰亚胺化和脱酰胺化)和结构变化(例如形成二硫桥)。翻译后修饰还包括由于与交联剂偶联以形成肽缀合物期间的化学反应而导致的氨基酸的变化，例如氨基酸的变化，例如氨基、羧基、或侧链的变化。
本文公开的肽可以是从天然来源鉴定和分离的野生型肽。同时，说明书中公开的肽可以是包含与SEQ ID NO:1的肽的片段相比有一个或多个氨基酸被取代、损失和/或插入的氨基酸序列的人工变体。野生型多肽以及人造变体中氨基酸的变化包括保守氨基酸的取代，其对蛋白质的折叠和/或活性没有显著影响。保守性取代可以在由碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸)，芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)构成的组内进行。通常，本领域已知不改变特定活性的氨基酸取代。最常出现的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，反之亦然。下表显示了保守性取代的其他实例。
[表1]
初始氨基酸 示例性残基取代 优选的残基取代
Ala(A) val；leu；ile Val
Arg(R) lys；gln；asn Lys
Asn(N) gln；his；asp,lys；arg Gln
Asp(D) glu；asn Glu
Cys(C) ser；ala Ser
Gln(Q) asn；glu Asn
Glu(E) asp；gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) asn；gln；lys；arg Arg
Ile(I) leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe Ile
Lys(K) arg；gln；asn Arg
Met(M) leu；phe；ile Leu
Phe(F) leu；val；ile；ala；tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) tyr；phe Tyr
Tyr(Y) trp；phe；thr；ser Phe
Val(V) ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸 Leu
就肽的生物学性质而言，通过选择在以下方面具有显著不同效果的取代物来进行实质性修饰：(a)维持多肽在取代区域的骨架结构，例如片层或螺旋样三维结构；(b)维持分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)维持侧链的大体积。根据侧链的一般性质，将天然残基分为以下几组：
(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性亲水性：cys、ser、thr；
(3)酸性：asp、glu；
(4)碱性：asn、gln、his、lys、arg；
(5)影响链构象的残基：gly、pro；和
(6)芳香性：trp、tyr、phe。
非保守性取代可以通过将一个组的成员与另一个组的成员进行交换来执行。与维持肽的适当三维结构无关的任何半胱氨酸残基通常可以被丝氨酸取代，从而增加分子的氧化稳定性并预防异常交联，相反地，通过向肽添加半胱氨酸键可以实现增强的稳定性。
通过改变抗体的糖基化模式来制备肽的不同类型的氨基酸变体。本文使用的术语“改变”是指删除在肽上发现的一种或多种糖残基，和(或)添加不存在于肽中的一种或多种糖基化位点。
肽中的糖基化通常是N-或O-连接的糖基化。本文使用的术语“N-连接的糖基化”是指糖残基与天冬酰胺残基侧链的连接。作为三肽序列，天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸)是用于将糖残基酶促附着至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，当这些三肽序列中的一个存在于多肽中时，产生潜在的糖基化位点。本文所用的“O-连接的糖基化”是指糖之一(例如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖)与羟基氨基酸以及最典型地与丝氨酸或苏氨酸连接，但也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列以含有上述三肽序列，方便地向肽添加糖基化位点(对于N-连接的糖基化位点)。这样的改变可以通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加到最初的抗体序列中或通过用这些残基之一进行置换来进行(对于O-连接的糖基化位点)。
而且，根据本发明的一个方面包含SEQ ID NO:1序列的肽、SEQ ID NO:1序列的片段或与所述肽具有至少80％序列同源性的肽具有低细胞毒性和高体内稳定性。在本发明中，SEQ ID NO:1表示端粒酶衍生肽，其是如下由16个氨基酸组成的肽。
下表2中显示了SEQ ID NO:1所示的肽。下表2中的“名称”用于区分一种肽和另一种肽。在本发明的一个方面中，SEQ ID NO:1所示的肽代表人端粒酶的全部肽。在本发明的另一方面，SEQ ID NO:1的肽、其片段或与该肽序列具有至少80％序列同源性的肽包括由存在于在端粒酶中包括的肽的相应位置处的肽合成的“合成肽”。SEQ ID NO:2表示端粒酶的全长氨基酸序列。
[表2]
Figure BDA0003219249530000171
在本发明的一方面，提供了包含有效预防神经元损失和使神经元再生的肽，例如包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽、与该氨基酸序列具有至少80％序列同源性的肽或其片段，作为活性成分的药物组合物。
本发明一方面的有效预防神经元损失和使神经元再生的药物组合物可包括：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽、与该氨基酸序列具有至少80％序列同源性的肽或其片段，浓度为0.01至100mg/mL，优选0.1至10mg/mL，但是如果根据每个治疗目标的剂量存在效果差异，则可以适当调整剂量。当包含含量在上述范围内或更低的本发明的肽时，可能适合于发挥本发明的期望效果，并且可以满足组合物的稳定性和安全性。另外，就成本效益而言，上述含量可能是合适的。
根据本发明的一个方面的组合物可以应用于包括人、狗、鸡、猪、牛、羊，豚鼠和猴在内的所有动物。
在本发明的一个方面，提供了包含有效预防神经元损失和使神经元再生的肽(例如包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽、与该氨基酸序列具有至少80％序列同源性的肽或其片段)的药物组合物。本发明一个方面的药物组合物可以口服、直肠内、经皮、静脉内、肌内、腹膜内、髓内、鞘内、皮内或皮下施用，优选腹膜内、皮内、血管内或皮下施用，更优选皮下施用。
用于口服施用的剂型可以包括但不限于片剂、丸剂、软胶囊或硬胶囊剂、颗粒剂、散剂、溶液剂和乳剂。用于肠胃外施用的剂型可以包括但不限于注射剂、滴剂、洗剂、软膏剂、凝胶剂、乳膏剂、混悬剂、乳剂、栓剂、贴剂或喷雾剂。
根据本发明的一个方面的药物组合物可以根据需要包含诸如稀释剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、分散剂、表面活性剂、着色剂、芳香剂或甜味剂等添加剂。根据本发明的一个方面的药物组合物可以通过本领域的常规方法制备。
根据本发明的一个方面的药物组合物的活性成分可以根据患者的年龄、性别、体重、病理状况和严重程度、施用途径或处方者的判断而变化。本领域普通技术人员基于这些参数确定组合物的剂量，日剂量可以是例如0.0001至100mg/kg/天，优选0.001至10mg/kg/天，更优选0.001至1mg/kg/天，并且如果根据剂量存在效果差异，则可以适当调整剂量。根据本发明的示例性实施方式的药物组合物可以每天施用一次至三次，但是本发明不限于此。
根据本发明的一个方面的药物组合物的活性成分的施用剂量和间隔由本领域普通技术人员确定。例如，施用剂量可以是0.01至200mg，优选0.1至5mg，更优选0.4至1.2mg，还更优选0.4mg、0.56mg或1.12mg，并且施用间隔可以是每1至4周1次，总共四次或更多次，优选每1至2周一次，共6至26次，但是本发明不限于此。
在本发明的一方面，提供了一种预防和恢复神经元损失的组合物，其包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽、与该氨基酸序列具有至少80％序列同源性的肽、或其片段作为活性成分。
根据本发明一个方面的组合物的剂型没有特别限制，但可以是例如片剂、丸剂、软胶囊或硬胶囊、颗粒剂、散剂、溶液剂或乳剂。除活性成分之外，根据剂型或使用目的，本领域普通技术人员可以毫无困难地通过适当选择和混合在相应领域常规使用的成分来制备每种剂型，并且可以在与其他原料同时使用时具有协同效应。
说明书中使用的术语旨在用于描述具体实施方式而不是限制本发明。前面没有数字的术语不旨在限制数量，而是为了表明存在至少一个/一件。应该开放地解释术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”(即“包括但不限于”)。
提到数字范围替代了提到在该范围内的单个数字，并且除非另有说明，每个数字适用于说明书，如同在说明书中单独提及的那样。所有范围的端值都包含在该范围内，并可以独立组合。
说明书中提到的所有方法可以以适当的顺序执行，除非另有说明或与上下文明确矛盾。除非包括在权利要求书中，否则任何一个实施方式和所有实施方式或示例性语言(例如，“诸如”或“等”)的使用是为了更清楚地描述本发明而不是限制本发明的范围。在权利要求之外的本文任何语言不应该被解释为实施本发明所必需。除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
本发明的示例性实施方式包括发明人已知的用于执行本发明的最佳模式。在阅读以上描述时，本领域技术人员可以清楚示例性实施方式的变化。发明人预期，本领域技术人员将适当地使用这样的变化，并且以与说明书中所描述的方式不同的方式来实施本发明。因此，如专利法所允许的，本发明包括所附权利要求书中提及的本发明要点的等同物和所有修改。此外，除非明确地另外声明或与上下文相矛盾，否则上述组件的任何组合的所有可能的变化都包括在本发明中。尽管通过示例性实施方式描述和示出了本发明，但是本领域技术人员将很好地理解，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。
在下文中，将参考实施例和实验例更详细地描述本发明的配置和效果。然而，提供下面的实施例和实验例仅仅是为了说明本发明以帮助理解本发明，并且本发明的范围不限于此。
实施例1:肽合成
1.肽合成
根据常规已知的固相肽合成方法制备SEQ ID NO:1的肽(下文中称为“PEP1”)。具体而言，使用ASP48S(Peptron,Inc.,Daejeon,Korea)，通过Fmoc固相肽合成(SPPS)从C末端将每个氨基酸偶联至另一个氨基酸来合成肽。使用其中C-末端的第一个氨基酸连接至树脂的肽：
NH2-Lys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂
NH2-Ala-2-氯-三苯甲基树脂
NH2-Arg(Pbf)-2-氯-三苯甲基树脂
在用于肽合成的所有氨基酸成分中，N-末端用Fmoc保护，残基用Trt、Boc、叔丁基酯(t-Bu)和2,2,4,6,7-五甲基二氢-苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)(其可以在酸中除去)保护。氨基酸成分的实例如下：
Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ahx-OH、Trt-巯基乙酸。
作为偶联剂，使用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)/N-羟基苯并三唑(HOBt)/4-甲基吗啉(NMM)。使用20％哌啶的DMF溶液进行Fmoc脱保护。为了从树脂中分离合成的肽并除去残基的保护基，使用切割混合物[三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(TIS)/乙二硫醇(EDT)/H2O＝92.5/2.5/2.5/2.5]。
通过重复以下过程合成每个肽：利用其中起始氨基酸被氨基酸保护基保护同时结合到固相支架上的状态，使各相应氨基酸反应，用溶剂洗涤所得产物，并进行去保护。从树脂上切下后，合成的肽通过HPLC纯化，通过质谱法(MS)确认合成，并进行冻干。
如使用高效液相色谱测定的，本实施例中使用的所有肽的纯度均为95％或更高。
制备肽PEP1的具体过程如下。
1)偶联
将用NH2-Lys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂保护的氨基酸(8当量)与溶于DMF中的偶联剂HBTU(8当量)/HOBt(8当量)/NMM(16当量)混合，在室温下反应2小时，并依次用DMF、MeOH和DMF洗涤。
2)Fmoc脱保护
向所得产物中加入20％哌啶的DMF溶液，在室温下进行两次反应5分钟，然后依次用DMF、MeOH和DMF进行洗涤。
3)重复反应1)和2)，从而形成肽骨架(NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂)。
4)切割:通过向合成完成的肽树脂加入切割混合物，而从树脂中分离肽。
5)向所得混合物加入冷却的乙醚，将通过离心获得的肽沉淀。
6)通过制备型HPLC纯化后，通过LC/MS测定分子量并进行冻干，由此制备粉末。
实施例2:实验准备和材料
实施例2-1:NSC和原代皮层神经细胞的培养和处理
涉及动物的所有程序均根据Hanyang大学动物护理和使用委员会的指导方针进行。所有实验均使用最少数量的动物并使其疼痛最小化来进行，并且所有动物仅在实验中使用一次。
从大鼠胚胎的脑中分离NSC，培养并发育。NSC培养以与下面将要描述的方式相同的方式进行。简言之，在胚胎期的第13天获得大鼠胚胎，并将脑迅速移出并置于含有冷磷酸盐缓冲生理盐水(Hank平衡盐溶液；HBSS)的培养皿中。
从大脑皮层、外侧神经节隆起和胚胎中脑分离单细胞。将这些细胞放入用含有磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)(不含钙和镁)的L-鸟氨酸和纤连蛋白预处理的培养皿中，密度为20,000个细胞/cm2。此外，将细胞在N2培养基(DMEM F/12，4.4nM胰岛素，100mg/L转铁蛋白，30nM亚硒酸盐，0.6M腐胺，20nM黄体酮，0.2mM抗坏血酸，2nM L-谷氨酰胺，8.6mM D(+)葡萄糖和20nM碳酸氢钠)中培养。培养物在37℃下湿润和5％CO2条件中保持4至6天。
通过将细胞培养基更换为不含bFGF(10ng/ml)的N2培养基来诱导NSC分化，并且每天更换培养基。
将NSC分成6份样品，每份样品用0、2.5、5、20或40μM Aβ25-3寡聚体处理48小时以确定合适的浓度。Aβ25-30的水溶性寡聚体形式按照以下众所周知的报道中的建议制备。简而言之，将Aβ25-30溶解于六氟异丙醇中直至浓度达到1mM。另外，使用无菌超微量离心管分配制备的溶液。使用真空干燥器系统除去六氟异丙醇，并将肽膜储存并在-20℃下干燥。为了制备寡聚体，将肽与干燥的二甲基亚砜混合至浓度达到5mM。另外，将得到的肽加入Ham'sF-12培养基中，最终浓度为1mM。如上所述，细胞在4℃下培养24小时。
为了鉴定NSC中PEP1的效应，将PEP1以0、1、10、50、100和200μM的不同浓度处理48小时。为了鉴定PEP1对Aβ25-30诱导的神经毒性的影响，将NSC用0、1、10、50和100μM的不同浓度的PEP1和20μM的Aβ25-30的处理48小时。用PBS轻轻洗涤平板数次，并使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、MTT和乳酸脱氢酶(LDH)测定细胞活力。
为了鉴定PI3K/AKT信号传导系统在PEP1机制中的作用，在50μM PEP1和20μM Aβ25-30处理之前，NSC用PI3K抑制剂LY294002处理1小时。NSC分为以下4组：对照组(第1组)，20μM Aβ25-35处理48小时组(第2组)，20μM Aβ25-35以及50μM PEP1处理48小时组(第3组)，和用10μM LY294002和20μM Aβ25-35以及50μM PEP1处理48小时组(第4组)。
在胚胎期的第16天从胎中大鼠的大脑皮层获得原代培养的皮质神经。简而言之，将大脑从大鼠中快速移出，并置于含有冷磷酸盐缓冲生理盐水(HBSS)的培养皿中。从大脑皮层中分离单细胞，并将其加入预先包被有聚L-赖氨酸的直径为100mm的Corning皿中，或置于6或24孔板中的盖玻片上。将培养的细胞在DMEM(高葡萄糖)中培养。
加入细胞2天后，通过5μM阿糖胞苷胞苷处理24小时除去非神经元细胞。本实验只使用成熟培养物(试管中7天)。从原代皮层的神经元获得中约79.7％的一组神经元。
将人NSC(H9 hESC来源，GIBCO)以5x104个细胞/cm2的密度铺在预先包被有其中Ca2+/Mg2+溶解在D-PBS中的CELLStart(GIBCO)的培养皿中，并且在StemPro NSC SFM(KnockOut DMEM/F-12,2mM GlutaMAX补充物，2％StemPro神经补充物，20ng/mL碱性FGF重组蛋白和20ng/mL EGF重组蛋白)中培养。将培养基在37℃，潮湿的5％CO2气氛中保存4至6天。
实施例2-2:用于评价细胞活力的CCK-8和LDH分泌测试
通过将2-[2-甲氧基-4-硝基苯基]-3-[4-硝基苯基]-5-[2,4-二磺基苯基]-2H-四唑一钠盐(WST-8)与甲基硫酸1-甲氧基吩嗪鎓(PMS)结合，使用CCK-8作为计数活细胞的方法。简而言之，通过添加10μL试剂盒试剂来培养在96孔板中所含的细胞3小时。通过测定450nm处的吸光度而评估细胞活力。所有结果均基于无细胞孔标准化。使用比色法来测定培养的NSC中的LDH水平。通过测定490nm处的吸光度和690nm处的参考吸光度来评估细胞活力。所有结果均基于无细胞孔标准化。
实施例2-3:使用溴脱氧尿苷测定细胞分裂的测试
用不同浓度的PEP1和20μM Aβ25-30处理NSC48小时。之后，将NSC在溴脱氧尿苷(BrdU)标记的培养基中培养5小时并使用试剂盒进行观察。通过测定370nm处的吸光度和492nm处的参考吸光度来评估细胞分裂。所有结果均基于无细胞孔标准化。
实施例2-4:集落形成单位(CFU)测试
通过以下方法进行CFU测定。简言之，将0.25x105个NSC铺于6孔板中，并用20μM Aβ25-30，然后用1、10或50μM的PEP1处理48小时。用DPBS洗涤细胞，然后将培养基更换为新鲜的细胞培养基。14天后，再次用DPBS洗涤细胞，并在室温下用溶于甲醇的0.5％结晶紫染色30分钟。染色后，将平板用DPBS洗涤，然后干燥。使用立体显微镜观察集落的数量，并且在这些集落中，将小于2mm或弱着色的集落除去。
实施例2-5:观察凋亡的TUNEL染色
将NSC置于直径为13mm的胶原包被的盖玻片上，然后按照下述方式进行处理：1)用Aβ25-30和PEP1处理；2)仅用20μM Aβ25-30处理；或3)在用20μM Aβ25-30和各浓度(1、10、50或100μM)的PEP1处理48小时。
细胞用PBS洗涤并用4％多聚甲醛固定20分钟。
TUNEL染色是一种用于确认细胞凋亡的方法。为观察完整的、凝聚的或片段化的细胞核，将已经用TUNEL染色过的细胞用100μg/ml DAPI处理20分钟以染色细胞核，然后将其置于其上施加了DAPI混合固定介质的载玻片上。
细胞在荧光显微镜下观察并在对应于DAPI和TUNEL的激发荧光波长下观察。
实施例2-6:细胞迁移测试
使用QCM-24孔细胞迁移试剂盒进行细胞迁移测定。简言之，将20μM Aβ25-30和各浓度的PEP1(1、10或50μM)加入到下室中，并将3x105个NSC在37℃的上室中培养24小时。NSC向膜迁移，在为了观察迁移细胞的数量而染色后，在560nm处测定吸光度。
实施例2-7:确认PEP1穿入NSC
以1x105个细胞/孔的密度加入NSC。将细胞暴露于20μM Aβ25-30，并和对照组一起用1μM FITC标记的PEP1处理0至24小时，由此能够观察到线粒体和细胞膜被染色。线粒体染色用100nM MitoTracker Red FM在37℃下进行10分钟，并且细胞膜染色用1μMCellTracker CM-Dil在37℃下进行5分钟。染色后，细胞用细胞培养基洗涤，并用2％多聚甲醛在室温下固定15分钟。之后，将细胞用PBS洗涤数次，并将样品置于其上施加了含DAPI的固定介质的载玻片上。使用合适的激发波长在荧光显微镜下观察细胞。
实施例2-8:观察活性氧(ROS)的产生
NSC用20μM Aβ25-30处理48小时，并用DCFH-DA染色15分钟以测定ROS。NSC用不同浓度的PEP1和20μM Aβ25-30处理48小时。培养后，细胞用10μM DCFH-DA在37℃染色15分钟，并用PBS洗涤三次。DCFH-DA自由通过细胞膜，然后通过细胞中存在的酯酶降解为DCF。因此，DCF荧光强度指示细胞内过氧化氢(ROS)水平。根据490nm处的吸光度和690nm处的参考吸光度，使用读取器评估DCF积累。使用Accuri C6流式细胞仪观察和分析流式细胞术。
为了研究Aβ25-30和PEP1如何影响ROS，通过无细胞方法测定和观察DHBA水平。该方法通过HPLC观察含有20μM Aβ25-30和各浓度PEP1(0、1、10或50μM)的管中的DHBA水平来进行。
实施例2-9:观察线粒体中氧化DNA损伤的方法
使用8-OHdG ELISA试剂盒观察线粒体中的氧化性DNA损伤。使用基因组DNA分离试剂盒获得线粒体DNA。向样品和对照组中加入8-OHdG单克隆抗体，然后向其中加入相应的HRP连接的二抗。样品使用8-OHdG定量并通过测定450nm处的吸光度来观察。
实施例2-10:测定线粒体细胞膜电位的方法
将NSC以5x105个细胞/孔的密度接种于96孔板中。细胞用20μM Aβ25-30和各浓度的PEP1(1、10或50μM)在37℃下处理48小时。
使用JC-1线粒体细胞膜电位观察试剂盒测定线粒体细胞膜电位。使用ELISA读取器观察线粒体细胞膜电位。在罗丹明波长和德克萨斯红波长处观察健康细胞，并且证实大多数JC-1聚集。通过在FITC波长处观察死细胞或不健康的细胞，证实JC-1处于单体状态。
实施例2-11:三磷酸腺苷(ATP)测定
使用ATP测定试剂盒观察ATP浓度并通过ELISA读数器评估。在535/587nm的激发/发射波长处观察ATP浓度。
实施例2-12:蛋白质组学
蛋白质样品的制备
用冷PBS洗涤培养的NSC两次，并使用超声波仪在样品裂解缓冲液中破碎10秒。另外，细胞在室温再次破碎1小时。在15℃和15000g离心1小时后，去除非水溶性样品，只有水溶性样品进行双向电泳。通过Bradford方法定量蛋白质浓度。
二维聚丙烯酰胺电泳
将200μg蛋白质样品加载到Immobiline DryStrip凝胶上。在20℃下进行电子聚焦。对于电子聚焦，电压在3小时内从150伏增加到3500伏，以使样品进入凝胶。在进入二维之前，将样品在平衡缓冲液中培养10分钟。将包含在平衡缓冲液中的样品渗透到SDS-PAGE凝胶中，使用2D料斗系统(hopper system)在20℃和1700个粒子的条件下观察。
图像分析
为了定量分析，使用PDQuest系统分析图像。为了测定每个点的体积，使用点的总体积进行归一化。选择归一化体积增加2倍或更高的蛋白质斑点。
肽质量指纹图谱
为了通过肽质量指纹图谱鉴定蛋白质，使用胰蛋白酶将蛋白质斑点切割成更小的肽，在50％乙腈/0.1％TFA中的α-氰基-4-羟基肉桂酸充分混合，然后用MALDI-TOF分析。
从每个光谱300次拍摄获得光谱，并使用自动胰蛋白酶消化峰校准。峰值列表使用Flex分析系统进行校准。如下所述通过使用阈值来执行峰值检测。对于S/N，选择单同位素质量的最小分辨率。使用MASCOT分析程序来鉴定通过质量指纹图谱分析发现的蛋白质。搜索数据库使用的参数如下：酶(胰蛋白酶)；错过的切割的最大次数；固定修饰(Cys)；可变修饰(Met)；单同位素质量；质量容差。
根据可能的蛋白质评分将肽质量指纹图谱数据分类。
实施例2-13:抗体微阵列
对于抗体微阵列分析，使用全景抗体细胞信号传导试剂盒。简言之，将1.5x107个细胞铺在100mm培养皿中并用20μM Aβ25-35和10μM PEP1处理48小时。收获细胞以制备蛋白质细胞。蛋白质样品用Cy3和Cy5标记并进行抗体微阵列。使用扫描仪读取阵列载玻片，并使用分析程序分析获得的扫描的结果。
实施例2-14:蛋白质印迹和免疫染色
对于蛋白质印迹，使用了以下抗体：Ki67(1:200Abcam)、P85a(1:1000,Millipore)、pAKT(ser 473,1:500,Cell Signaling Technology)、GSK-3b(ser 9,1:1000.Santa Cruz Biotechnology)、HSTF-1(1:1000,Santa Cruz Biotechnology)、抗-B细胞淋巴瘤-2(1:1000,Cell Signaling Technology)、HMGB-1(1:500,Cell SignalingTechnology)、Bax(1:1000,Cell Signaling Technology)、细胞溶质细胞色素C(1:200,Cell Signaling Technology)、切割的半胱天冬酶3(Asp175,1:1000,Cell SignalingTechnology)、c-Myc(1:1000,Cell Signaling Technology)、GFP(1:1000,Cell SignalingTechnology)、hTERT(1:500,Santa Cruz Biotechnology)和rTERT(1:500,Santa CruzBiotechnology)。
为了确认细胞内信号传导系统，在48小时的处理后进行蛋白质印迹。
为了获得线粒体和细胞质蛋白质，使用线粒体/细胞内蛋白质分离试剂盒(Abcam)。使用ECL溶液观察所有印迹，并使用分析程序分析观到的察图像。
进行免疫染色以确认细胞内的表达和位置。对于免疫染色，使用以下抗体：Ki67(1:100Abcam)、兔抗双皮质素(1mg/mL；Abcam)、兔抗神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(1:5000；Abcam)、兔抗Tuj1(1mg/mL；Abcam)、小鼠抗GalC(1mg/mL；Millipore)和兔抗HMGB1(1:100；Cell Signaling Technology)。
使用Olympus荧光显微镜观察数据，并使用合适的荧光。
实施例2-15:使用膜联蛋白-5和碘化丙啶检测(检测细胞凋亡的实验方法)
使用FITC膜联蛋白5凋亡试剂盒进行膜联蛋白-5和碘化丙啶的检测。简言之，用20μM Aβ25-35和各浓度的PEP1(1、10或50μM)处理所收获的大脑皮质，并在37℃下培养48小时。细胞用冷PBS洗涤两次，并与1x结合缓冲液混合。之后，将细胞以1x105个细胞/100μL的密度放入1.5ml管中，向其中加入5μL FITC标记的膜联蛋白-5和10μL碘化丙啶。细胞在室温下培养15分钟，加入400μL结合缓冲液后，使用流式细胞仪分析细胞。
实施例2-16:TERT的过表达
质粒载体
hTERT-GFP载体和穿梭载体购自OriGene Technologies Inc。
Neon基因的转染
制备人干细胞(H9 hESC，GIBCO)以用于转染。将人干细胞分离成单个细胞，并与20μL的Neon Buffer-R混合。为了其中进行施加DC高电压以试图转染基因的电穿孔，将细胞和1μg的TERT放入无菌管中。将Neon吸头放入Neon移液管后，将DNA和细胞的混合物在没有气泡的情况下吸入吸头(tip)。将Neon移液管插入含有3mLNeon电泳缓冲液E的Neon管中。施加1300伏的电击一次。电击后，将细胞迅速转移到StemPro NSC SFM中的CellStar包被的培养板中。
实施例2-17:统计分析
通过每次实验进行5次以对所有数据进行统计分析，并且当P值小于0.05时，将其确定为显著的实验值。
实施例3:在细胞水平PEP1对神经元损伤预防和神经元再生的效果分析
实施例3-1:Aβ25-35和PEP1对NSC存活能力、增殖和迁移的影响评估
本发明人证实了不同浓度的Aβ25-35(0、2.5、5、10、20或40μM)处理48小时是否影响NSC的存活能力、增殖和迁移。通过CCK-8、MIT和LDH测定法测定细胞活力。此外，通过BrdU和CFU测定法来评估NSC的增殖。用Aβ25-35处理后，在浓度依赖性方法中细胞存活能力和增殖显著降低。然而，与存活能力相比，在较低浓度的Aβ25-35时增殖减少(参见图1)。
本发明人用不同浓度的PEP1(0、1、10、50、100或200μM)处理NSC以研究PEP1对NSC的影响。如通过CCK-8和BrdU测定所测定的，细胞存活能力和增殖在浓度多至100μM时不受影响(参见图2)。
为了评估在Aβ诱导的应激环境下PEP1对NSC的影响，将NSC暴露于20μM Aβ25-3548小时，并且还用不同浓度的PEP1(0、1、10、50和100μM)处理。通过MTT、CCK-8和LDH分析测定NSC的存活能力，并通过BrdU和CFU测定法测定增殖。与仅用20μM Aβ25-35处理的NSC相比，20μM Aβ25-35和PEP1(高达100μM)的共处理以浓度依赖性方式逐渐增加NSC的存活能力和增殖(参见图3至6)。
使用DAPI和TUNEL染色测定PEP1对Aβ诱导的NSC细胞凋亡的影响。当用20μM Aβ25-35处理细胞48小时(p<0.01)时，以百分比表示的NSC细胞凋亡程度显著增加，并且通过用PEP1(至多100μM)共处理而显著降低(p<0.05)(参见图7和图8；图7的明亮部分是TUNEL染色的NSC)。
为了研究作为干细胞主要特征的干细胞迁移能力是否受Aβ和PEP1的影响，将NSC用20μM Aβ25-35和不同浓度的PEP1(0、1、10和50μM)处理48小时。随后，使用迁移分析试剂盒评估迁移能力。20μM Aβ25-35处理降低了NSC的迁移能力，但不同浓度的PEP1处理有效恢复迁移(参见图9)。
实施例3-2:PEP1在NSC中的穿透
为了评价PEP1穿透进入NSC的能力，用10μM的FITC标记的PEP1和/或20μM的Aβ25-35处理NSC。作为实验的结果，PEP1在正常环境中有效地穿透进入NSC中，并且通常位于细胞质和线粒体中。细胞中的PEP1水平随时间而增加。然而，当NSC通过20μM Aβ25-35处理而损伤时，显示一些PEP1穿透进入细胞核(参见图10至13；图10至13的明亮部分是FITC标记的PEP1)。
实施例3-3:PEP1对由Aβ25-35引起的ROS产生和氧化性线粒体DNA损伤的影响
观察了PEP1穿透进入细胞的能力后，检查PEP1是否表现出ROS抑制作用。考虑到Aβ25-35诱导氧化应激并且通过PEP1有效抑制NSC的细胞凋亡，在本发明中，研究了PEP1是否具有抗氧化作用。结果表明，PEP1显著降低由Aβ25-35诱导的ROS的量(参见图14或15)。在本发明中，作为也试图确认PEP1对由Aβ25-35引起的ROS产生的直接作用的结果，但是在无细胞条件下，β-淀粉样蛋白和PEP1都不显示对ROS产生的显著影响(参见图16)。还测定了由氧化应激引起的线粒体DNA损伤。因此，可以看出，当Aβ25-35处理时氧化性线粒体DNA损伤显著增加，但当PEP1处理时则显著降低(参见图17)。
实施例3-4:PEP1对Aβ25-35损伤的NSC的线粒体的影响
为了观察PEP1对由Aβ25-35毒性损伤的NSC的线粒体的影响，本发明人测定了线粒体细胞膜电位和ATP水平。在NSC中，Aβ25-35使线粒体细胞膜电位降低，PEP1使细胞膜电位恢复至正常范围内的水平(参见图18至20)。Aβ25-35降低ATP水平，PEP1显著恢复ATP水平(参见图21)。
实施例3-5:Aβ25-35和PEP1对细胞蛋白质水平的影响
为了研究Aβ25-35和PEP1对NSC中蛋白质生产的影响，进行了蛋白质组学研究。量化了由Aβ25-35产生的各种修饰蛋白和通过PEP1处理而恢复的蛋白质。进行抗体微阵列以观察蛋白质的磷酸化模式，其结果表明，与增殖相关的各种磷酸化蛋白质通过Aβ25-35降低并通过PEP1恢复(参见图22至25；图24的明亮部分是与炎症、TCA循环、细胞迁移和GPCR相关的斑点)。
发明人通过蛋白质印迹和免疫染色直接观察到由Aβ25-35和PEP1诱导的一些蛋白质的免疫应答。与NSC增殖能力相关的蛋白ki67被Aβ25-35降低，但是被PEP1以浓度依赖性的方式增加。增殖相关蛋白如P85a PI3K和pAKT(Ser 473)、磷酸化GSK3-3b(Ser 9)、HSTF-1和细胞质HMGB-1被Aβ25-35降低，但被PEP1恢复。相反，凋亡相关蛋白如Bax、细胞质细胞色素C和切割的半胱天冬酶-3被Aβ25-35增加，并且被PEP1显著降低。细胞质中HMGB1的表达(通过免疫染色观察)被Aβ25-35降低，但是通过PEP1共处理而以浓度依赖的方式恢复(参见图26至30；图30的明亮部分是与HMGB-1表达相关的免疫染色部分)。
作为研究PEP1对受损神经元中细胞内信号传导蛋白的作用的结果，观察到大量的增殖相关蛋白，并且观察到低量凋亡相关蛋白(参见图31至34)。
实施例3-6:PEP1对Aβ25-35毒性诱导的经由PI3K途径的神经保护作用的评估
为了研究PEP1对Aβ25-35毒性诱导的经由PI3K途径的神经保护的作用，将NSC分为四组：对照组(组1)，用20μM Aβ25-35处理48小时的组(组2)，用20μMAβ25-35和10μM PEP1处理48小时的组(组3)，或者用10μM LY294002处理49小时然后用20μM Aβ25-35 10μM PEP1处理48小时的组(组4)。
作为实验的结果，与组3相比，在用PI3K抑制剂LY294002预处理的组4中NSC的存活能力降低约16％(参见图35)，因此推断PI3K途径与PEP1的神经保护作用有关。
实施例3-7:PEP1对Aβ25-35毒性引起的NSC分化的影响的评估
为了评价PEP1对由于Aβ25-35毒性导致的NSC分化的各个步骤的影响，本发明的发明人通过将培养基更换为无bFGF的N2培养基来诱导NSC分化。虽然分化前没有特异性，但分化后未出现Nestin和Ki67的免疫应答。然而，在大量的GFAP阳性细胞和NeuN阳性细胞中，这种免疫应答在分化后增加。此外，Aβ25-35的处理倾向于增加NSC分化成GFAP阳性细胞并降低分化成NeuN阳性细胞，但在PEP1处理中观察到相反效果(参见图36至48；图36的明亮部分是经免疫染色显示Nestin或Ki67表达的部分，图37的明亮部分是经免疫染色显示Nestin、GFAP或DAPI表达的部分，图38的明亮部分是经免疫染色显示NeuN、DCX或DAPI表达的部分，图39的明亮部分是经免疫染色显示Tuj1或DAPI表达的部分，图40的明亮部分是经免疫染色显示Nestin、Ki67或DAPI表达的部分，图43的明亮部分是经免疫染色显示GalC、GFAP或DAPI表达的部分，图46的明亮部分是经免疫染色显示NeuN或DAPI表达的部分)。
实施例3-8:PEP1对人类NSC中hTERT过表达的影响的评估
为了确认PEP1的作用是否与hTERT的细胞外端粒酶活性直接相关，本发明人在人NSC中诱导hTERT过度表达。尽管hTERT过度表达，人类NSC的存活能力通过基因转染而降低。根据蛋白质组学结果，显示受PEP1处理影响的相似蛋白质也受到hTERT过表达的影响(参见图49至54)。
实施例4:PEP1对在动物模型(3XTg-AD)中预防神经元损失及使神经元再生的影响的分析)
实施例4-1:用于实验的动物模型的准备和实验的设计
为了测试PEP1对AD的功效，AD转基因小鼠(3XTg-AD)购自Jackson Laboratory。转基因小鼠的遗传特征如下：B6；129-Psen1tm1Mpm Tg(APPSwe，tauP301L)1Lfa/Mjjax。在8周龄的转基因小鼠进行初步饲养后，将小鼠以1:2的雄性和雌性比例饲养在笼子中以增加转基因小鼠的数目，大约7或8天后，分离并观察大约7至8周小鼠的妊娠。在确认小鼠怀孕一周后，将新小鼠接生并断奶3周。两周后，获得成熟的小鼠。
在初步培育和整个实验期间，温度保持在23±2℃，相对湿度保持在60±10％，然后在12小时黑暗/光照周期下饲养小鼠。将实验动物分成五组，每组包括10只动物。划分的实验组如下。第1组：用生理盐水处理；第2组：用0.01mg/kg PEP1处理；第3组：用1mg/kg的PEP1处理；第4组：用1mg/kg多奈哌齐治疗，阳性对照组；和第5组：用乱序肽(长度为16个氨基酸的随机肽)处理。
PEP1、生理盐水、多奈哌齐和乱序肽从12个月龄开始每个浓度皮下注射每周三次，持续两个月，然后在注射两个月后，进行认知/记忆行为测试(被动回避测试和Y形迷宫测试)以检查认知功能和记忆功能的改善程度。在提取脑部以分离海马体后，通过蛋白质印迹和免疫染色测定海马体和全脑中的β淀粉样蛋白的量以及β淀粉样蛋白寡聚体和由tau过度磷酸化产生的NFT的量。另外，通过蛋白质印迹观察到脑中由PEP1引起的特定蛋白质的各种变化。
实施例4-2:用免疫染色分析海马体和全脑中各种蛋白质的方法
麻醉后，将完成动物行为测试的小鼠(每组10只小鼠)用0.9％生理盐水进行心脏再灌注，然后再用4％多聚甲醛再灌注以进行固定。将4％的多聚甲醛固定的脑取出并加入到含有4％多聚甲醛的15ml试管中。第二天，大脑维持原样加入到30％蔗糖中。大脑放置，直到大脑浸入30％蔗糖中。使用O.C.T化合物将经固定的组织在-20℃冷冻。使用低温恒温器将冷冻组织剪切成20μm的厚度。切割的组织切片用与0.01M PBS混合的50％乙醇处理30分钟，以使抗体容易渗透组织。将组织用0.3％过氧化氢处理10分钟，以除去组织中固有的过氧化物酶的活性。将组织切片置于10％正常血清(N/S)中1小时。之后，将组织在稀释至0.5％N/S的含有一抗的溶液中4℃放置1天。
用于免疫荧光染色的一抗如下：抗β-淀粉样蛋白(D54D2)(1:100,CellSignaling,Beverly,MA,USA)、抗寡聚体β-淀粉样蛋白(1:100,Millipore)、抗Tau(2μg/ml,Invitrogen)、抗NeuN(1:100,Millipore)、抗DCX(1:100,Cell Signaling)、抗Tuj1(2μg/ml,Abcam)、抗GFAP(1:1,000,Abcam)和抗GalC(1:000,Millipore)。
之后，将组织切片放置在含二抗的溶液中2小时。本文使用的二抗如下：山羊抗兔Alexa Fluor 488(Molecular Probes)、抗兔四甲基罗丹明(Molecular Probes)和山羊抗小鼠Alexa Fluor 488(Molecular Probes)。
组织切片用PBS洗涤三次，置于载玻片上，然后使用含有DAPI的固定培养基(Vector Laboratories)进行固定。之后，使用荧光显微镜观察组织切片。
实施例4-3:PEP1对NeuN表达的影响的评估
麻醉后，将完成动物行为测试的小鼠(每组10只小鼠)用0.9％生理盐水进行心脏再灌注，然后除去全部血液。之后，提取脑以将海马体部分和全脑部分分开，由此获得脑组织，并使用液氮将脑组织快速冷冻。之后，破碎组织，并通过加入裂解缓冲液(1X RIPAⅡ细胞裂解缓冲液，1mM原钒酸钠(Na3VO4)，100mg/ml苯基甲基磺酰氟(PMSF)，1mM氟化钠(NaF)和1X蛋白酶抑制剂混合物)裂解。将获得的蛋白质的量定量，以相同量(35μg)的裂解物进行SDS-PAGE电泳，然后将通过电泳分离的蛋白质转移到PVDF膜上。将附着所转移蛋白质的PVDF膜首先置于2％脱脂牛奶中1小时，然后在4℃放置在1:1000稀释度的5％BSA(牛血清白蛋白)中的神经元核(NeuN,MAB377,Millipore)抗体溶液中一天。膜用含0.1％吐温20的TBS/T洗涤，并与以1:3000稀释的HRP缀合的抗小鼠IgG抗体反应1小时。膜用TBS/T洗涤并使用West-Q化学发光底物增强试剂盒(GenDEPOT,TX,USA)可视化，接着使用图像分析仪分析图像的条带强度。
作为分析的结果，与对照组和阳性对照组(多奈哌齐)相比，当以相同量的PEP1处理时，显示海马体和全脑中NeuN增加(参见图55)。因PEP1导致的在有丝分裂后神经元的细胞核中表达的大量成熟神经元标记物NeuN的存在，可能表明许多神经元可以由于PEP1而产生。
实施例4-4:PEP1对DCX表达的影响的评估
麻醉后，将完成动物行为测试的小鼠(每组10只小鼠)用0.9％生理盐水进行心脏再灌注，然后除去全部血液。之后，提取脑以将海马体部分和全脑部分分开，由此获得脑组织，并使用液氮将脑组织快速冷冻。之后，破碎组织，并通过加入裂解缓冲液(1X RIPAⅡ细胞裂解缓冲液，1mM原钒酸钠(Na3VO4)，100mg/ml苯基甲基磺酰氟(PMSF)，1mM氟化钠(NaF)和1X蛋白酶抑制剂混合物)裂解。将获得的蛋白质的量定量，以相同量(35μg)的裂解物进行SDS-PAGE电泳，然后将通过电泳分离的蛋白质转移到PVDF膜上。将附着所转移蛋白质的PVDF膜首先置于2％脱脂牛奶中1小时，然后在4℃放置在1:10000稀释度的5％BSA(牛血清白蛋白)中的GFAP(ab7260,Abcam)抗体溶液中一天。膜用含0.1％吐温20的TBS/T洗涤，并与以1:3000稀释的HRP缀合的抗兔IgG抗体反应1小时。膜用TBS/T洗涤并使用West-Q化学发光底物增强试剂盒(GenDEPOT,TX,USA)可视化，接着使用图像分析仪分析图像的条带强度。
作为分析的结果，与对照组和阳性对照组(多奈哌齐)相比，当以相同量的PEP1处理时，显示海马体和全脑中DCX增加(参见图56和57；图57的明亮部分是经免疫染色显示DCX或NeuN表达的部分)。考虑到在神经祖细胞和未成熟神经元中高度表达的DCX由于PEP1而高度表达，可以看出早期神经元祖细胞由于PEP1而高度表达，表明PEP1可影响神经元的增殖。
实施例4-5:PEP1对Tuj1表达的影响的评估
麻醉后，将完成动物行为测试的小鼠(每组10只小鼠)用0.9％生理盐水进行心脏再灌注，然后除去全部血液。之后，提取脑以将海马体部分和全脑部分分开，由此获得脑组织，并使用液氮将脑组织快速冷冻。之后，破碎组织，并通过加入裂解缓冲液(1X RIPAⅡ细胞裂解缓冲液，1mM原钒酸钠(Na3VO4)，100mg/ml苯基甲基磺酰氟(PMSF)，1mM氟化钠(NaF)和1X蛋白酶抑制剂混合物)裂解。将获得的蛋白质的量定量，以相同量(35μg)的裂解物进行SDS-PAGE电泳，然后将通过电泳分离的蛋白质转移到PVDF膜上。将附着所转移蛋白质的PVDF膜首先置于2％脱脂牛奶中1小时，然后在4℃放置在1:10000稀释度的5％BSA(牛血清白蛋白)中的Tuj1(ab18207,Abcam)抗体溶液中一天。膜用含0.1％吐温20的TBS/T洗涤，并与以1:3000稀释的HRP缀合的抗兔IgG抗体反应1小时。膜用TBS/T洗涤并使用West-Q化学发光底物增强试剂盒(GenDEPOT,TX,USA)可视化，接着使用图像分析仪分析图像的条带强度。
作为分析的结果，与对照组和阳性对照组(多奈哌齐)相比，当以相同量的PEP1处理时，显示海马体和全脑中Tuj1增加(参见图58和59；图59的明亮部分是经免疫染色显示Tuji表达的部分)。考虑到已知在分裂中的神经元前体或新产生的未成熟的有丝分裂后神经元中表达的Tuj1由于PEP1而高度表达，可以看出，PEP1施用可影响新神经元的分裂、产生和分化的诱导。
实施例4-6:PEP1对GFAP表达的影响的评估
麻醉后，将完成动物行为测试的小鼠(每组10只小鼠)用0.9％生理盐水进行心脏再灌注，然后除去全部血液。之后，提取脑以将海马体部分和全脑部分分开，由此获得脑组织，并使用液氮将脑组织快速冷冻。之后，破碎组织，并通过加入裂解缓冲液(1X RIPAⅡ细胞裂解缓冲液，1mM原钒酸钠(Na3VO4)，100mg/ml苯基甲基磺酰氟(PMSF)，1mM氟化钠(NaF)和1X蛋白酶抑制剂混合物)裂解。将获得的蛋白质的量定量，以相同量(35μg)的裂解物进行SDS-PAGE电泳，然后将通过电泳分离的蛋白质转移到PVDF膜上。将附着所转移蛋白质的PVDF膜首先置于2％脱脂牛奶中1小时，然后在4℃放置在1:10000稀释度的5％BSA(牛血清白蛋白)中的GFAP(ab7260,Abcam)抗体溶液中一天。膜用含0.1％吐温20的TBS/T洗涤，并与以1:3000稀释的HRP缀合的抗兔IgG抗体反应1小时。膜用TBS/T洗涤并使用West-Q化学发光底物增强试剂盒(GenDEPOT,TX,USA)可视化，接着使用图像分析仪分析图像的条带强度。
作为分析的结果，与对照组和阳性对照组(多奈哌齐)相比，当以相同量的PEP1处理时，显示海马体和全脑中GFAP减少(参见图60)。在中枢神经系统的星形胶质细胞中表达的GFAP在过度表达或异常表达时引起疾病如胶质细胞增生，并且考虑到通过PEP施用减少在痴呆诱导的动物模型中过表达的GFAP，可以看出PEP1具有预防和减少神经元疾病的发生的作用。
实施例4-7:PEP1对Galc表达的影响的评估
麻醉后，将完成动物行为测试的小鼠(每组10只小鼠)用0.9％生理盐水进行心脏再灌注，然后除去全部血液。之后，提取脑以将海马体部分和全脑部分分开，由此获得脑组织，并使用液氮将脑组织快速冷冻。之后，破碎组织，并通过加入裂解缓冲液(1X RIPAⅡ细胞裂解缓冲液，1mM原钒酸钠(Na3VO4)，100mg/ml苯基甲基磺酰氟(PMSF)，1mM氟化钠(NaF)和1X蛋白酶抑制剂混合物)裂解。将获得的蛋白质的量定量，以相同量(35μg)的裂解物进行SDS-PAGE电泳，然后将通过电泳分离的蛋白质转移到PVDF膜上。将附着所转移蛋白质的PVDF膜首先置于2％脱脂牛奶中1小时，然后在4℃放置在1:500稀释度的5％BSA(牛血清白蛋白)中的半乳糖脑苷脂(GalC,MAB342,Millipore)抗体溶液中一天。膜用含0.1％吐温20的TBS/T洗涤，并与以1:3000稀释的HRP缀合的抗小鼠IgG抗体反应1小时。膜用TBS/T洗涤并使用West-Q化学发光底物增强试剂盒(GenDEPOT,TX,USA)可视化，接着使用图像分析仪分析图像的条带强度。
作为分析的结果，与对照组和阳性对照组(多奈哌齐)相比，当以相同量的PEP1处理时，显示海马体和全脑中Galc增加(参见图61和62；图62的明亮部分是经免疫染色以显示GFAP、GalC或DAPI表达的部分)。Galc是去除半乳糖的酶并且作为少突胶质细胞的标志物，表明NSC分化成少突胶质细胞。考虑到PEP1诱导Galc增加，可以看出PEP1影响健康神经元所必需的少突胶质细胞的产生。
实施例4-8:PEP1对所有类型Aβ表达水平的影响的评估
麻醉后，将完成动物行为测试的小鼠(每组10只小鼠)用0.9％生理盐水进行心脏再灌注，然后除去全部血液。之后，提取脑以将海马体部分和全脑部分分开，由此获得脑组织，并使用液氮将脑组织快速冷冻。之后，破碎组织，并通过加入裂解缓冲液(1X RIPAⅡ细胞裂解缓冲液，1mM原钒酸钠(Na3VO4)，100mg/ml苯基甲基磺酰氟(PMSF)，1mM氟化钠(NaF)和1X蛋白酶抑制剂混合物)裂解。将获得的蛋白质的量定量，以相同量(35μg)的裂解物进行SDS-PAGE电泳，然后将通过电泳分离的蛋白质转移到PVDF膜上。将附着所转移蛋白质的PVDF膜首先置于2％脱脂牛奶中1小时，然后在4℃放置在1:1000稀释度的5％BSA(牛血清白蛋白)中的抗β-淀粉样蛋白(D54D2；Cell Signaling,Beverly,MA,USA)抗体溶液中一天。膜用含0.1％吐温20的TBS/T洗涤，并与以1:2000稀释的HRP缀合的抗兔IgG抗体反应1小时。膜用TBS/T洗涤并使用West-Q化学发光底物增强试剂盒(GenDEPOT,TX,USA)可视化，接着使用图像分析仪分析图像的条带强度。
作为分析的结果，与对照组和阳性对照组(多奈哌齐)相比，由于PEP1的处理，海马体和全脑中所有类型Aβ的表达水平降低(参加图63)。可以显示，PEP1以寡聚体形成，从而降低了在变成斑块形式前的阶段中Aβ的绝对量，从而可以预防神经元损失。
实施例4-9:PEP1对寡聚体Aβ表达水平的影响的评估
麻醉后，将完成动物行为测试的小鼠(每组10只小鼠)用0.9％生理盐水进行心脏再灌注，然后除去全部血液。之后，提取脑以将海马体部分和全脑部分分开，由此获得脑组织，并使用液氮将脑组织快速冷冻。之后，破碎组织，并通过加入裂解缓冲液(1X RIPAⅡ细胞裂解缓冲液，1mM原钒酸钠(Na3VO4)，100mg/ml苯基甲基磺酰氟(PMSF)，1mM氟化钠(NaF)和1X蛋白酶抑制剂混合物)裂解。将获得的蛋白质的量定量，以相同量(35μg)的裂解物进行SDS-PAGE电泳，然后将通过电泳分离的蛋白质转移到PVDF膜上。将附着所转移蛋白质的PVDF膜首先置于2％脱脂牛奶中1小时，然后在4℃放置在1:1000稀释度的5％BSA(牛血清白蛋白)中的β-淀粉样蛋白寡聚体(AB9234,Millipore)抗体溶液中一天。膜用含0.1％吐温20的TBS/T洗涤，并与以1:3000稀释的HRP缀合的抗兔IgG抗体反应1小时。膜用TBS/T洗涤并使用West-Q化学发光底物增强试剂盒(GenDEPOT,TX,USA)可视化，接着使用图像分析仪分析图像的条带强度。
作为分析的结果，与对照组和阳性对照组(多奈哌齐)相比，由于PEP1的处理，海马体和全脑中寡聚体Aβ的表达水平下降(参见图64)。可以看出，PEP1以斑块形式形成，由此在即将引发神经元的外部损伤和死亡之前降低寡聚体Aβ的绝对量，从而可以预防和治疗神经元损伤和死亡。
实施例4-10:PEP1对NFT产生的影响的评估
麻醉后，将完成动物行为测试的小鼠(每组10只小鼠)用0.9％生理盐水进行心脏再灌注，然后除去全部血液。之后，提取脑以将海马体部分和全脑部分分开，由此获得脑组织，并使用液氮将脑组织快速冷冻。之后，破碎组织，并通过加入裂解缓冲液(1X RIPAⅡ细胞裂解缓冲液，1mM原钒酸钠(Na3VO4)，100mg/ml苯基甲基磺酰氟(PMSF)，1mM氟化钠(NaF)和1X蛋白酶抑制剂混合物)裂解。将获得的蛋白质的量定量，以相同量(35μg)的裂解物进行SDS-PAGE电泳，然后将通过电泳分离的蛋白质转移到PVDF膜上。将附着所转移蛋白质的PVDF膜首先置于2％脱脂牛奶中1小时，然后在4℃通过在5％BSA中稀释1μg/ml的Tau(神经原纤维缠结标志物,AHB0042,Invitrogen)抗体制备的溶液中放置一天。膜用含0.1％吐温20的TBS/T洗涤，并与以1:3000稀释的HRP缀合的抗小鼠IgG抗体反应1小时。膜用TBS/T洗涤并使用West-Q化学发光底物增强试剂盒(GenDEPOT,TX,USA)可视化，接着使用图像分析仪分析图像的条带强度。
作为分析的结果，与对照组和阳性对照组(多奈哌齐)相比，由于PEP1的处理，海马体和全脑中Tau表达水平降低(参见图65和66；图66的明亮部分是经免疫染色显示β-淀粉样蛋白、NFT或DAPI表达的部分)。PEP1诱导的Tau表达(其用于测定由于神经元内部结构的缠结而引起神经元损伤和死亡的NFT产生的程度)下降表明PEP1预防NFT产生，由此有效预防神经元损失。
实施例5:根据动物模型的行为测试分析，评估PEP1对预防神经元损失和使神经元再生的作用
实施例5-1:根据被动回避测试评估PEP1在动物模型中的作用
对每组如实施例4-1所述注射药物的10只AD转基因小鼠进行被动回避测试。药物注射后两个月，被动回避测试如下进行。准备了具有明室和暗室的盒子，并且制作了一扇门，以允许在这些房间之间自由通行。在动物试验的第一天，将小鼠放入有光的室中，并且一旦它们移动，通向没有光的室的门自动打开180秒。第二天，测试以与第一天相同的方式进行，并且当小鼠进入没有光的室时，施加5V/0.05mA的DC电10秒。在第三天，测试以与第一天相同的方式进行，然后测定进入没有光的室的时间和频率。每个等待时间不超过180秒。在动物行为测试的第三天，小鼠可能不会移动，如果是这样，则不给予使它们移动的物理刺激。
作为分析的结果，与对照组和阳性对照组(多奈哌齐)相比，用PEP1处理的小鼠表现出优异的回避能力(参见图67和68)。已知认知能力的增加受到神经元状态的影响，并且根据测试结果，可以推测PEP1的处理对于预防神经元损失和使神经元再生有效，并且因此认知能力增加。
实施例5-2:根据Y-迷宫测试评估PEP1在动物模型中的作用
根据实施例4-1中描述的方法，对每组注射不同药物的10只AD转基因小鼠进行Y-迷宫试验。Y-迷宫测试是用于检查PEP1是否有助于AD转基因小鼠的空间感知能力和短期记忆恢复的测试。行为测试在具有三个臂的Y形迷宫中进行。每个臂相互之间以120°的预定角度布置。允许小鼠在这三个臂之间自由移动。小鼠似乎很乐于探索新的地方。因此，小鼠一般喜欢去新手臂，而不是回到访问过的手臂。臂被定义为A、B和C区域，并且小鼠的头朝向一个区域的墙壁放置，以允许小鼠自由移动180秒，然后观察和记录实验动物进入的区域。测定进入各臂的次数和次序以评估自发改变(％)。
作为分析的结果，与对照组和阳性对照组(多奈哌齐)相比，用PEP1处理的动物表现出色的行为判断(参见图69)。Y形迷宫测试是这样的测试：其能够确定选择新途径的能力和记住已经走过的途径的能力。根据测试结果，考虑到施用PEP1的动物表现出更高的能力，PEP1的处理可以改善记忆能力和行动力以及认知能力。
实施例5-3:根据对重度AD动物模型的行为测试分析，评估PEP1对预防神经元损失和使神经元再生的作用
根据实施例4-1中描述的方法通过饲养AD转基因小鼠(3XTg-AD)达20个月或更长时间，来制备对应于重度AD模型的20月龄以上的AD转基因小鼠。在从20个月的年龄开始每周三次皮下注射PEP1和生理盐水两个月后，进行认知/记忆行为测试(被动回避测试和Y-迷宫测试)，以评估认知功能和记忆功能的增强程度。对重度AD转基因小鼠，例如PEP1(1mg/kg)施用组的7只小鼠和生理盐水施用组(对照)的6只小鼠，通过与实施例5中所述方法类似的方法进行认知/记忆行为测试。
更具体而言，在药物施用2个月后，进行其中准备具有明室和暗室的盒子的被动回避测试，测定电刺激后进入没有光的室的时间和频率，并进行Y迷宫测试，所述Y迷宫测试中允许小鼠在具有三个臂的Y形迷宫中自由移动180秒，然后测定进入每个臂的次数和顺序以评估自发改变(％)(具体测试方法参考实施例5-1和5-2)。
作为分析结果，在被动回避测试的情况下，与对照组相比，PEP1施用组在停留在明室中的时间和频率增加，因此表现出优异的回避，即记忆恢复(参见图70)，并且在Y形迷宫测试的情况下，与对照组相比，PEP1施用组选择新途径(自发改变(％))的能力增加，因此表现出优异的恢复认知/记忆能力(参见图71)。如上所述，可以看出，PEP1施用模型对于重度AD倾向于表现出更高的认知/记忆能力，这表明重度AD小鼠可以通过PEP1施用改善认知能力、记忆能力和行为能力。
实施例6:根据临床试验评估PEP1对预防神经元损失和使神经元再生的作用实施例6-1:临床试验的施用方法和目标
通过招募轻度、中度和重度AD患者进行临床试验，已知这些是神经元损失和由此引起的神经退行性疾病中最具代表性的。实验设计为随机，安慰剂对照，双盲，平行设计，多中心2期临床试验，并使用众所周知的测定痴呆严重程度的方法确定疾病的进展。
在临床试验中，对如下四组进行施用：
1)对照组：安慰剂(0.9％盐水)皮下施用共26次，例如每周4次，每2周22次。
2)实验组1：根据实施例1制备的0.40mg PEP1皮下施用共26次，例如每周4次和每2周22次。
3)实验组2：根据实施例1制备的0.56mg PEP1皮下施用共26次，例如每周4次和每2周22次。
4)实验组3：根据实施例1制备的1.12mg PEP1皮下施用总共26次，例如每周4次和每2周22次。
该临床试验设计为随机，安慰剂对照，双盲，平行设计，多中心2期临床试验。将适合临床试验的受试者随机分配到三个实验组和安慰剂组中的一个。在随机分配的受试者中，对应于实验组的一个受试者皮下施用预定剂量的药物总共26次，例如每周4次和每2周22次。选作对照组的受试者通过与上述相同的方法，用相同量的安慰剂(0.9％盐水)作为测试药物治疗。
实施例6-2:临床试验的评估标准和方法
功效变量的分析在完整分析集(FAS)上进行，并与每个协议集(PPS)获得的附加结果进行比较。
功效变量分为两类。
1)主要功效变量(主要终点)：相对于基线的ADAS-cog和ADCS-ADL的变化(在第0、12、24、36和48周测定)
2)次要功效变量(次要终点)：相对于基线的CIBIC-Plus和QOL-AD的变化(在第0、12、24、36和48周测定)，以及相对于基线的总海马体萎缩和脑脊液(CSF)Aβ(1-x)的变化(在筛选的第24和48周时测定)
通过异常反应评估和临床试验结果(常规血液测试，血液生化测试，尿分析)的变化来测定安全性变量。
根据这些实施例，可以看出PEP1在预防和恢复神经元损失方面表现出优异的效果，并且由此在使用动物模型和临床试验以及在细胞水平的实验中引起认知能力增加。因此，根据本发明的肽PEP1可以开发为用于预防或治疗由此引起的神经元损失和神经退行性疾病的药物，并且可以提供使用该药物的神经疾病的根本预防和治疗方法。另外，预期PEP1在与神经疾病用常规治疗剂的共同治疗中显示出优异的协同效应。
<110> 珍白斯凯尔有限公司
<120> 肽在制造用于治疗神经退行性疾病的组合物中的用途
<130> OF16P242/PCT
<150> KR 10-2015-0153518
<151> 2015-11-03
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<170> KopatentIn 2.0
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<212> PRT
<213> 智人(homo sapiens)
<400> 1
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 1132
<212> PRT
<213> 智人(homo sapiens)
<400> 2
Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser
1 5 10 15
His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly
20 25 30
Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg
35 40 45
Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro
50 55 60
Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu
65 70 75 80
Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val
85 90 95
Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro
100 105 110
Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr
115 120 125
Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val
130 135 140
Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val
145 150 155 160
Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr
165 170 175
Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly
180 185 190
Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg
195 200 205
Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg
210 215 220
Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg
225 230 235 240
Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp
245 250 255
Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val
260 265 270
Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala
275 280 285
Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His
290 295 300
Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro
305 310 315 320
Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly
325 330 335
Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro
340 345 350
Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser
355 360 365
Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His
385 390 395 400
Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg
405 410 415
Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln
420 425 430
Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu
435 440 445
Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe
450 455 460
Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser
465 470 475 480
Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser
485 490 495
Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met
500 505 510
Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys
515 520 525
Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe
530 535 540
Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe
545 550 555 560
Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr
565 570 575
Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His
580 585 590
Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln
595 600 605
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile
610 615 620
Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val
625 630 635 640
Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser
645 650 655
Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg
660 665 670
Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg
675 680 685
Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro
690 695 700
Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile
705 710 715 720
Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln
725 730 735
Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His
740 745 750
Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp
755 760 765
Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser
770 775 780
Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu
785 790 795 800
Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His
805 810 815
Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro
820 825 830
Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp
835 840 845
Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu
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Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala
865 870 875 880
Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys
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Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu
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Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe
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Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser
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Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly
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Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln
995 1000 1005
Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln
1010 1015 1020
Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala
1025 1030 1035 1040
Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu
1045 1050 1055
Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp
1060 1065 1070
Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr
1075 1080 1085
Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser
1090 1095 1100
Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn
1105 1110 1115 1120
Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp
1125 1130

Claims (7)

1.肽在制造用于治疗神经退行性疾病的组合物中的用途，其中所述组合物包含：药物有效量的由氨基酸序列SEQ ID NO:1组成的肽，
其中所述神经退行性疾病是脑疾病、脊髓损伤、外周神经损伤、外周神经疾病、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿病、脊髓小脑变性和多发性神经病中的任一种。
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述组合物与一种或多种神经疾病用治疗剂共同治疗。
3.如权利要求1所述的用途，其中，所述神经退行性疾病是早期、进行性或重度神经退行性疾病。
4.如权利要求1所述的用途，其中，所述SEQ ID NO:1的肽作为药物活性成分以0.0001至100mg/kg/天的剂量施用。
5.如权利要求1所述的用途，其中，所述SEQ ID NO:1的肽作为药物活性成分以0.01至200mg/kg/天的剂量施用。
6.如权利要求1所述的用途，其中，所述SEQ ID NO:1的肽作为药物活性成分每一周至每四周施用一次，总共四次以上。
7.如权利要求1所述的用途，其中，口服、直肠内、经皮、静脉内、肌内、腹膜内、髓内、鞘内、皮内或皮下施用所述组合物以注入作为药物活性成分的所述SEQ ID NO:1的肽。
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