KR20180064434A

KR20180064434A - 신경세포 손실 예방 및 재생 효능을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR20180064434A
Application number: KR1020187011802A
Authority: KR
Inventors: 고성호; 이규용; 김상재
Original assignee: 주식회사 젬백스앤카엘
Priority date: 2015-11-03
Filing date: 2016-11-03
Publication date: 2018-06-14
Also published as: CN108431021A; US20180318383A1; CN113476589A; JP6920324B2; WO2017078440A1; CN108431021B; JP2019501210A; EP3372613A4; EP3372613A1

Abstract

본 발명은 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 텔로머라제로부터 유래된 펩티드를 포함하여 알려진 신경세포 손실 및 재생불능에 의한 질환에 효과적인 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 펩티드는 알츠하이머성 질환을 포함하는 신경세포 손상 및 재생 불능 질환에 대하여 예방 및 치료효과를 나타내어, 신경세포 손상 및 재생 불능 질환에 새로운 치료방법을 제공할 수 있다.

Description

신경세포 손실 예방 및 재생 효능을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물

본 발명은 신경세포의 재생 및 손실 예방 효능을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 텔로머라제로부터 유래된 펩티드를 포함하며 신경세포의 재생 및 손실예방 효과를 보여 신경세포의 손실로 인한 질환을 예방 및 치료하는데 효과적인 뇌혈관질환 또는 퇴행성 신경계질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

신경세포는 신경줄기세포 (neural stem cell)이 분화하여 만들어지는 다양한 종류의 세포이다. 신경줄기세포는 신경세포 (neuron), 신경교세포 (glia), 아스트로사이트 (astrocyte), 올리고덴드로사이트 (oligodendrocyte) 등으로 다양하게 분화하여 신경계 (nervous system)를 이루게 된다.

신경줄기세포가 신경세포로 분화할 때 각 분화 단계 별로 마커를 나타내는데 증식, 분화, 이동, 표적화, 시냅스생성 단계가 있다. DCX (doublecortin)은 신경전구체에서 발현되는 단백질로 미성숙 신경세포임을 나타내고, TuJ1 (neuron-specific class IIIβ Tubulin)은 한창 분열중인 신경세포 전구체 또는 새로 생성된 미성숙 후분열기 신경세포에서 발현되어 한창 분열 중인 신경세포임을 나타내며, NeuN (neuronal nuclear antigen)은 핵단백질로 분열 후기에 발현되며 성숙된 신경세포임을 나타낸다. 이들 마커들의 발현량을 통해 신경세포의 분화 및 증식 여부 및 정상 증식이 되고 있는지 여부를 알 수 있다.

신경세포의 손상은 다양한 증상을 초래하며, 뇌신경세포가 손상될 시 인지장애, 시력감퇴 등으로 이어질 수 있다. 신경세포가 손상되는 것을 알 수 있는 마커 중에서 GFAP (glial fibrillary acidic protein)은 아스트로사이트를 포함한 중추신경계에서 발현되는 단백질로 아스트로사이트의 세포골격을 이루는 기능을 하는데, 이 단백질의 이상발현은 신경교증 (gliosis)를 유도하며 인지능력 장애를 불러온다. 또한 GalC (galactosylceramidase)는 갈락토스 (galactose)를 제거하는 효소이며, 올리고덴드로사이트 마커로, 신경줄기세포가 올리고덴드로사이트로 분화되었음을 나타낸다. 이들 마커를 통하여 신경줄기세포가 손상되어 있는지 여부 및 올리고덴드로사이트의 재생이 이루어지고 있는지 알 수 있다.

신경 기능에 이상을 초래하는 것을 신경계 질환이라고 하는데, 뇌졸중, 뇌종양, 파킨슨병, 간질, 편두통, 수면 질환, 치매 등이 이에 해당한다.

신경질환 중 뇌졸중 (stroke)은 뇌혈관의 병적인 변화에 의해 뇌의 이상이 초래되는 뇌혈관질환 (cerebrovascular disease)로, 색전증 (embolism) 또는 혈전증 (thrombosis)에 의한 혈관내강의 폐색, 혈관의 파열 등이 일어난다. 이와 같은 뇌졸중은 뇌혈관이 막히거나 터져서 발생하는 병으로, 뇌경색과 뇌출혈 두 가지 유형으로 나뉜다. 뇌경색은 허혈성 뇌혈관 질환이라 부르며, 뇌혈관이 막혀서 뇌에 혈액과 산소 공급이 원활하지 못해서, 뇌세포가 죽게 되어 발생하는 질환이다. 한편, 뇌출혈은 출혈성 뇌혈관 질환이라 부르며, 뇌혈관이 터져 피가 흐르고 고여서 뇌 손상이 오는 경우이다. 상기 뇌경색과 뇌출혈은 뇌의 기능을 상실시키며, 이로 인해 반신마비, 언어장애 및 의식장애 등이 나타나며, 심할 경우 사망에 이른다.

상기 허혈성 뇌혈관 질환은 뇌의 혈류가 감소되어 뇌세포에 산소와 포도당의 공급이 이루어지지 않아 해마 CA1 영역에 지연성 신경세포사 (delayed neuronal death)가 유발되어 발생하는 질환이다 (Kirino, Brain Res., 239, p57-69, 1982). 또한, 허혈성 뇌질환은 혈전증 (thrombosis), 색전증 (embolism), 일과성 허혈발작 (transient ischemic attack) 및 소경색 (lacume) 등으로 세분류 된다.

뇌졸중과 같은 허혈 손상의 분자생물학적 기전은 뇌실질의 특정 부위에 혈액 공급이 차단되면 산소 및 포도당의 공급 중단으로 세포막 내 이온 채널을 유지하기에 충분한 ATP 공급이 불가능해지고 NDMA (N-methyl-D-aspartic acid) 수용체, AMPA (a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propinoic acid) 및 메타보트로픽 글루타메이트 수용체 (metabotropic glutamate receptor)의 연속적인 활성의 유도를 통한 칼슘이온의 세포 내 유입을 증가 시킨다 (Science, 244, p1360-1362, 1989). 칼슘의 세포 내 유입은 글루타메이트 및 아스팔테이트가 과도하게 방출되어 자유 라디칼을 포함하는 세포 독성 분자가 생성되어 DNA 및 세포막 등의 세포 구조물을 파괴하여 신경세포 사망을 촉진하는 것으로 알려져 있다.

허혈성 뇌졸중은 단일 질환으로서는 사망원인 1위이기도 하면서 치료에 막대한 사회경제적 비용을 요구한다. 뇌졸중은 노인에서 발병률이 높은 질환이지만 최근 30-40대의 뇌졸중 발병률이 전체 뇌졸중 환자의 1/4를 차지할 정도로 발병 연령이 젊은 층으로 확산되고 있다. 그러나 현재까지 뇌졸중에 의해 야기되는 신경세포의 손상을 방지하는데 확실한 효과를 보이는 약물은 개발되지 않았다. 대부분의 환자들에게는 뚜렷한 치료가 없어 보존적인 치료와 이차예방을 위한 치료에 주력하고 있으나 심각한 후유증을 가지게 된다. 따라서, 새로운 치료법의 개발을 통해 뇌졸중으로 인한 뇌신경세포의 사멸을 최소화함으로써 그 후유증을 줄이려는 연구들이 진행되고 있다. 현재까지 뇌졸중으로부터 신경세포를 보호하려는 목적으로 개발된 약물들은 뇌졸중에 의해 유발되는 세포사멸 경로 중 특정 부위만을 차단하여 효과를 보려고 하였다. 그러나, 뇌졸중에 의한 신경세포사멸은 다양한 경로를 통해 이루어지기 때문에 그다지 효과적이지 못하였다. 최근에는 허혈성 뇌졸중의 정확한 병리기전을 밝히고 그에 관여하는 여러 인자들을 조절함으로써 뇌신경세포의 사멸을 최소화하려는 타겟 치료법에 대한 연구들이 진행되고 있다.

본 발명에서는 텔로머라제 유래 펩티드로 항암, 항염 효과를 가진 것으로 알려진 PEP1 허혈성 뇌졸중의 시험관내 (in vitro) 모델인 산소 포도당 결핍 (Oxygen Glucose Deprivation, OGD)에 의한 신경세포의 사멸을 억제하는 효과를 확인하였다. PEP1은 여러 질병을 타겟으로 한 다수의 임상실험에서 독성실험을 완료하고 부작용에 대한 안정성을 확인한 바 있다. 현재까지 허혈성 뇌졸중 치료제로 제시되고 있는 다양한 약물들은 치료대상이나 발생시점에 매우 한계적이며, 출혈증의 부작용이 있으나, PEP1은 예상치 못했던 놀라운 신경보호 효과를 나타내었다.

신경계 질환 중에서 환경, 유전 등의 요인에 의하여 뇌나 말초의 신경세포가 퇴화, 감소, 세포사하거나, 또는 상해를 입거나 제외됨으로써 발병하는 퇴행성 신경계 질환은 치매, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 척수 소뇌 변성증, 근위축성 측색 경화증, 다발성 신경병증, 척수 손상, 뇌혈관 장해 등이 있다. 이러한 신경질환의 치료에는 신경세포의 상해에 의하여 소실된 신경 전달 물질을 보충하거나, 신경세포를 재생하는 것이 치료의 핵심이다.

치매는 뇌세포의 손상과 손상에 수반된 뇌세포의 감소가 나타나는 뇌질환을 가진 사람들에게서 일반적으로 발견되는 인지기능의 점진적 감소와 같은 일련의 증후군을 의미한다. 뇌세포의 감소는 노화의 한 과정이지만 치매를 일으키는 질환은 더 빠른 뇌세포의 감소를 일으키며, 비정상적인 뇌기능을 야기한다. 2012년 치매 유병률 조사 결과에 의하면 65세 이상 노인의 치매 유병률은 9.18%이었다. 급속한 고령화로 치매 유병률은 계속 상승하고 있으며, 2012년 약 54만 명에서, 2030년도에는 약 127만명, 2050년도에는 약 271만 명으로 매 20년마다 약 2배씩 증가할 것으로 추산된다. 치매의 주원인으로는 알츠하이머 치매가 차지하는 비중이 과반수를 넘는 것으로 추정된다. 알츠하이머 질환에 이어 치매의 두번째 원인으로는 혈관성 치매를 포함한 혈관성 인지장애 (vascular cognitive impairment)이다.

알츠하이머는 환자수가 최근 급증하는 추세이며, 환자 및 환자의 가족에게 많은 고통을 안겨주는 것으로 사회적 문제화 되고 있기도 하다.

알츠하이머는 대뇌피질의 신경세포의 소실 및 비정상적인 단백질의 침윤 등을 특징으로 하며 대뇌 피질 (두정엽, 측두엽)의 위축을 초래하는 퇴행성 뇌질환으로, 치매의 가장 흔한 원인 중 하나이다. 병인이 아직까지 명확하지 않지만 병리학적으로는 비정상적인 아밀로이드 단백질과 사멸된 신경세포 및 염증세포로 구성된 베타 아밀로이드 반 (β amyloid plaque)이 신경세포외부에 침윤하며, 신경세포내부에는 과인산화된 타우 (tau) 단백질로 이루어진 신경원섬유매듭 (neurofibrillary tangle, NFT)의 농축을 특징으로 한다.

알츠하이머 질환 (AD)에서 나타나는 신경 퇴행은 초기에는 시냅스 독성 및 호중구의 감소, 신경전달물질 이상, 세포외 β-아밀로이드 (Aβ) 축적 (아밀로이드/노인성 반) 및 세포내 신경원섬유 (neurofibril) 매듭 (NFTs), 신경아교증 (gliosis)이 나타나고, 후기에는 현저한 신경 손실과 이와 연관된 뇌 위축 (atrophy)가 나타난다. 초기 단계에는 내후각뇌피질 (entorhinal cortex) 및 해마 (hippocampus)에 영향이 국한되고, 인지 및 기억력 손상이 나타난다. AD가 진행됨에 따라 해마의 80%까지의 신경이 사멸하고, AD 증상이 진행되면서 인지 장애와 일상 생활에서의 장애가 나타나고, 전반적 임상 인상 지수 (clinical global impression score)가 악화된다.

알츠하이머는 병인에 따라서 유전성 (familial) 알츠하이머 질환 (AD)과 산발성 AD로 구분된다. 유전성 AD는 1% 내지 5% 정도를 차지하는 것으로 알려져 있다. 대부분의 알츠하이머 질환 (AD)은 상 염색체 유전성을 나타내지 않으며, 산발성 AD에서는, 환경적 및 유전적 요인이 위험 인자로 작용할 것으로 생각되고 있다. 유전성 AD에서, 상 염색체 우성 가족 조기발현 (autosomal dominal familial early-onset) 알츠하이머 질환 환자에서, 다음과 같은 4개의 유전자에서의 돌연변이와 알츠하이머 발병과의 연관성이 제시되어 왔다: 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), 프레시닐린 (presenilin) 1 (PS1), 프레시닐린 2(PS2) 및 아폴리포프로틴 E (ApoE). APP 및 PS 단백질에서의 돌연변이는 Aβ 펩티드의 생성을 증가시키고, 구체적으로는 노인성 반 (senile plaque)의 주요 성분인 아밀로이이드생성 형태 Aβ42 생성을 증가시킬 수 있다.

아직까지 알츠하이머 질환의 발병 기전과 원인에 대해서는 명확이 밝혀져 있지 않으나, 유전자 돌연변이 외에 기타 발병 기작으로는 신경전달물질의 수준 감소나 증가에 의한 신경전달물질 가설 (neurotransmitter hypothesis), 베타 아밀로이드 침전에 의한 신경손상 가설 (amyloid hypothesis), 타우의 과인산화로 인한 신경손상 가설 (tau hypothesis) 등이 제시되어 왔다.

알츠하이머 발명 기전 중 신경전달물질 가설은 두 종류의 신경전달물질이 알츠하이머 질환과 연관이 있는 것으로 생각하고 있다: 아세틸콜린 및 글루타메이트, 아세틸콜린 (Ach)은 근육을 활성화시키고, 흥분, 단기 기억능 및 학습을 돕는다. AD 환자는 낮은 수준의 Ach를 나타낸다. 글루타메이트는 뇌에서 가장 흔한 신경전달물질로 학습 및 기억능에 관여한다. AD 환자의 뇌 세포가 사멸하면서 과량의 글루타메이트를 방출한다. 과량의 글루타메이트는 건강한 뇌 세포를 과도하게 자극하여 흥분독성 (excitotoxicity)로 알려진 현상을 나타내어, 신경세포가 손상되거나 또는 사멸하도록 만들므로 해로운 영향을 나타낸다. 알츠하이머 치료법으로 도네페질 (donepezil, 상표명 Aricept), 리바스티그민 (rivastigmine, 상표명 Exelon), 갈란타민 (galantamine, 상표명 Razadyne) 및 메만틴 (memantine, 상표명 Namenda)과 같은 콜린성 신경계 조절약물들은 저하된 신호전달기능을 개선하는 기전을 가지며, 글루타메이트 신경전달물질은 신경세포손상을 억제하는 NMDA 수용체 길항체 기전을 가지는 메만틴이 주로 사용된다. 그러나 이들 약물들은 단지 증상을 호전시키는 정도의 효능을 보유하고 있다.

현재까지 알츠하이머 질환을 근본적으로 치료할 수 있는 약물은 없다. 현재 시판 중인 약물들은 증상을 완화시키고 진행을 지연시키는 작용하는 효과를 가진다. 알츠하이머병에 대한 기존 치료제로 사용되는 것들은 신경전달물질 조절을 통해 약효를 나타내는 것으로, 도네페질, 리바스티그민, 갈란타민 및 메만틴이 있다. 도네페질, 리바스티그민 및 갈란타민은 뇌의 아세틸콜린 농도를 높여주는 아세틸콜린 에스테라아제 (acetylcholine esterase) 억제제 계열의 약물들이다. 상기 약물들은 아세틸콜린의 분해에 관여하는 아세틸콜린 에스테라아제를 억제하는 기능을 하며, 알츠하이머병 환자의 인지기능을 개선시켜주는 대중적인 치료제이다. 그러나 콜린분해효소 억제제의 공통적인 부작용으로 아세틸콜린의 증가로 인한 오심, 구토, 설사, 식욕 감퇴, 근육 경련 및 수면 장애가 알려져 있으며, 이 약물들은 알츠하이머병의 증상을 안정화시키거나 일시적으로 완화시킬 뿐, 정지시킬 수 없기 때문에 근본적인 치료제는 아니다. 메만틴은 또 다른 신경전달물질인 글루타메이트를 조절하는 것으로, 비경쟁적 NMDA (N-methyl-D-aspartate) 길항제(noncompetitive NMDA antagonist)로서 글루타메이트에 의한 세포 독성을 막아주는 역할을 하여 중등도 및 중증 알츠하이머 환자를 치료하는데 이용된다. 글루타메이트는 흥분성 신경전달물질로서 NMDA 수용체를 활성화 시키고, 과하게 활성화 되면 뇌신경세포 내에 지나친 칼슘 유입을 통해 세포를 파괴한다. 알츠하이머병 환자는 글루타메이트가 과도하게 분비되어 안정기에도 항상 NMDA 수용체의 칼슘 이온 통로가 열려 세포 내로 칼슘이 과량 유입되는데, 메만틴은 NMDA 수용체 내에 위치한 칼슘 이동 통로에서 친화력이 낮은 길항제로 작용해 칼슘의 세포 내 유입을 차단해 뇌신경세포의 파괴를 막는 역할을 한다. 그러나 메만틴도 어지러움, 두통등의 부작용을 일으키는 것으로 알려져 있다.

아밀로이드 가설은 세포외 아밀로이드 베타 (Aβ) 응집 또는 Aβ 제거의 감소가 독성 이벤트를 일으키고, 신경세포 퇴화를 가져오는 질환의 주요 원인이라고 가정한다. Aβ는 타입 1 세포막 (integral membrane) 글리코 단백질, 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 단백질 분해를 통행 생성된다. APP의 Aβ로의 분해작용은 두 개의 주요 경로, 즉 아밀로이드형성 (amyloidogenic) 경로 및 비아밀로이드 형성 경로로 일어나고, 알파 (α), 베타 (β) 및 감마 (γ) 세크리타제로 불리는 효소군에 의해 절단된다. γ-세크리타제 활성에 의한 APP 프로세싱이 Aβ1-40 및 Aβ1-42 모두의 방출의 최종 단계에 관여한다. 프레시닐린 1 (PS1) 및 프레시닐린 2 (PS2)는 각각 세크리타제 복합체 형성에 기여한다. Aβ는 두개의 주요 형태, Aβ1-40 및 Aβ1-42로 존재하는 것으로 알려져 있다 (이 둘은 공통된 N-말단을 가지나, C-말단이 다름). 정상적인 환경에서는 α-γ-세크리타제에 의한 분해로 Aβ1-40이 형성된다. Aβ1-40은 응집을 일으키거나 독성을 나타낼 확률이 적다. 반면, 병적인 환경에서는 β-γ-세크리타제에 의한 분해가 일어나 Aβ1-42가 생성된다. Aβ1-42는 AD 환자의 뇌에서 가장 많이 발견되는 유형이다. 아밀로이드 가설을 뒷받침하는 증거 중 하나는 아포리포프로틴이 베타 아밀로이드의 분해를 향상시키지만, APOE4와 같은 특정 이형질체 (isoform)는 이러한 분해 작용이 약하고, 그 결과 뇌에서 과도한 아밀로이드 축적을 일으킨다는 점이다. 아밀로이드 가설에 기초하여 아밀로이드 베타 펩티드를 타켓으로 하는 항체를 알츠하이머 질환 치료 약물로 개발하려는 시도가 있었다. 이제까지는 베타 아밀로이드 펩티드를 인식하는 항체 치료제로 기대를 모았던 바피누주맵 (bapineuzumab, Pfizer), 솔라네주맵 (solanezumab, Lilly) 및 면역 글로블린 기반 약물인 감마가드 (gammagard, Baxter)에 대한 임상 3상이 모두 실패한 것으로 나타났다.

이와 같이 베타 아밀로이드의 불용성, 원섬유 응집체가 알츠하이머 질환의 신경병리학적으로 대표적 표지이긴 하지만, 인간의 뇌 기능 장애와 연관성이 잘 설명되지 않고 있다. 최근에 알츠하이머 발병과 관련하여 베타 아밀로이드의 역할에 대한 새로운 가설로 베타 아밀로이드의 용해성 응집체 (oligomers)의 세포독성 역할에 대한 연구가 행해져 왔다. 아밀로이드-β 이량체 (dimer), 아밀로이드-β 삼량체 (trimer) 및 Aβ56과 같은 아밀로이드-β 올리고머들이 동물 모델에서 인지 능력에 미치는 영향에 대한 연구가 이루어졌다. 아밀로이드-β 이량체 및 Aβ56 가 건강한 어린 랫에 주사되었을 때, 뇌 기능을 손상시킨다는 강력한 증거가 있다.

타우 가설은 타우의 과인산화가 AD의 주요 원인이라고 가정하고 있다. 알츠하이머 환자의 뇌에서 과인산화된 타우가 신경원섬유매듭 (NFTs)의 주요 성분이다. NFTs는 알츠하이머 질환 및 기타 타우가 관여하는 질환에서 타우를 포함하는 섬유성 응집체이다. 정상적인 환경에서 타우는 용해되어 있으며, 미세소관 및 소낭성 (vesicular) 운반의 어셈블리 및 안정성을 유지하는 축삭 (axon)에서 주로 발견된다. 미세소관과 연관된 타우 단백질은 포유류의 뇌에서 정상적인 신경활성에 주요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. 한편, AD 및 기타 타우가 관여하는 병리적 환경에서 타우 키나제와 포스파타제 활성의 불균형으로 타우의 과인산화가 일어나고 타우의 형태를 변화시킨다. 이러한 변화는 타우 단백질이 불용성이 되게 만들며 미세소관에 대한 친화력을 감소시켜서 미세소관으로부터 탈착되어 자가 응집을 일으켜 쌍 나선 필라멘트 구조를 만들도록 한다. 이들 필라멘트는 NFTs로 응집되어서 액손 운반을 방해하고 저해시킨다. 타우를 코딩하는 유전자 MAPT (Microtubule -associated protein tau)가 위치하는 염색체 17번에서 발견되는 30여종 이상의 돌연변이가 유전성 알츠하이머 (FAD)와 파킨스병과 연관되어 있다. 또한, MAPT에서 확인된 돌연변이가 타우 단백질이 미세소관에 부착하는 것을 감소시키고, 비정상적인 필라멘트로 응집하는 경향을 증가시킨다. 이는 산발성 AD에서의 타우 병리증상과 일치한다. 이는 기능장애가 일어난 타우 단백질이 신경퇴행 질환의 주요 원인이라는 가설을 뒷받침한다.

유전성 알츠하이머 질환 (FAD) 돌연변이의 확인은 AD 동물 모델이 만들어질 수 있도록 하였다. 현재 사용되고 있는 동물 모델들은 돌연변이된 APP, PS1 및 MAPT 유전자 등을 사용하여 개발되었다.

알츠하이머를 포함하는 퇴행성 신경계 질환의 치료제의 개발을 위한 효력, 효능 실험에 사용되는 동물 모델로는 아밀로이드 베타의 축적 및 NFT가 유도되도록 특정 유전자 3개 (APP, Tau, PS1)가 변이된 쥐 (3XTg-AD mouse model) 등이 있다.. 이 3가지의 유전자가 변이된 쥐는 시간이 경과할수록 알츠하이머 증상을 포함한 신경세포 손상 질병 진행 상황을 나타낸다. 이러한 신경세포의 손실이 유도되는 동물에 개발한 약제를 투여하여 신경세포의 파괴억제 및 재생능을 관찰하고 비투여 대조군과 비교하는 것으로 치료제 후보들의 효력, 효능을 측정 할 수 있다고 알려져 있다.

본 발명에 따른 펩티드 (이하 PEP1)는 PEP1은 텔로머라제 (telomerase)의 촉매부분에 존재하는 16개의 중요한 아미노산으로 구성된 펩타이드로 항염 및 항산화등의 효능을 지닌 것으로 알려져 있다. 본 발명에 따른 펩티드가 퇴행성 신경 계질환의 근본 원인인 신경세포의 손실 예방 및 재생에 효과가 있음이 동물 실험등을 통하여 발견됨에 따라 PEP1이 퇴행성 신경계질환의 예방 및 치료에서 기존의 치료제의 한계, 즉 단순 증상 완화 효과를 넘어 근본적인 신경계질환 예방 및 치료 효과를 보일 것으로 기대된다.

본 발명은 텔로머라제의 역전사 효소 (reverse transcriptase of telomerase) 유래의 펩티드를 포함하는 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물을 제공한다. 구체적으로 본 발명은 인간 텔로머라제 역전사 효소 (reverse transcriptase of human telomerase, hTERT) 유래의 아미노산 펩티드를 포함하는 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물을 제공한다. 보다 구체적으로는 본 발명은 hTERT 유래의 16개 아미노산 펩티드, PEP1을 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물로 제공한다.

[선행기술문헌] WO 2010128807 A2

이러한 배경하에서 본 발명자들은 부작용이 거의 없으면서, 효과가 우수한 신경세포 손실 예방 및 재생 효능을 지닌 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 효과적이면서 동시에 부작용이 없으며 신경세포 손실에 의한 퇴행성 신경계질환에 대하여 근본적인 치료제인 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 일측면에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 약학적으로 유효한 양으로 포함하는 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 신경세포 손실 예방 및 재생에 사용하기 위한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물을 제조하기 위한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 신경세포 손실 및 재생 불능에 의한 질환의 예방, 치료, 경감 및 개선용이거나, 상기 질환에 의한 후유증의 예방, 치료, 경감 및 개선용인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 신경세포 손실 및 재생 불능에 의한 질환은 뇌혈관 질환 또는 퇴행성 신경계 질환인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 뇌혈관 질환은 허혈성 뇌혈관 질환 또는 출혈성 뇌혈관 질환인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 퇴행성 신경계 질환은 뇌질환, 척수손상, 말초신경손상, 말초신경질환, 근위축성 측색 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis), 치매, 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머성 질환, 척수 소뇌 변성증, 근위축성 측색 경화증, 및 다발성 신경병증 중 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 신경계질환 치료제와 병용 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 알츠하이머성 질환은 치매, 인지장애, 기억력저하 중 어느 하나 이상을 보이는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 알츠하이머성 질환은 초기, 진행성 또는 중증 알츠하이머성 질환인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약학적 유효성분으로 서열번호 1의 펩티드를 0.0001 내지 100 mg/kg/일 용량으로 투여하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약학적 유효성분으로 서열번호 1의 펩티드 0.01mg 내지 200mg을 투여하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약학적 유효성분으로 서열번호 1의 펩티드를 매 1주 내지 4주마다 1회씩 총 4회 이상 투여하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약학적 유효성분으로 서열번호 1의 펩티드를 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내, 피내, 또는 피하로 투여하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따르면, 약학적으로 유효한 양의 본 발명에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 신경세포 손실 예방 및 재생 치료방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따르면, 본 발명에 따른 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물, 및 약학적 유효성분으로 서열번호 1의 펩티드를 0.01mg 내지 200mg을 매 1주 내지 4주마다 1회씩 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 지시하는 지시서를 포함하는 신경세포 손실 예방 및 재생 치료용 키트가 제공된다.

본 발명에 따른 서열번호의 서열을 갖는 펩티드 또는 상기 서열과 80%의 상동성을 갖는 서열을 갖는 펩티드 또는 단편인 펩티드가 신경세포 손실 예방 및 재생에 효능을 가져, 신경세포 손실 및 재생 불능에 의한 질환의 예방 및 치료법을 제공한다.

도 1은 신경줄기세포에 Aβ_25-35 (β-Amyloid 베타아밀로이드 25-35)를 농도별(0, 2.5, 5, 10, 20, 40μM)로 처리했을 때 세포 생존능력을 CCK-8 (cell count kit-8) 로, 세포 활성도를 BrdU 염색법으로 측정한 결과를 대조군 (0 μM)에 대한 비율로 나타낸 그래프이다.
도 2는 신경줄기세포에 PEP1을 농도별 (0, 1, 10, 50, 100, 200 μM)로 처리했을 때 세포 생존능력을 CCK-8로, 세포 활성도를 BrdU 염색법으로 측정한 결과를 대조군 (0 μM)에 대한 비율로 나타낸 그래프이다.
도 3은 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별 (0, 1, 10, 50, 100 μM)로 처리했을 때, 세포 생존능력을 CCK-8, MTT, LDH로 측정한 결과를 흡광도 및 대조군에 대한 비율로 나타낸 그래프이다.
도 4는 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별(0, 1, 10, 50, 100 μM)로 처리했을 때, 세포 증식 정도를 흡광도로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별(0, 1, 10, 50, 100 μM)로 처리했을 때, 세포 사멸 (apoptosis)을 DAPI 및 TUNEL염색으로 확인한 사진이다.
도 6은 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별(0, 1, 10, 50 μM)로 처리했을 때, 집락형성단위 (CFU) 측정법을 통하여 집락 (colony)당 세포수를 나타낸 그래프이다.
도 7은 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별(0, 1, 10, 50, 100 μM)로 처리했을 때, 처리 전 후 세포 사멸을 TUNEL염색법으로 확인한 사진이다.
도 8은 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별(0, 1, 10, 50, 100 μM)로 처리했을 때, 처리 전 후 세포 사멸을 TUNEL염색한 것을 흡광도 측정하여 세포 사멸이 진행된 세포 비율을 나타낸 그래프이다.
도 9는 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별(0, 1, 10, 50 μM)로 처리했을 때, 세포 이동 능력을 관찰하기 위하여 QCM-24 웰 세포이동법 키트를 이용하여 세포이동 어세이를 실시한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10 내지 도 11은 PEP1을 10 μM 처리 후 신경줄기세포 내로 PEP1이 침투하는 과정을 알아보기 위하여 PEP1을 FITC로 라벨링하여 0내지 24시간 처리한 뒤 미토콘드리아 염색 및 세포막 염색을 진행하여 관찰한 사진이다.
도 12 내지 도 13은 Aβ_25-35를 20 μM 를 처리한 신경줄기세포에 PEP1을 1 μM 처리 후 베타아밀로이드 처리된 신경줄기세포 내로 PEP1이 침투하는 과정을 알아보기 위하여 PEP1을 FITC로 라벨링하여 0 내지 24시간 처리한 뒤 핵 염색을 진행하여 관찰한 사진이다.
도 14 내지 도 16은 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별 (0, 1, 10, 50 μM)로 처리했을 때, 활성산소(ROS) 생성을 측정하기 위하여 DCFH-DA를 염색하고 DCF 형광값을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별 (0, 1, 10, 50 μM)로 처리했을 때, 미토콘드리아의 산화적 DNA 손상 정도를 알아보기 위하여 8-OHdG ELISA 키트를 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별(0, 1, 10, 50 μM)로 처리했을 때, 미토콘드리아 세포막 전위를 ELISA 리더기를 사용하여 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 19 내지 도 20은 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별 (0, 1, 10, 50 μM)로 처리했을 때, 미토콘드리아의 세포막 전위를 JC-1 키트를 사용하여 관찰하였을 때, 사멸된 세포나 건강하지 않은 세포의 경우 FITC 파장에서 관찰한 결과 (도 19) 및 건강한 세포의 경우 로다민 파장 및 텍사스레드 파장에서 관찰한 결과 (도 20)를 나타낸 그래프이다.
도 21은 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별 (0, 1, 10, 50 μM)로 처리했을 때, ATP 농도(nmol/μL)를 나타낸 그래프이다.
도 22 는 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별 (0, 1, 10, 50 μM)로 처리했을 때, 세포내 단백질들의 발현 레벨에 PEP1이 영향을 주는 정도를 단백질체학의 관점에서 알아보기 위하여 수행된 항체 마이크로어레이의 결과 사진이다.
도 23은 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별 (0, 1, 10, 50 μM)로 처리했을 때, 각각의 조건에서 발현 및 감소하는 세포 내 단백질들을 나타낸 표이다.
도 24은 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별 (0 및 10 μM)로 처리했을 때, 세포 내 단백질들의 발현 레벨을 마이크로어레이로 나타냈을 때의 결과 사진이다.
도 25는 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별 (0 및 10 μM)로 처리했을 때, 각각의 조건에서 발현 및 감소하는 세포 내 단백질들을 나타낸 표이다.
도 26 내지 도 27은 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별 (0, 1, 10, 50 μM)로 처리했을 때, 발현되는 Ki67, PI3K, Ser473, Ser9, HMGB-1의 발현정도를 면역염색법을 사용하여 측정한 결과 사진 (도 26) 및 이를 수치화한 그래프 (도 27)이다.
도 28 내지 도 29는 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별 (0, 1, 10, 50 μM)로 처리했을 때, 발현되는 Bax, cytochrome c, caspase-3의 발현 정도를 면역염색법을 사용하여 측정한 결과 사진 (도 28) 및 이를 수치화한 그래프(도 29)이다.
도 30은 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별 (0, 1, 10 μM)로 처리했을 때, 발현되는 HMGB-1를 시간의 경과에 따라 관찰한 사진이다.
도 31 내지 도 32은 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별 (0, 1, 10 μM)로 처리했을 때, 발현되는 PI3K, Ser473, Akt, Ser9, Bcl-2 의 발현 정도를 면역염색법을 사용하여 측정한 결과 사진 (도 31) 및 이를 수치화한 그래프 (도 32)이다.
도 33 내지 도 34는 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리하고, PEP 1을 농도별 (0, 1, 10 μM)로 처리했을 때, 발현되는 PARP, Bax, Cytochrome-c, caspase-9, caspase-3 의 발현 정도를 면역염색법을 사용하여 측정한 결과 사진 (도 33) 및 이를 수치화한 그래프(도 34)이다.
도 35는 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리할 때, PEP 1을 농도별 (0, 1, 10 μM)도 함께 처리한 뒤 PIK3 저해제로 알려진 LY294002를 처리했을 때 세포 생존능력을 관찰한 결과를 측정한 그래프이다.
도 36 내지 도 48은 신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 μM (대조군) 및 20 μM를 처리할 때, PEP 1을 농도별 (0 및 1 μM)도 함께 처리한 뒤, bFGF (basic FGF)가 있는 상태 또는 없는 상태에서 각각 신경줄기세포의 분화 및 분열 단계별 마커인 Nestin, Ki67, GFAP, NeuN, DCX, Tuj1의 발현 정도를 DAPI 염색법 및 면역염색법을 통하여 관찰한 사진 및 그래프들이다.
도 49는 인간신경줄기세포에 hTERT (인간텔로머라제역전사효소)를 1μg 과발현시킨 뒤, 셔틀벡터 및 TERT를 각각 GFP로 태그하여 관찰한 사진이다.
도 50 내지 도 54는 인간신경줄기세포에 Aβ_25-35를 20 μM처리한 뒤 hTERT를 1μg 과발현 시킨 것과 1 μM의 PEP1을 처리한 것을 비교한 마이크로어레이 사진 (도 50), 셔틀벡터 및 hTERT를 GFP로 태그하여 TERT의 발현을 확인한 전기영동 사진 (도 51), 과발현된 hTERT 및 PEP1에 의해 증가 또는 감소된 단백질들을 나타낸 목록 (도 52), 인간신경줄기세포에 Aβ_25-35를 0 또는 20 μM처리하고 PEP1을 농도별 (0, 1, 10, 50 μM)로 함께 처리한 뒤 TERT의 발현 정도를 관찰한 사진 (도 53) 및 이를 수치화하여 나타낸 그래프 (도 54)이다.
도 55는 대조군 (saline 및 scramble 펩티드 1mg/kg) 및 농도별 PEP1 (0.01, 0.1, 1 mg/kg), 기존 약물인 도네페질 (donepezil, 1mg/kg)의 투여군 별 동물모델의 해마 (hippocampus) 및 전체 뇌에서 NeuN의 발현 정도를 웨스턴블랏 (western blot)으로 측정한 결과 사진 및 이를 수치화한 그래프이다.
도 56은 대조군 (saline 및 scramble 펩티드 1mg/kg) 및 농도별 PEP1 (0.01, 0.1, 1 mg/kg), 기존 약물인 도네페질 (donepezil, 1mg/kg)의 투여군 별 동물모델의 해마(hippocampus) 및 전체 뇌에서 DCX의 발현 정도를 웨스턴블랏 (western blot)으로 측정한 결과 사진 및 이를 수치화한 그래프(도 56)이다.
도 57은 대조군 (saline 및 scramble 펩티드 1mg/kg) 및 농도별 PEP1 (0.01, 0.1, 1 mg/kg), 기존 약물인 도네페질 (donepezil, 1mg/kg)의 투여군 별 동물모델의 SVZ (Subventricular zone)부위에서 신경조직을 면역염색 (immune staining)하여 DCX 및 NeuN의 발현 정도를 관찰한 사진이다.
도 58은 대조군 (saline 및 scramble 펩티드 1mg/kg) 및 농도별 PEP1 (0.01, 0.1, 1 mg/kg), 기존 약물인 도네페질 (donepezil, 1mg/kg)의 투여군 별 동물모델의 해마 및 전체 뇌에서 Tuj1의 발현 정도를 웨스턴블랏으로 측정한 결과 사진 및 이를 수치화한 그래프이다.
도 59은 대조군 (saline 및 scramble 펩티드 1mg/kg) 및 농도별 PEP1 (0.01, 0.1, 1 mg/kg), 기존 약물인 도네페질 (donepezil, 1mg/kg)의 투여군 별 동물모델의 SVZ (Subventricular zone)부위에서 신경조직을 면역염색 하여 Tuj1의 발현 정도를 확인한 사진이다.
도 60은 대조군 (saline 및 scramble 펩티드 1mg/kg) 및 농도별 PEP1 (0.01, 0.1, 1 mg/kg), 기존 약물인 도네페질 (donepezil, 1mg/kg)의 투여군 별 동물모델의 해마 및 전체 뇌에서 GFAP의 발현 정도를 웨스턴블랏으로 측정한 결과 사진 및 이를 수치화한 그래프이다.
도 61은 대조군 (saline 및 scramble 펩티드 1mg/kg) 및 농도별 PEP1 (0.01, 0.1, 1 mg/kg), 기존 약물인 도네페질 (donepezil, 1mg/kg)의 투여군 별 동물모델의 해마 및 전체 뇌에서 GalC의 발현 정도를 웨스턴블랏으로 측정한 결과 사진 및 이를 수치화한 그래프이다.
도 62는 대조군 (saline 및 scramble 펩티드 1mg/kg) 및 농도별 PEP1 (0.01, 0.1, 1 mg/kg), 기존 약물인 도네페질 (donepezil, 1mg/kg)의 투여군 별 동물모델의 SVZ 부위에서 신경조직을 면역염색 하여 DCX 및 NeuN의 발현 정도를 관찰한 사진이다.
도 63은 대조군 (saline 및 scramble 펩티드 1mg/kg) 및 농도별 PEP1 (0.01, 0.1, 1 mg/kg), 기존 약물인 도네페질 (donepezil, 1mg/kg)의 투여군 별 동물모델의 해마 및 전체 뇌에서 전체 단일 (monomer) 베타아밀로이드 (β-Amyloid)들의 발현 정도를 웨스턴블랏으로 측정한 결과 사진 및 이를 수치화한 그래프이다.
도 64는 대조군 (saline 및 scramble 펩티드 1mg/kg) 및 농도별 PEP1 (0.01, 0.1, 1 mg/kg), 기존 약물인 도네페질 (donepezil, 1mg/kg)의 투여군 별 동물모델의 해마 및 전체 뇌에서 올리고머 (oligomer) 베타아밀로이드들의 발현 정도를 웨스턴블랏으로 측정한 결과 사진 및 이를 수치화한 그래프이다.
도 65는 대조군 (saline 및 scramble 펩티드 1mg/kg) 및 농도별 PEP1 (0.01, 0.1, 1 mg/kg), 기존 약물인 도네페질 (donepezil, 1mg/kg)의 투여군 별 동물모델의 해마 및 전체 뇌에서 NFT의 발생 정도를 나타내는 마커인 Tau의 발현 정도를 웨스턴블랏으로 측정한 결과 사진 및 이를 수치화한 그래프이다.
도 66는 대조군 (saline 및 scramble 펩티드 1mg/kg) 및 농도별 PEP1 (0.01, 0.1, 1 mg/kg), 기존 약물인 도네페질 (donepezil, 1mg/kg)의 투여군 별 동물 모델의 신경조직을 면역염색하여 신경세포에서 NFT (Tau로 측정) 및 베타아밀로이드들의 발현 정도를 확인한 사진이다.
도 67은 대조군 (saline 및 scramble 펩티드 1mg/kg) 및 농도별 PEP1 (0.01, 0.1, 1 mg/kg), 기존 약물인 도네페질 (donepezil, 1mg/kg)의 투여군 별 동물 모델의 수동회피실험 결과를 평가하여 좋음 (good, 빗금) 및 나쁨 (bad, 빗금없음)의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 68은 대조군 (saline 및 scramble 펩티드 1mg/kg) 및 농도별 PEP1 (0.01, 0.1, 1 mg/kg), 기존 약물인 도네페질 (donepezil, 1mg/kg)의 투여군 별 동물 모델의 수동회피실험에서 반응 시간 (초단위)을 나타낸 그래프이다.
도 69은 대조군 (saline 및 scramble 펩티드 1mg/kg) 및 농도별 PEP1 (0.01, 0.1, 1 mg/kg), 기존 약물인 도네페질 (donepezil, 1mg/kg)의 투여군 별 동물 모델의 Y-maze 실험 결과를 평가하여 나타낸 그래프이다.
도 70은 중증 알츠하이머 동물 모델의 수동회피실험 결과를 평가하여 밝은 방에 머무는 개체수의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 71은 중증 알츠하이머 동물 모델의 Y-maze 실험 결과를 평가하여 변경행동력을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

신경계 질환에서는 신경세포가 퇴화, 감소 또는 세포사함으로써 다양한 병리적 증상을 일으킨다. 신경세포 손실 및 재생 불능에 의한 질환은 허혈성 뇌졸중과 같은 뇌혈관 질환 및 치매 또는 알츠하이머 질환과 같은 퇴행성 신경계 질환이 있다. 현재까지 퇴행성 신경제 질환 치료제는 증상개선을 위한 약제일 뿐 질환의 경과를 변경시키지 못하므로, 근본적인 치료법으로는 신경보호치료제 또는 신경재생치료법이 개발될 것이 요구되고 있다. 또한, 현재까지 허혈성 뇌졸중으로부터 신경세포를 보호하려는 목적으로 개발된 약물들은 뇌졸중에 의해 유발되는 세포사멸 경로 증 특정부위만을 차단하여 효과를 보려 하고 있으나, 뇌졸중에 의한 신경세포사멸은 다양한 경로를 통해 이루어지기 때문에 근본적인 해결책을 제시하지 못하고 있다. 따라서, 허혈성 뇌졸중에 관여하는 여러 인자들을 동시에 조절함으로써 뇌신경세포의 사멸을 최소화하는 표적 치료법이 요구되고 있다.

텔로미어 (telomere)는 염색체의 말단에 반복적으로 존재하는 유전 물질로서, 해당 염색체의 손상이나 다른 염색체와의 결합을 방지한다고 알려져 있다. 세포가 분열할 때마다 텔로미어의 길이는 조금씩 짧아지는데, 일정한 횟수 이상의 세포 분열이 있게 되면 텔로미어는 매우 짧아지고, 그 세포는 분열을 멈추고 죽게 된다. 반면 텔로미어를 길게 하면 세포의 수명이 연장된다고 알려져 있으며, 그 예로 암세포에서는 텔로머라제 (telomerase)라는 효소가 분비되어 텔로미어가 짧아지는 것을 막기 때문에, 암세포가 죽지 않고 계속 증식할 수 있다고 알려져 있다. 텔로머라제 유래 펩티드인 PEP1은 췌장암을 비롯한 다양한 암에 대한 항암제로 개발되어 왔지만, 그간 항암 효과 이외에도, 항염, 항산화, 세포투과성 및 세포 내 주요 신호전달 과정에 관여하는 것으로 밝혀졌으며, PEP1의 이러한 세포 내 기능들에 착안하여 기존 항암제로서의 용도 이외에 새로운 적응증에 대한 활용가능성이 탐구되어 왔다. 본 발명자들은 텔로머라제로부터 유래되는 펩티드가 뇌신경 질환을 일으키는 염증작용을 억제하는 것을 기작을 나타내며 신경세포 손실 예방 및 재생에 효과적임을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다. 보다 구체적으로, 본 발명에서는 알츠하이머 동물 모델 시험을 통해서 PEP1이 알츠하이머 질환의 발병 원인으로 추정되고 있는 베타 아밀로이드의 응집 형성을 감소시키고, 타우 단백질의 과인산화로 인해 형성되는 신경원섬유매듭을 감소시키는 결과를 확인하였다. 아울러, 본 발명에서는 다양한 신경세포 마커의 발현량을 통해서 PEP1이 신경세포의 분화 및 증식에 긍정적인 효과를 나타내고 있음을 확인하였다.

본 발명의 일측면에서, 서열 번호 1의 펩티드 (PEP1), 서열번호 1의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제, 구체적으로 인간(Homo sapiens) 텔로머라제에서 유래한 펩티드를 포함한다.

본 명세서에 개시된 펩티드는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 펩티드는, 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그 단편들과 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산이 변화된 펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 아미노산 변화는 펩티드의 물리화학적 특성이 변경되도록 하는 성질에 속한다. 예를 들어, 펩티드의 열안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변경시키고, 최적의 pH를 변화시키는 등의 아미노산 변화가 수행될 수 있다.

본 명세서에서 "아미노산"이라 함은 자연적으로 펩티드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 일측면에서 펩티드는 D-아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있다. 한편, 본 발명의 다른 측면에서 펩티드는 번역 후 변형 (post-translational modification)된 비표준 아미노산 등을 포함할 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화 (phosphorylation), 당화 (glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화 (acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화 (palmitoylation)를 포함), 알킬화 (alkylation), 카르복실화 (carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응 (glycation), 비오티닐화 (biotinylation), 유비퀴티닐화 (ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화 (예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화 (예컨대, 이황화물 브릿지의 형성) 를 포함한다. 또한, 펩티드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제 (crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다.

본 명세서에 개시된 펩티드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩티드일 수 있다. 한편, 본 명세서에 개시된 펩티드는 서열번호 1의 단편들인 펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수 있다. 인공 변이체에서 뿐만 아니라 야생형 폴리펩티드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩 (folding) 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 보존성 치환의 예들은 염기성 아미노산 (아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산 (글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산 (글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산 (루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산 (페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산 (글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)의 군의 범위 내에 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly, 그리고 이들과 반대인 것들이다. 보존적 치환의 다른 예는 다음 표와 같다.

원래 아미노산	예시적인 잔기 치환	바람직한 잔기 치환
Ala (A)	val; leu; ile	Val
Arg (R)	lys; gln; asn	Lys
Asn (N)	gln; his; asp, lys; arg	Gln
Asp (D)	glu; asn	Glu
Cys (C)	ser; ala	Ser
Gln (Q)	asn; glu	Asn
Glu (E)	asp; gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	Arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; norleucine	Leu
Leu (L)	norleucine; ile ; val; met; ala; phe	Ile
Lys (K)	arg; gln; asn	Arg
Met (M)	leu; phe; ile	Leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	tyr; phe	Tyr
Tyr (Y)	trp; phe ; thr; ser	Phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; norleucine	Leu

펩티드의 생물학적 특성에 있어서의 실재적인 변형은 (a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면 시트 또는 나선 입체 구조를 유지하는데 있어서의 이들의 효과, (b) 표적 부위에서의 상기 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는데 있어서의 이들의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어서의 이들의 효과가 상당히 상이한 치환부를 선택함으로써 수행된다. 천연 잔기는 통상의 측쇄 특성에 기준하여 다음 그룹으로 구분된다:

(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또다른 부류로 교환함으로써 이루어질 것이다. 펩티드의 적당한 입체 구조를 유지하는 것과 관련이 없는 어떠한 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 상기 분자의 산화적 안정성을 향상시키고 이상한 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 상기 펩티드에 가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다.

펩티드의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변화된 것이다. 변화란 의미는 펩티드에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 펩티드 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 나타낸다.

펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된 것이다. N-연결된이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.

펩티드로의 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 언급된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 수행된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 이러한 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 최초 항체의 서열에 부가하거나 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).

또한 본 발명의 일측면에 따른 서열 번호 1의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 세포 내 독성이 낮고, 생체 내 안정성이 높다는 장점을 가진다. 본 발명에서의 서열번호 1은 텔로머라제 유래 펩티드로서 하기와 같이 16개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다.

서열 번호 1에 기재된 펩티드는 아래 표 2과 같다. 아래 표 2의 "이름"은 펩티드를 구별하기 위해 명명한 것이다. 본 발명의 일측면에서, 서열 번호 1에 기재된 펩티드는 인간 텔로머라제의 전체 펩티드를 나타낸다. 본 발명의 다른 일측면에서, 서열 번호 1의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제에 포함된 펩티드 중 해당 위치의 펩티드를 선별해 합성한 "합성 펩티드"를 포함한다. 서열번호 2는 전체 텔로머라제의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

본 발명의 일측면에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 (comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 신경세포 손실 예방 및 재생 효능을 가지는 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 따른 신경세포 손실 예방 및 재생 효능을 가지는 약학 조성물은 일측면에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 (comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 0.01 mg/mL 내지 100 mg/mL, 바람직하게는 0.1 mg/mL 내지 10 mg/mL의 농도로 포함할 수 있으나 치료대상별로 용량에 따른 효과의 차이를 보이는 경우 이를 적절히 조절할 수 있다. 상기 범위 또는 그 이하의 범위로 포함하는 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐만 아니라, 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 포함하는 것이 적절할 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물은 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함하는 모든 동물에 적용될 수 있다.

본 발명의 일측면에서 조성물은 서열번호 1 의 아미노산 서열을 포함하는 (comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 신경세포 손실 예방 및 재생 효능을 가지는 펩티드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내, 피내 또는 피하 등으로, 바람직하게는 복강 내, 피내, 혈관 또는 피하로, 보다 바람직하게는 피하로 투여될 수 있다.

경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 당업계의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물의 유효 성분은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어, 0.0001 mg/kg/일 내지 100 mg/kg/일, 바람직하게는 0.001 mg/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 더 바람직하게는 0.001 mg/kg/일 내지 1 mg/kg/일이 될 수 있으나, 용량에 따른 효과의 차이를 보이는 경우 이를 적절히 조절할 수 있다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 1일 1회 내지 3회 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물의 유효 성분의 투여 용량 및 투여 간격의 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 예를 틀어, 투여 용량은 0.01 mg 내지 200 mg, 바람직하게는 0.1 mg 내지 5 mg, 더 바람직하게는, 0.4mg 내지 1.2mg, 보다 더 바람직하게는 0.4 mg, 0.56 mg, 또는 1.12 mg이 투여될 수 있으며, 투여 간격은 매 1주 내지 4주마다 1회씩 총 4회 이상, 바람직하게는 매 1주 내지 2주마다 1회씩 총 6회 내지 26회가 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일측면에서 조성물은 서열번호 1 의 아미노산 서열을 포함하는 (comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 액제, 고형 제제 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적으로만 의도된 것이지 본 발명을 한정하고자 하는 의도가 아니다. 명사 앞에 개수가 생략된 용어는 수량을 제한하고자 하는 것이 아니라 언급된 명사 물품이 하나 이상 존재하는 것을 나타내는 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 열린 용어로 해석된다 (즉, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"의 의미).

수치의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 수치들을 개별적으로 언급하는 것을 대신하는 쉬운 방법이기 때문이며, 그것이 아님이 명시되어 있지 않는, 각 별개의 수치는 마치 개별적으로 명세서에 언급되어 있는 것처럼 본 명세서에 통합된다. 모든 범위의 끝 값들은 그 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합 가능하다.

본 명세서에 언급된 모든 방법들은 달리 명시되어 있거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 어느 한 실시예 및 모든 실시예 또는 예시적 언어 (예컨대, "~과 같은")를 사용하는 것은, 청구범위에 포함되어 있지 않는 한, 단지 본 발명을 더 잘 기술하기 위함이지 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 어떤 비청구된 구성요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 해석되어서는 아니된다. 다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구체예들은 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 최적의 모드를 포함한다. 바람직한 구체예들의 변이들이 앞선 기재를 읽으면 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 그러한 변이를 적절히 이용하길 기대하고, 발명자들은 본 명세서에 기재된 것과 다른 방식으로 본 발명이 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은, 특허법에 의해 허용되는 것과 같이, 첨부된 특허청구범위에서 언급된 발명의 요지의 균등물 및 모든 변형들을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변이들 내에서 상기 언급된 구성요소들의 어떤 조합이라도 여기서 반대로 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 예시적인 구체예들을 참조하여 구체적으로 나타내어지고 기술되었지만, 당업자들은 하기 청구범위에 의해 정의되는 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서도 형태 및 디테일에서 다양한 변화가 행해질 수 있음을 잘 이해할 것이다 .

이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 펩티드의 합성

1. 펩티드의 합성

서열번호 1의 펩티드 (이하 "PEP1"이라 함)를 종래에 알려진 고상 펩티드 합성법에 따라 제조하였다. 구체적으로, 펩티드들은 ASP48S (Peptron, Inc., 대한민국 대전)를 이용하여 Fmoc 고상 합성법 (solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통해 C-말단부터 아미노산 하나씩 커플링함으로써 합성하였다. 다음과 같이, 펩티드들의 C-말단의 첫 번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

NH₂-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin

NH₂-Ala-2-chloro-Trityl Resin

NH₂-Arg(Pbf)-2-chloro-Trityl Resin

펩티드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-term이 Fmoc으로 보호 (protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu (t-butylester), Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sμfonyl) 등으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, Trt-Mercaptoacetic acid.

커플링 시약(Coupling reagent)으로는 HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] /NMM [4-Methylmorpholine] 를 사용하였다. Fmoc 제거는 20%의 DMF 중 피페리딘 (piperidine in DMF)을 이용하였다. 합성된 펩티드를 Resin에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 절단 칵테일 (Cleavage Cocktail) [TFA (trifluoroacetic acid) /TIS (triisopropylsilane) / EDT (ethanedithiol) / H₂O=92.5/2.5/2.5/2.5] 를 사용하였다.

아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상태를 이용하여 여기에 해당 아미노산들을 각각 반응시키고 용매로 세척한 후 탈보호하는 과정을 반복함으로써 각 펩티드를 합성하였다. 합성된 펩티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고, 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다.

본 실시예에 사용된 펩티드에 대해 고성능 액체 크로마토그래피 결과, 모든 펩티드의 순도는 95% 이상이었다.

펩티드 PEP1 제조에 관한 구체적인 과정을 설명하면 다음과 같다.

1) 커플링

NH₂-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin 에 보호된 아미노산 (8당량)와 커플링 시약 HBTU (8당량)/HOBt (8당량)/NMM (16당량) 을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

2) Fmoc 탈보호

20%의 DMF 중의 피페리딘(piperidine in DMF) 을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

3) 1과 2의 반응을 반복적으로 하여 펩티드 기본 골격 NH₂-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-chloro-Trityl Resin)을 만들었다.

4) 절단 (Cleavage): 합성이 완료된 펩티드 Resin에 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) 을 가하여 펩티드를 Resin에서 분리하였다.

5) 얻어진 혼합물에 냉각 디에틸 에테르를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 펩티드를 침강시킨다.

6) Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 파우더로 제조하였다.

실시예 2: 실험 준비 및 재료

실시예 2-1: 신경줄기세포와 1차 피질신경의 세포 배양과 처리

동물에 관한 모든 절차는 한양대학교 실험동물 가이드라인에 따라 진행하였다. 모든 실험은 동물의 개체 수와 고통을 최소화 하였으며, 모든 동물은 한번만 사용되었다.

신경줄기세포는 쥐 배아의 뇌로부터 분리되었고, 배양 및 확장시켰다. 신경줄기세포 배양은 다음과 같이 언급된 방식대로 진행하였다. 간단하게 설명하자면, 랫 (rat) 배아는 배아기 13일째에 얻었고, 뇌를 재빠르게 제거하였고, 차가운 생리식염인산상충액(HBSS)이 담긴 페트리 디쉬에 놓였다.

태아의 랫의 대뇌피질, 외부신경절돌기, 배의 중간뇌로부터 단일세포로 분리하였다. 이 세포는 칼슘, 마그네슘이 없는 생리식염인산상충액 (PBS)에 L-오르니틴과 파이브로넥틴으로 전처리 코팅된 디쉬에 cm²당 20000개의 밀도로 세포를 담았다. 그리고 N2 배지 (DMEM F/12, 4.4nM 인슐린, 100 mg/L 트렌스페린, 30 nM 셀레나이트, 0.6M 푸트레신, 20 nM 프로게스테론, 0.2mM 아스코빅 산, 2 nM L-글루타민, 8.6 mM D(+) 글루코즈, 20 nM 탄산수소나트륨)에 배양하였다. 배양은 가습 5% 이산화탄소 상태에서 4~6일동안 37°C에서 유지하였다.

신경줄기세포 분화는 bFGF (10ng/ml)가 빠진 N2 배지로 세포 배지를 변화시켜 유도되었고, 이 배지는 매일 교체하였다.

신경줄기세포를 6개의 샘플로 나눈 후, 적정한 농도를 알아보기 위해 샘플에 0, 2.5, 5, 20, 40 μM Aβ_25-30 올리고머를 48시간 동안 처리하였다. Aβ_25-30 의 수용성 올리고머 형태는 다음과 같이 알려진 레포트에서 처럼 준비하였다. 간단하게 설명하자면, Aβ_25-30는 헥사플로로아이소프로판올을 이용하여 1 mM 농도가 되게 녹였다. 그리고 멸균된 초미세원심분리기 튜브를 이용하여 분주하였다. 헥사플로아이소프로판올은 진공건조시스템을 이용하여 제거하였고, 펩타이드필름은 -20℃에서 저장 및 건조하였다. 올리고머를 준비하기 위해, 펩타이드는 건조된 디메틸설포사이드로 5mM 농도가 되게 섞어주었다. 그리고 Ham's F-12 배지에 최종 농도가 1 mM이 되도록 넣어주었다. 이러한 과정으로 4℃에서 24시간 동안 배양하였다.

신경줄기세포에서 PEP1의 효과를 알아보기 위해, PEP1을 0, 1, 10, 50, 100, 200 μM의 다양한 농도로 48시간 처리하였다. Aβ_25-30유도된 신경독성에 대한 PEP1의 효과를 알아보기 위해, 신경줄기세포에 PEP1을 0, 1, 10, 50, 100μM의 다양한 농도와 20 μM Aβ_25-30 를 48시간 처리하였다. 플레이트를 조심히 생리식염인산상충액 (PBS)로 여러 번 씻었고, 세포 생존능력을 Cell counting kit-8 (CCK-8)과 MTT 그리고 락테이드 디하이드로게네이즈 (LDH)를 이용하여 측정하였다.

PEP1의 메커니즘에서 PI3K/AKT 신호전달체계의 역할을 알아보기 위해, 신경줄기세포에 PI3K 억제제인 LY294002를 50 μM PEP1과 20 μM Aβ25-30 를 처리하기 전 1시간 동안 처리하였다. 신경줄기세포는 다음의 4개의 군으로 나누었다: 대조군(1군), 20 μM의 Aβ_25-35을 48시간동안 처리한 군(2군), 20 μM의 Aβ_25-35을 50 μM PEP1과 함께 48시간 동안 처리한 군(3군), 10 μM LY294002과 20 μM의 Aβ_25-35을 50 μM PEP1과 함께 48시간 동안 처리한 군(4군).

1차 배양 피질신경은 배아기 16일째 태아 랫의 대뇌피질 (cerebral cortex)로부터 얻었다. 간단하게 설명하자면, 랫으로부터 뇌를 재빠르게 제거하였고, 차가운 생리식염인산상충액이 (HBSS) 담긴 페트리 디쉬에 놓였다. 단일세포는 대뇌피질로부터 분리되었고, 폴리-L-라이신이 미리 코팅된 직경 100mm 코닝디쉬에 넣거나, 유리 커버스립 (coverslip)은 6-, 24-웰 플레이트에 넣었다. 이 배양은 DMEM (높은 글루코즈)에서 배양되었다.

세포를 넣은 후 이틀 뒤에, 신경세포가 아닌 세포들은 5μM 싸이토신 아라비오사이드를 24시간 처리하여 제거하였다. 성숙한 배양물 (시험관 내에서 7일)만이 실험에 사용되었다. 신경세포의 집단은 1차 피질의 뉴런부터 79.7% 정도 수득되었다.

인간 신경 줄기세포 (H9 hESC-derived, GIBCO)는 5x10⁴ cells/cm²밀도로 Ca2+/Mg2+ 가 있는 D-PBS에 녹인 CELLStart (GIBCO)로 미리 코팅되어있는 배양 디쉬에 플레이팅 되었고 StemPro NSC SFM 배지 (KnockOut DMEM/F-12, 2 mM GlutaMAXsupplement, 2% StemPro neural supplement, 20 ng/mL 기본 FGF 재조합단백질, 및 20 ng/mL EGF 재조합단백질)에서 배양되었다. 배양 배지는 37℃를 유지하며 습기가 있는 5% CO₂ 대기에서 4내지 6일간 수행되었다.

실시예 2-2: 세포 생존능력을 측정하기 위한 CCK-8 과 LDH 분비 검사법

WST-8 (2-[2-메톡시-4-니트로페닐]-3-[4-니트로페닐]-5-[2,4-디술포페닐]-2H-테트라졸리움, 모노소듐염)과 PMS (1-메톡시페나지니움 메틸설페이트)를 결합하여 살아있는 세포를 셀 수 있는 방법인 CCK-8을 사용하였다. 간단하게 설명하자면, 세포가 있는 96-웰 플레이트에 10 μL 키트 시약을 넣고 3시간 동안 배양하였다. 세포 생존능력은 흡광도 450 nm 측정을 통해 관찰하였다. 모든 결과는 세포가 없는 웰을 기준으로 정규화 하였다. 비색분석법은 배양된 신경줄기세포의 LDH 양을 측정하기 위해 사용하였다. 세포 생존능력은 흡광도 490 nm, 참고 흡광도 690 nm을 이용하여 측정하였다. 모든 결과는 세포가 없는 웰을 기준으로 정규화하였다.

실시예 2-3: 브로모데옥시유리딘 세포 분열 측정법

신경줄기세포는 농도별 PEP1과 20 μM Aβ_25-30을 48시간 처리하였다. 이 후, 신경줄기세포는 브로모데옥시유리딘 (BrdU)가 라벨된 배지에서 5시간 배양한 후 키트를 이용하여 관찰하였다. 세포 분열은 흡광도 370 nm, 참고 흡광도 492nm을 이용하여 관찰하였다. 모든 결과는 세포가 없는 웰을 기준으로 정규화 하였다.

실시예 2-4: 집락형성단위 측정법 (CFU)

CFU 측정법은 다음과 같은 방법을 통해 진행하였다. 간단하게 설명하자면, 신경줄기세포는 0.25x10⁵으로 6-웰 플레이트에 넣었고 20 μM Aβ_25-30 과 PEP1을 1, 10, 50 μM 농도로 48시간 처리하였다. 세포는 DPBS로 씻은 후, 세포배지로 교환해 줌. 14일 후에 세포는 다시 한번 DPBS로 씻은 후, 메탄올에 녹인 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 30분 동안 상온에서 염색하였다. 염색 후에 플레이트를 DPBS로 씻은 후 건조시켰다. 콜로니 개수는 해부현미경을 통해 관찰하였고, 콜로니 중 2 mm이하, 희미하게 염색된 부분은 제거하였다.

실시예 2-5: 세포사멸을 관찰하기 위한 TUNEL 염색법

신경줄기세포를 콜라겐이 코팅된 직경 13mm 글라스 커버슬립에 넣고 다음과 같은 조건으로 나누어 진행하였다. 1) Aβ_25-30 와 PEP1을 처리, 2) 20 μM Aβ_25-30 만 처리 3) 20 μM Aβ_25-30 와 농도별 PEP1 (1, 10, 50, 100 μM) 각 조건으로 48시간 처리하였다.

세포를 PBS로 씻어준 뒤 4% 파라포름알데하이드로 20분간 고정시켰다.

TUNEL 염색법은 세포 사멸을 확인하기 위해 사용되는 방법이다. 온전하고, 응축되고, 조각난 핵을 관찰하기 위해, TUNEL 염색이 끝난 세포는 핵을 염색하기 위해 20분간 100 μg/ml DAPI 를 처리 하고 DAPI가 섞인 마운팅배지가 있는 글라스슬라이드에 올렸다.

세포는 형광현미경 상에서 관찰하였고 DAPI와 TUNEL이 해당하는 자극형광파장에서 관찰하였다.

실시예 2-6: 세포이동관찰법

세포이동관찰법은 QCM-24웰 세포이동법 키트를 이용하였다. 간단하게 설명하자면, 20 μM Aβ_25-30 와 농도별 PEP1 (1, 10, 50 μM)을 아래쪽 챔버에 넣고 위쪽 챔버에는 3x10⁵의 신경줄기세포를 37℃에서 24시간 배양하였다. 신경줄기세포는 막 쪽으로 이동하였고, 이동된 세포수를 관찰하기 위해 염색을 한 후, 흡광도 560nm 에서 관찰하였다.

실시예 2-7: PEP1이 신경줄기세포로 침투하는 과정 확인

신경줄기세포는 웰당 1x10⁵ 개의 밀도로 넣어주었다. 세포에 20μM Aβ_25-30 를 노출시키고 대조군과 함께 1 μM의 FITC가 라벨된 PEP1을 0~24시간 처리 후, 미토콘드리아와 세포막에 염색된 것을 관찰한다. 미토콘드리아 염색은 100 nM 의 MitoTracker Red FM으로 37℃에서 10분간 염색하였고, 세포막염색은 1μM Cell Traker CM-Dil를 37℃에서 5분간 염색하였다. 염색이 끝난 후 세포는 세포 배지로 씻고, 2% 파라포름알데하이드로 상온에서 15분간 고정시켰다. 이후 PBS로 여러 번 씻어 준 후 DAPI가 있는 마운팅배지가 있는 글라스 슬라이드에 샘플을 올렸다. 세포는 형광현미경에서 관찰하였고, 적절한 자극파장을 사용하였다.

실시예 2-8: 활성산소 생성의 관찰

신경줄기세포를 20 μM Aβ_25-30를 48시간동안 처리하고, 활성산소를 측정하기 위해 DCFH-DA를 15분간 염색하였다. 신경줄기세포에 농도별 PEP1과 20 μM Aβ_25-30를 48시간 처리하였다. 배양 후 10 μM DCFH-DA를 사용하여 37℃ 15분간 염색하였고, 세포를 PBS로 3번 씻었다. DCFH-DA는 자유롭게 세포막을 통과하고 세포내의 에스터레이즈에 의해 DCF 로 분해된다. 그러므로 DCF 형광값은 세포내 하이드로젠퍼옥사이드(ROS)의 레벨을 의미한다. DCF의 축적은 흡광도 490nm와 참고 흡광도 690nm을 가지고 리더기를 통해 관찰하였다. 유세포분석은 Accuri C6 유세포분석기로 관찰하고 분석하였다.

Aβ_25-30 와 PEP1이 활성산소 (ROS)에 어떠한 영향을 미치는 지 알아보기 위해 세포가 없는 방식인 셀프리 방식으로 DHBA 양을 측정하여 관찰하였다. 이 방법은 20 μM Aβ_25-30및 농도별 PEP1 (0, 1, 10, 50 μM)이 포함된 튜브에서 HPLC를 통해 DHBA양을 관찰하는 방식으로 진행되었다.

실시예 2-9: 미토콘드리아의 산화적 DNA 손상 관찰법

미토콘드리아의 산화적 DNA 손상관찰법은 8-OHdG ELISA 키트를 이용하여 관찰하였다. 미토콘드리아 DNA는 Genomic DNA 분리 키트를 이용하여 DNA를 얻었다. 샘플과 대조군에 8-OHdG 단일항체를 넣고 해당하는 HRP가 붙은 2차 항체를 넣어주었다. 샘플은 8-OHdG를 사용하여 정량하였고, 흡광도 450nm 를 사용하여 관찰하였다.

실시예 2-10: 미토콘드리아 세포막전위 측정법

신경줄기세포를 96-웰 플레이트에 웰당 5x10⁵개의 밀도로 넣어주었다. 세포에 20 μM Aβ_25-30 와 농도별 PEP1 (1, 10, 50 μM)을 넣어 37℃에서 48시간 처리하였다.

미토콘드리아 세포막전위는 JC-1 미토콘드리아 세포막전위 관찰 키트를 이용하여 측정하였다. 미토콘드리아 세포막전위는 ELISA 리더기를 이용하여 관찰하였다. 건강한 세포는 로다민 파장과 텍사스레드 파장에서 관찰하여, 대부분 JC-1이 뭉쳐있는 것을 확인하였다. 사멸된 세포나 건강하지 않은 세포의 경우 FITC 파장에서 관찰하여, JC-1 이 모노머 상태인 것을 확인하였다.

실시예 2-11: 아네노신 트리포스페이트 측정법

아데노신 트리포스페이트 (ATP) 농도는 ATP 측정 키트를 이용하여 관찰하고 ELISA 리더기를 이용함. ATP농도는 자극/배출 파장 535/587 nm 에서 관찰하였다.

실시예 2-12: 단백질체학

단백질 샘플 준비

배양된 신경줄기세포를 차가운 PBS로 2번 씻어준 후, 샘플 라이시스 버퍼와 소니케이터를 이용하여 10초간 세포를 파쇄하였다. 그리고 추가로 1시간 동안 상온에서 세포를 파쇄하였다. 15℃ 1시간동안 15000g 에서 원심분리 후, 비수용성 샘플은 제거하고, 수용성 샘플만 2차원 전기영동에 사용하였다. 단백질 농도는 브래드포드 방법을 통해 정량하였다.

2차원 폴리아크릴아마이드 전기영동

Immobiline DryStrip 젤에 200 μg의 단백질 샘플을 걸어주었다. 전자초점은 20℃에서 진행하였다. 전자초점을 위해서, 샘플이 젤 안으로 들어가게 하기 위해 전압을 3시간이 넘도록 150에서 3500볼트로 증가시켰다. 2차원으로 들어가기 전에, 샘플을 10분동안 평형버퍼에 배양하였다. 평형버퍼에 담긴 샘플은 SDS-PAGE 젤 안으로 들어가는데, 호퍼 2D시스템을 이용하여 관찰하였고 조건은 20℃에서 1700 포를 이용하였다.

이미지 분석

정량분석을 위해 PDQuest 시스템을 이용하여 관찰하였다. 각 스팟의 양을 측정하기 위해 전체의 스팟으로 정량화하였다. 단백질의 스팟은 2배 이상 증가된 것으로 선택하였다.

펩타이드 질량 지문법

펩타이드 질량 질문법을 통해 단백질을 확인하기 위해 단백질 스팟을 잘라, 트립신으로 녹인 후, α-cyano-4-hydroxycinnamic acid in 50% acetonitrile/0.1% TFA로 잘 섞은 후 말디토프로 분석을 하였다.

스펙트럼은 스펙트럼당 300 장으로부터 얻었고, 트립신을 이용한 자동 분해 피크를 이용하여 교정을 하였다. 피크 리스는 Flex분석 시스템을 통해 교정하였다. 피크를 고르기 위해 한계점을 다음과 같은 방법으로 시행하였다. S/N을 위해 모노아이소토픽 질량의 최소한의 해상도를 선택하였다. 분석프로그램인 MASCOT 로 관찰하여 질량지문법으로 이용하여 발견된 단백질을 확인함. 데이터베이스 검색에 사용된 파라미터는 다음과 같다: 분해 효소인 트립신, 놓쳐진 분해의 최대값, 완성된 변화의 값 Cys, 부분 변화의 값, Met, 모노아이소토픽 질량, 질량의 관용.

펩타이드 질량 지문법은 개연성있는 단백질점수에 따라 분류하였다.

실시예 2-13: 항체 마이크로어레이

항체 마이크로어레이는 파노라마 항체 마이크로어레이 세포 신호전달 키트를 이용하여 관찰하였다. 간단하게 설명하자면, 1.5x10⁷ 세포를 100mm 디쉬에 넣고, 20 μM Aβ_25-35 와 10 μM PEP1을 48시간 동안 처리하였다. 세포를 모아 단백질 세포를 준비하였다. 단백질 샘플은 Cy3, Cy5로 라벨 시키고 항체 마이크로어레이를 수행하였다. 어레이 슬라이드는 스캐너를 통해 읽었고, 스캔본을 가지고 분석프로그램을 이용하여 분석하였다.

실시예 2-14: 웨스턴블랏 및 면역염색

웨스턴블랏에는 다음의 항체를 사용하였다: Ki67 (1:200 abcam), P85a (1:1000, milipore), pAKT (ser 473, 1:500, Cell signaling), GSK-3b (ser 9, 1:1000. Santa cruz biotech), HSTF-1 (1:1000, Santa Cruz), anti-B cell lymphoma-2 (1:1000, Cell signaling), HMGB-1 (1:500, cell signaling), Bax (1:1000, cell signaling), Cytosolic cytochrome C (1:200,cell signaling), Cleaved caspase3 (Asp175, 1: 1000, cell signaling), c-Myc (1: 1000, cell signaling), GFP (1: 1000, cell signaling), hTERT (1:500, santa cruz), rTERT (1:500, santa cruz) .

세포 내 신호전달 체계를 확인하기 위해 웨스턴블랏을 48시간 처리 후에 진행하였다.

미토콘드리아와 세포질 내 단백질을 얻기 위해 미토콘드리아/세포 내 분리키트를 이용하였다(Abcam). 모든 블랏은 ECL솔루션을 이용하여 관찰하였고, 관찰된 이미지는 분석 프로그램을 이용하여 분석하였다.

면역염색의 경우 세포내의 발현과 위치를 확인하기 위해 진행하였다. 면역염색에는 다음의 항체를 사용하였다: Ki67 (1:100 abcam), rabbit antidoublecortin (1 mg/mL; Abcam), rabbit anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) (1:5000; Abcam), rabbit anti-Tuj1 (1 mg/mL; Abcam), mouse anti-GalC (1 mg/mL; Millipore), and rabbit anti-HMGB1 (1:100; Cell Signaling).

데이터는 올림푸스 형광현미경으로 관찰하였고, 적절한 형광을 사용하였다.

실시예 2-15: 아넥신-5, 프로피디움 아이오다이드 관찰법 (세포사멸을 보기 위한 실험법)

아넥신-5 및 프로피디움 아이오다이드 관찰법은 FITC 아넥신 5 세포사멸 키트를 이용하여 진행하였다. 간단하게 설명하자면, 채집한 대뇌피질에 20 μM Aβ_25-35 와 농도별 PEP1 (1, 10, 50 μM)을 처리한 후 각각 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 세포를 차가운 PBS로 두 번 씻어 준 후, 1x 바인딩버퍼로 섞어주었다. 이 후 100 μL 안에 1x10⁵ 개의 세포를 1.5ml 튜브에 넣은 후 FITC 라벨된 아넥신-5 5μL 와 10 μL 프로피디움 아이오다이드를 넣었다. 상온에서 15분동안 배양한 후, 400 μL 바인딩버퍼를 넣고 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다.

실시예 2-16: 텔로머레이즈 역전사효소 과발현

플라스미드 벡터

hTERT-GFP간 벡터와, 셔틀벡터를 오리진 테크놀로지에서 구입하였다.

네온 유전자 도입

사람줄기세포 (H9 hESCs, GIBCO)를 유전자 도입을 하기 위해 준비하였다. 단일세포로 분리 한 후 네온버퍼-R 20μL과 함께 섞었다. 직류고전압을 주어 유전자 도입을 시도하는 전기천공(electroporation)을 하기 위해, 세포와 1ug의 TERT를 멸균된 튜브에 넣었다. 네온팁을 네온 파이펫 안으로 넣은 후, DNA와 세포 혼합체를 팁 안으로 방울이 생기기 않게 밀어 넣었다. 네온파이펫은 3 mL 의 네온전기분해 버퍼 E가 있는 네온튜브에 삽입시켰다. 1300 볼트로 한번에 전기 충격을 주었다. 충격 후 세포를 빠르게 StemPro NSC SFM에 Cell -star가 코팅된 배양 플레이트에 옮겨 담았다.

실시예 2-17: 통계분석

모든 데이터는 각각의 실험을 5회 진행하여 통계 분석을 진행하였고, P-밸류 값이 0.05 미만일 경우 유의적인 실험값이라고 판단하였다.

실시예 3: 세포 단계에서 PEP1의 신경 손상 방지 및 재생 효과 분석

실시예 3-1: Aβ _25-35 및 PEP1의 신경 줄기 세포의 생존 능력, 증식 및 이동에 대한 영향 평가

본 연구자들은 농도별 Aβ_25-35(0, 2.5, 5, 10, 20, 40 μM)를 48 시간 동안 신경줄기세포에 처리하여 신경줄기세포의 생존 능력, 증식 및 이동에 대한 영향을 확인하였다. 세포 생활성은 CCK-8, MIT 및 LDH 어세이로 측정하였다. 아울러, 신경줄기세포의 증식을 BrdU 및 CFU 어세이로 평가하였다. Aβ_25-35 로 처리한 후, 세포 생존 능력 및 증식이 농도 의존적 방식으로 현저하게 감소하였다. 그러나, 증식은 생존 능력에서 보다 낮은 농도의 Aβ_25-35에서 감소되었다 (도 1 참조).

본 연구자들은 PEP1 단독의 신경줄기세포에 대한 영향을 연구하기 위하여 농도별 PEP1 (0, 1, 10, 50, 100, 200 μM)으로 신경줄기세포를 처리하였다. 세포 생존 능력 및 증식은 CCK-8 및 BrdU 어세이에서 측정된 바와 같이, 100μM까지의 농도에서 영향을 받지 않았다 (도 2 참조).

Aβ에 의해 유도되는 스트레스 환경 하에서 PEP1의 신경줄기세포에 대한 영향을 평가하기 위해서, 신경줄기세포를 20μM Aβ_25-35에 48 시간 동안 노출시키고, 농도별 PEP1 (0, 1, 10, 50, 100 μM)으로 동시에 처리하였다. 신경줄기세포의 생존 능력을 MTT, CCK-8 및 LDH 분석으로 측정하고, BrdU 및 CFU 어세이로 증식을 측정하였다. 20μM Aβ_25-35 만으로만 처리한 신경줄기세포와 비교하여, 20μM Aβ_25-35과 PEP1 공동처리 (100 μM까지)는 농도 의존적 방식으로 신경줄기세포 생존능력 및 증식을 점진적으로 증가시켰다 (도 3 내지 도 6 참조).

DAPI 및 TUNEL 염색을 사용하여 Aβ으로 유도된 신경줄기세포의 세포사멸에 대한 PEP1의 영향을 측정하였다. 백분율로 나타낸 신경줄기세포의 세포사멸 정도는 20μM Aβ_25-35을 사용하여 48 시간 동안 처리하였을 때 현저하게 증가하였지만 (p<0.01), PEP1의 공동 처리 (100 μM까지)에 의하여 현저하게 감소하였다 (p<0.05) (도 7 내지 도 8 참조)(도 7에서 밝은 부분이 TUNEL 염색 신경줄기세포).

줄기 세포의 중요한 특징인 줄기 세포 이동성이 Aβ 및 PEP1에 의한 영향을 받는지 조사하기 위해, 신경줄기세포를 20μM Aβ_25-35 및 농도별 PEP1 (0, 1, 10, 50 μM)으로 48 시간 동안 처리하였다. 이어서, 이동 분석 키트를 사용하여 이동 능력을 평가하였다. 20μM Aβ_25-35 에 의한 처리는 신경줄기세포의 이동 능력을 감소시켰지만, 다양한 농도의 PEP1 처리는 효과적으로 이동을 회복시켰다 (도 9 참조).

실시예 3-2: 신경 줄기세포 중으로 PEP1의 투과

PEP1이 신경줄기세포를 통과하는 능력을 분석하기 위해서, 10μM 농도의 FITC-표지된 PEP1 및/또는 20μM Aβ_25-35를 사용하여 신경줄기세포를 처리하였다. 실험결과, PEP1은 정상적인 환경에서 효과적으로 신경줄기세포에 들어갔으며 주로 세포질 및 미토콘드리아에 국소화하였다. 세포 내 PEP1의 양은 시간 의존적으로 증가하였다. 그러나, 신경줄기세포가 20μM Aβ_25-35에 의한 처리로 손상되었을 때, 일부 PEP1은 핵 내로 들어가는 것으로 나타났다(도 10 내지 도 13 참조)(도10 내지 도13에서 밝은 부분이 FITC-표지된 PEP1).

실시예 3-3: Aβ _25-35 에 의한 활성산소 생성과 산화적 미토콘드리아 DNA 손상에 대한 PEP1의 효과

PEP1이 세포 내로 침투하는 능력을 관찰한 후, PEP1이 활성산호 저해효과가 나타나는지 알아보았다. Aβ_25-35에 의한 산화적 스트레스 유도하고 신경줄기세포 세포사를 PEP1이 효과적으로 저해하는 것을 고려하여, 본 발명에서는 PEP1이 항산화제 효과가 있는지 알아보았다. 그 결과, PEP1이 현저하게 Aβ_25-35에 의해 유도된 활성산소의 양을 감소시키는 것으로 나타났다 (도 14 또는 도 15 참조). 본 발명에서 Aβ_25-35의 PEP1의 ROS생산에 직접적인 효과를 한번 더 확인하고자 하였으나, 세포가 없는 조건에서 베타아밀로이드와 PEP1 은 둘 다 ROS 생산에 현저한 영향은 주지 않는 것으로 나타났다 (도 16 참조). 산화적 스트레스에 의한 미토콘드리아 DNA손상을 마찬가지로 측정하였다. 그 결과 산화적 미토콘드리아 DNA 손상은 유의적으로 Aβ_25-35를 처리하였을 때 증가하였고, PEP1을 처리하였을 때 효과적으로 산화적 미토콘드리아 DNA 손상이 감소됨을 알 수 있었다(도 17 참조).

실시예 3-4: PEP1 이 Aβ _25-35 에 의해 손상 받은 신경줄기세포 미토콘드리아에 미치는 영향

Aβ_25-35독성에 의해 손상을 받은 신경줄기세포 미토콘드리아에 대한 PEP1의 효과를 관찰하기 위해, 본 연구팀은 미토콘드리아 세포막 전위와 ATP 레벨을 측정하였음. 신경줄기세포에서 미토콘드리아 세포막전위는 Aβ_25-35에 의해 감소되었고, PEP1 은 정상범위 수치까지 세포막전위를 회복시키는 것으로 나타났다 (도 18 내지 도 20 참조). ATP 레벨은 Aβ_25-35에 의해 감소되었고, PEP1 은 유의적으로 ATP레벨을 회복시키는 것으로 나타났다(도 21 참조).

실시예 3-5: 세포 내 단백질 레벨에 대한 Aβ _25-35 와 PEP1효과

신경줄기세포에서 세포 내 단백질의 생산에 대한 Aβ_25-35와 PEP1의 효과를 알아보기 위해 단백질체학 연구를 진행하였다. Aβ_25-35에 의해 변화된 다양한 단백질의 생성과 PEP1을 처리하였을 때 회복되는 단백질을 정량화 하였다. 항체 마이크로어레이는 단백질의 인산화 패턴을 관찰하기 위해 수행되었고, 그 결과 증식과 관련된 다양한 인산화 단백질이 Aβ_25-35에 의해 감소되고 PEP1에 의해 회복되는 것으로 나타났다(도 22 내지 도 25 참조)(도 24에서 밝은 부분이 염증반응, TCA cycle, 세포이동, GPCR 등에 관련된 스팟).

본 발명의 발명자들은 웨스턴블랏과 면역염색을 통해 Aβ_25-35와 PEP1 에 의해 유도된 몇몇 단백질의 면역반응을 직접적으로 관찰하였다. 신경줄기세포에서 증식능력과 관련된 단백질인 ki67은 Aβ_25-35에 의해 감소되었지만, PEP1에 의해 농도의존적으로 증가하는 것이 나타났다. 증식과 관련된 단백질인 P85a PI3K, pAKT (Ser 473), 인산화 GSK3-3b (Ser 9), HSTF-1, 세포질 내 HMGB-1은 Aβ_25-35에 의해 감소되었지만, PEP1 에 의해 회복됨이 나타났다. 반면 사멸과 관련된 단백질인 Bax, 세포질 내 cytochrome C, cleaved caspase-3는 Aβ_25-35에 의해 증가되었고, PEP1 에 의해 유의적으로 감소되었다. 세포질 내 HMGB1의 발현은 (면역염색에서 관찰됨) Aβ_25-35에 의해 감소되었지만, PEP1을 동시에 처리할 경우 HMGB1 발현은 농도 의존적으로 회복되었다 (도 26 내지 도 30 참조)(도 30에서 밝은 부분이 HMGB-1 발현 관련 면역염색 부분).

손상 받은 뉴런의 세포 내 신호전달 단백질에 대한 PEP1의 효과를 알아본 결과, 증식과 관련된 단백질은 많이 관찰되었고, 사멸과 관련된 단백질은 적게 관찰되었다(도 31 내지 도 34 참조).

실시예 3-6: Aβ _25-35 독성에 의한 PI3K 경로를 통한 신경보호에 대한 PEP1의 효과 영향 평가

Aβ_25-35독성에 의한 PI3K 경로를 통한 신경보호에 대한 PEP1의 효과를 알아보기 위하여, 신경줄기세포는 다음의 4개 군으로 나누었다: 대조군 (1 군) 20 μM Aβ_25-35 48시간 처리군 (2 군), 20 μM Aβ_25-35 및 10 μM PEP1으로 48시간 처리군 (3 군), 10 μM LY294002를 49 시간 처리한 뒤 20 μM Aβ_25-35 10 μM PEP1을 48시간 처리군 (4 군).

실험 결과, PI3K 저해제인 LY294002로 전처리한 4군에서 신경줄기세포의 생존 능력이 3군에 비하여 약 16% 감소한 것으로 나타났으며 (도 35 참조), 이를 통해 PI3K 경로가 PEP1이 신경보호효과를 나타내는 것과 관련이 있음을 유추할 수 있었다.

실시예 3-7: Aβ_25-35 독성에 의한 신경줄기세포 분화에 대한 PEP1의 영향 평가

Aβ_25-35독성에 의한 신경줄기세포의 다양한 분화 단계별 PEP1의 영향을 평가하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 신경줄기세포의 분화를 bFGF가 없는 N2 배지로 배양배지를 바꿔주는 것으로 유도하였다. 분화 이전에 특별한 사항이 없더라도, Nestin과 Ki67의 면역반응은 분화 후에는 나타나지 않았다. 그러나 많은 수의 GFAP-양성 세포들 과 NeuN-양성 세포들은 분화 후에 증가하였다. 또한 Aβ_25-35의 처리가 신경줄기세포가 GFAP-양성 세포로 분화하는 경향을 증가시키고, NeuN-양성 세포로 분화하는 것을 감소 시키는 것으로 나타났지만, 여기에 PEP1을 처리시 반대의 효과가 나타났다(도 36 내지 48 참조)(도 36에서 밝은 부분이 Nestin, Ki67 발현 관련 면역염색 부분, 도 37에서 밝은 부분이 Nestin, GFAP, DAPI 발현 관련 면역염색 부분, 도 38에서 밝은 부분이 NeuN, DCX, DAPI 발현 관련 면역염색 부분, 도 39에서 밝은 부분이 Tuj1, DAPI 발현 관련 면역염색 부분, 도 40에서 밝은 부분이 Nestin, Ki67, DAPI 발현 관련 면역염색 부분, 도 43에서 밝은 부분이 GalC, GFAP, DAPI 발현 관련 면역염색 부분, 도 46에서 밝은 부분이 NeuN, DAPI 발현 관련 면역염색 부분).

실시예 3-8: 인간 신경줄기세포에서 hTERT 과발현에 대한 효과 평가

PEP1의 효과가 hTERT의 외부-텔로머라제 활성과 직접적으로 관련이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 인간 신경 줄기세포에서 hTERT 과발현을 유도하였다. hTERT가 과발현되었지만 인간 신경 줄기세포의 생존 능력은 유전자 도입에 의해 감소되었다. 단백질체학적 결과에서 PEP1 처리에 의하여 영향받은 유사한 단백질들이 hTERT의 과발현에 의해서도 영향을 받는 것으로 나타났다(도 49 내지 도 54 참조).

실시예 4: 동물 모델(3XTg-AD)에서 PEP1의 신경 손실 예방 및 재생 효과 분석

실시예 4-1: 실험을 위한 동물모델의 준비 및 실험 설계

알츠하이머 질환에서의 PEP1의 효력을 테스트 하기 위하여, 잭슨 실험실(Jackson Laboratory)에서 알츠하이머 형질 전환 마우스 (3XTg-AD)을 구입하였다. 이 형질전환 마우스의 유전적 특성은 다음과 같다: B6; 129-Psen1tm1Mpm Tg (APPSwe, tauP301L)1Lfa, Mmjax. 8주령의 상기 형질전환 마우스를 분양 받아, 예비 사육한 후, 형질전환 마우스의 개체수를 늘리기 위해 수컷과 암컷의 비율을 1:2로 케이지에 보관하여 약 7~8일이 지난 후 분리하고, 약 7~8주를 기다리며 임신의 여부를 관찰한다. 임신이 확인된 마우스는 1주가 지난 후 태어나며 3주동안의 이유과정을 거쳤다. 그리고 2주가 지나 성숙한 마우스를 얻을 수 있었다.

예비 사육 및 실험 전체 기간 동안 온도23±2℃, 상대습도 60±10%를 유지하였으며, 12시간의 명암주기를 지켜서 사육하였다. 실험동물은 5 군으로 구분하였으며, 각 군마다 10마리씩 배치하였다. 구분된 실험군은 다음과 같다. 1군: 생리식염수 투여, 2군: PEP1 0.01mg/kg 투여, 3군: PEP1 1mg/kg 투여, 4군: Donepezil 1mg/kg 투여 양성 대조군, 5군: 스크램블 펩티드 (16개 아미노산 길이 랜덤 펩티드) 투여.

PEP1 및 생리식염수, donepezil, 스크램블 펩티드는 12개월 때부터 두 달 동안 일주일에 3번씩 각 농도 별로 피하 주사한 후, 2달 후에 인지기능과 기억기능의 향상 정도를 알아보는 인지/기억 행동실험 (수동회피실험 및 Y maze)를 수행하였다. 그 후 뇌를 꺼내어, 해마를 분리한 후, 해마 및 뇌 전체에서의 아밀로이드 베타의 양과, 아밀로이드 베타 올리고머 및 타우의 과인산화로 인한 신경원섬유매듭(NFT, neurofibrillary Tangles)의 양을 웨스턴 블랏 방법과 면역염색방법을 이용하여 확인하였다. 또한 여러 가지 뇌 안의 PEP1에 의한 특정 단백질의 변화를 웨스턴 블랏을 통해 관찰하였다.

실시예 4-2: 해마 및 뇌전역에서 여러 단백질의 면역염색법 분석 방법

동물 행동실험을 마친 마우스 (각 군당 10 마리)에서, 마취 후에, 0.9% 생리식염수를 이용하여 마우스의 심장을 통한 재관류를 시행한 후, 다시 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)로 재관류 하여 고정시켰다. 4% 파라 (para)로 고정된 뇌를 꺼내 4% 파라포름알데히드 가 들어있는 15ml 튜브에 넣는다. 이렇게 방치한 뇌를 다음날 30% 수크로즈 (sucrose)에 넣는다. 뇌가 이 30% 수크로즈에 가라 앉을 때까지 기다린다. 고정된 조직은 O.C.T 컴파운드를 이용하여 -20℃에서 조직을 얼린다. 얼린 조직은 Cryostat를 이용하여 두께 20 μm로 자른다. 잘려진 조직절편을 0.01 M PBS와 섞여 있는 50% Ethanol을 이용하여 30분동안 처리하여 항체가 잘 조직으로 습윤하게 하였다. 0.3% 과산화수소를 10분동안 처리하여 조직에 내재해 있는 퍼옥시다제 (peroxidase) 활성을 제거 하였다. 이 조직절편을 10% 노말 세럼 (N/S, normal serum) 에 한 시간 방치하였다. 그 후 0.5% N/S에 희석된 일차 항체가 포함된 용액에 하루 동안 4℃에서 방치하였다.

면역형광염색에 사용한 일차 항체는 다음과 같다: anti-β-amyloid (D54D2) (1:100, Cell signaling, Beverly, MA, USA), anti-oligomer β-amyloid (1:100, Millipore), anti-Tau (2 μg/ml, Invitrogen), anti-NeuN (1:100, Millipore), anti-DCX (1:100, Cell Signaling), anti-Tuj1 (2 μg/ml, Abcam), anti-GFAP (1:1,000, Abcam) and anti-GalC (1:000, Millipore).

그 후 조직절편을 2차 항체가 포함된 용액에 2시간 방치하였다. 이때 사용된 2차 항체는 다음과 같다: goat-anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Molecular Probes), anti-rabbit tetramethylrhodamine (Molecular Probes), and goat-anti-mouse Alexa Fluor 488 (Molecular Probes).

조직절편을 PBS로 세 번 세척한 후 글라스 슬라이드에 올리고, DAPI가 포함된 마운팅 배지 (Vector Laboratories)를 사용하여 마운팅하였다. 그 후 형광 현미경을 사용하여 관찰하였다.

실시예 4-3: PEP1의 NeuN 발현에 대한 영향 평가

동물 행동실험을 마친 마우스(각 군당 10 마리)에서, 마취 후에, 0.9% 식염수를 이용하여 마우스의 심장을 통한 재관류를 시행하여 전체의 피를 제거하였다. 그 후 뇌를 꺼내어, 해마 부위와 전체 뇌 부위로 분리하여 뇌조직을 얻어, 액체 질소를 이용하여 급격히 얼렸다. 그 후에 조직을 분쇄하고, 라이시스 버퍼 (lysis buffer, 1X RIPA Ⅱ cell lysis buffer, 1 mM sodium orthovanadate (Na3VO4), 100 mg/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM sodium fluoride (NaF), 1X Protease Inhibitor cocktail)를 첨가하여 조직을 용해하였다. 얻어진 단백질의 양을 정량하고, 동일양 (35 μg) 의 라이세이트 (lysate)을 가지고 SDS-PAGE 전기영동을 실시한 후, PVDF 막으로 전기영동된 단백질을 이동 (transfer)시켰다. 이동된 단백질이 붙어 있는 PVDF 막을 먼저 2% 탈지유 (skim milk)로 1시간 방치 한 후, 1:1000으로 5% BSA (bovine serum albumin)에 희석한 NeuN (Neuronal Nuclei, MAB377, Millipore) 항체 용액에 하루 종일 4℃에서 방치하였다. 0.1% Tween-20 이 함유된 TBS/T로 세척하고, 1:3000으로 희석된 HRP가 컨쥬게이션 된 항-마우스 (anti-mouse) IgG 항체를 사용, 한 시간 방치한다. TBS/T로 세척하고 West-Q Chemiluminescent Substrate Plus Kit (GenDEPOT, TX, USA)을 이용하여 발광시킨 후, 이미지 분석기 (image analyzer)를 통해 이미지의 밴드 세기를 분석하였다.

분석 결과, 대조군 및 양성대조군 (Donepezil)에 비하여 동일한 양의 PEP1을 처리시, NeuN을 해마 및 뇌전역 (whole brain)에서 증가시키는 것으로 나타났다 (도 55 참조). 핵단백질 분열 후기에 발현되어 성숙한 신경세포임을 나타내는 마커인 NeuN이 PEP1에 의해 많이 나타난다는 것은 성숙한 신경세포들이 PEP1에 의해 많이 생성될 수 있음을 나타내는 것이라 할 수 있다.

실시예 4-4: PEP1의 DCX 발현에 대한 영향 평가

동물 행동실험을 마친 마우스(각 군당 10 마리)에서, 마취 후에, 0.9% 생리식염수를 이용하여 마우스의 심장을 통한 재관류를 시행하여 전체의 피를 제거하였다. 그 후 뇌를 꺼내어, 해마 부위와 전체 뇌 부위로 분리하여 뇌조직을 얻어, 액체 질소를 이용하여 급격히 얼린다. 그 후에 조직을 분쇄하고, 라이시스 버퍼 (1X RIPA Ⅱ cell lysis buffer, 1 mM sodium orthovanadate (Na3VO4), 100 mg/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM sodium fluoride (NaF), 1X Protease Inhibitor cocktail)를 첨가하여 조직을 용해하였다. 얻어진 단백질의 양을 정량하고, 동일양 (35 μg) 의 라이세이트를 가지고 SDS-PAGE 전기영동을 실시한 후, PVDF 막으로 전기 영동된 단백질을 이동시켰다. 이동된 단백질이 붙어 있는 PVDF 막을 먼저 2%, 탈지유로 1시간 방치 한 후, 1:10000으로 5% BSA에 희석한 GFAP (ab7260, Abcam) 항체 용액에 하루 종일 4℃에서 방치하였다. 0.1% Tween-20 이 함유된 TBS/T로 세척하고, 1:3000으로 희석된 HRP가 컨쥬게이션 된 항-토끼(anti-rabbit) IgG 항체를 사용, 한 시간 방치하였다. TBS/T로 세척하고 West-Q Chemiluminescent Substrate Plus Kit (GenDEPOT, TX, USA)을 이용하여 발광시킨 후, 이미지 분석기를 통해 이미지의 밴드 세기를 분석하였다.

분석결과, 대조군 및 양성대조군(Donepezil)에 비하여 동일한 양의 PEP1을 처리시, DCX를 해마 및 뇌전역 (whole brain)에서 증가시키는 것으로 나타났다 (도 56 내지 도 57 참조)(도 57에서 밝은 부분이 DCX, NeuN 발현 관련 면역염색 부분). 신경전구체에서 발현되는 미성숙 신경 세포의 신경 전구체에서 많이 발현되는 DCX가 PEP1에 의해 많이 발현되는 것으로 미루어볼 때 PEP1에 의해 초기 신경세포전구체가 많이 발현되므로 신경세포의 증식에 PEP1이 영향을 줄 수 있음을 나타낸다고 할 수 있다.

실시예 4-5: PEP1의 Tuj1 발현에 대한 영향 평가

동물 행동실험을 마친 마우스 (각 군당 10 마리)에서, 마취 후에, 0.9% 생리식염수를 이용하여 마우스의 심장을 통한 재관류를 시행하여 전체의 피를 제거하였다. 그 후 뇌를 꺼내어, 해마 부위와 전체 뇌 부위로 분리하여 뇌조직을 얻어, 액체 질소를 이용하여 급격히 얼린다. 그 후에 조직을 분쇄하고, 라이시스 버퍼 (1X RIPA Ⅱ cell lysis buffer, 1 mM sodium orthovanadate (Na3VO4), 100 mg/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM sodium fluoride (NaF), 1X Protease Inhibitor cocktail)를 첨가하여 조직을 용해하였다. 얻어진 단백질의 양을 정량하고, 동일양 (35 μg) 의 라이세이트을 가지고 SDS-PAGE 전기영동을 실시한 후, PVDF 막으로 전기 영동된 단백질을 이동 (transfer)시켰다. 이동된 단백질이 붙어 있는 PVDF 막을 먼저 2% skim milk로 1시간 방치 한 후, 1:10000으로 5% BSA에 희석한 Tuj1 (ab18207, Abcam) 항체 용액에 하루 종일 4℃에서 방치하였다. 0.1% Tween-20 이 함유된 TBS/T로 세척하고, 1:3000으로 희석된 HRP가 컨쥬게이션 된 항-토끼 IgG 항체를 사용, 한 시간 방치하였다. TBS/T로 세척하고 West-Q Chemiluminescent Substrate Plus Kit (GenDEPOT, TX, USA)을 이용하여 발광시킨 후, 이미지 분석기를 통해 이미지의 밴드 세기를 분석하였다.

분석결과, 대조군 및 양성대조군 (donepezil)에 비하여 동일한 양의 PEP1을 처리시, Tuj1를 해마 및 뇌전역에서 증가시키는 것으로 나타났다 (도 58 내지 도 59 참조)(도 59에서 밝은 부분이 Tuji 발현 관련 면역염색 부분). 한창 분열중인 신경세포 전구체 또는 새로 생성된 미성숙 후분열기 신경세포에서 발현되는 것으로 알려진 Tuj1이 PEP1에 의하여 많이 발현되는 것으로 미루어볼 때, PEP1의 투여는 새로운 신경세포의 분열, 생성, 분화를 유도하는 것에 영향을 줄 수 있음을 나타낸다고 할 수 있다.

실시예 4-6: PEP1의 GFAP 발현에 대한 영향 평가

동물 행동실험을 마친 마우스 (각 군당 10 마리)에서, 마취 후에, 0.9% 생리식염수를 이용하여 마우스의 심장을 통한 재관류를 시행하여 전체의 피를 제거하였다. 그 후 뇌를 꺼내어, 해마 부위와 전체 뇌 부위로 분리하여 뇌조직을 얻어, 액체 질소를 이용하여 급격히 얼린다. 그 후에 조직을 분쇄하고, 라이시스 버퍼(1X RIPA Ⅱ cell lysis buffer, 1 mM sodium orthovanadate (Na3VO4), 100 mg/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM sodium fluoride (NaF), 1X Protease Inhibitor cocktail)를 첨가하여 조직을 용해하였다. 얻어진 단백질의 양을 정량하고, 동일양 (35 μg) 의 라이세이트를 가지고 SDS-PAGE 전기영동을 실시한 후, PVDF 막으로 전기 영동된 단백질을 이동 (transfer)시켰다. 이동된 단백질이 붙어 있는 PVDF 막을 먼저 2% skim milk로 1시간 방치 한 후, 1:10000으로 5% BSA에 희석한 GFAP (ab7260, Abcam) 항체 용액에 하루 종일 4도에서 방치하였다. 0.1% Tween-20 이 함유된 TBS/T로 세척하고, 1:3000으로 희석된 HRP가 컨쥬게이션 된 anti-rabbit IgG 항체를 사용, 한 시간 방치하였다. TBS/T로 세척하고 West-Q Chemiluminescent Substrate Plus Kit (GenDEPOT, TX, USA)을 이용하여 발광시킨 후, 이미지 분석기를 통해 이미지의 밴드 세기를 분석하였다.

분석결과, 대조군 및 양성대조군 (donepezil)에 비하여 동일한 양의 PEP1을 처리시, GFAP를 해마 및 뇌전역에서 감소시키는 것으로 나타났다 (도 60 참조). 중추신경계의 아스트로사이트에서 발현되는 GFAP는 과발현 또는 이상 발현 시 신경아교증 (gliosis)등의 질환을 일으키는데, 치매유도 동물모델에서 과발현 되어 있는 GFAP가 PEP1의 투여에 의해 감소하는 것으로 미루어볼 때, PEP1이 신경질환 발생을 예방 및 감소시키는 효과를 가질 수 있음을 알 수 있다.

실시예 4-7: PEP1의 Galc 발현에 대한 영향 평가

동물 행동실험을 마친 마우스 (각 군당 10 마리)에서, 마취 후에, 0.9% 생리식염수를 이용하여 마우스의 심장을 통한 재관류를 시행하여 전체의 피를 제거하였다. 그 후 뇌를 꺼내어, 해마 부위와 전체 뇌 부위로 분리하여 뇌조직을 얻어, 액체 질소를 이용하여 급격히 얼린다. 그 후에 조직을 분쇄하고, 라이시스 버퍼 (1X RIPA Ⅱ cell lysis buffer, 1 mM sodium orthovanadate (Na3VO4), 100 mg/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM sodium fluoride (NaF), 1X Protease Inhibitor cocktail)를 첨가하여 조직을 용해하였다. 얻어진 단백질의 양을 정량하고, 동일양 (35 μg) 의 라이세이트를 가지고 SDS-PAGE 전기영동을 실시한 후, PVDF 막으로 전기영동된 단백질을 이동 (transfer)시켰다. 이동된 단백질이 붙어 있는 PVDF 막을 먼저 2% 탈지유로 1시간 방치 한 후, 1:500으로 5% BSA에 희석한 GalC (Galactocerebroside, MAB342, Millipore) 항체 용액에 하루 종일 4도에서 방치하였다. 0.1% Tween-20 이 함유된 TBS/T로 세척하고, 1:3000으로 희석된 HRP가 컨쥬게이션 된 항-마우스 IgG 항체를 사용, 한 시간 방치하였다. TBS/T로 세척하고 West-Q Chemiluminescent Substrate Plus Kit (GenDEPOT, TX, USA)을 이용하여 발광시킨 후, 이미지 분석기를 통해 이미지의 밴드 세기를 분석하였다.

분석결과, 대조군 및 양성대조군 (donepezil)에 비하여 동일한 양의 PEP1을 처리시, Galc를 해마 및 뇌전역에서 증가시키는 것으로 나타났다 (도 61 및 도 62 참조)(도 62에서 밝은 부분이 GFAP, GalC, DAPI 발현 관련 면역염색 부분). Galc는 갈락토스 (galactose)를 제거하는 효소이며 올리고덴드로사이트 (oligodendrocyte)의 마커로, 신경 줄기세포가 올리고덴드로사이트로 분화 되었음을 알 수 있는데, PEP1이 Galc를 증가시키는 것으로 미루어 보아 건강한 신경세포에 필요한 올리고덴드로사이트 형성에 PEP1이 영향을 줄 수 있는 것을 알 수 있다.

실시예 4-8: PEP1이 전체 Aβ(아밀로이드 베타)의 발현량에 주는 영향 평가

동물 행동실험을 마친 마우스 (각 군당 10 마리)에서, 마취 후에, 0.9% 생리식염수를 이용하여 마우스의 심장을 통한 재관류를 시행하여 전체의 피를 제거하였다. 그 후 뇌를 꺼내어, 해마 부위와 전체 뇌 부위로 분리하여 뇌조직을 얻어, 액체 질소를 이용하여 급격히 얼린다. 그 후에 조직을 분쇄하고, 라이시스 버퍼 (1X RIPA Ⅱ cell lysis buffer, 1 mM sodium orthovanadate (Na3VO4), 100 mg/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM sodium fluoride (NaF), 1X Protease Inhibitor cocktail)를 첨가하여 조직을 용해하였다. 얻어진 단백질의 양을 정량하고, 동일양 (35 μg) 의 라이세이트을 가지고 SDS-PAGE 전기영동을 실시한 후, PVDF 막으로 전기영동된 단백질을 이동 (transfer)시켰다. 이동된 단백질이 붙어 있는 PVDF 막을 먼저 2% 탈지유로 1시간 방치 한 후, 1:1000으로 5% BSA에 희석한 anti-β-amyloid (D54D2) Cell signaling, Beverly, MA, USA) 항체 용액에 하루 종일 4°C에서 방치하였다. 0.1% Tween-20 이 함유된 TBS/T로 세척하고, 1:2000으로 희석된 HRP가 컨쥬게이션 된 anti-rabbit IgG 항체를 사용, 한 시간 방치하였다. TBS/T로 세척하고 West-Q Chemiluminescent Substrate Plus Kit (GenDEPOT, TX, USA)을 이용하여 발광시킨 후, 이미지 분석기를 통해 이미지의 밴드 세기를 분석하였다.

분석결과, 대조군 및 양성대조군(Donepezil)에 비하여 PEP1을 처리시, 전 종류의 Aβ의 발현량이 해마 및 뇌전역에서 감소하는 것으로 나타났다(도 63 참조). 이는 PEP1이 올리고머로 형성되어 플라크(plaque)형태가 되기 전단계의 Aβ들의 절대량을 감소시켜 신경손실을 예방할 수 있는 효과가 있는 것을 나타낸다고 할 수 있다.

실시예 4-9: PEP1이 올리고머 Aβ(아밀로이드 베타)의 발현량에 주는 영향 평가

동물 행동실험을 마친 마우스(각 군당 10 마리)에서, 마취 후에, 0.9% 생리식염수를 이용하여 마우스의 심장을 통한 재관류를 시행하여 전체의 피를 제거하였다. 그 후 뇌를 꺼내어, 해마 부위와 전체 뇌 부위로 분리하여 뇌조직을 얻어, 액체 질소를 이용하여 급격히 얼린다. 그 후에 조직을 분쇄하고, 라이시스 버퍼 (1X RIPA Ⅱ cell lysis buffer, 1 mM sodium orthovanadate (Na3VO4), 100 mg/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM sodium fluoride (NaF), 1X Protease Inhibitor cocktail)를 첨가하여 조직을 용해하였다. 얻어진 단백질의 양을 정량하고, 동일양 (35 μg) 의 라이세이트을 가지고 SDS-PAGE 전기영동을 실시한 후, PVDF 막으로 전기영동된 단백질을 이동(transfer)시켰다. 이동된 단백질이 붙어 있는 PVDF 막을 먼저 2% 탈지유로 1시간 방치 한 후, 1:1000으로 5% BSA에 희석한 β-Amyloid oligomer (AB9234, Millipore) 항체 용액에 하루 종일 4°C에서 방치하였다. 0.1% Tween-20 이 함유된 TBS/T로 세척하고, 1:3000으로 희석된 HRP가 컨쥬게이션된 anti-rabbit IgG 항체를 사용, 한 시간 방치하였다. TBS/T로 세척하고 West-Q Chemiluminescent Substrate Plus Kit (GenDEPOT, TX, USA)을 이용하여 발광시킨 후, 이미지 분석기를 통해 이미지의 밴드 세기를 분석하였다.

분석결과, 대조군 및 양성대조군 (donepezil)에 비하여 PEP1을 처리시, 올리고머 Aβ의 발현량이 해마 및 뇌전역에서 감소하는 것으로 나타났다 (도 64 참조). 이는 PEP1이 플라크 (plaque) 형태가 되어 신경세포외부의 손상 및 사멸을 유도하기 직전 단계인 올리고머 Aβ들의 절대량을 감소시켜 신경손상 및 사멸을 예방 및 치료할 수 있는 효과가 있는 것을 나타낸다고 할 수 있다.

실시예 4-10: PEP1이 NFT의 생성에 주는 영향 평가

동물 행동실험을 마친 마우스 (각 군당 10 마리)에서, 마취 후에, 0.9% 생리식염수를 이용하여 마우스의 심장을 통한 재관류를 시행하여 전체의 피를 제거하였다. 그 후 뇌를 꺼내어, 해마 부위와 전체 뇌 부위로 분리하여 뇌조직을 얻어, 액체 질소를 이용하여 급격히 얼린다. 그 후에 조직을 분쇄하고, 라이시스 버퍼 (1X RIPA Ⅱ cell lysis buffer, 1 mM sodium orthovanadate (Na3VO4), 100 mg/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM sodium fluoride (NaF), 1X Protease Inhibitor cocktail)를 첨가하여 조직을 용해하였다. 얻어진 단백질의 양을 정량하고, 동일양 (35 μg) 의 라이세이트를 가지고 SDS-PAGE 전기영동을 실시한 후, PVDF 막으로 전기영동된 단백질을 이동 (transfer)시켰다. 이동된 단백질이 붙어 있는 PVDF 막을 먼저 2% 탈지유로 1시간 방치 한 후, 1 μg/ml의 농도로 5% BSA에 희석한 Tau (Neurofibrillary Tangles Marker, AHB0042, Invitrogen) 항체 용액에 하루 종일 4도에서 방치하였다. 0.1% Tween-20이 함유된 TBS/T로 세척하고, 1:3000으로 희석된 HRP가 컨쥬게이션 된 항-마우스 IgG 항체를 사용, 한 시간 방치하였다. TBS/T로 세척하고 West-Q Chemiluminescent Substrate Plus Kit (GenDEPOT, TX, USA)을 이용하여 발광시킨 후, 이미지 분석기를 통해 이미지의 밴드 세기를 분석하였다.

분석결과, 대조군 및 양성대조군 (donepezil)에 비하여 PEP1을 처리시, Tau의 발현량이 해마 및 뇌전역에서 감소하는 것으로 나타났다 (도 65 내지 도 66 참조)(도 66에서 밝은 부분이 β-amyloid, NFT, DAPI 발현 관련 면역염색 부분). 신경세포의 내부구조가 얽혀서 신경세포의 손상 및 사멸을 초래하는 NFT의 발생 정도를 측정하는 Tau의 발현이 PEP1에 의해 감소한다는 것은 PEP1이 NFT생성을 방지하여 신경세포의 손실을 예방하는 효과가 있다는 것을 나타낸다.

실시예 5: 동물 모델의 행동 실험 분석을 통한 PEP1의 신경손실 예방 및 재생 효과 평가

실시예 5-1: 수동회피실험을 통한 동물 모델에서의 PEP1의 효과 평가

군당 10마리의 실시예 4-1에서 언급한대로 약물이 주입된 알츠하이머 형질전환 마우스를 가지고 수동회피실험을 진행하였다. 약물 주사 후 2달 후에 다음과 같은 수동회피 실험을 실시하였다. 밝은 방과 어두운 방이 있는 상자를 준비하고 두 방 사이에 자유스러운 왕래가 가능하도록 문을 만들어 논다. 동물실험 첫날에 빛이 있는 상자에 넣고 움직임이 시작되면 빛이 없는 방의 출입문이 자동으로 열리고 180초 동안 대기하였다. 이튿날에도 첫날과 같은 방법으로 하되, 이번에는 빛이 없는 방에 들어갔을 때 5V/0.05mA의 직류전기를 10초간 가하였다. 삼 일째가 되면 첫날과 같은 방법으로 하면서 빛이 없는 방으로 들어가는 시간 및 빈도를 측정하였다. 모든 기다리는 시간은 180초 이상을 넘지 않는다. 셋째 날의 동물행동실험에서 동물의 움직임이 없을 수도 있고 움직이지 않을 경우 물리적 힘을 가하여 움직이도록 어떠한 자극도 주지 않는다.

분석결과, 대조군 및 양성대조군(Donepezil)에 비하여 PEP1을 처리한 동물이 우수한 회피 능력을 보이는 것으로 나타났다(도 67 및 도 68 참조). 인지능력의 증가는 신경세포의 상태에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있으며, 실험결과를 통해 PEP1의 투여 시 신경세포의 손실 및 재생에 효능을 보여 인지능력이 상승하는 것을 추정할 수 있다.

실시예 5-2: Y-미로 실험을 통한 동물 모델에서의 PEP1의 효과 평가

실시예 4-1에서 언급한 방법에 따라, 군당 10마리의 각각의 약물이 주입 완료된 알츠하이머 형질전환 마우스를 가지고 Y-미로 실험을 실시하였다. Y-미로 실험 (Y-maze task) PEP1이 알츠하이머 형질 전환 마우스의 공간지각능력 및 단기 기억능력의 회복 (short-term memory recovery)에 도움을 주는지를 알아보기 위한 실험이다. Y 모양으로 되어 있는 3개의 팔이 있는 미로에서 행동실험을 실시하였다. 각 팔은 서로 120°의 일정한 각도로 배치되어 있다. 마우스는 자유롭게 세 개의 팔에 왕래할 수 있도록 하였다. 마우스들은 새로운 곳으로의 탐색을 좋아하였다. 따라서 쥐들은 보통 그들이 방문했던 팔로 돌아오기 보다는 새로운 팔로 가기를 더 좋아하였다. 각각의 팔을 A, B, C 영역으로 정한 후 하나의 영역에 마우스의 머리를 벽의 방향으로 놓고 방치하여 180초간 자유롭게 움직이도록 한 다음, 실험동물이 들어간 영역을 관찰하여 기록하였다. 각 미로에 들어간 횟수 및 순서를 측정하여 변경행동력 (spontaneous alteration, %)을 평가하였다.

분석결과, 대조군 및 양성대조군 (donepezil)에 비하여 PEP1을 처리한 동물이 우수한 행동 판단력을 보이는 것으로 나타났다 (도 69 참조). Y-미로는 새로운 길을 선택하는 능력 및 이미 지나간 길을 기억하는 능력을 판단할 수 있는 실험으로, 실험결과에서 PEP1을 투여 받은 동물들이 보다 더 높은 능력을 보이는 경향이 있는 것으로 나타나는 것으로 미루어 볼 때, PEP1 투여 시 인지능력뿐만 아니라 기억능력 및 행동력이 향상된 다고 할 수 있다.

실시예 5-3: 중증 알츠하이머 동물 모델의 행동 실험 분석을 통한 PEP1의 신경손실 예방 및 재생 효과 평가

실시예 4-1에 기재된 방법으로 알츠하이머 형질 전환 마우스(3XTg-AD)를 20개월 이상 사육하여 중증 알츠하이머 모델에 해당하는 20개월령 이상의 알츠하이머 형질 전환 마우스를 준비하였다. PEP1 및 생리식염수를 20개월 때부터 두 달 동안 일주일에 3회 피하 주사한 후, 2달 후에 인지기능과 기억기능의 향상 정도를 알아보는 인지/기억 행동실험(수동회피실험 및 Y maze)를 수행하였다. PEP1(1mg/kg) 투여군 7마리과 생리식염수 투여군(대조군) 6마리의 중증 알츠하이머 형질전환 마우스를 대상으로 실시예 5에 기재된 방법과 유사한 방법으로 인지/기억 행동실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 약물 투여 후 2달 후에, 밝은 방과 어두운 방이 있는 상자를 준비하고 전기 자극 후 빛이 없는 방으로 들어가는 시간 및 빈도를 측정하는 수동회피실험과, Y 모양으로 되어 있는 3개의 팔이 있는 미로에서 180초 간 자유롭게 움직이도록 한 다음 각 미로에 들어간 횟수 및 순서를 측정하여 변경행동력을 평가하는 Y-미로 실험을 수행하였다. (구체적인 실험 방법은 실시예 5-1 및 5-2 참조)

분석 결과, 수동회피실험의 경우, 대조군에 비하여 PEP1 투여군이 밝은 방에서 머무는 시간 및 빈도가 증가하여 우수한 회피 능력, 즉 기억력 회복 능력을 보이는 것으로 나타났으며(도 70 참조), Y-미로 실험의 경우, 대조군에 비하여 PEP1 투여군이 새로운 길을 선택하는 능력(변경행동력)이 증가하여 우수한 인지/기억 회복 능력을 보이는 것으로 나타났다(도 71 참조). 이상과 같이, 중증 알츠하이머 질환에 있어서도 PEP1을 투여한 모델들이 보다 더 높은 인지/기억 능력을 보이는 경향이 있는 것을 알 수 있으며, 이로부터 중증 알츠하이머 질환의 경우에도 PEP1 투여 시 인지능력, 기억능력, 및 행동력이 향상될 수 있다고 할 수 있다.

실시예 6: 임상 실험을 통한 PEP1의 신경손실 예방 및 재생 효과 평가

실시예 6-1: 임상실험의 투여 방법 및 대상

임상실험은 신경세포의 손실 및 이로 인한 퇴행성 신경계질환 중 가장 대표적으로 알려진 경도, 중등도 및 중증 알츠하이머 질환을 가진 대상을 모집하여 실시한다. 실험은 무작위배정, 위약대조, 양측눈가림, 평행디자인, 다기관, 2상 임상시험으로 설계되었으며　질병의 진행 정도는　널리 알려진 치매 질환 정도 측정법을 이용하여 진행된다.

임상실험은 투여에 따라 다음의 4개군으로 나누어 투여된다.

1) 대조군: 위약(0.9% saline)을 매 1주 간격으로 4회, 이후 매 2주 간격으로 22회, 총 26회 방문하여 방문 시마다 피하로 투여한다.

2) 시험군 1: 실시예 1에 따라 제조된 PEP1 0.40mg을 매 1주 간격으로 4회, 이후 매 2주 간격으로 22회, 총 26회 방문하여 방문 시마다 피하로 투여한다.

3) 시험군 2: 실시예 1에 따라 제조된 PEP1 0.56mg을 매 1주 간격으로 4회, 이후 매 2주 간격으로 22회, 총 26회 방문하여 방문 시마다 피하로 투여한다.

4) 시험군 3: 실시예 1에 따라 제조된 PEP1 1.12mg을 매 1주 간격으로 4회, 이후 매 2주 간격으로 22회, 총 26회 방문하여, 방문 시마다　피하 투여한다.

본 임상실험은 알츠하이머 환자들에 투여된 PEP1의 유효성 및 안전성을 평가하기 위한 무작위배정, 위약대조, 양측눈가림, 평행디자인, 다기관, 2상 임상시험으로 설계되었다. 임상시험에 적합한 대상자는 3개 시험군 및 위약군 중 한 군으로 무작위 배정된다. 무작위배정을 받은 대상자 중, 시험군에 해당되는 대상자는 기 정해진 용량을 매 1주 간격으로 4회. 이후 매 2주 간격으로 22회, 총 26회 피하로 약물을 투여받는다. 대조군으로 선정된 대상자는 시험약과 동량의 위약(0.9% saline)을 동일한 방법으로 투여받는다.

실시예 6-2: 임상실험의 평가기준 및 방법

유효성 평가 변수의 분석은 FAS (Full analysis set) 분석군을 대상으로 실시할 예정이며, 부가적으로 PP (Per-protocol) 분석군을 대상으로 한 결과와 비교한다.

유효성 평가 변수는 다음 2가지로 나누어 평가한다.

1) 일차 유효성 평가변수 (Primary Endpoint): Baseline 대비 ADAS-cog 및 ADCS-ADL의 변화량(0, 12주, 24주, 36주, 48주차 측정)

2) 이차 유효성 평가변수 (Secondary Endpoints): Baseline 대비 CIBIC-Plus 및 QOL-AD의 변화량 (0, 12주, 24주, 36주, 48주차 측정), Baseline 대비 total hippocampal atrophy 및 cerebrospinal fluid (CSF) Aβ(1-x)의 변화량(스크리닝 시, 24주, 48주차 측정)

안전성 평가변수는 이상반응평가 및 임상실험실적 검사치(일반혈액검사, 혈액생화학검사, 뇨검사)의 변화를 통하여 측정된다.

상기 실시예들을 통하여 PEP1이 세포단계에서뿐만 아니라, 동물모델을 통한 실험 및 임상실험에서도 신경세포의 손실 예방 및 재생, 이를 통한 인지능력 상승 등에 우수한 효과를 나타냄을 알 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 펩티드 PEP1은 신경세포의 손실 및 이에 의한 퇴행성 신경계질환의 예방 또는 치료제로서 개발될 수 있으며, 이를 이용하여 신경질환의 근본적인 예방 및 치료방법을 제공할 수 있을 것이다. 또한, 기존의 신경계질환 치료제와의 병용 투여 시에도 뛰어난 상승효과를 보일 수 있을 것으로 기대된다.

<110> KIM, sangjae Gemvax & KAEL Co.,LTD. <120> A Peptide Having Neuronal Loss Inhibition and Neuron Regeneration Activity and the Composition Comprising the Same <130> OF16P242/PCT <150> KR 10-2015-0153518 <151> 2015-11-03 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 1132 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser 1 5 10 15 His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly 20 25 30 Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg 35 40 45 Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60 Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu 65 70 75 80 Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val 85 90 95 Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro 100 105 110 Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr 115 120 125 Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val 130 135 140 Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val 145 150 155 160 Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr 165 170 175 Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly 180 185 190 Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg 195 200 205 Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg 210 215 220 Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg 225 230 235 240 Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp 245 250 255 Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val 260 265 270 Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala 275 280 285 Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His 290 295 300 Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro 305 310 315 320 Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly 325 330 335 Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro 340 345 350 Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser 355 360 365 Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln 370 375 380 Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His 385 390 395 400 Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg 405 410 415 Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln 420 425 430 Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu 435 440 445 Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe 450 455 460 Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser 465 470 475 480 Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser 485 490 495 Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met 500 505 510 Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys 515 520 525 Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe 530 535 540 Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe 545 550 555 560 Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr 565 570 575 Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His 580 585 590 Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln 595 600 605 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 610 615 620 Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val 625 630 635 640 Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser 645 650 655 Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg 660 665 670 Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg 675 680 685 Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro 690 695 700 Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile 705 710 715 720 Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln 725 730 735 Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His 740 745 750 Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp 755 760 765 Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser 770 775 780 Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu 785 790 795 800 Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His 805 810 815 Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro 820 825 830 Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp 835 840 845 Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu 850 855 860 Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala 865 870 875 880 Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys 885 890 895 Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu 900 905 910 Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe 915 920 925 Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser 930 935 940 Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe 945 950 955 960 Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly 965 970 975 Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn 980 985 990 Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln 995 1000 1005 Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln 1010 1015 1020 Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala 1025 1030 1035 1040 Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu 1045 1050 1055 Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp 1060 1065 1070 Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr 1075 1080 1085 Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser 1090 1095 1100 Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn 1105 1110 1115 1120 Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp 1125 1130

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 약학적으로 유효한 양으로 포함하는 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편인 펩티드를 포함하는 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 신경세포 손실 및 재생 불능에 의한 질환의 예방, 치료, 경감 및 개선용이거나, 상기 질환에 의한 후유증의 예방, 치료, 경감 및 개선용인 것을 특징으로 하는 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 신경세포 손실 및 재생 불능에 의한 질환은 뇌혈관 질환 또는 퇴행성 신경계 질환인 것을 특징으로 하는 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 뇌혈관 질환은 허혈성 뇌혈관 질환 또는 출혈성 뇌혈관 질환인 것을 특징으로 하는 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 퇴행성 신경계 질환은 뇌질환, 척수손상, 말초신경손상, 말초신경질환, 근위축성 측색 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis), 치매, 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머성 질환, 척수 소뇌 변성증, 근위축성 측색 경화증, 및 다발성 신경병증 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 신경계질환 치료제와 병용 투여되는 것을 특징으로 하는 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 알츠하이머성 질환은 치매, 인지장애, 기억력저하 중 어느 하나 이상을 보이는 것을 특징으로 하는 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 알츠하이머성 질환은 초기, 진행성 또는 중증 알츠하이머성 질환인 것을 특징으로 하는 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적 유효성분으로 서열번호 1의 펩티드를 0.0001 내지 100 mg/kg/일 용량으로 투여하는 것을 특징으로 하는 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적 유효성분으로 서열번호 1의 펩티드 0.01mg 내지 200mg을 투여하는 것을 특징으로 하는 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적 유효성분으로 서열번호 1의 펩티드를 매 1주 내지 4주마다 1회씩 총 4회 이상 투여하는 것을 특징으로 하는 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적 유효성분으로 서열번호 1의 펩티드 를 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내, 피내, 또는 피하로 투여하는 것을 특징으로 하는 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물.
약학적으로 유효한 양의 제1항 내지 제13항에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 신경세포 손실 예방 및 재생 치료방법.
제 1항 내지 제13항에 따른 신경세포 손실 예방 및 재생용 조성물; 및
약학적 유효성분으로 서열번호 1의 펩티드를 0.01mg 내지 200mg을 매 1주 내지 4주마다 1회씩 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 지시하는 지시서
를 포함하는 신경세포 손실 예방 및 재생 치료용 키트.