EA013230B1 - Пептиды механофактора роста и их применение - Google Patents
Пептиды механофактора роста и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- EA013230B1 EA013230B1 EA200702012A EA200702012A EA013230B1 EA 013230 B1 EA013230 B1 EA 013230B1 EA 200702012 A EA200702012 A EA 200702012A EA 200702012 A EA200702012 A EA 200702012A EA 013230 B1 EA013230 B1 EA 013230B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- polypeptide
- peptide
- muscle
- polypeptide according
- amino acids
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 543
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 339
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 title 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 259
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 132
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 115
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 77
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 52
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 46
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 42
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 37
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 claims description 35
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 33
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 32
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 31
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 30
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 25
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 25
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 25
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 22
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 claims description 18
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 claims description 18
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 claims description 14
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 claims description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 13
- 230000020763 muscle atrophy Effects 0.000 claims description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 claims description 11
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 claims description 11
- 208000029578 Muscle disease Diseases 0.000 claims description 10
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 claims description 10
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 claims description 10
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 claims description 10
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 9
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 9
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 claims description 9
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 9
- 238000004904 shortening Methods 0.000 claims description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 8
- GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N benzyl(trichloro)silane Chemical group Cl[Si](Cl)(Cl)CC1=CC=CC=C1 GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical group NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 claims description 5
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 claims description 5
- 102100022745 Laminin subunit alpha-2 Human genes 0.000 claims description 5
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 claims description 5
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 claims description 5
- 201000006815 congenital muscular dystrophy Diseases 0.000 claims description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 230000003680 myocardial damage Effects 0.000 claims description 5
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 claims description 4
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 claims description 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 claims description 4
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000018360 neuromuscular disease Diseases 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 210000005070 sphincter Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 claims description 4
- 206010007556 Cardiac failure acute Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 claims description 3
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 claims description 3
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 claims description 3
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims description 3
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003293 cardioprotective effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000003607 serino group Chemical class [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006029 Cardiomegaly Diseases 0.000 claims description 2
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 claims description 2
- 208000032131 Diabetic Neuropathies Diseases 0.000 claims description 2
- 206010014498 Embolic stroke Diseases 0.000 claims description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 208000016988 Hemorrhagic Stroke Diseases 0.000 claims description 2
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010366 Postpoliomyelitis syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 claims description 2
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 claims description 2
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 claims description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000001619 diaphragma pelvis Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000003073 embolic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 claims description 2
- 208000020658 intracerebral hemorrhage Diseases 0.000 claims description 2
- 230000003387 muscular Effects 0.000 claims description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 claims description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000026526 progressive weakness Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001076 sarcopenia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 claims description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000013875 Heart injury Diseases 0.000 claims 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 201000006935 Becker muscular dystrophy Diseases 0.000 claims 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 claims 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 claims 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 claims 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 abstract description 7
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 abstract description 7
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 abstract description 7
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 97
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 43
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 31
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 29
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 21
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 21
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 17
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 16
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 16
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 15
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 13
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 13
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 229940090044 injection Drugs 0.000 description 13
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 11
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 11
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 8
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 8
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 8
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 7
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 7
- 230000001114 myogenic effect Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 7
- 210000001057 smooth muscle myoblast Anatomy 0.000 description 7
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 6
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]propanoyl]amino]prop-2-enoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 5
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 5
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 5
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 5
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 230000000431 effect on proliferation Effects 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 208000013363 skeletal muscle disease Diseases 0.000 description 5
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 5
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 4
- 241000699694 Gerbillinae Species 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 4
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 4
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 4
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 4
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 3
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 3
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 3
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 3
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N n-hexanoic acid Natural products CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N Caprylic acid Natural products CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 2
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 2
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000005961 cardioprotection Effects 0.000 description 2
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 2
- 210000001168 carotid artery common Anatomy 0.000 description 2
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 2
- 230000001055 chewing effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000001665 muscle stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 2
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 2
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000022379 skeletal muscle tissue development Effects 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N tert‐butyl hydroperoxide Chemical compound CC(C)(C)OO CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZKXIUQUNJAKYCW-LMDPIGAJSA-N (8s,9s,11s,13s,14s,16r,17r)-16-iodanyl-11-methoxy-13-methyl-6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-decahydrocyclopenta[a]phenanthrene-3,17-diol Chemical compound C([C@H]12)CC3=CC(O)=CC=C3[C@H]1[C@@H](OC)C[C@@]1(C)[C@H]2C[C@@H]([125I])[C@@H]1O ZKXIUQUNJAKYCW-LMDPIGAJSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-UHFFFAOYSA-N 2-aminohexanoic acid Chemical group CCCCC(N)C(O)=O LRQKBLKVPFOOQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 2-aminopropyl Chemical group 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 1
- 101100324465 Caenorhabditis elegans arr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100505326 Candida albicans (strain WO-1) CAG1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000020446 Cardiac disease Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108010068426 Contractile Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002585 Contractile Proteins Human genes 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000026072 Motor neurone disease Diseases 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004987 Troponin T Human genes 0.000 description 1
- 108090001108 Troponin T Proteins 0.000 description 1
- 108010051583 Ventricular Myosins Proteins 0.000 description 1
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 210000003489 abdominal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 150000001294 alanine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 229930185229 antidesmin Natural products 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 1
- 101150024147 bax gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009811 bilateral tubal ligation Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 229940013767 bupivacaine injection Drugs 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000003727 cerebral blood flow Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 1
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940082319 dexamethasone and antibiotic Drugs 0.000 description 1
- LSXWFXONGKSEMY-UHFFFAOYSA-N di-tert-butyl peroxide Chemical compound CC(C)(C)OOC(C)(C)C LSXWFXONGKSEMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002934 diuretic Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002592 echocardiography Methods 0.000 description 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 210000000256 facial nerve Anatomy 0.000 description 1
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 description 1
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011556 gerbil model Methods 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- CPBQJMYROZQQJC-UHFFFAOYSA-N helium neon Chemical compound [He].[Ne] CPBQJMYROZQQJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 108010045676 holotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004220 muscle function Effects 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004070 myogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001452 natriuretic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001272 neurogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002232 neuromuscular Effects 0.000 description 1
- 230000004693 neuron damage Effects 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 1
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 208000027232 peripheral nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037081 physical activity Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001176 projection neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000518 sarcolemma Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000004096 skeletal muscle tissue growth Effects 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000005482 strain hardening Methods 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 1
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
- A61P25/32—Alcohol-abuse
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Addiction (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
Abstract
Данное изобретение относится к биологически активным полипептидам, полученным из Е-пептида, который образует С-конец сплайсингового варианта инсулинподобного фактора роста (IGF-I), известного в качестве механофактора роста (MGF). Эти пептиды модифицированы для улучшения их стабильности в сравнении с природным Е-пептидом.
Description
Данное изобретение относится к биологически активным полипептидам, полученным из Е-домена, который образует С-конец сплайсингового варианта инсулинподобного фактора роста (1ОЕ-1), известного как механо-фактор роста (МОЕ). Эти пептиды модифицированы для улучшения их стабильности в сравнении с природным пептидом Е-домена.
Уровень техники
Полипептиды 1ОЕ-1 млекопитающих имеют ряд изоформ, которые возникают в результате альтернативного сплайсинга мРНК. В общих чертах, существуют два типа изоформ, изоформы печеночного типа и изоформы непеченочного типа. Изоформы печеночного типа могут экспрессироваться в печени или в другом месте, но при их экспрессии в другом месте они являются эквивалентными изоформам, экспрессируемым в печени. Они обладают системным действием и являются основными изоформами у млекопитающих. Изоформы непеченочного типа являются менее распространенными, и считается, что они имеют аутокринное/паракринное действие. Изоформа МОЕ, к которой относится это изобретение, является изоформой последнего типа.
В МОЕ (Уапд с1 а1., 1996; МсКоу е1 а1., 1999) альтернативный сплайсинг вводит вставку, которая изменяет рамку считывания С-концевой части молекулы. Эта вставка имеет длину 49 п.н. в МОЕ человека. В МОЕ крысы и кролика подобное действие имеет вставку из 52 п.н. Результатом является то, что МОЕ является немного длиннее, чем 1ОЕ-1 печеночного типа (так как терминирующий кодон появляется позднее вследствие сдвига рамки считывания), и то, что С-концевой Е-домен имеет отличающуюся последовательность. Он также является в целом меньшим, так как он лишен гликозилирования.
В МОЕ человека С-конец образован Е-доменом из 24 аминокислот, иногда называемым Еспептидом (8ЕО ΙΌ N0:27). В МОЕ крысы и кролика соответствующие домены Е, иногда называемые ЕЬпептидами, имеют длину 25 аминокислот (8Е0 ΙΌ N0:13/14). Вместо этого 1ОЕ-1 печеночного типа содержит Еа-пептид на С-конце. Последовательности Еа- и Ес/ЕЬ-пептидов не являются родственными друг другу вследствие обсуждаемого выше сдвига рамки считывания. Присутствие сплайсингового варианта с тем, что, как видно теперь, является С-концом МОЕ, было впервые замечено Сйете е1 а1 (1995), которые идентифицировали его в ткани печени во время исследований на пациентах, страдающих от рака печени, но не исследовали его вообще в отношении потенциальной функции или терапевтической значимости.
Оо1ё8ршк и сотрудники уже идентифицировали МОЕ для применения против нарушений скелетной мышцы, особенно мышечной дистрофии; для применения против нарушения сердечной мышцы, особенно в профилактике или ограничении повреждения миокарда в ответ на ишемию или механическую перегрузку сердца; для лечения неврологических нарушений в целом и для восстановления (репарации) нервов, в частности, \У0 97/33997; \У0 01/136483; \У0 01/85781; \У0 03/066082. Становится все яснее, что 1ОЕ-1 печеночного типа и МОЕ имеют разные роли и функции. Так, НШ апё Оо1ё§р1пк (2003) показали, что в передней большеберцовой мышце крысы МОЕ экспрессируется быстро в ответ на механическое повреждение, вызванное электрической стимуляцией или вследствие инъекции бупивакаина, но что его экспрессия затем снижается в пределах нескольких дней. Напротив, 1ОЕ-1 печеночного типа активируется более медленно, и его увеличение соответствует снижению экспрессии МОЕ. Кроме того, Уапд апё Оо1ё§р1пк (2002) показали с использованием линии мышечных клеток С2С12 мыши в качестве модели ш νίίτο, что пептид из 24 аминокислот, сходный с Ес-пептидом из С-конца МОЕ человека, но с гистидином в предпоследнем положении, а не с природным аргинином, и с дополнительным С-концевым цистеином, имеет активность в сравнении с активностью зрелого 1ОЕ-1, отличающуюся тем, что он увеличивает пролиферацию миобласта, но ингибирует образование мышечных трубочек. □1ихше\\ъка е1 а1., (8ер1етЬет 2005) показали также сильное нейрозащитное действие родственного пептида, опять с гистидином в предпоследнем положении, а не с природным аргинином, и некоторыми модификациями вследствие превращения Ь-аргинина в Ό-аргинин в положениях 14 и 15 плюс С-концевым амидированием и ПЭГилированием.
Сущность изобретения
Однако авторы данного изобретения обнаружили, что природный С-концевой Ес-пептид МОЕ человека имеет короткий период полувыведения в плазме человека. Таким образом, стабилизирующие модификации могут увеличивать его потенциал для применения в качестве фармацевтического вещества.
Авторы данного изобретения показали также, что стабилизированные С-концевые Е-пептиды МОЕ обладают нейрозащитными и кардиозащитными свойствами, а также способностью увеличивать силу нормальной и дистрофической скелетной мышцы.
Таким образом, данное изобретение обеспечивает полипептид, содержащий до 50 аминокислотных остатков;
причем указанный полипептид содержит последовательность аминокислот, полученную из С-концевого Епептида изоформы механо-фактора роста (МОЕ) инсулинподобного фактора роста I (1ОЕ-1);
причем указанный полипептид включает в себя одну или несколько модификаций, которые придают ему увеличенную стабильность в сравнении с немодифицированным Е-пептидом МОЕ;
и причем указанный полипептид обладает биологической активностью.
- 1 013230
Это изобретение обеспечивает также удлиненный полипептид, содержащий полипептид данного изобретения, удлиненный аминокислотной последовательностью не дикого типа, Ν-концевой и/или Сконцевой относительно указанного полипептида.
Это изобретение обеспечивает также композицию, содержащую полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения и носитель.
Это изобретение обеспечивает также фармацевтическую композицию, содержащую полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.
Это изобретение обеспечивает также полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения для применения в способе лечения человека или животного.
Это изобретение обеспечивает также способ лечения мышечного нарушения введением пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества полипептида или удлиненного полипептида данного изобретения. Указанным мышечным нарушением может быть, например, нарушение скелетной мышцы или нарушение сердечной мышцы.
Это изобретение обеспечивает также способ лечения неврологического нарушения введением пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества полипептида или удлиненного полипептида данного изобретения.
Это изобретение обеспечивает также применение полипептида или удлиненного полипептида данного изобретения в приготовлении лекарственного средства для применения в описанном выше лечении.
Это изобретение обеспечивает также способ лечения неврологического нарушения введением пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества:
полипептида, содержащего до 50 аминокислотных остатков, причем указанный полипептид содержит последовательность аминокислот, полученную из С-концевого Е-пептида изоформы механо-фактора роста (МОЕ) инсулинподобного фактора роста I (ЮЕ-Ι); или удлиненного полипептида, содержащего указанный полипептид и удлиненного аминокислотной последовательностью не дикого типа, Νконцевой и/или С-концевой относительно указанного полипептида;
причем указанный полипептид или удлиненный полипептид обладает биологической активностью.
Это изобретение обеспечивает также способ лечения нарушения сердечной мышцы введением пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества:
полипептида, содержащего до 50 аминокислотных остатков, причем указанный полипептид содержит последовательность аминокислот, полученную из С-концевого Е-пептида изоформы механо-фактора роста (МОЕ) инсулинподобного фактора роста I (ЮЕ-Ι); или удлиненного полипептида, содержащего указанный полипептид и удлиненного аминокислотной последовательностью не дикого типа, Νконцевой и/или С-концевой относительно указанного полипептида;
причем указанный полипептид обладает биологической активностью.
Это изобретение обеспечивает также применение полипептида, содержащего до 50 аминокислотных остатков, причем указанный полипептид содержит последовательность аминокислот, полученную из С-концевого Е-пептида изоформы механо-фактора роста (МОЕ) инсулинподобного фактора роста I (ЮЕI); или удлиненного полипептида, содержащего указанный полипептид и удлиненного аминокислотной последовательностью не дикого типа, Ν-концевой и/или С-концевой относительно указанного полипептида;
причем указанный полипептид обладает биологической активностью в приготовлении лекарственного средства для применения в лечении неврологического нарушения или нарушения сердечной мышцы.
Краткое описание фигур
Фиг. 1: Выравнивание последовательностей, показывающее последовательности, кодируемые частью последовательности каждого из МОЕ человека, крысы и кролика и ЮЕ4 печеночного типа человека, крысы или кролика (аминокислоты 26-110 8ЕО ГО N0:2 и до 26-111 8Е0 ГО N0:4 и 6: см. ниже), и выделяющее различия между МОЕ и ЮЕ4 на С-конце; созданные вставкой 49 п.н. в МОЕ человека и вставкой 52 п.н. в МОЕ крысы/кролика, приводящие к сдвигу рамки считывания и дивергенции на Сконце.
Фиг. 2: Действие замещения аланина и С-концевого и Ν-концевого укорочения на стабильность и биологическую активность - дополнительное выравнивание последовательностей, сравнивающее модифицированные последовательности пептидов 1-6 (8Е0 ГО N0:15-20) и коротких пептидов 1-4 (8Е0 ГО N0:21-24) и детализация влияния изменений на стабильность, измеренную инкубированием в плазме человека, и биологическую активность, измеренную тестированием линии мышечных клеток (см. примеры в отношении подробностей тест-процедур).
На этой фигуре первые два столбца слева идентифицируют эти пептиды и дают их последовательности, идентифицирующие изменения, сделанные путем замещения. Третий столбец дает результаты тестов на стабильность (см. пример 5 в отношении подробностей) и последний столбец справа дает результаты тестов на биологическую активность (опять см. пример 5 в отношении подробностей).
Фиг. 3: Увеличение силы дистрофической мышцы мыши после инъекции стабилизированного пептида спустя 3 недели
- 2 013230 (A) процентное изменение тетанической силы в дистрофической мышце мышей шбх после инъекции стабилизированного пептида (левый столбец) и ЮЕ (правый столбец).
(B) процентное изменение тетанической силы в дистрофической мышце мышей шбх после инъекции стабилизированного пептида (левый столбец) и контроля-носителя РВ8 (правый столбец).
Фиг. 4: Кардиозащита после введения стабилизированного пептида - сравнение фракций выброса, достигаемых после введения в овечье сердце с инфарктом стабилизированного пептида (третий столбец, названный «Ес-доменом»), полноразмерного МОЕ (четвертый столбец), зрелого ЮЕ-Ι (второй столбец) и контрольного препарата (первый столбец).
Фиг. 5: Результаты петли давление/объем, показывающие сохранение функции после инфаркта миокарда (ΜΙ) - для нормального (наверху слева) и поврежденного (ΜΙ) (наверху справа) желудочка мыши, и показывающие действие стабилизированного пептида, доставляемого системно в ΜΙ-сердце (внизу справа, названное «пептид МОЕ» и нормальное сердце (внизу слева). Все панели показывают давление (мм рт. ст.) на Υ-оси и Относительные Единицы Объема на Х-оси.
Фиг. 6: Нейрозащитные действия в системе срезов головного мозга крысы - слева направо, процент мертвых клеток после обработки стабилизированным пептидом (обозначенным «МОЕ»), ЮЕ-Ι, ТВН, ТВН + стабилизированный пептид (24 ч), ТВН + ЮЕ-Ι (24 ч), ТВН + стабилизированный пептид (48 ч), ТВН + ЮЕ-Ι (48 ч).
Фиг. 7: Вестерн-блоты, демонстрирующие более высокую стабильность стабилизированного пептида, который включает в себя превращение аргинина из Ь- в Ό-форму и Ν-концевое ПЭГилирование стабильность стабилизированного пептида в сравнении с соответствующим пептидом, лишенным превращения Ь- в Ό-форму и Ν-концевого ПЭГилирования, исследовали инкубированием в свежей плазме человека в течение диапазона различных временных интервалов. Затем использовали Вестерн-блоттинг для оценки выживания каждого пептида на протяжении временных интервалов: А=0 мин; В=30 мин; С=2 часа; Ό=24 ч. Результаты для пептида с Ь-О-превращением и Ν-концевым ПЭГилированием показаны справа; результаты для пептида, лишенного превращений Ь-формы в Ό-форму и Ν-концевого ПЭГилирования, находятся слева.
Фиг. 8: Действие С-концевых пептидов из 8-аминокислот на пролиферацию мышечных клеток С1С12:
(A) ΌΜΟΡ- и СМОЕ-пептиды:
Клетки С2С12 получали при 2000 клеток на лунку в среде, содержащей ОМЕМ (1000 мг/л глюкоза), плюс В8А (100 мкг/мл), плюс ЮЕ-Ι (2 нг/мл), и инкубировали в течение 36 ч. Затем пролиферацию клеток оценивали с использованием анализа с красителем Аламаровым синим. Левая группа показателей показывает результаты для экспериментов с концентрациями ОМОЕ-пептида (см. пример 1.3.1 в отношении подробностей) 2, 5, 50 и 100 нг/мл. Средняя группа показателей показывает результаты для экспериментов с концентрациями СМОЕ-пептида (см. пример 1.3.1 в отношении подробностей) 2, 5, 50 и 100 нг/мл. Левая группа показателей показывает результаты для экспериментов с концентрациями одного ЮЕ-Ι (см. пример 1.5 в отношении подробностей) 2, 5, 50 и 100 нг/мл. Величины Υ-оси являются флуоресценцией (длина волны возбуждения 535 нм, измерения при 590 нм; среднее плюс стандартная ошибка) в анализе с красителем Аламаровым синим.
(B) Пептиды А2, А4, А6 и А8:
Клетки С2С12 при 500 клеток на лунку. Культивирование проводили в течение 24 ч в 10% ЕВ8 с последующими голоданием в течение 24 ч в 0,1% В8А, стимуляцией в течение 24 ч и затем обработкой ВтбИ в течение 5 ч. Испытывали концентрации 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл пептидов А2, А4, А6 и А8 вместе с 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл ЮЕ-Ι (см. серию результатов справа). Включение ВтбИ измеряли для оценки уровня достигнутой пролиферации. Обеспечивали также контроли, не содержащие клеток, только среду, 5% ЕВ8 и без ВтбИ. Величины на Υ-оси являются флуоресценцией (оптическая плотность при 370 нм; среднее плюс стандартная ошибка для 4 лунок). Первый столбец слева относится к контролю без присутствующих клеток. Следующие четыре столбца относятся к пептиду А2 в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл. Следующие четыре столбца относятся к пептиду А4 в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл. Центральные три столбца относятся к контролям, содержащим только среду (шеб), 5% ЕВ8) и не содержащим ВтбИ. Следующие четыре столбца относятся к пептиду А6 в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл. Следующие четыре столбца относятся к пептиду А8 в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл. Правая группа результатов относится к ЮЕ-Ι (см. пример 1.5) в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл.
Фиг. 9: Действие на пролиферацию на клетках Н8ММ (А) Пептид А5: Клетки Н8ММ при 500 клеток на лунку.
Культивирование проводили в течение 24 ч в 10% ЕВ8 с последующими двумя промывками в бессывороточной среде, стимуляцией в течение 48 ч и затем обработкой ВтбИ в течение 5 ч. Испытывали концентрации 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл пептида А5 вместе с 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл ЮЕ-Ι. Включение ВтбИ измеряли для оценки уровня достигнутой пролиферации. Обеспечивали также контроли, содержащие только среду, без клеток (ВЬК), окрашивание фона (ВО) и 10% ЕВ8. Величины на Υ-оси являются флуоресценцией (оптическая плотность при 370 нм; среднее плюс стандартная ошибка для 4 лунок). Первые пять столбцов относятся к пептиду А5 в концентрациях 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл. Следующий
- 3 013230 столбец относится к контролю, содержащему только среду. Следующие три столбца относятся к 1ОЕ-1 (см. пример 1.5) одному в концентрациях 100, 10 и 0,1 нг/мл). Следующие три столбца относятся к контролям, содержащим 10% ЕВ8, фоновое окрашивание и отсутствие клеток, соответственно. * обозначает Р<0,05 в сравнении с контролем только со средой.
(В) Пептид А5: Клетки Н8ММ при 500 клеток на лунку.
Культивирование проводили в течение 24 ч в 10% ЕС8 с последующими двумя промывками в бессывороточной среде, стимуляцией в течение 48 ч и затем обработкой ВтбИ в течение 5 ч. Испытывали концентрации 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл пептида А5 в комбинации с 2 нг/мл ЮЕ-1, вместе с 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл ЮЕ-1. Включение ВтбИ измеряли для оценки уровня достигнутой пролиферации. Обеспечивали также контроли, содержащие среду, дополненную 2 нг/мл ЮЕ-1, без клеток (ВЬК), и 10% ЕВ8. Величины на Υ-оси являются флуоресценцией (оптическая плотность при 370 нм; среднее плюс стандартная ошибка для 4 лунок). Первые пять столбцов относятся к пептиду А5 в концентрациях 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл. Следующие три столбца относятся к ЮЕ-1 (см. пример 1.5) одному в концентрациях 100, 10 и 0,1 нг/мл. Следующие три столбца относятся к контролям, содержащим 10% ЕВ8, среду, дополненную 2 нг/мл ЮЕ-1, и без клеток, соответственно. * обозначает Р<0,01 и ** обозначает Р<0,001 в сравнении с контролем со средой, содержащей 2 нг/мл ЮЕ-1.
Фиг. 10: Действие на пролиферацию на клетках Н8ММ (A) Пептид А5: Клетки Н8ММ при 500 клеток на лунку.
Культивирование проводили в течение 24 часов в 10% ЕС8 с последующими двумя промывками в бессывороточной среде, стимуляцией в течение 48 часов и затем обработкой ВтбИ в течение 5 ч. Испытывали концентрации 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл пептида А5 вместе с 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл ЮЕ-1. Включение ВтбИ измеряли для оценки уровня достигнутой пролиферации. Обеспечивали также контроли, содержащие только среду, без клеток (ВЬК), окрашивание фона (ВО) и 10% ЕВ8. Величины на Υ-оси являются флуоресценцией (оптическая плотность при 370 нм; среднее плюс стандартная ошибка для 4 лунок). Первые пять столбцов относятся к пептиду А5 в концентрациях 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл. Следующий столбец относится к контролю, содержащему только среду. Следующие три столбца относятся к ЮЕ-1 (см. пример 1.5) одному в концентрациях 100, 10 и 0,1 нг/мл). Следующие три столбца относятся к контролям, содержащим 10% ЕВ8, фоновое окрашивание и отсутствие клеток, соответственно. * обозначает Р<0,05 в сравнении с контролем только со средой.
(B) Пептид А5: Клетки Н8ММ при 500 клеток на лунку.
Культивирование проводили в течение 24 ч в 10% ЕС8 с последующими двумя промывками в бессывороточной среде, стимуляцией в течение 48 ч и затем обработкой ВтбИ в течение 5 ч. Испытывали концентрации 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл пептида А5 в комбинации с 2 нг/мл ЮЕ-1, вместе с 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл ЮЕ-1. Включение ВтбИ измеряли для оценки уровня достигнутой пролиферации. Обеспечивали также контроли, содержащие среду, дополненную 2 нг/мл ЮЕ-1, без клеток (ВЬК), фоновое окрашивание (Вд) и 10% ЕВ8. Величины на Υ-оси являются флуоресценцией (оптическая плотность при 370 нм; среднее плюс стандартная ошибка для 4 лунок). Первые пять столбцов относятся к пептиду А5 в концентрациях 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл. Следующий столбец относится к контролю, содержащему только среду, дополненную 2 нг/мл ЮЕ-1. Следующие три столбца относятся к ЮЕ-1 (см. пример 1.5) одному в концентрациях 100, 10 и 0,1 нг/мл). Следующие три столбца относятся к контролям, содержащим 10% ЕВ8, фоновое окрашивание и отсутствие клеток, соответственно. * обозначает Р<0,1 в сравнении с контролем со средой, содержащей 2 нг/мл ЮЕ-1.
Фиг. 11: Действие на пролиферацию на клетках Н8ММ (A) Пептид А5: Клетки Н8ММ при 1000 клеток на лунку.
Культивирование проводили в течение 24 ч в 10% ЕВ8 с последующими двумя промывками в бессывороточной среде, стимуляцией в течение 48 ч и затем обработкой ВтбИ в течение 5 ч. Испытывали концентрации 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл пептида А5 вместе с 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл ЮЕ-1.
Включение ВтбИ измеряли для оценки уровня достигнутой пролиферации. Обеспечивали также контроли, содержащие только среду, без клеток (ВЬК), окрашивание фона (ВО) и 10% ЕС8. Величины на Υ-оси являются флуоресценцией (оптическая плотность при 370 нм; среднее плюс стандартная ошибка для 4 лунок). Первые пять столбцов относятся к пептиду А5 в концентрациях 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл. Следующий столбец относится к контролю, содержащему только среду. Следующие три столбца относятся к ЮЕ-1 (см. пример 1.5) одному в концентрациях 100, 10 и 0,1 нг/мл). Следующие три столбца относятся к контролям, содержащим 10% ЕС8, фоновое окрашивание и отсутствие клеток, соответственно.
(B) Пептид А5: Клетки Н8ММ при 1000 клеток на лунку.
Культивирование проводили в течение 24 ч в 10% ЕС8 с последующими двумя промывками в бессывороточной среде, стимуляцией в течение 48 ч и затем обработкой ВтбИ в течение 5 ч. Испытывали концентрации 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл пептида А5 в комбинации с 2 нг/мл ЮЕ-1, вместе с 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл ЮЕ-1. Включение ВтбИ измеряли для оценки уровня достигнутой пролиферации. Обеспечивали также контроли, содержащие среду, дополненную 2 нг/мл ЮЕ-1, без клеток (ВЬК), фоновое окрашивание (ВО) и 10% ЕВ8. Величины на Υ-оси являются флуоресценцией (оптическая плотность при 370 нм;
- 4 013230 среднее плюс стандартная ошибка для 4 лунок). Первые пять столбцов относятся к пептиду А5 в концентрациях 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл. Следующий столбец относится к контролю, содержащему только среду, дополненную 2 нг/мл ЮР-Ι. Следующие три столбца относятся к ЮР-Ι (см. пример 1.5) одному в концентрациях 100, 10 и 0,1 нг/мл. Следующие три столбца относятся к контролям, содержащим 10% РВБ, фоновое окрашивание и отсутствие клеток, соответственно. * обозначает Р<0,1 в сравнении с контролем со средой, содержащей 2 нг/мл ЮР-1.
Информация о последовательностях
ДНК-последовательности и аминокислотные последовательности МСР человека, крысы и кролика приведены в Списке последовательностей в виде БЕр ΙΌ N0:1/2, 3/4 и 5/6, соответственно. Их называют полноразмерными последовательностями МОР, так как они представляют зрелый МОР, кодируемый экзонами 3/4/5/6 гена ЮР-Ι, включающими в себя вставку 49/52 п.н., который изменяет рамку считывания и создает характерный С-конец МОР. Экзоны 1 и 2 являются альтернативными лидерными последовательностями. Для сравнения, соответствующие ДНК-последовательности и аминокислотные последовательности из ΙΟΡ-Ι печеночного типа человека, крысы и кролика приведены в виде БЕр ΙΌ N0:7/8, 9/10 и 11/12, соответственно. Сравнение этих шести аминокислотных последовательностей от начала последовательности, кодируемой экзоном 4, и далее, сделано на фиг. 1.
Последовательность нативного ЕЬ-пептида крысы (25 аминокислот; аминокислоты 87-111 БЕр ΙΌ N0:4) от С-конца МОР крысы приведена в виде БЕр ΙΌ N0:13.
Последовательность нативного ЕЬ-пептида кролика (25 аминокислот; аминокислоты 87-111 БЕр ΙΌ N0:6) от С-конца МОР кролика приведена в виде БЕр ΙΌ N0:14.
Последовательность нативного Ес-пептида человека (24 аминокислоты; аминокислоты 87-110 БЕр ΙΌ N0:2) от С-конца МОР человека приведена в виде БЕр ΙΌ N0:27.
Модифицированные последовательности, полученные из пептида БЕр ΙΌ N0:27, приведены в виде БЕр ΙΌ N0:28-32.
В БЕр ΙΌ N0:28 серин заменен аланином в положении 5.
В БЕр ΙΌ N0:29 серин заменен аланином в положении 12.
В БЕр ΙΌ N0:30 серин заменен аланином в положении 18.
В БЕр ΙΌ N0:31 аргинин заменен аланином в положении 14.
В БЕр ΙΌ N0:32 аргинин заменен аланином в положении 14 и аргинин заменен также аланином в положении 15.
Нативный Ес-пептид человека имеет аргинин в предпоследнем положении. Вариант этого нативного пептида с гистидином в предпоследнем положении был синтезирован и показан в БЕр ΙΌ N0:15. Этот пептид описан также как пептид 1 на фиг. 2. БЕр ΙΌ N0:26 представляет последовательность полноразмерного МОР человека, включающего в себя гистидин в предпоследнем положении вместо аргинина. БЕр ΙΌ N0:25 является кодирующей последовательностью ДНК для БЕр ΙΌ N0:26, в которой гистидин в предпоследнем положении кодируется САС, а остальная последовательность является такой же, что и в БЕр ΙΌ N0:1.
Модифицированные последовательности, полученные из пептида БЕр ΙΌ N0:15, приведены в виде БЕр ΙΌ N0:16-24. Они сравниваются с пептидом БЕр ΙΌ N0:15 и другим пептидом на фиг. 2.
В пептиде 2 (БЕр ΙΌ N0:16) серин заменен аланином в положении 5.
В пептиде 3 (БЕр ΙΌ N0:17) серин заменен аланином в положении 12.
В пептиде 4 (БЕр ΙΌ N0:18) серин заменен аланином в положении 18.
В пептиде 5 (БЕр ΙΌ N0:19) аргинин заменен аланином в положении 14.
В пептиде 6 (БЕр ΙΌ N0:20) аргинин заменен аланином в положении 14 и аргинин также заменен аланином в положении 15.
В коротком пептиде 1 (БЕр ΙΌ N0:21) аргинин заменен аланином в положении 14 и две С-концевые аминокислоты удалены.
В коротком пептиде 2 (БЕр ΙΌ N0:22) аргинин заменен аланином в положении 14 и четыре Сконцевые аминокислоты удалены.
В коротком пептиде 3 (БЕр ΙΌ N0:23) аргинин заменен аланином в положении 14 и три Иконцевые аминокислоты удалены.
В коротком пептиде 4 (БЕр ПЭ N0:24) аргинин заменен аланином в положении 14 и пять N концевых аминокислот удалены.
Четыре содержащие 8 аминокислот последовательности пептидов также включены в Список последовательностей.
БЕр ΙΌ N0:33 является 8 С-концевыми аминокислотами вариантной последовательности БЕр ΙΌ N0:15, содержащей гистидин в предпоследнем положении.
БЕр ΙΌ N0:34 является 8 С-концевыми аминокислотами С-конца нативного МОР человека БЕр ΙΌ N0:27, содержащей аргинин в предпоследнем положении.
БЕр ΙΌ N0:35 является последовательностью БЕр ΙΌ N0:33 с серином в положении 2, замещенным аланином. Таким образом, она соответствует 8 С-концевым аминокислотам БЕр ΙΌ N0:18 (пептида 4).
- 5 013230
БЕО ΙΌ N0:36 является последовательностью БЕО ΙΌ N0:34 с серином в положении 2, замещенным аланином. Таким образом, она соответствует 8 С-концевым аминокислотам БЕО ΙΌ N0:30.
Для облегчения ссылки эти последовательности описаны также в следующей таблице.
ЗЕО 10 ΝΟ: | Описание (аа обозначает аминокислота |
1 | Полноразмерный 1СГ-1-Ес (=МСГ) человека (нуклеотидная и аминокислотная) |
2 | Полноразмерный ΙΟΓ-Ι-Ес (=МСГ) человека (только аминокислотная) |
3 | Полноразмерный ЮЕ-1-ЕЬ крысы (=МСГ крысы) (нуклеотидная и аминокислотная) |
4 | Полноразмерный ЮЕ-1-ЕЬ крысы (=МСГ крысы) (только аминокислотная) |
5 | Полноразмерный 1СЕ-1-ЕЬ кролика (=МСЕ кролика) (нуклеотидная и аминокислотная) |
6 | Полноразмерный ЮГ-1-ЕЬ кролика (=М6Е кролика) (только аминокислотная) |
7 | Полноразмерный 1СГ-1 печеночного типа человека (нуклеотидная и аминокислотная) |
8 | Полноразмерный 1СЕ-1 печеночного типа человека (только аминокислотная) |
9 | Полноразмерный 1СЕ-1 печеночного типа крысы (нуклеотидная и аминокислотная) |
10 | Полноразмерный 1СГ-1 печеночного типа крысы (только аминокислотная) |
11 | Полноразмерный 1СЕ-1 печеночного типа кролика (нуклеотидная и аминокислотная |
12 | Полноразмерный 1СГ-1 печеночного типа кролика (только аминокислотная) |
13 | Синтетический пептид, соответствующий аа 87-111 5Еф Ю N0:4 |
- 6 013230
14 | Синтетический пептид, соответствующий аа 87-111 ЗЕО ΙΡ N0:6 |
15 | Синтетический пептид, соответствующий аа 87-110 ЗЕО ΙΌ N0:2 с Агд109->Н13 (=Агд23->Н1з с использованием нумерации ЗЕО Ю N0:15) |
16 | Пептид ЗЕО Ю N0:15 с Зег5->А1а |
17 | Пептид ЗЕО Ю N0:15 с Зег12->А1а |
18 | Пептид ЗЕО Ю N0:15 с Зег18->А1а |
19 | Пептид ЗЕО Ю N0:15 с Агд14—>А1а |
20 | Пептид ЗЕО Ю N0:15 с Агд14^-А1а, Агд15->А1а |
21 | Синтетический пептид, соответствующий аа 1-22 ЗЕО Ю N0:15 с Агд14->А1а |
22 | Синтетический пептид, соответствующий аа 1-20 ЗЕО Ю N0:15 с Агд14->А1а |
23 | Синтетический пептид, соответствующий аа 4-24 ЗЕО ΙΠ N0:15 с Агд14->А1а и Агд23—>А1а |
24 | Синтетический пептид, соответствующий аа 6-24 ЗЕО Ю N0:2 с Агд14—>А1а и Агд23->Н1з |
25 | Последовательность ЗЕО Ю N0:1 с Агд109->Н1з (нуклеотидная и аминокислотная) |
26 | Последовательность ЗЕО Ю N0:2 с Агд109->Н1в (только аминокислотная) |
27 | Синтетический пептид, соответствующий аа 87-110 ЗЕО Ю N0:2 |
28 | Пептид ЗЕО Ю N0:27 с Зег5->А1а |
29 | Пептид ЗЕО Ю N0:27 с Зег12->А1а |
30 | Пептид ЗЕО Ю N0:27 с 5ег18->А1а |
31 | Пептид ЗЕО Ю N0:27 с Агд14->А1а |
32 | Пептид ЗЕО Ю N0:27 с Агд14-»А1а, Агд15—>Л1а |
33 | Пептид, соответствующий 8 С-концевым аминокислотам ЗЕО Ю N0:15 |
34 | Пептид, соответствующий 8 С-концевым аминокислотам ЗЕО Ιϋ N0:27 |
35 | Пептид, соответствующий 8 С-концевым аминокислотам ЗЕО Ю N0:18 |
36 | Пептид, соответствующий 8 С-концевым аминокислотам ЗЕО Ю N0:30 |
Подробное описание изобретения Полипептиды и удлиненные полипептиды изобретения Полипептиды изобретения
Полипептиды данного изобретения имеют длину до 50 аминокислотных остатков. Например, они могут иметь длину до 10 аминокислот, до 30 аминокислот, например длину 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 аминокислот или до 35, 40, 45 или 50 аминокислот. Предпочтительно, они имеют длину 15-30 аминокислот, более предпочтительно 20-28, наиболее предпочтительно 22, 23, 24 или 25 аминокислот. Предпочтительными являются также полипептиды с длиной 5-10 аминокислот, т.е. 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, особенно полипептиды с длиной 8 аминокислот.
- 7 013230
Полипептид данного изобретения содержит последовательность аминокислот, полученную из Сконцевого Е-пептида изоформы МОЕ ЮЕ-Ι. Изоформа МОЕ является, как обсуждалось выше, изоформой, в которой альтернативный сплайсинг вводит в мРНК вставку, которая удлиняет и изменяет рамку считывания С-концевого Е-пептида, обнаруженного в С-конце ЮЕ-Ι, с образованием Ес- или ЕЬ-пептида. Изоформа МОЕ будет обычно иметь по меньшей мере 80%, предпочтительно 85% или 90% идентичность последовательности с одним из МОЕ 8ЕО ΙΌ N0:2, 4 или 6. В МОЕ человека (8Е0 ΙΌ N0:1 и 2) эта вставка состоит из 49 п.н., и С-концевой Е-пептид известен как Ес-пептид (8Е0 ΙΌ N0:27), который имеет длину 24 аминокислот. В МОЕ крысы и кролика (8Е0 ΙΌ N0:3-6) эта вставка состоит из 49 п.н., и Сконцевые Е-пептиды известны как ЕЬ-пептиды, которые имеют длину 25 аминокислот (8Е0 ΙΌ N0:13 и 14). Последовательность данного изобретения может быть получена из любого из этих С-концевых Епептидов МОЕ или из другого С-концевого Е-пептида из МОЕ любых других видов.
Последовательность, содержащаяся в полипептиде данного изобретения и полученная из Сконцевого Е-пептида изоформы МОЕ, может быть получена из указанного С-концевого Е-пептида любым путем, пока удовлетворяются требования в отношении биологической активности и стабильности (см. ниже). В частности, эта последовательность может быть получена из С-концевого Е-пептида МОЕ в том смысле, что она имеет точно последовательность С-концевого Е-пептида (например, 8Е0 ΙΌ N0:13, 14, 27 или 34) и только не присутствует в полноразмерной молекуле МОЕ. Она может быть получена из С-концевого Е-пептида МОЕ в том смысле, что ее последовательность является измененной (см. раздел «Модификации» ниже), опять, пока удовлетворяются требования в отношении биологической активности и стабильности (см. ниже).
До максимальной длины 50 аминокислот этот полипептид может также содержать нативную последовательность МОЕ, ^терминальную относительно последовательности, полученной из С-концевого Епептида. Альтернативно, любая дополнительная последовательность может быть не получена из МОЕ, т.е. она может быть любой последовательностью, опять-таки, пока она соответствуют требованиям в отношении биологической активности и стабильности (см. ниже).
Последовательность, полученная из С-концевого Е-пептида МОЕ, может включать в себя по меньшей мере 10, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 20 аминокислот, например 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 аминокислоты в случае С-концевого Ес-пептида МОЕ человека или 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот в случае С-концевого ЕЬ-пептида МОЕ крысы или кролика. Альтернативно, она может включать в себя до 10 аминокислот, предпочтительно 5-10 аминокислот, т.е. 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, особенно 8 аминокислот.
Полипептиды или удлиненные полипептиды данного изобретения могут быть собраны вместе с образованием больших структур, содержащих два или более полипептидов данного изобретения, например множественные копии одного и того же полипептида или удлиненных полипептидов данного изобретения, или смеси различных полипептидов. В зависимости от природы полипептидов и, в частности, от того, содержат ли они любые Ь-Э-превращення (см. ниже), эти структуры могут быть получены в виде слитых белков, обычно рекомбинантной экспрессией стандартными способами из кодирующей ДНК, или собраны синтетически, или экспрессированы в виде слитых белков и затем подвергнуты подходящим химическим модификациям.
Удлиненные полипептиды изобретения
Удлиненный полипептид данного изобретения содержит полипептид данного изобретения, удлиненный последовательностью не дикого типа. Под этим имеется в виду, что любая удлиненная последовательность не является последовательностью МОЕ в том смысле, что, если Юконец или С-конец полипептида данного изобретения представляет нативную последовательность МОЕ, то эта последовательность может быть просто не присоединена к любой последовательности, которая соседствует с ней в нативном МОЕ. Кроме того, удлинение может иметь любую оследовательность. Таким образом, полипептиды данного изобретения могут быть удлинены на любом конце или на обоих С-и Юконцах аминокислотной последовательностью любой длины. Например, удлинение может содержать до 5, до 10, до 20, до 50 или до 100 или 200 или более аминокислот. Обычно любое такое удлинение будет коротким, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот в длину. Удлинение может содержать аминокислоты Όформы, или даже может состоять целиком из аминокислот Ό-формы (см. ниже), например для уменьшения атаки экзопептидаз. Например, полипептид может быть удлинен 1-5 аминокислотами Ό-формы на одном конце или на обоих концах. Например, в некоторых вариантах осуществления на С-конце может быть включен дополнительный остаток цистеина.
Модификации
Полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения может быть модифицирован любым способом, который увеличивает его стабильность в сравнении с немодифицированным Е-пептидом, из которого получена их последовательность. Стабильность может быть увеличена различными путями. Например, ожидается, что модификации (например, ПЭГилирование или другие химические модификации или превращения аминокислот Ό-Ό-форм) в отношении С- и/или Юконцов этого белка будут защищать от против атаки экзопептидаз, как и циклизация, и что внутренние модификации (например, замещение, делеция, инсерция и внутреннее превращение Ό-Ό-форм) будут защищать его от расщепления
- 8 013230 эндопептидазами вследствие разрушения их сайтов расщепления.
Например, полипептид может быть ПЭГилирован предпочтительно на Ν-конце до такой степени, что местоположение ПЭГилирования может регулироваться, хотя также предполагается ПЭГилирование в других сайтах, таких как С-конец и между С- и Ν-концами. ПЭГилирование включает в себя ковалентное присоединение ПЭГ к этому полипептиду. Любой подходящий тип ПЭГ, например любой подходящей молекулярной массы, может быть использован, пока полученный ПЭГилированный полипептид соответствует требованиям в отношении биологической активности и стабильности (см. ниже).
Для достижения стабилизации или для другой цели полипептид данного изобретения может также включать в себя другие химические модификации наряду с ПЭГилированием или вместо него. Такие модификации включают в себя гликозилирование, сульфатирование, амидирование или ацетилирование. В частности, полипептиды могут быть ацетилированы на Ν-конце или амидированы на С-конце или на обоих концах. Альтернативно или дополнительно может быть добавлена одна или несколько групп гексановой или аминогексановой кислоты, предпочтительно одна группа гексановой или аминогексановой кислоты, обычно на Ν-конце.
Наряду с этим или альтернативно, этот полипептид или удлиненный полипептид может включать в себя одну или несколько аминокислот в Ό-форме. В природе аминокислоты находятся в Ь-форме. Встраивание аминокислот Ό-формы может улучшать стабильность. Обычно могут быть использованы несколько, например 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот Ό-формы. Однако может быть также использовано большее количество, например 5-10, 10-15, 15-20 или 20 или более, пока полученный ПЭГилированный полипептид соответствует всем требованиям в отношении биологической активности и стабильности (см. ниже). Если он удовлетворяет этим требованиям, даже весь этот полипептид может быть синтезирован с использованием аминокислот в Ό-форме.
Аминокислоты в Ό-форме могут быть использованы в любом положении в этом полипептиде. В Сконцевом Е-пептиде МОЕ человека ЗЕР ΙΌ N0:27 предпочтительно заменять один или оба аргинина в положениях 14 и 15 аминокислотами в Ό-форме. Соответствующие изменения являются также предпочтительными в последовательностях ЗЕр ΙΌ N0:13 и 14 крысы и кролика (положения 14, 15 и 16, так как последовательности крысы/кролика содержат три аргинина последовательно, тогда как Е-пептид человека содержит только два аргинина) и в вариантной последовательности ЗЕр ΙΌ N0:15.
Стереохимические и/или направленные пептидные изомеры могут быть также использованы. Например, могут быть использованы ретро (КЕ)-пептиды, в которых последовательность данного изобретения собрана из Ь-аминокислот, но в обращенном порядке. Альтернативно, могут быть использованы ретро-инверсо (К1)-пептиды, в которых последовательность является обращенной и синтезированной из Ό-аминокислот.
Дополнительно или альтернативно, Ό-аминокислоты могут быть включены на одном конце или на другом конце, или на обоих концах этого полипептида. Предполагается, что это поможет защитить от воздействия экзопептидаз. Это может быть достигнуто превращением концевых аминокислот, например концевых 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот на одном или на обоих концах последовательности, полученной из С-концевого Е-пептида МОЕ в Ό-форму. Альтернативно или дополнительно, это может быть достигнуто добавлением 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных аминокислот Ό-формы на одном или на обоих концах этого полипептида. Такие дополнительные аминокислоты могут соответствовать или могут не соответствовать аминокислотам, которые граничат с последовательностью, полученной из С-концевого Е-пептида МОЕ, в нативном МОЕ. Такие дополнительные аминокислоты могут быть любыми аминокислотами. Одной возможной аминокислотой для добавления в Ό-форме таким образом является аргинин. Например, остаток аргинина в Ό-форме может быть добавлен на Ν-конце, на С-конце или на обоих концах.
В одном варианте осуществления последовательность нативного С-концевого Е-пептида МОЕ человека ЗЕр ΙΌ Ν0:27 сохраняют, но аргинины в положениях 14 и 15 ЗЕр ΙΌ Ν0:27 превращают в Όформу и обеспечивают Ν-концевое ПЭГилирование. Может быть также обеспечено С-концевое амидирование.
В другом варианте осуществления последовательность варианта С-концевого Е-пептида МОЕ человека ЗЕр ΙΌ Ν0:15 сохраняют, но аргинины 14 и 15 в ЗЕр ΙΌ Ν0:15 превращают в Ό-форму и обеспечивают Ν-концевое ПЭГилирование.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления используют последовательность из 8 Сконцевых аминокислот из ЗЕр ΙΌ Ν0:15 или 27, т.е. последовательность ЗЕр ΙΌ Ν0:33 или 34, и обеспечивают Ν-концевое ПЭГилирование или на С-конце добавляют группу гексановой или аминогексановой кислоты. Может быть также обеспечено С-концевое амидирование.
Альтернативно или дополнительно, полипептиды данного изобретения могут также включать в себя другие модификации, например укорочение, инсерцию, внутреннюю делецию или замещение.
Что касается укорочения, было обнаружено, что более короткие пептиды, основанные на Сконцевых восьми аминокислотах ЗЕр ΙΌ Ν0:15, являются активными. Однако результаты в примере 5 ниже предполагают, что активность более длинных пептидов, связанных с С-концом МОЕ, может быть вполне чувствительной к укорочению, в частности Ν-конца этих пептидов. На Ν-конце пептида ЗЕр ΙΌ Ν0:15 укорочение на 3 аминокислоты приводило к потере активности в модели мышечных клеток, ис
- 9 013230 пользованной в примере 5. На С-конце пептида 8ЕО ΙΌ N0:15 укорочение на четыре аминокислоты приводило к потере активности в модели мышечных клеток, хотя укорочение на две аминокислоты не приводило к потере активности. Таким образом, в случае нативных последовательностей Е-пептида человека, крысы и кролика и в вариантном Е-пептиде 8Е0 ΙΌ N0:15 и других пептидах данного изобретения, которые имеют длины, сравнимые с длинами нативных пептидов (например, 18 или более аминокислот), ожидается, что можно будет удалять 1, 2 или 3 аминокислоты на С-конце без потери активности. Ожидается также, что можно будет удалять 1 или 2 аминокислоты на Ν-конце без потери активности.
Что касается инсерции, короткие отрезки аминокислот могут быть инсертированы в последовательность, полученную из последовательности С-концевого Е-пептида МОЕ человека, пока полученный полипептид соответствует требованиям в отношении биологической активности и стабильности (см. ниже) и содержит менее чем 50 аминокислот. Каждая инсерция может содержать, например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот. Могут быть одна или более, например 2, 3, 4 или 5 таких инсерции.
Что касается делеции, короткие отрезки аминокислот могут быть делетированы из внутренней последовательности, полученной из последовательности С-концевого Е-пептида МОЕ, пока полученный полипептид соответствует требованиям в отношении биологической активности и стабильности (см. ниже). Одна или несколько таких делеций, например, 1, 2, 3, 4 или 5 делеций, могут быть получены, например, до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот в целом.
Что касается замещения, любая из аминокислот в этом полипептиде может быть, в принципе, замещена любой другой аминокислотой, пока полученный полипептид соответствует требованиям в отношении биологической активности и стабильности (см. ниже). Одно или несколько таких замещений могут быть получены, например, до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, до 15 или до 20 замен в целом. Предпочтительно в последовательности, полученной из С-концевого Е-пептида МОЕ, будут выполняться не более чем 10 замещений, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 замещений. Предпочтительно, в последовательности, полученной из С-концевого Е-пептида МОЕ, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 69%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% аминокислотных остатков будут такими же, что и аминокислотные остатки в нативном С-концевом Е-пептиде МОЕ, из которого получена эта последовательность. В одном предпочтительном подходе замещены остатки на одном конце или на обоих концах этого полипептида (концевые остатки). Ожидается, что это будет защищать от атаки экзопептидаз. Таким образом, может быть предпочтительной замещение остатков в Ν-концевых и С-концевых положениях или в положениях, непосредственно смежных с концевыми положениями, или до 3, 4, или 5 положений от одного конца или обоих концов.
Замещения могут увеличивать стабильность или биологическую активность. Например, результаты, обсуждаемые в примере 5 и на фиг. 2 ниже, указывают на то, что замещение в одном или нескольких положениях 5, 12, 14 и 18 пептида 8Е0 ΙΌ N0:15 может увеличивать стабильность. Те же самые результаты показывают, что замещения в положениях 12, 14 и 18 могут также увеличивать биологическую активность. Таким образом, предпочтительными являются замещения в положениях 5, 12, 14 и 18 пептидов 8Е0 ΙΌ N0:27 и 15 и в положении 2 8Е0 ΙΌ N0:33 и 34 (которые соответствуют положению 18 8Е0 ΙΌ N0:15 и 27). Предпочтительными являются также соответствующие замещения в положениях 5, 12, 15 и 19 С-концевых Е-пептидов МОЕ крысы/кролика 8Е0 ΙΌ N0:13 и 14.
Независимо от того, находится ли она в положениях 5, 12, 14 или 18 8Е0 ΙΌ N0:27 или 15, положении 2 8Е0 ΙΌ N0:33 и 34, положениях 5, 12, 15 и 19 8Е0 ΙΌ N0:13 и 14 или в другом месте, замещение нативной аминокислоты аланином является предпочтительной возможностью, как показано в примере 5 и на фиг. 2. Однако равным образом могут быть использованы и другие аминокислоты.
Альтернативно или дополнительно, этот полипептид может включать в себя замещения, которые не имеют значимого действия на стабильность или биологическую активность. Они обычно будут консервативными замещениями. Консервативные замещения могут быть выполнены, например, в соответствии со следующей таблицей. Аминокислоты в одном и том же блоке во втором столбце и предпочтительно в одном и том же ряду в третьем столбце могут замещать друг друга.
Алифатические | Неполярные | САР |
I Ь V | ||
Полярныенезаряженные | С 5 Τ М | |
ν | ||
Полярные-заряженные | С Ε | |
к к | ||
Ароматические | Н Г Η Υ |
Обычно модификации аминокислотных последовательностей, такие как Ь-Э-превращения, замещения, инсерции и делеции, в полипептидах данного изобретения будут обнаружены в последовательности аминокислот, которая получена из С-концевого Е-пептида МОЕ. Однако, если этот полипептид содержит дополнительную МОЕ-последовательность, они могут быть альтернативно или дополнительно обнару
- 10 013230 жены в этой дополнительной последовательности. Например, если полипептид данного изобретения содержит дополнительную МОЕ-последовательность, которая является №концевой относительно последовательности этого Е-пептида (например, 8Е0 ГО N0:13, 14 или 27) в нативном МОЕ, в этой последовательности могут быть обнаружены модификации.
Альтернативно или дополнительно, стабильность может быть также увеличена циклизацией полипептидов или удлиненных полипептидов данного изобретения. Ожидается, что это будет защищать от атаки экзопептидаз.
Предпочтительные полипептиды данного изобретения включают в себя следующие полипептиды.
(ί) Пептид, который имеет длину 24 аминокислот и имеет последовательность 8Е0 ГО N0:15, но стабилизирован превращением двух аргининов 8Е0 ГО N0:15 (положения 14 и 15) из Ь-формы в Όформу и №концевым ПЭГилированием.
(ίί) Пептид, как в (1) выше, т.е. имеющий последовательность 8Е0 ГО N0:15, но стабилизированный превращением двух аргининов 8Е0 ГО N0:15 (положения 14 и 15) из Ь-формы в Ό-форму.
(ίίί) Пептиды, описанные в примере 5 и на фиг. 2 в виде пептидов 2, 3, 4 и 5 (8Е0 ГО N0:16-19).
(ίν) Пептид, описанный в примере 5 и на фиг. 2 в виде короткого пептида 1 (8Е0 ГО N0:21), который имеет последовательность 8Е0 ГО N0:19 (в которой аргинин в положении 14 заменен аланином), но укорочен на 2 аминокислоты в С-конце.
(ν) Пептид, соответствующий пептиду (ί), приведенному выше, но основанный на нативном Сконцевом пептиде человека 8Е0 ГО N0:27, который содержит аргинин, а не гистидин в предпоследнем положении, т.е. пептид, имеющий последовательность 8Е0 ГО N0:27, но стабилизированный превращением двух аргининов в положениях 14 и 15 8Е0 ГО N0:27 из Ь-формы в Ό-форму и №концевым ПЭГилированием.
(νί) Пептид, как в (ν), приведенному выше, но лишенный ПЭГилирования, т.е. имеющий последовательность 8Е0 ГО N0:27, но стабилизированный превращением двух аргининов в положениях 14 и 15 8Е0 ГО N0:27 из Ь-формы в Ό-форму.
(νίί) Пептиды, соответствующие пептидам (ίίί), приведенным выше, но основанные на нативном Сконцевом пептиде человека 8Е0 ГО N0:27, которые содержат аргинин, а не гистидин в предпоследнем положении; показанные здесь в виде 8Е0 ГО N0:28-31.
(νίίί) Пептиды любой из 8Е0 ГО N0:33-36 с №концевым ПЭГилированием или присоединением N концевой группы гексановой или аминогексановой кислоты.
(ίχ) Любой из пептидов (ί), (ίί), (ίίί), (ίν), (ν), (νί), (νίί) или (νίίί), приведенный выше с С-концевым амидированием, особенно пептиды (ίί) и (νί), приведенные выше с С-концевым амидированием, т.е. пептиды, имеющие последовательности 8Е0 ГО N0:15 и 27, с превращением Ь-аргинина в Ό-аргинин в положениях 14 и 15 и С-концевым амидированием, но не имеющие ПЭГилирования.
(х) Любой из пептидов (ί), (ίί), (ίίί), (ίν), (ν), (νί), (νίί), (νίίί) или (ίχ), приведенных выше, с дополнительным остатком цистеина на С-конце.
(χί) Любой из пептидов (ί), (ίί), (ίίί), (ίν), (ν), (νί), (νίί), (νίίί) или (ίχ), приведенных выше с дополнительным остатком аргинина Ό-формы на №конце.
Модификации в соответствии с этим изобретением могут придавать дополнительные преимущества, а также увеличенную стабильность. Например, они могут придавать увеличенную терапевтическую активность или быть предпочтительными с иммунологической точки зрения (например, вследствие уменьшенной иммуногенности). Это относится, в частности, к модификациям, которые включают в себя Ь-О-превращение и/или стереохимическую и/или направленную изомерию (см. выше).
Биологическая активность
Полипептиды и удлиненные полипептиды данного изобретения обладают биологической активностью. Эта активность может быть выбрана из следующего.
Способность увеличивать мышечную силу в дистрофической и/или недистрофической мышце у мышей, людей или других млекопитающих (см. пример 2 ниже). Предпочтительно полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения будет способен увеличивать мышечную силу (например, измеренную по максимальной полученной тетанической силе) по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75% или по меньшей мере на 100% в дистрофической и/или недистрофической мышце.
Кардиозащитная способность у овец, мышей, людей или других животных (см. пример 3 ниже). Предпочтительно, полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения будет способен предотвращать или ограничивать повреждение миокарда в имеющем инфаркт или механически перегруженном сердце. Это может быть измерено по петлям давление/объем или ссылкой на способность увеличивать фракцию выброса в сравнении с поврежденным сердцем, в которое не вводят полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения. Предпочтительно, полипептид или удлиненный полипептид этого изобретения будет способен увеличивать фракцию выброса по меньшей мере на 1%, по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 3%, по меньшей мере на 4%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 6%, по меньшей мере на 7%, по меньшей мере на 8%, по меньшей мере на 9% или по меньшей мере на
- 11 013230
10% или более.
Нейрозащитная способность ίη νίίτο или ίη νίνο у мышей, песчанок, людей или других млекопитающих (см. пример 4 ниже). Предпочтительно полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения будет иметь способность уменьшать смертность клеток в органотипических культурах гиппокампа и/или других сходных моделях ίη νίίτο. Предпочтительно после воздействия ТВН или другого агента, который индуцирует окислительный стресс или вызывает повреждение другими путями, полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения будет иметь способность уменьшать смертность клеток в таких моделях по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85% или по меньшей мере на 90% или более. Альтернативно или дополнительно, полипептиды или удлиненные полипептиды данного изобретения могут иметь нейрозащитную способность.
Кроме того, полипептиды или удлиненные полипептиды данного изобретения могут иметь одно или несколько биологических свойств, характерных для полноразмерного МОР (например, 8ЕЦ ΙΌ N0:2, 4 или 6). Например, полипептиды или удлиненные полипептиды данного изобретения могут иметь функциональные свойства МОР, идентифицированные в \У0 97/33997. В частности, они могут быть способны индуцировать рост скелетной мышечной ткани. Подобным образом, как обсуждалось здесь, они могут иметь способность положительно регулировать синтез белка, необходимый для восстановления (репарации) скелетных мышц, и/или активировать сателлитные (стволовые) клетки в скелетной мышце.
В этом отношении одним способом оценки биологической активности является способ с использованием красителя Аламарового Синего, обсуждаемого в примере 5.2.2. Он включает в себя контактирование полипептида с мононуклеарными миобластными клетками и оценку степени, до которой он заставляет их пролиферировать. Это может оцениваться в баллах любым подходящим способом, например, по шкале 0-3, как обсуждается в примерах. Активность может быть также измерена с использованием циклинов, таких как циклин ΙΌ, которые являются ранними маркерами деления клеток. Активность может быть также измерена с использованием бромдезоксиуридина (ВгбИ). ВгбИ будет замещать собой тимидин во время репликации ДНК и, следовательно, может быть использован для идентификации клеток, ДНК которых подвергается репликации, и для количественного измерения репликации и клеточного деления, которые имеют место.
Альтернативно или дополнительно, полипептиды или удлиненные полипептиды данного изобретения могут иметь нейрологические свойства, ранее идентифицированные в XV О 01/136483. Таким образом, они могут обладать способностью спасения мотонейронов. В частности, они могут быть способны уменьшать потерю мотонейронов после авульсии нерва на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100% у лечащегося субъекта в сравнении с эквивалентной ситуацией у не получающего лечения субъекта. Предпочтительным является уменьшение потери мотонейронов на 70 или более или 80% или более (т.е. до 30% или менее или 20% или менее). Степень спасения может быть рассчитана с использованием любого подходящего способа, например, известного способа, такого как стереологический способ. В качестве конкретного теста могут быть использованы способы, использованные в ν0 01/136483, которые основаны на измерении спасения мотонейронов в ответ на авульсию лицевого нерва у крыс.
Альтернативно или дополнительно, полипептиды или удлиненные полипептиды данного изобретения могут иметь свойства, идентифицированные в ν0 03/060882, одним из которых является, скажем, способность предотвращать или ограничивать повреждение миокарда после ишемии или механической перегрузки предотвращением смерти клеток, или апоптоза, мышечных клеток миокарда. Предпочтительно, полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения будет иметь способность полного предотвращения апоптоза в зоне сердечной мышцы, к которой он применен. Однако апоптоз может быть только частично предотвращен, т.е. ограничен. Повреждение является ограниченным, если достигается любое уменьшение повреждения в сравнении с повреждением, которое имело бы место без лечения по данному изобретению, например, если повреждение уменьшается на 1% или более, 5% или более, 10% или более, 20% или более, 30% или более, 50% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более, 98% или более или 99% или более, как измерено количеством или долей клеток, которые погибают, или размером площади мышцы, которая теряет функцию, или общей способностью сердца нагнетать кровь.
В частности, уменьшение повреждения может оцениваться ίη νίνο определением минутного сердечного выброса, фракции выброса и т.д. с использованием минимально инвазивных способов. Могут быть также анализированы такие маркеры, как креатинкиназа и тропонин Т в сыворотке. Имеются параметры, используемые в клинических ситуациях для определения степени повреждения сердечной мышцы после повреждения.
Способность предотвращать апоптоз может быть измерена любым подходящим способом. Например, со ссылкой на пример 4 и на фиг. 3 и 6, она может быть измерена по способности предотвращать апоптоз в клетке сердечной мышцы или клеточной линии, подобной сердечным мышечным клеткам, как показано фрагментацией ДНК. Способность предотвращать апоптоз, обнаруживаемая по фрагментации ДНК, может быть испытана обработкой этих клеток сорбитом или другим агентом, который помещает
- 12 013230 эти клетки под осмотический стресс в течение, например, до 1, 2, 4, 6, 12, 24 или 48 ч, предпочтительно 12-24 ч, более предпочтительно 24 ч, и исследованием, может ли наблюдаться характер фрагментации, ассоциированный с апоптозом. Полипептид МОЕ данного изобретения, экспрессируемый таким образом, обычно будет уменьшать, предпочтительно элиминировать фрагментацию ДНК в этих условиях, в сравнении с необработанной клеткой, после 6, 12 или 24 ч обработки сорбитом.
Отсутствие экспрессии, или низкая экспрессия, генов, которые действуют в качестве маркеров апоптоза, может также действовать как указание предотвращения апоптоза. Одним подходящим маркером является ген Вах. Подобным образом, увеличенная экспрессия антиапоптотических маркеров в МОЕ-трансфицированных клетках в апоптотических условиях может быть принята за признак того, что полипептид данного изобретения предотвращает апоптоз. Одним подходящим антиапоптотическим маркерным геном является Вс12. Способность предотвращать апоптоз может быть также измерена по способности полипептида МОЕ предотвращать уменьшение количества клеток в миоцитных клетках ίη νίίτο.
Другим предпочтительным свойством полипептидов и удлиненных полипептидов данного изобретения является способность индуцировать гипертрофический фенотип в сердечных мышечных клетках. В частности, это может быть испытано оценкой способности индукции гипертрофического фенотипа в первичных культурах сердечных миоцитов ίη νίΐΓο. Предпочтительным способом определения этого является тестирование на увеличение экспрессии ΑΝΕ (атриального натрийуретического фактора) и/или ЬМНС (тяжелой цепи бета-миозина). ΑΝΕ является эмбриональным маркерным геном, который положительно регулируется в гипертрофических условиях. ЬМНС является важным сократительным белком в мышце.
Стабильность полипептидов и удлиненных полипептидов изобретения
Полипептиды и удлиненные полипептиды данного изобретения имеют увеличенную стабильность в сравнении с нативными С-концевыми Е-пептидами МОЕ, из которых получены их последовательности. Такие сравнения выполняют между полипептидом или удлиненным полипептидом данного изобретения и нативным С-концевым Е-пептидом МОЕ в его выделенной, немодифицированной форме (например, в немодифицированной форме БЕО ΙΌ N0:13, 14, 27 или 34, отделенной от остальной молекулы МОЕ, и в выделенной форме в виде 24-мера (БЕО ΙΌ N0:27), 25-мера (БЕО ΙΌ N0:13/14) или 8-мера (БЕО ΙΌ N0:34)). Сравнения могут выполняться также с гистидинсодержащими последовательностями БЕО ΙΌ N0:15 и 33. Стабильность может быть увеличена в любой степени посредством обсуждаемых здесь модификаций.
Стабильность может оцениваться по периоду полувыведения в плазме человека или любым другим подходящим способом. В частности, стабильность может быть измерена оценкой чувствительности пептидов к протеолитическому расщеплению в свежей плазме человека в соответствии со способом примера
5.1 ниже, в котором эту плазму хранили до использования при -70°С, 10 мкг пептида добавляли к 2 мл плазмы, плюс 7 мл РВБ и эту смесь инкубировали при 37°С в течение разных интервалов времени. Затем использовали Вестерн-блоттинг для детектирования каждого пептида на протяжении этих временных интервалов. (На фиг. 7: А=0 мин; В=30 мин; С=2 ч; Ό=24 ч. Результаты для пептида с Ь-Э-превращением и ^концевым ПЭГилированием показаны справа; результаты для пептида, лишенного превращений Ьформы в Ό-форму и ^концевого ПЭГилирования, показаны слева). Относительно малое количество пептида, лишенного Ь-Э-превращения и ПЭГилирования, могло быть детектировано после 30 мин, очень мало после 2 ч и нисколько или почти нисколько после 24 ч. В отличие от этого, пептид с Ь-Όпревращением и ПЭГилированием мог быть детектирован в гораздо большем количестве при 2 и 24 ч.
Другие меры стабильности могут быть основаны на определении потери биологической активности на протяжении времени. Это может быть выполнено любым подходящим способом, например, с использованием анализа ίη νίΐΓο на любой из критериев биологической активности, обсуждаемых здесь.
Количественно, в относительных единицах, предпочтительные полипептиды или удлиненные полипептиды данного изобретения могут иметь периоды полувыведения в плазме, которые увеличены по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 200% или по меньшей мере на 500% или более в сравнении с соответствующим немодифицированным Сконцевым Е-пептидом МОЕ.
Количественно, в относительных единицах, предпочтительные полипептиды или удлиненные полипептиды данного изобретения могут иметь периоды полувыведения в плазме по меньшей мере 1 ч, по меньшей мере 2 ч, по меньшей мере 4 ч, по меньшей мере 8 ч, по меньшей мере 12 ч, по меньшей мере 24 ч или по меньшей мере 48 ч или более.
Альтернативно, могут быть использованы количественные или полуколичественные измерения стабильности, как в примере 5 и на фиг. 2, например, балльной оценкой стабильности полипептидов и удлиненных полипептидов по шкале от 0 до 3. По этой шкале полипептид БЕО ΙΌ N0:15 имел оценку 1. Некоторые другие модифицированные полипептиды данного изобретения имели оценки 2 или 3. Полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения будет обычно иметь оценку, более высокую на такой шкале, чем соответствующий нативный С-концевой Е-пептид МОЕ.
- 13 013230
Дополнительные пептиды изобретения
Хотя многие из пептидов данного изобретения будут стабилизированными, в определенных обстоятельствах можно использовать нестабилизированные полипептиды, в том числе нативные полипептиды 8ЕО ΙΌ N0: 13, 14, 27 и 34 или гистидинсодержащий вариант 8Е0 ΙΌ N0:15 и 33. В лечении неврологических и сердечных нарушений в соответствии с этим изобретением может быть желательной относительно быстрая деградация полипептида или удлиненного полипептида данного изобретения, т.е. проявление его действия в течение относительно короткого периода времени. Таким образом, стабилизация необязательно потребуется в контексте таких способов лечения.
В случаях, когда стабилизации не требуется, предпочтительно использовать полипептиды 8Е0 ΙΌ N0:13, 14, 27 и 34 или гистидинсодержащий вариант 8Е0 ΙΌ N0:15 и 33 без стабилизирующих модификаций. Однако могут быть также использованы модифицированные полипептиды. Любая из обсужденных здесь модификаций может быть использована, за исключением того, что, в этом аспекте, не требуется, чтобы эти модификации приводили к увеличенной стабильности.
Способы лечения в соответствии с изобретением
Полипептиды и удлиненные полипептиды данного изобретения могут быть использованы для лечения ряда состояний. В широком смысле они разделяются на три категории: нарушения скелетной мышцы, нарушения сердечной мышцы и неврологические нарушения. Однако поскольку нервная и мышечная функции являются взаимозависимыми, между этими категориями может быть некоторое перекрывание, например, в категории нервно-мышечных нарушений.
Неврологические нарушения могут быть обычно разделены на две категории, нейрогенные нарушения, где дефект лежит в самой нервной системе, и миогенные или связанные с мускулатурой неврологические нарушения. Обе категории могут лечиться в соответствии с этим изобретением.
Нарушения скелетной мышцы, которые являются чувствительными к лечению в соответствии с этим изобретением, включают в себя мышечную дистрофию, в том числе, но не только, мышечную дистрофию Дюшенна или мышечную дистрофию Беккера, плече-лопаточно-лицевую мышечную дистрофию (Ρ8ΗΌ), врожденную мышечную дистрофию (СМО) и аутосомные дистрофии, и родственные прогрессирующие слабость и истощение скелетной мышцы; мышечную атрофию; в том числе, но не только, ограниченную атрофию от неиспользования мышц, индуцированную глюкокортикоидом атрофию, мышечную атрофию в людях старшего возраста и мышечную атрофию, индуцированную повреждениями спинного мозга или нервно-мышечными заболеваниями; кахексию, например кахексию, ассоциированную с раком, СПИДом, хроническим обструктивным заболеванием легких (00ΡΌ). хроническими воспалительными заболеваниями, ожоговым повреждением и т.д.; мышечную слабость, особенно в некоторых мышцах, таких как мочевой сфинктер, анальный сфинктер и мышцы диафрагмы таза; саркопению и хрупкость в пожилых людей. Это изобретение находит также применение в восстановлении (репарации) мышц после травмы. Что касается неврологических нарушений, одной из возможностей является лечение нейродегенеративных нарушений. Лечение нарушений мотонейронов, в частности нейродегенеративных нарушений мотонейронов, также является возможным.
Примеры неврологических (в том числе нервно-мышечных) нарушений включают в себя боковой амиотрофический склероз; мышечную атрофию спинного мозга; прогрессирующую атрофию спинного мозга; мышечную атрофию детей младшего возраста или юношескую мышечную атрофию, полиомиелит или постполиосиндром; нарушение, вызванное подверганием действию токсина, травму мотонейронов, повреждение мотонейронов или повреждение нерва; повреждение, которое влияет на мотонейроны; и потерю мотонейронов, ассоциированную со старением; и аутосомную, а также связанную с полом мышечную дистрофию; болезнь Альцгеймера; болезнь Паркинсона; диабетическую невропатию; периферические невропатии; эмболический и геморрагический инсульт и связанное с алкоголем повреждение головного мозга. Полипептиды и удлиненные полипептиды данного изобретения могут быть также использованы для поддержания центральной нервной системы (ЦНС). Это изобретение находит также применение в восстановлении (репарации) нервов после травмы.
Повреждения нервов могут также лечиться в соответствии с этим изобретением. В этом варианте осуществления полипептид или удлиненный полипептид будет обычно локализован около такого повреждения для осуществления репарации, например, посредством изоляционной трубки около двух концов разрезанного периферического нерва (см. \У0 01/85781).
Что касается сердечных нарушений, могут быть упомянуты заболевания, в которых стимуляция синтеза белка сердечной мышцы является полезным лечением; кардиомиопатии; острая сердечная недостаточность или острый инсульт, включающий в себя миокардит или инфаркт миокарда; патологическая гипертрофия сердца и застойная сердечная недостаточность. Полипептиды и удлиненные полипептиды данного изобретения могут быть также использованы для улучшения минутного сердечного выброса посредством увеличения ударного систолического объема сердца. В частности, полипептиды и удлиненные полипептиды данного изобретения могут быть использованы для профилаклики миокардиального повреждения после ишемии и/или механической перегрузки.
В этом случае их обычно вводят так быстро, как это только возможно, после возникновения ишемии или механической перегрузки в отношении сердца, например, так быстро, как только был диагно- 14 013230 стирован сердечный приступ, вызванный ишемией.
Предпочтительно их будут вводить в пределах 5, 10, 15, 30 или 60 мин или в пределах 2 или 5 ч. Предпочтительно ишемия или механическая перегрузка, в ответ на которые вводят полипептид или полинуклеотид МОР, являются временным состоянием. В особенно предпочтительном варианте осуществления полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения вводят в ответ на сердечный приступ. Способы лечения по данному изобретению будут особенно эффективными в оказании помощи страдающим от сердечных приступов людям для хорошего восстановления и для возвращения к нормальному, активному стилю жизни.
При некоторых обстоятельствах может быть желательным применение полипептидов и удлиненных полипептидов данного изобретения в комбинации с другими фармацевтически активными агентами. Например, полипептиды и удлиненные полипептиды по данному изобретению могут быть использованы вместе ЮР-Ι (см. примеры 1, 5, 7 и 8). Такие комбинированные применения могут включать в себя совместное введение полипептидов или удлиненных полипептидов по данному изобретению в едином фармацевтически приемлемом носителе или эксципиенте с другим фармацевтически активным агентом, или другими фармацевтически активными агентами, или они могут вводиться в виде отдельной, последовательной или одновременной инъекции в одно и то же время или в разных местах.
Получение полипептидов и удлиненных полипептидов изобретения
Полипептиды и удлиненные полипептиды данного изобретения могут быть получены стандартными способами. Обычно, их будут получать стандартными способами пептидного синтеза и подходящими химическими модификациями (например, ПЭГилированием) в отношении полученной аминокислотной последовательности, если необходимо. В том случае, если нет аминокислот Ό-формы, полипептиды и удлиненные полипептиды данного изобретения могут быть вместо этого получены посредством рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине из подходящей кодирующей ДНК, опять с использованием стандартных способов.
Выделение и очистка до любой желаемой степени могут также проводиться стандартными способами. Полипептиды и удлиненные полипептиды по данному изобретению будут обычно выделенными или очищенными, полностью или частично. Препарат выделенного полипептида или удлиненного полипептида является любым препаратом, который содержит полипептид или удлиненный полипептид в более высокой концентрации, чем препарат, в котором он был продуцирован. В частности, если полипептид или удлиненный полипептид получают рекомбинантно, этот полипептид или удлиненный полипептид будет обычно экстрагироваться из клетки-хозяина и основные клеточные компоненты будут удалены.
Полипептид или удлиненный полипептид в очищенной форме будет обычно образовывать часть препарата, в котором более чем 90%, например до 95, до 98 или до 99% полипептидного материала в этом препарате являются полипептидом по данному изобретению.
Выделенные или очищенные препараты часто будут водными растворами, содержащими полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения. Однако полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения может быть выделен или очищен в других формах, например в виде кристаллов или других сухих препаратов.
Композиции, готовые формы, введение и дозы
Полипептиды и удлиненные полипептиды данного изобретения обеспечены предпочтительно в форме композиций, содержащих полипептид или удлиненный полипептид и носитель. В частности, такая композиция может быть фармацевтической композицией, содержащей полипептид или удлиненный полипептид и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Может быть использована любая подходящая фармацевтическая композиция.
Например, подходящие готовые формы могут включать в себя водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические агенты, бактериальные антибиотики и растворенные вещества, которые делают эту готовую форму изотонической с жидкостями тела предполагаемого реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать в себя суспендирующие агенты и загущающие агенты. Эти готовые формы могут быть представлены в однодозовых или многодозовых контейнерах. Например, запаянные ампулы и герметизированные флаконы могут храниться в замороженном или высушенном замораживанием (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекций, непосредственно перед использованием.
Должно быть понятно, что, наряду с конкретно упомянутыми выше ингредиентами, готовые формы данного изобретения могут включать в себя другие агенты, общепринятые в данной области, имеющие отношение к типу рассматриваемой готовой формы. Предпочтительными являются стерильные, апирогенные водные и неводные растворы.
Готовые формы обычно приспосабливают стандартными способами приготовления готовых форм, к способам введения, обсуждаемым ниже.
Полипептид данного изобретения может вводиться любым подходящим способом, приспособленным к состоянию, подлежащему лечению, например, местным, кожным, парентеральным, внутримы
- 15 013230 шечным, подкожным или чрескожным введением; или прямой инъекцией в кровоток или прямым нанесением на ткани слизистой оболочки.
Инъекция является, по-видимому, предпочтительным способом во многих обстоятельствах, например подкожная, парентеральная, внутримышечная или внутривенная инъекция. Внутривенная инъекция будет часто предпочтительной во многих клинических обстоятельствах. В некоторых обстоятельствах будет возможной так называемая инъекция «без иглы» или чрескожное введение.
В лечении нарушений скелетных мышц предпочтительными способами являются внутривенная и внутримышечная инъекция. Местное введение также предусматривается, например, посредством пластырей, для усиления мышц живота или для других целей.
В лечении нарушений сердечной мышцы доставка будет обычно внутривенной. При подходящих клинических обстоятельствах (например, в специализированных кардиологических отделениях) может быть возможна прямая доставка в сердце, например, с использованием так называемой системы инъекции «без иглы» для доставки полипептида в сердце.
Полипептиды и удлиненные полипептиды по данному изобретению могут быть доставлены в любой подходящей дозе и с использованием любой подходящей схемы введения доз. Лицам с квалификацией в данной области будет понятно, что дозовое количество и схема введения доз могут быть приспособлены для гарантии оптимального лечения конкретного подлежащего лечению состояния, в зависимости от многочисленных факторов. Некоторыми такими факторами могут быть возраст, пол и клиническое состояние подлежащего лечению субъекта.
На основании собственного опыта авторы изобретения ожидают, что будут эффективными дозы в диапазоне 0,2-10 мг, например 0,2-0,8 мг, предпочтительно приблизительно 0,5 мг. Например, раствор, содержащий полипептид или удлиненный полипептид, в концентрации 1 мг/мл, может быть использован в количестве 0,1-1 мл. Могут предоставляться единственные дозы или множественные дозы, в зависимости от предполагаемого применения и клинических обстоятельств.
Следующие примеры иллюстрируют это изобретение.
Примеры
1. Пептиды
1.1 Пептиды примеров 2, 3, 4 и 6
Пептид, использованный в примерах 2, 3, 4 и 6, имел последовательность 8ЕО ΙΌ N0:15, в которой предпоследний аргинин нативной последовательности (см. 8Е0 ΙΌ N0:1, 2 и 27) заменен гистидином, стабилизированную с использованием Ό-формы аргинина вместо природно-встречающейся Ь-формы в положениях 14 и 15 и ковалентным присоединением Ν-конца к производному полиэтиленгликоля (ПЭГ) (О',О-бис-(2-аминопропил)полиэтиленгликоль 1900) (1ейат1по) мостиком янтарной кислоты и амидированную на С-конце.
1.2 Пептиды примера 5
Пептиды примера 5 получали из Айа ВюкОепсек, Виттдйат, ИК, причем эти пептиды были синтезированы стандартными способами с использованием пептидного синтезатора. Эти пептиды являются не-ПЭГилированными и не имеют Ь-О-превращений и С-концевого амидирования.
Кроме того, пептид, соответствующий пептидам 1.1., приведенным выше, с теми же самыми Ь-Όпревращениями, но без ПЭГилирования, также испытывали на стабильность (см. 5.2.3 ниже). Этот пептид синтезировали при помощи стандартных способов с использованием пептидного синтезатора. Продукт очищали ВЭЖХ и анализировали с использованием ΜΑΌΌΙ-Μδ.
2.3 Пептиды примера 7
1.3.1 Пептиды примера 7.1
Пептиды примера 7.1 имели последовательность из 8 аминокислот С1у-8ег-Тйг-Рйе-С1и-С1и-Н|5-Еу5 (8Е0 ΙΌ N0:33), плюс модификации для улучшения стабильности. В пептиде, называемом ΌΜΟΕ на фиг. 8, стабилизацию получали Ν-концевым ПЭГилированием, как в 1.1 выше. В пептиде, называемом СМОГ на фиг. 8, стабилизацию получали Ν-концевым присоединением гексановой кислоты. Как ΌΜΟΕ, так и СМСЕ были также амидированы на С-концевой стороне.
1.3.2 Пептиды примера 7. 2
В примере 7.2, пептиды А2, А4 и А6 имели последовательность С1и-8ег-Тйг-Рйе-С1и-С1и-Агд-Ьу8 (8Е0 ΙΌ N0:34). Пептиды А2, А4 и А6 были амидированы на С-конце. Пептид А2 не был модифицирован на №конце. Пептид А4 имел группу гексановой кислоты на №конце. Пептид А6 имел группу аминогексановой кислоты, присоединенную к №концу.
Пептид А8 имел последовательность С1и-8ег-Тйг-Рйе-С1и-С1и-Нщ-Ьу5 (8Е0 ΙΌ N0:33), амидированную на С-конце и с гексановой кислотой, присоединенной к №концу.
1.4 Пептид примера 8
Пептид, использованный в примере 8, имел последовательность 8Е0 ΙΌ N0:15, в которой предпоследний аргинин нативной последовательности (см. 8Е0 ΙΌ N0:1, 2 и 27) заменен гистидином, стабилизированную с использованием Ό-формы аргинина вместо природно-встречающейся Ь-формы в положениях 14 и 15 и амидированную на С-конце. Пептид, использованный в примере 8, не был ПЭГилированным.
- 16 013230
1.5 Пептид ЮЕ-Ι
Для сравнения использовали пептид ЮЕ-Ι. Он является доменом связывания рецептора ЮЕ-Ι, кодируемым экзонами 3 и 4, который является общим во всех сплайсинговых вариантах, и имеет длину приблизительно 70 аминокислот. В примерах 1-4 его получали из РсргоТссН. ЕС, ИК. В примере 6 его получали из 81дта-ЛИпсй (ЕК2 ЮЕ-Ι). Пептид ЮЕ-Ι использовали также в примере 7.
2. Инъекция стабилизированного пептида в дистрофическую мышцу
При помощи внутримышечных инъекций (инъекций дважды в неделю 25 мкл, содержащих 17 мкг химически стабилизированного пептида) мышечная сила увеличивалась более чем на 25%, в пределах нескольких недель в передней большеберцовой мышце недистрофических мышей. Эта мышца не является больной, подобно мышце мышей тТх (см. ниже), хотя возможно, что она была физически повреждена повторяющимися инъекциями.
Более значительные увеличения, до приблизительно 35% (фиг. 3А, 3В), регистрировали для внутримышечных инъекций (дважды в неделю в течение трех недель) в дистрофических мышцах мыши тбх, которая имеет тот же самый тип мутации, что и тип мутации в мышечной дистрофии Дюшенна. Инъекции ЮЕ-Ι приводили только к увеличению приблизительно 5%, как показано на фиг. 3А. На той же основе результаты сравнения между стабилизированным пептидом и контролем только с носителем РВ8 показаны на фиг. 3В.
Эти данные, относящиеся к защите и восстановлению мышцы, показывают, что стабилизированный пептид является эффективным в увеличении силы дистрофической и недистрофической мышцы.
3. Кардиозащита и восстановление (репарация) миокарда стабилизированным пептидом
Инфаркт миокарда (МЦ индуцировали в овечьих сердцах катетеризацией маргинальной ветви огибающей коронарной (венечной) артерии и инъекцией небольшого болюса микросфер для индукции локализованной ишемии. Полноразмерный МОЕ (нативный С-концевой пептид плюс последовательность, кодируемая экзонами 3 и 4 и общая для МОЕ и ЮЕ-Ι печеночного типа) или стабилизированный пептид инъецировали (200 нМ, интракоронарно) спустя 15 мин с использованием того же самого катетера, в то время как животное находилось все еще под анестезией. В качестве контроля использовали зрелый ЮЕ-Ι печеночного типа. Было обнаружено, что использование одного стабилизированного пептида увеличивает процент жизнеспособного миокарда и фракцию выброса, измеренную эхокардиографией и комьютерным анализом функции выброса после МТ. Полноразмерный МОЕ также имел значимое, хотя и меньшее действие.
Зрелый ЮЕ-Ι печеночного типа проявлял гораздо меньшее действие. Результаты приведены на фиг. 4, которая показывает процентное изменение фракции выброса в день 6 в сравнении с фракцией выброса в день 1, до проведения этой процедуры. Таким образом, стабилизированный пептид был очень эффективным в защите миокарда от ишемического повреждения.
Дополнительные эксперименты проводили на мышах. В этих исследованиях МI индуцировали лигированием левой передней нисходящей (ΕΆΌ) коронарной артерии мышиного сердца. Это вызывает расширение левого желудочка, прогрессирование которого приводит к сердечной недостаточности. Стабилизированный пептид, вводимый системно, заметно улучшает силу и функцию сердца, измеренную по петлям давление/объем (фиг. 5), которые демонстрируют способность сердца нагнетать кровь и расширение, которое происходит, когда поврежденное сердце уже не может справляться с возвратом венозной крови. Это явно улучшается системным введением стабилизированного пептида, посредством которого мышца миокардиальной стенки защищается и увеличивает толщину. Таким образом, имеется значительный потенциал для лечения пациентов сразу же после сердечного приступа.
4. Нейрозащита стабилизированным пептидом после ишемии и общего повреждения
4.1 Нейрозащитное действие ίη νίΐτο
Нейрозащитное действие стабилизированного пептида демонстрировали ίη νίΐτο с использованием хорошо охарактеризованной модели селективной смерти нейронов в органотипических культурах гиппокампа в крысе.
Срезы гиппокампа получали из 7-10-дневных крыс А1й1аг в соответствии со способом δΐορρίηί с1 а1 (1991) с минорными модификациями в соответствии с 8агпо\\ъка (2002). Вкратце, крыс анестезировали Вебуталом, охлаждали на льду и обезглавливали. Головной мозг быстро извлекали в охлажденный на льду рабочий раствор с рН 7,2: 96% НВ88/НЕРЕ8-(без Са2+ и Мд2+), содержащий 2 ммоль/л Ь-глутамина, 5 мг/мл глюкозы, 1% амфотерицин В, 0,4% пенициллин-стрептомицин. Гиппокампы отделяли и нарезали на срезы 400 мкм с использованием измельчителя тканей МсП\\шп. Мембраны М1Шсе11-СМ (М1Шроте) в 6-луночных чашках предварительно уравновешивали 1 мл культуральной среды рН 7,2: 50% ОМЕМ, 25% НВ88/НЕРЕ8, 25% Н8, 2 ммоль/л Ь-глутамина, 5 мг/мл глюкозы, 1% амфотерицина В, 0,4% пенициллин-стрептомицина, в увлажненной атмосфере воздуха и 5% СО2 при 32°С в течение 30 мин. Четыре выбранных среза осаждали на каждой мембране. Срезы культивировали в течение двух недель при 32°С в атмосфере СО2 со 100% влажностью. Жизнеспособность этих срезов проверяли ежедневно окрашиванием иодидом пропидия и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (2е1йй Лхю\'ег1 25) с камерой МС-10095 (Саг1 2е1йй 1епа ОтЬН) для регистрации начального поглощения ΡΙ (8атпотека, 2002).
- 17 013230
Окислительный стресс индуцировали после 14 дней в культуре добавлением 30 мМ ТВН (третбутилпероксида) в течение 3 ч. После этого времени срезы переносили в свежую культуральную среду. Полученную смерть клеток оценивали спустя 24 и 48 ч после начала эксперимента.
Стабилизированный пептид или, для целей сравнения, рекомбинантный ЮЕ-Ι добавляли к культуральной среде до конечной концентрации 100 нг/мл в начале эксперимента, и он непрерывно присутствовал в среде.
Для исследования пути, в котором действует МОЕ, специфическое в отношении ЮЕ-Ι-рецептора (АВ-1) блокирующее антитело (0псодепе) включали в среду за 1 ч перед подверганием срезов действию ТВН и пептида МОЕ или ЮЕ-Ι.
Концентрацию антитела (1000 нг/мл) использовали в соответствии с рекомендацией изготовителя.
Для получения детальных изображений этих срезов использовали конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (2е155 Ь8М 510). Для возбуждения иодида пропидиума (ΡΙ) использовали гелийнеоновый лазер (543 нм). После получения изображения обрабатывали с использованием пакета программного обеспечения ν.2.8 2е155 Ь8М 510. Количественное измерение разрушения тканей выполняли с использованием анализатора изображений К8 300 (Саг1 2е155 1епа ОтЬН).
Повреждение клеток измеряли количественно на изображениях флуоресценции ΡΙ-окрашенных культур спустя 24 и 48 ч после воздействия ТВН. Относительную степень смерти клеток рассчитывали из каждого стандартизированного района СА1 следующим образом: % мертвых клеток = (экспериментальная интенсивность флуоресценции (ЕЦ-И фона)/(максимальная ЕI -ΡΙ фона) х 100, где максимальную величину получают убиванием всех клеток воздействием 100 мМ глутамата.
Все измерения повторяли для 5 независимых препаратов культур и использовали 8 срезов для каждого экспериментального условия. Статистическую значимость различий между результатами рассчитывали с использованием однофакторного Αηονα с последующим критерием Дуннета (ОгарйРаб Рпкт 3.02).
Срезы головного мозга крыс выделяли после индукции локализованного повреждения третбутилгидропероксидом (ТВН), как обсуждалось выше. Определяли результирующую гибель клеток в обработанных и необработанных средах мозга. Это иллюстрируется на фиг. 6. В отсутствие пептида обработки ТВН вызывал смерть приблизительно 60% клеток в пределах 24 ч, но после обработки стабилизированным пептидом (100 нг/мл) наблюдали 85% защиту. Пептид ЮЕ-Ι-рецепторного домена (гЮЕ-Ι), который был также частью полноразмерного МОЕ, был также нейрозащитным (как сообщалось ранее). Однако эта защита была выражена в меньшей степени (72%), и защитное действие ЮЕ-Ι было заметным только до 24 ч, тогда как стабилизированный пептид действовал значительно дольше, так как его нейрозащитное действие все еще явно наблюдали после 48 ч.
4.2 Нейрозащитное действие в модели песчанки
Другие эксперименты проводили с использованием модели ишемии головного мозга песчанки. Для оценки нейрозащиты конфокальную микроскопию проводили на головном мозге после введения стабилизированного пептида или ЮЕЛ-рецептор-связывающего домена.
В головном мозгу песчанки билатеральное лигирование общих сонных артерий неизменно вызывает специфические повреждения гиппокампа: в области СА1, пирамидальные нейроны начинают умирать спустя 3-4 дня после ишемии.
Использовали самцов монгольских (когтистых) песчанок с массой 50-60 г. Ишемическое повреждение вызывали 5-минутным лигированием общих сонных артерий при анестезии галотаном в атмосфере Ю0:02 (70:30) в строго контролируемых нормотермических условиях, как описано ранее (Иотапкка1ашк е1 а1., 2004). Мозговое кровообращение подвергали непрерывному мониторингу лазерной потокометрией Допплера (Миго, Ιηα). Группа животных получала стабилизированный пептид или ЮЕ-Ι (1 мкг/мкл в РВ8) инъекцией в дозе 25 мкг непосредственно в левую сонную артерию сразу же после реперфузии. Ложнооперированных животных инъецировали той же самой дозой этого пептида.
Обычно спустя 10-15 мин после этой процедуры обработанные животные стояли на ногах и вели себя, как необработанные животные. Животным предоставляли период восстановления в течение одной недели, затем их перфузировали охлажденным на льду 4% параформальдегидом в РВ8 при пентобарбитальной анестезии. Гистологическую оценку выполняли на залитых в парафин и фиксированных срезах толщиной 10 мм, окрашенных гематоксилином/эозином. Степень повреждения клеток в области СА1 гиппокампа определяли количественно, под микроскопом (2е188 Ахшксор 2), в виде среднего числа стойких, интактных нейронов в относящихся к венечному шву срезах. По меньшей мере три определенных поля зрения 300 мкм области СА1 гиппокампа охватывали с использованием камеры МС 10095 (Саг1 2е188 1епа ОтЬН) и считали в компьютеризованной системе анализа изображений (К8 300, Саг1 2е188 1епа ОтЬН).
У контрольных животных среднее число морфологически интактных нейронов на длину 300 мкм, оцениваемое в области СА1, было равно 121,25±12,5 (среднее±8И, п=5). В противоположность необработанным животным, где только приблизительно 12% (15,2±5, п=7) нейронов выживали при ишемическом приступе, инъекция (единственный болюс 25 мкг) стабилизированного С-концевого пептида МОЕ в
- 18 013230 левую сонную артерию, сразу же после реперфузии, обеспечивала очень значительную нейрозащиту. 83,2±25 (п=10) нейронов были оценены на инъецированной стороне (74,5% величины неоперированной контрольной группы) и 65,8±30 (п=10) на контралатеральной стороне (54% величины неоперированной контрольной группы). Таким образом, обработка стабилизированным С-концевым пептидом МОЕ позволила высокой доле нейронов СА1 гиппокампа выживать при ишемическом повреждении. В большинстве животных защитное действие было заметным билатерально, тогда как у малого количества оно было наиболее очевидным на инъецированной (левой) стороне.
В противоположность этому, инъекция 25 мкг пептида ЮЕ-Ι оказывала малое влияние на постишемическое выживание нейронов СА1; спустя 7 дней после повреждения оставались 19,2±7,3 нейронов (п=5) свободными, что составляет только 15,8% числа нервных клеток в контроле и не является значимо отличающимся от необработанной постишемической группы.
5. Биологическая активность и стабильность модифицированных пептидов
5.1 Пептид, стабилизированный Ό-Ό-превращением и Ν-концевым ПЭГилированием
Пептид, использованный в примерах 2, 3 и 4 выше, имел последовательность 8Е0 ΙΌ ΝΟ:15 (которая соответствует последовательности Ес-пептида МОЕ человека (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:27), за исключением того, что аргинин в предпоследнем положении заменен гистидином), стабилизированную использованием Όформы аргинина в положениях 14 и 15 вместо природной Ь-формы и ковалентным присоединением Νконца к полиэтиленгликолю (ПЭГ) и амидидированную на С-конце.
Биологическая активность этого пептида подтверждается в примерах 2, 3 и 4.
Его стабильность демонстрируется фиг. 7. Стабильность пептидов с ПЭГилированием и Ь-Όпревращением аргинина в положениях 14 и 15 и без ПЭГилирования и Ь-О-превращения аргинина в положениях 14 и 15 исследовали оценкой чувствительности пептидов к протеолитическому расщеплению в свежей плазме человека.
Плазму хранили до использования при -70°С. 100 мкг пептида добавляли к 2 мл плазмы, плюс 7 мл РВ8. Эту смесь инкубировали при 37°С в течение различных временных интервалов. Затем использовали Вестерн-блоттинг с поликлональным антителом, специфическим в отношении пептидов с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ:15, для детектирования каждого пептида на протяжении этих временных интервалов (на фиг. 7: А=0 мин; В=30 мин; С=2 ч; Ό=24 ч. Результаты для пептида с Ь-Όпревращением и Ν-концевым ПЭГилированием показаны справа; результаты для пептида, лишенного превращений Ь-формы в Ό-форму и Ν-концевого ПЭГилирования, находятся слева). Относительно мало пептида, лишенного Ь-О-превращения и ПЭГилирования, можно было детектировать после 30 мин, очень мало после 2 ч и нисколько или почти нисколько - после 24 ч. В противоположность этому, пептид с Ь-О-превращением и ПЭГилированием мог детектироваться в изобилии даже после 24 ч.
5.2 Дополнительные пептиды - замена серина или аргинина аланином и С-концевым или Νконцевым укорочением
5.2.1 Дополнительные пептиды
Здесь последовательность нативного ЕС-пептида человека из С-конца МОЕ человека приведена в виде 8ЕО ΙΌ ΝΟ:27. В пептиде 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:15 предпоследняя аминокислота, которая является аргинином в нативном пептиде (см. 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2 и 27), заменена гистидином. Пептид 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 15 описан в виде пептида 1 на фиг. 2.
Дополнительно модифицированные последовательности, полученные из последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ:15, приведены в виде 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:16-24 и сравниваются с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:15 на фиг. 2, где их называют пептидами 2-6 и короткими пептидами 1-4.
В пептиде 2 (ЪЕЦ ΙΌ ΝΟ:16) серин заменен аланином в положении 5. В пептиде 3 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:17) серин заменен аланином в положении 12. В пептиде 4 (ЪЕЦ ΙΌ ΝΟ:18) серин заменен аланином в положении 18. В пептиде 5 (ЪЕЦ ΙΌ ΝΟ:19) аргинин заменен аланином в положении 14. В пептиде 6 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:20) аргинин заменен аланином в положении 14 и аргинин также заменен аланином в положении 15. В коротком пептиде 1 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:21) аргинин заменен аланином в положении 14 и две С-концевые аминокислоты удалены. В коротком пептиде 2 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:22) аргинин заменен аланином в положении 14 и четыре С-концевые аминокислоты удалены. В коротком пептиде 3 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:23) аргинин заменен аланином в положении 14 и три Ν-концевые аминокислоты удалены. В коротком пептиде 4 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:24) аргинин заменен аланином в положении 14 и пять Ν-концевых аминокислот удалены.
5.2.2 Биологическая активность дополнительных пептидов
Биологическую активность измеряли с использованием системы ίη νίίΓΟ измерением способности Сконцевых пептидов индуцировать мононуклеарные миобласты (сателлитные клетки) в отношении репликации. Количество клеток определяли при помощи способа с использованием красителя Аламарового синего. Оценку выполняли по шкале 0-3, и эти результаты показаны на фиг. 2.
= нет измеримого увеличения количества клеток при 6 ч.
= значимое увеличение количества клеток при 4 ч.
= значимое увеличение количества клеток при 2 ч.
= значимое увеличение количества клеток при 1 ч.
- 19 013230
Значимость была на уровне Р>0,05 при использовании Т-критерия.
Пептид (пептид 1) 8Е0 Ю N0:15 обнаруживал низкую активность или отсутствие активности вследствие его короткого периода полувыведения. Пептид 2 (8Е0 ΙΌ N0:16) и короткий пептид 1 (8Е0 ΙΌ N0:21) имели оценку 1 на шкале активности. Пептиды 4 и 5 (8Е0 ΙΌ N0:18 и 19) имели оценку 2 на шкале активности. Пептид 3 (8Е0 ΙΌ N0:17) имел оценку 3 на шкале активности. Пептид 6 (8Е0 ΙΌ N0:20) и короткие пептиды 2, 3 и 4 (8Е0 ΙΌ N0:22, 23 и 24) не обнаруживали измеримой активности (оценка 0).
5.2.3 Стабильность дополнительных пептидов
Стабильность каждого пептида определяли введением его в свежую плазму человека и использованием Вестерн-блоттинга, как обсуждалось в примере 5.1 выше. Подобно биологической активности, стабильность оценивали в баллах по шкале 0-3. Результаты показаны на фиг. 2.
Стабильность определяли в виде количества пептида, которое оставалось интактным и связывалось со специфическим антителом следующим образом:
= заметная потеря детектируемого связывания антитела при 1/2 ч.
= заметная потеря детектируемого связывания при 2 ч.
= отсутствие заметной потери связывания антитела при 24 ч.
Пептид (пептид 1) 8Е0 ΙΌ N0:15 имел оценку 1. Пептид 6 (8Е0 ΙΌ N0:20) также имел оценку 1. Пептиды 3 и 4 (8Е0 ΙΌ N0:17 и 18) имели оценку 2. Пептиды 2 и 5 (8Е0 ΙΌ N0:16 и 19) имели оценку 3.
Пептиды примеров 1-4 также имели оценку 3 по этой шкале. Тот же самый пептид, но лишенный ПЭГилирования, также имел оценку 3 по этой шкале. Короткие пептиды 1-4 еще не были тестированы, хотя Короткие пептиды 2-4, по-видимому, так или иначе не имеют биологической активности.
6. Действие стабилизированного пептида на пролиферацию мышечных сателлитных клеток в дистрофической мышце, мышце при боковом амиотрофическом склерозе (ЛЬ8) и мышце здорового человека
В этих экспериментах использовали стабилизированный пептид 1.1, приведенный выше. Сравнения выполняли с пептидом ЮЕ-Ι 1.3, приведенным выше.
6.1 Резюме
Первичные культуры мышечных клеток человека получали из биопсий пациентов с врожденной мышечной дистрофией (СМИ), плече-лопаточно-лицевой дистрофией (Е8НИ) и заболеванием мотонейронов или боковым амиотрофическим склерозом (ЛЬ8), а также из здоровой мышцы с использованием анализов пролиферации/дифференцировки. Клеточные культуры обрабатывали двумя пептидами и использовали способы иммуноцитохимии для детектирования клеток, экспрессирующих маркер дифференцировки десмин, и общего количества ядер с использованием красителя ΌΑΡΙ. Анализы креатинфосфокиназы (СРК) и белка использовали для определения миогенной дифференцировки после обработки пептидами. Стабилизированный пептид значительно увеличивал пролиферацию стволовых (десминположительных) клеток для нормальной (без заболевания) мышцы (с 38,4±2,5% до 57,9±3,2%) в нормальной (без заболевания) конечности и с 49,8±2,4% до 68,8±3,9% для нормальных (без заболевания) биопсий черепно-лицевых мышц). Хотя начальные количества мышечных стволовых клеток были более низкими в пациентах с мышечным истощением, стабилизированный пептид все еще индуцировал увеличение (СМИ с 10,4±1,7% до 17,511,6%; Е8НО с 11,7±1,3% до 20,4±2,1% и АЬ8 с 4,8±1,1% до 7,2±0,8%). Эти результаты подтвердили также, что стабилизированный пептид не влиял на образование мышечных трубочек, но показали, что он увеличивает пролиферацию клеток-предшественников миобластов, тогда как зрелый ЮЕ-Ι усиливает дифференцировку.
6.2 Выделение полученных из мышц человека клеток
Первичные культуры мышечных клеток человека выделяли, как описано ранее |Ье\\'15 с1 а1., 2000; Зшапап с1 а1., 2004]. Вкратце, после информированного согласия биопсии черепно-лицевой мышцы (жевательной мышцы) получали от здорового взрослого и пациентов с СМИ во время рекомендуемой хирургии в Еайтап апб МкФсхсх НокрйаЦ Ьопбоп. ИК. Пробы мышцы нижней конечности человека (уа§Ιιΐ5 1а1сга115) получали от давших информированное согласие взрослого здорового человека и пациентов с Е8НИ и АЬ8 пункционной биопсией под местной анестезией в Воуа1 Егее Но§рйа1, Ьопйоп, ИК. Биопсии объединяли от нескольких пациентов с одним и тем же нарушением для получения достаточных количеств клеток в первичных культурах. Их промывали антибиотиком *пенициллином, 100 Е/мл; стрептомицином, 100 мкг/мл; фунгизоном, 2,5 мкг/мл; Шуйгодеп), дополненным ИМЕМ (высокая глюкоза; Ιπνί1годеп), измельчали ножницами и фрагменты ткани высевали в покрытые 0,2% желатином (81дтаА1бпей) культуральные колбы Т150 см2 (Не1епа Вюкаепеек). Культуры эксплантатов инкубировали в содержащей сыворотку среде для выращивания (§ОМ), составленной из ИМЕМ, 20% ЕВ8 (ΡΑΑ Ьайога1опе§), пенициллина (1000 Е/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл) Цпуйгодеп), и поддерживали при 37°С в увлажненном воздухе (95%) с 5% СО2. Первую волну миграции мононуклеарных клеток из эксплантата обозначали как Ό-волна, и эту популяцию использовали во всем этом исследовании. Мигрирующие мышечные клетки человека собирали ферментативно с использованием смеси трипсин-ЕДТА Дпуйгодеп) и субкультивировали в §ОМ до 70-80%-ной конфлюэнтности. Число пассажей х (Рх) определяли как х-ый
- 20 013230 последовательный сбор клеток субконфлюэнтных клеток. Все эксперименты выполняли с использованием Р3-5-когорт (поколений). Затем размноженные клетки хранили при криогенных условиях, пока их не использовали в описанных ниже экспериментах. Выполняли по меньшей мере 6 экспериментов для каждой из обработок, используемых для каждой культуры больной мышцы, а также для двух типов здоровой мышцы.
6.3 Определение популяции миогенных (стволовых) клеток-предшественников ίη νίίτο
Оценку количества миогенных предшественников выполняли, как описано ранее (Зтапап с1 а1., 2004). Клетки пересевали на покрытые желатином (0,2%) покровные стекла 13 мм при начальной плотности 4,5х103 клеток/см2. Во избежание приводящих к путанице действий ΙΟΕ и родственного белка в ЕВЗ, клетки культивировали в бессывороточной среде (ЙОМ); ИМЕМ, дополненной ЕОЕ (10 нг/мл), ЬЕОЕ (2 нг/мл), инсулином (5 нг/мл), голо-трансферрином (5 мкг/мл), селенитом натрия (5 нг/мл), дексаметазоном (390 нг/мл), витамином С (50 мкг/мл), витамином Н (И-биотином; 250 нг/мл), витамином Е (Тго1ох; 25 мкг/мл) (З1дта-А1йгкй), албумаксом-1 (0,5 мг/мл) (Ιηνίίτο^βη), фетуином (500 мкг/мл) (С1опс11С8/В1оЬ^1йакег), пенициллином (100 Е/мл) и стрептомицином (100 мкг/мл) (Ιηνίΐτο^βη). После предоставления возможности для прикрепления в течение 24 ч в ЙОМ добавляли стабилизированный пептид (10 нг/мл) с гЮЕ-Ι и без гЮЕ-Ι (10 нг/мл), и с моноклональным антителом против ЮЕ-Ирецептора или без моноклонального антитела против ЮЕ-Ирецептора (АЬ-1, 100 мкг/мл, 0μο^^), по мере необходимости. Используемыми пептидами были (см. 1.1 и 1.3 выше) стабилизированный пептид, родственный Едомену МОЕ/Ес-пептиду ЮЕ-Ι [24 аминокислотных остатка], синтезированные, как описано ранее |О1и/ше\\ъка е1 а1., 2005] и пептид ЮЕ-Ι человека [70 аминокислотных остатков] (З1дта-А1йгкй ЕР2 ЮЕΙ). Все среды сменялись каждые 2-3 дня. Из культур брали пробы в различных временных точках для иммуноцитохимических анализов.
6.4 Иммуноцитохимия
В подходящих временных точках клетки фиксировали метанолом в течение 10 мин (-20°С) с последующим увеличением проницаемости с использованием 0,5% Тритона X 100 в течение 10-15 мин. Затем клетки инкубировали в течение 60 мин с антидесмин-антителом (1:100; клон И33, ИАК0, С1о51гир. Иеотагк), разбавленным в растворе для разведения антител (АИЗ; РВЗ плюс 10% ЕВЗ, 0,025% азид натрия, 0,1М лизин). Класс-специфическое антиИдО мыши-антитело, конъюгированное с ΡΙΤΟ (1:200; Ьаскюо IттиηοΒе5еа^с11/^аЬο^аιο^^е5 З1га1есЬ ЗскШШс), использовали для визуализации. Ядра идентифицировали введением флуоресцентного связывающего ДНК малой бороздки зонда, ΌΛΡΙ (1,0 нг/мл; З1дтаА1йпс11) в конечную стадию инкубирования антитела. Покровные стекла готовили с использованием агента на основе глицерина, препятствующего обесцвечиванию, ΟίΙίΠιιοΓ (СйтПиог Ый.), и заливали прозрачным лаком для ногтей. Ассоциированную с клетками флуоресценцию и морфологию визуализировали эпи-флуоресценцией и Ьека Мойик-Шоа СоШгай (ЬМС)-микроскопией, соответственно, с использованием инвертированного микроскопа Ьеюа ИМГКВ, оборудованного программным обеспечением для обработки изображений Ьеюа Е\У4000. Для анализа пролиферации все синие и зеленые флуоресцентноположительные клетки считали в поле зрения. По меньшей мере 30 полей зрения в каждом покровном стекле считали последовательным образом; таким образом на каждом покровном стекле считали по меньшей мере 100 клеток. Количество клеток сравнивали в виде процента десмин-положительных клеток с общим количеством ИАРИположительных клеток.
6.5 Анализ креатинфосфокиназы (СРК)
Этот анализ выполняли с использованием ранее опубликованных протоколов [Аи1иск е1 а1., 2005]. Измерение СРК делает возможным количественное сравнение миогенеза [Оо1о е1 а1., 1999], так как она является маркером образования мышечных трубочек. Фермент СРК катализирует обратимое фосфорилирование аденозин-5-дифосфата (АДФ) с образованием аденозин-5-трифосфата (АТФ) и свободного креатина. Эта реакция может быть прослежена в любом направлении измерением образования неорганического фосфора, конечного продукта реакции, которое пропорционально активности СРК. Эту активность измеряли с использованием колориметрического способа на основе процедуры генерирования неорганического фосфата [Екке аай ЗиЬЬаготе, 1925]. Затем ее выражали в виде содержания белка культуры.
Предварительно размноженные первичные культуры мышечных клеток человека повторно высевали при 10х104 клеток на лунку в покрытых 0,2% желатином 96-луночных планшетах. Клетки культивировали до 70/80% конфлюэнтности в §ОМ, затем эту среду заменяли средой для дифференцировки (ИМ; ИМЕМ, 2% ЕВЗ, пенициллин (100 Е/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл)), содержащей стабилизированный пептид (24 аминокислотных остатков), синтезированный, как описано ранее [ИЫ/шетека е1 а1., 2005] и/или пептид ЮЕ-Ι человека (70 аминокислотных остатков) (З1дта-А1йгкй ЮЕ-Ι ЕР2). Спустя 48 ч клетки промывали дважды охлажденным на льду РВЗ и затем хранили в замороженном виде в 0,5 мМ глициновом буфере (рН 6,75) при -70°С. Фиксированные клетки лизировали быстрым оттаиванием и набор для анализа СРК использовали в соответствии с инструкциями изготовителей (З1дта-А1йгкй). Концентрацию белка каждой пробы определяли против калибровочной кривой альбумина с использованием набора Р1егсе Мкго ВСА (РегВю Зск^е, ИК Ь1й., НоПИитЬегк-тй, ИК).
- 21 013230
6.6 Статистический анализ
1-факторный критерий Лпоуа применяли с использованием 81а1У1ете 4.51 (8Л8 1п81йи1е 1пс., СНег\се11 8с1епййс РиЬШЫпд Ыб, Θχίοτά, ИК) с последующим ро§1 Нос критерием РБ8Э Фишера. р<0,05 считали значимым. Данные объединяли для всех экспериментов (минимально 6) для 4 типов экспериментов для каждого условия, включающего в себя два типа здоровой мышцы, и представляли в виде среднего значения ± 8Ό (стандартное отклонение).
6.7 Доля миогенных предшественников в первичных культурах мышечных клеток человека
Процент миогенных (десмин-положительных) клеток определяли из всех испытанных мышц (см. табл. ниже). Нормальная (без заболевания) мышца содержала значительную долю десминположительных клеток, тогда как больная мышца содержала гораздо меньшую долю миогенных клеток.
Таблица. Первичные мышечные культуры, полученные из различных мышечных источников, которые содержат различающиеся доли миогенных (десмин-положительных) клеток перед добавлением пептидов
Тип мышцы | Десмин-положительные клетки в виде процента от всех клеток в первичной культуре |
Нормальная (без заболевания) черепно-лицевая | 49,8±2,4% |
Нормальная (без заболевания) конечность | 38,4+2,5% |
Конечность СМЭ | 10,4±1,7% |
Конечность АЬЗ 4,8+1,1%
Конечность Г8НР 11,7+1,3%
6.8 Действие на нормальные (без заболевания) первичные мышечные клетки-предшественники
Стабилизированный пептид увеличивал значимо пролиферацию (изменения в доле десминассоциированных ядер относительно всех ядер) в первичных культурах клеток нормальных черепнолицевых (жевательных) мышц с 49,8±2,4% до 68,8±3,9%; р<0,0001). ЮР-1 также индуцировал умеренное увеличение (с 49,8±2,4% до 58,4±4,2%; р<0,0001). Интересно то, что, как было обнаружено, действие стабилизированного пептида на долю пролиферации десмин-положительных клеток ингибировалось при добавлении ЮР-1 (с 68,8±3,9% до 59,5±4,2%; р<0,0001). Это действие, наблюдаемое в нормальной нижней конечности (четырехглавой мышце ядра), было сходным с действием, наблюдаемым с черепнолицевой мышцей.
Стабилизированный пептид увеличивал значимо пролиферацию мышечных клетокпредшественников (с 38,4±2,5% до 57,9±3,2%; р<0,0001). ЮР-1 имел только небольшое действие на пролиферацию (с 38,4±2,5% до 47,1±3,5%; р<0,0001), но ЮР-1 полностью уничтожал реакцию на стабилизированный пептид при добавлении этих двух пептидов в комбинации (с 57,9±3,2 до 38,8±0,6%; р<0,0001).
6.9 Действие на пролиферацию эмбриональных полученных из мышцы клеток человека в состоянии заболевания
После наблюдения, что стабилизированный пептид мог воспроизводимо и значимо увеличивать количество десмин-положительных клеток в здоровой мышце, исследовали действие на мышцу в состоянии заболевания. В первичных культурах, полученных из мышц в случае врожденной мышечной дистрофии (СМИ), стабилизированный пептид значимо увеличивал пролиферацию мышечных клетокпредшественников (с 10,4±1,7% до 17,5±1,6%; р<0,0001), тогда как ЮР-1 имел низкое действие (с 10,4±1,7% до 13,2±1,7%; р=0,005). При объединении обоих пептидов опять наблюдали ингибирующее действие, как и для здоровой мышцы, причем действие стабилизированного пептида уменьшалось до контрольных уровней (с 17,5±1,6% до 13,1±1,2%; р=0,0001). Действия стабилизированного пептида на клеточную пролиферацию мышечных клеток из мышц пациентов с боковым амиотрофическим склерозом - (ЛЬ8) и Р8НИ - давали сходные результаты. Стабилизированный пептид увеличивал количества десмин-положительных клеток заметным образом в этих нарушениях (ЛЬ8 с 4,8±1,1% до 7,2±0,8%; р=0,0002, Р8НИ с 11,7±1,3% до 20,4±2,1%; р<0,0001). Как и в случае со здоровой мышцей, ЮР-1 опять имел незначительное действие (ЛЬ8 с 4,8±1,1% до 4,7±1,4%, р=0,7719, Р8НИ с 11,7±1,3% до 14,1±1,6%; р=0,0107)). При использовании обеих изоформ вместе МСР-индуцированное увеличение экспрессии десмина опять ингибировалось (ЛЬ8 с 7,2±0,8% до 5,3±1,0%; р=0,0024, Р8НИ с 20,4±2,1% до 14,5±1,4%; р<0,0001).
6.10 Увеличенная пролиферация клеток-предшественников Е-доменом МСР относительно ЮР-1рецептора
В здоровой мышце увеличение пролиферации, индуцированной стабилизированным пептидом, не ингибировалось присутствием анти-ЮР1К.-антитела (68,8±3,9% в МСР-обработанных и 71,1±6,2% в МСР+ЛЬ-1-обработанных клетках; р=0,2472). То же самое действие наблюдали так же, как для мышцы
- 22 013230
СМИ, так и для мышцы ЛЬ8 (17,5±1,6% против 16,7±1,8%; р=0,4589 для СМИ; 7,2±0,8% против 6,5±0,8%; р=0,2933 для ЛЬ8). Это указывает на то, что действие Е-домена МОЕ не включает в себя использование ЮЕ-1-рецептора.
6.11 Действия Е-домена МОЕ на предотвращение терминальной дифференцировки
В анализах СРК 6.4, приведенных выше, стабилизированный пептид не способствовал дифференцировке эмбриональных миобластов и образованию мышечных трубочек. В отличие от него, ЮЕ4 в концентрации 10 нг/мл, по-видимому, стимулирует образование мышечных трубочек, так как количества клеток, экспрессирующих десмин, уменьшаются добавлением ЮЕ4 на этой стадии миогенеза. Действительно, в присутствии 10 нг/мл ЮЕ4 стабилизированный пептид действовал в качестве агониста и зависимым от дозы образом предотвращал дифференцировку в стадию, компетентную в отношении слияния миобластов. Уменьшение 100 нг/мл стабилизированного пептида 10 нг/мл системным ЮЕ4 было более низким, чем 10 нг/мл МОЕ с той же дозой ЮЕ-Р
6.12 Выводы
Стабилизированный пептид индуцировал значимо пролиферацию клеток-предшественников в первичной культуре мышц от пациентов с СМИ, Ρ8ΗΌ и ЛЬ8, а также здоровых индивидуумов. Стабилизированный пептид не влиял на образование мышечных трубочек, т. е. на процесс, который значимо ускоряется ЮЕ-Р Это показывает, что биологически активный Е-домен МОЕ имеет отличающуюся активность в сравнении со зрелым ЮЕ-Р Открытия авторов данного изобретения показывают, что эти различные действия изоформ ЮЕ4, по-видимому, опосредованы различными рецепторами. Блокирование ЮЕРрецептора доказывает, что Е-домен МОЕ увеличивает пролиферацию сателлитных (стволовых) клеток через другой путь передачи сигнала, чем ЮЕ4, и что начальная активация сателлитных клеток является другим процессом, отличающимся от процесса, на который влияет зрелый ЮЕ-Р
Было сделано предположение, что мышечное истощение в неврологических состояниях и при старении обусловлено потерей сателлитных клеток. Авторы данного изобретения продемонстрировали, что отношение клеток-предшественников (десмин-положительных) к общему числу миобластов из пациентов с СМИ, Ρ8ΗΌ и ЛЬ8 является низким в сравнении с этим отношением миобластов из здоровых индивидуумов. Таким образом, вопрос о том, дегенерируются ли мышцы вследствие отсутствия сателлитнрых клеток или вследствие не способности экспрессировать некий фактор для активации сателлитных клеток, является дискуссионным. Авторы данного изобретения показали ранее, что пожилые люди неспособны экспрессировать МОЕ при уровнях, необходимых для поддержания мышц [Натеей е! а1., 2004], со сходными открытиями для пациентов с Ρ8ΗΌ и ЛЬ8 (неопубликованные данные).
Мышечное истощение является одной из главных причин смерти в случае пациентов с некоторыми нервно-мышечными заболеваниями. Потеря мышц может быть связана с неспособностью экспрессии МОЕ, и мышцы дистрофической мыши тйх, модели мышечной дистрофии Дюшенна человека, не способны продуцировать МОЕ во время действия механических стимулов |Со1Й5ртк е! а1., 1996]. Эе Вал е! а1. нашли, что, когда мезенхимные стволовые клетки вводят в дистрофические мышцы мыши тйх, восстанавливается экспрессия дистрофина сарколеммой, а также экспрессия МОЕ |Эе Вал е! а1., 2003]. Таким образом, продуцирование МОЕ может зависеть от эластичности клеточной мембраны и, возможно, включать в себя некоторый тип механизма механотрансдукции, например комплекс дистрофина.
В течение некоторого времени было известно, что ЮЕ4 является нейротрофическим фактором и имеет потенциальные клинические применения для нейродегенеративных нарушений, в частности, ЛЬ8. С использованием моделей животных системную доставку рекомбинантного ЮЕ4 человека (зрелого ЮЕ-к) использовали в моделях животных и для лечения пациентов с ЛЬ8. Недавно сообщалось, что физическая нагрузка при объединении с IОЕ-I-генотерапией с использованием вектора АЛУ2 проявляла некоторые синергические действия в лечении модели АЬ8 животного [Какраг е! а1., 2005].
Однако представленные здесь данные указывают на то, что именно активность МОЕ, а не активность обычного ГОЕ-!, будет предпочтительно применяться в лечении мышечного истощения, так как применение МОЕ предоставляет эффективный способ пополнения пула мышечных сателлитных (стволовых) клеток, который является необходимым для поддержания и восстановления мышц. Это подтверждает применение пептидов данного изобретения в качестве терапевтических агентов для мышечной дегенерации в таких нарушениях, как СМИ, Ρ8ΗΌ и ЛЬ8, в которых имеется явное нарушение в экспрессии сплайсингового варианта МОЕ. Имеется также потенциал в отношении применения пептидов данного изобретения для размножения мышечных сателлитных клеток в культуре для клеточной терапии.
7. Анализы пролиферации клеток с использованием пептидов из 8 аминокислот
7.1 Пептиды ИМОЕ и СМОЕ
Пептиды из 8 аминокислот, описанные в 1.3.1 выше и упоминаемые на фиг. 8 А как ИМОЕ и СМОЕ, испытывали на способность индукции пролиферации мышечных клеток С2С12 при плотности 2000 клеток на лунку в среде, содержащей ИМЕМ (1000 мг/л глюкоза, В8А (100 мкг/мл) и ЮЕИ (2 нг/мл). Испытывали концентрации 2, 5, 50 и 100 нг/мл ЭМСЕ и СМОЕ (см. серии результатов слева и в середине на фиг. 8), вместе с 2, 5, 50 и 100 нг/мл одного ЮЕН (см. серию результатов справа на фиг. 8). После 36 ч
- 23 013230 инкубации анализ с использованием красителя Аламарового синего использовали для оценки достигнутой пролиферации клеток. Обеспечивали также контроль, содержащий только среду.
Как ΌΜΟΡ, так и СМОР индуцировали пролиферацию клеток. Эти результаты показаны на фиг. 8А в виде флуоресценции в анализе с Аламаровым синим. Все величины для ΌΜΟΡ и СМОР и величины для одного ΙΟΡ-Ι были статистически отличающимися от контрольной величины только со средой. Увеличивающиеся уровни пролиферации наблюдали с увеличением концентрации ОМОР/СМОР.
7.2 Пептиды А2, А4, А6 и А8
Пептиды из 8 аминокислот, описанные в 1.3.2 выше и упоминаемые на фиг. 8В как А2, А4, А6 и А8, испытывали на способность индукции пролиферации мышечных клеток С2С12 при плотности 500 клеток на лунку. Культивирование проводили в течение 24 ч в 10% РВ8 с последующим голоданием в течение 24 ч в 0,1% В8А, стимуляцией в течение 24 ч и затем обработкой Вгйи в течение 5 ч. Испытывали концентрации 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл пептидов А2, А4, А6 и А8 вместе с 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл 1ОР-1 (см. серию результатов справа на фиг. 8В). Включение Вгйи измеряли для оценки уровня достигнутой пролиферации клеток. Обеспечивали также контроли, не содержащие клеток, содержащие только среду, 5% РВ8 и не содержащие Вгйи.
Пептиды А2, А4, А6 и А8 индуцировали пролиферацию клеток. Эти результаты показаны на фиг. 8 в виде флуоресценции (оптической плотности при 370 нм; средние величины плюс стандартная ошибка для 4 лунок.
8. Анализы пролиферации миобластов скелетных мышц человека (Н8ММ)
Пептид из 24 аминокислот, описанный в 1.4 выше и упоминаемый на фиг. 9-11 как А5, испытывали на способность индукции пролиферации мышечных клеток-предшественников человека (СатЬгех). Эти клетки являются коммерчески доступными эмбриональными мышечными клетками человека, т.е. мышечными стволовыми клетками (предшественниками) человека. Иногда они известны так же, как миобласты скелетных мышц человека (Н8ММ). Клетки получали из субъекта-мужчины 39 лет. Культивирование проводили в течение 24 ч в 200 мкл среды 8кОМ2, дополненной кЕОР, Й-С1и1. дексаметазоном, антибиотиками и 10% РВ8. Затем среду для культивирования удаляли и клетки промывали дважды в бессывороточной среде.
А5 тестировали на его способность индуцировать пролиферацию Н8ММ СатЬгех при плотности 500 (фиг. 9 и 10) или 1000 (фиг. 11) клеток на лунку в среде 8кОМ2 СатЬгех, дополненной кЕОР, Ь-О1ий дексаметазоном и антибиотиками. Испытывали концентрации 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл А5 (см. серию результатов на фиг. 9А, 10А и 11А), вместе с 0,1, 10 и 100 нг/мл одного 1ОР-1 (см. серию результатов слева на фиг. 9А, 10А и 11 А). Концентрации 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл А5 испытывали также в присутствии 2 нг/мл 1ОР-1 (см. серию результатов слева на фиг. 9В, 10В и 11В). После 48 ч инкубации клетки обрабатывали Вгйи в течение 5 ч. Включение Вгйи измеряли для оценки уровня достигнутой пролиферации клеток. Обеспечивали также контроли, не содержащие клеток, содержащие только среду, 5% РВ8 и не содержащие ВгйИ.
1ОР-1 один не оказывал значимого действия на пролиферацию Н8ММ в любой дозе (см. фиг. 9-11). После 48 ч пептид А5 имел значимое действие (Р<0,1) на пролиферации Н8ММ при применении отдельно в дозах 10 нг/мл и ниже (фиг. 9А и 10А). Добавление 2 нг/мл 1ОР-1 к среде в комбинации с А5 приводило к значимому действию на пролиферации Н8ММ при более высоком уровне значимости (Р <0,001; фиг. 9В, 10В и 11В). Поскольку эти клетки являются сравнительно медленно растущими, рекомендуется увеличение инкубационного периода с пептидом до 72 ч. Во-вторых, этот сигнал может быть усилен увеличением времени воздействием ВгйИ.
Ссылки ^οтаη8ка-^аη^к еί а1., Вгаш Ке8. Μο1. Вгат Ке8 121, 50-59 (2004);
Н111 анй Оο1Й8ρ^ηк, 1. Рку8ю1. 549.2, 409-418 (2003);
МсМу е1 а1., 1. Рку8ю1. 516.2, 573-592 (1999);
8атο№ка, Рока Nеи^ορаίкο1. 40[2], 101-106 (2002);
δίορρίηί, еί а1., 1. №иго8С1 Μеίкοй8 37, 173-182 (1991);
Упад е1 а1., 1. Ми8с1е Ке8. Се11 Μοί^1. 17, 487-495 (1996);
Упад аай Оο1Й8ρ^ηк, РЕО8 Ьей8. 522, 156-160 (2002);
Аи1иск е1 а1., Еию. 1. Ога1 8с1. 113: 218-244 (2005);
1)е Вап е1 а1., 1. Вю1. Скет. 60: 909-918 (2003);
□к.1/ше\\'8ка еί а1., РазеЬ 1. 19: 1896-1898 (2005);
Р18ке аай 8иЬЬаготе, 1. Вю1. Скет. 66: 375-400 (1925);
Оο1Й8ρ^ηк е1 а1., 1. Рку8ю1. 495Р: 162-163Р (1996);
Оοίο е1 а1., Ап^й. Вюскет. 272: 135-142 (1999);
Натеей е1 а1., 1. Рку8ю1. 555: 231-240 (2004);
Казраг еί а1., Αηη. №иго1. 57: 649-655 (2005);
йе\\'18 еί а1., Мизс1е Ке8. Се1. Μοί^1. 21: 223-233 (2000);
δίηηηηη еί а1., ВМескюк Арр1. Вюскет. 40: 25-34 (2004).
Claims (47)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Полипептид (a) до 50 аминокислотных остатков, содержащий аминокислотную последовательность БЕО ΙΌ N0:27 или 15, или (b) последовательность которого соответствует БЕО ΙΌ N0:33 или 34, включающий одну или несколько модификаций, которые придают ему увеличенную стабильность в сравнении с немодифицированной последовательностью, обладает биологической активностью, причем в последовательностях (а) (ί) указанные модификации включают один или оба остатка аргинина в положениях 14 и 15 БЕО ΙΌ N0:27 или 15, находящихся в И-форме, или (ίί) указанные модификации включают замещение одной или нескольких аминокислот в положениях 5, 12, 14 или 18, причем, если замещена одна аминокислота в положении 18, указанное замещение представляет собой замещение серина на аланин в положении 18 БЕО ΙΌ N0:27 или 15; и в последовательностях (Ь) (ί) модификации включают ПЭГилирование или добавление группы гексановой или аминогексановой кислоты на №конце или (ίί) модификации включают такое замещение, что последовательность соответствует БЕО ΙΌ N0:35 или 36.
- 2. Полипептид по п.1, где указанная биологическая активность выбрана из способности увеличивать мышечную силу, кардиозащитной способности и нейропротективной способности.
- 3. Полипептид по п.1(а)(1), где оба остатка аргинина в положениях 14 и 15 БЕО ΙΌ N0:27 или 15 находятся в И-форме.
- 4. Полипептид по п.1(а)(п), где указанным замещением аланина является одна или несколько из замен (а) серина на аланин в положении 5, (Ь) серина на аланин в положении 12, (с) аргинина на аланин в положении 14.
- 5. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, где указанные модификации дополнительно включают укорочение С-конца указанной последовательности на одну аминокислоту или на две аминокислоты.
- 6. Полипептид по п.1(а)(п), последовательность которого соответствует полипептиду БЕО ΙΌ N0:16, 17, 18, 19, 28, 29, 30 или 31.
- 7. Полипептид по п.1(а)(1), последовательность которого соответствует БЕО ΙΌ N0:15 или 27, но которая ПЭГилирована на №конце и в которой оба остатка аргинина в положениях 14 и 15 БЕО ΙΌ N0:15 или 27 находятся в И-форме.
- 8. Полипептид по п.1(а)(1), последовательность которого соответствует БЕО ГО N0:15 или 27, в которой оба остатка аргинина в положениях 14 и 15 БЕО ГО N0:15 или 27 находятся в И-форме и которая не является ПЭГилированной.
- 9. Полипептид по п.1(а)(1), последовательность которого соответствует БЕО ГО N0:27, где один или оба из остатков аргинина в положениях 14 и 15 БЕО ГО N0:27 находятся в И-форме.
- 10. Полипептид по п.9, где оба остатка аргинина в положениях 14 и 15 БЕО ГО N0:27 находятся в И-форме.
- 11. Полипептид по п.1(Ь), последовательность которого соответствует БЕО ГО N0:33, 34, 35 или 36.
- 12. Полипептид по пп.9, 10 или 11, дополнительно содержащий от одной до пяти дополнительных аминокислот на С-конце и/или от одной до пяти дополнительных аминокислот на №конце.
- 13. Полипептид по п.12, где одна или несколько из указанных дополнительных аминокислот являются аминокислотами в И-форме.
- 14. Полипептид по п.13, где на №конце присутствует одна дополнительная аминокислота в Иформе.
- 15. Полипептид по п.14, где указанная одна дополнительная аминокислота в И-форме является Иаргинином.
- 16. Полипептид по п.15, где на С-конце не присутствуют дополнительные аминокислоты.
- 17. Полипептид по любому из пп.10-13, где одна дополнительная аминокислота присутствует на Сконце и является цистеином.
- 18. Полипептид по п.17, где на №конце не присутствуют дополнительные аминокислоты.
- 19. Полипептид по п.1(а)(1) или 3, последовательность которого соответствует БЕО ГО N0:15 или 27 плюс один дополнительный остаток цистеина на С-конце, и необязательно от одной до четырех дополнительных аминокислот на С-конце, и/или от одной до пяти дополнительных аминокислот на №конце.
- 20. Полипептид по п.19, где одна или несколько из указанных дополнительных аминокислот являются аминокислотами в И-форме.
- 21. Полипептид по п.20, где на №конце присутствует одна аминокислота в И-форме.
- 22. Полипептид по п.21, где указанной одной аминокислотой в И-форме является И-аргинин.
- 23. Полипептид по любому из пп.9-22, который является ПЭГилированным.- 25 013230
- 24. Полипептид по п.23, в котором указанное ПЭГилирование находится на №конце.
- 25. Полипептид по любому из пп.9-24, который не является ПЭГилированным.
- 26. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, который амидирован на С-конце.
- 27. Удлиненный полипептид, содержащий полипептид по любому из предыдущих пунктов, удлиненный аминокислотной последовательностью не дикого типа, ^концевой и/или С-концевой относительно указанного полипептида по п.1.
- 28. Удлиненный полипептид по п.10, в котором указанное удлинение содержит остаток цистеина на С-конце и/или остаток Ό-аргинина на №конце.
- 29. Полипептид или удлиненный полипептид по любому из предыдущих пунктов, стабильность которого, измеренная периодом полувыведения в плазме человека, по меньшей мере на 10% больше, чем стабильность немодифицированного Е-пептида.
- 30. Полипептид или удлиненный полипептид по п.29, стабильность которого, измеренная периодом полувыведения в плазме человека, по меньшей мере на 50% больше, чем стабильность немодифицированного Е-пептида.
- 31. Полипептид или удлиненный полипептид по п.30, стабильность которого, измеренная периодом полувыведения в плазме человека, по меньшей мере на 100% или более больше, чем стабильность немодифицированного Е-пептида.
- 32. Полипептид или удлиненный полипептид по любому из предыдущих пунктов, период полувыведения которого в плазме человека составляет по меньшей мере 2 ч.
- 33. Полипептид или удлиненный полипептид по п.32, период полувыведения которого в плазме человека составляет по меньшей мере 12 ч или по меньшей мере 24 ч.
- 34. Композиция, содержащая полипептид или удлиненный полипептид по любому из предыдущих пунктов и носитель.
- 35. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид или удлиненный полипептид по любому из пп.1-33 и фармацевтически приемлемый носитель.
- 36. Полипептид или удлиненный полипептид по любому из пп.1-33 для применения в способе лечения человека или животного.
- 37. Способ лечения мышечного нарушения введением пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества полипептида или удлиненного полипептида по любому из пп.1-33.
- 38. Способ по п.37, где указанным мышечным нарушением является нарушение скелетной мышцы.
- 39. Способ по п.38, где указанным мышечным нарушением является мышечная дистрофия, или родственная прогрессирующая слабость, или истощение скелетных мышц, мышечная атрофия, кахексия, мышечная слабость; саркопения или хрупкость у пожилого субъекта или где указанный полипептид или удлиненный полипептид вводят с целью восстановления мышцы после травмы.
- 40. Способ по п.39, где указанной мышечной дистрофией является мышечная дистрофия Дюшенна или Беккера, плечелопаточно-лицевая мышечная дистрофия (Ε8ΗΌ) или врожденная мышечная дистрофия (СМО); указанной мышечной атрофией является атрофия от неиспользования мышц, атрофия, вызванная глюкокортикоидами; мышечная атрофия у пожилого субъекта или мышечная атрофия, индуцированная повреждением спинного мозга или нервно-мышечным заболеванием; указанная кахексия ассоциирована с раком, СПИДом, хроническим обструктивным заболеванием легких (С0РЭ), хроническим воспалительным заболеванием или ожоговым повреждением; или указанной мышечной слабостью является слабость в мышцах мочевого сфинктера, анального сфинктера и диафрагмы таза.
- 41. Способ по п.37, где указанным мышечным нарушением является нарушение сердечной мышцы.
- 42. Способ по п.41, где указанный полипептид или удлиненный полипептид вводят с целью профилактики или ограничения миокардиального повреждения в ответ на ишемию или механическую перегрузку сердца; для стимуляции синтеза сердечной мышцы; для улучшения минутного сердечного выброса увеличением ударного систолического объема сердца; для лечения кардиомиопатии; в ответ на острую сердечную недостаточность или острую травму сердца; для лечения патологической гипертрофии сердца или для лечения застойной сердечной недостаточности.
- 43. Способ по п.42, где указанная острая сердечная недостаточность или острая сердечная травма включает миокардит или инфаркт миокарда.
- 44. Способ лечения неврологического нарушения введением пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества полипептида или удлиненного полипептида по любому из пп.1-33.
- 45. Способ по п.44, где указанный полипептид или удлиненный полипептид вводят с целью профилактики потери нейронов, ассоциированной с нарушением, повреждением нервной системы или для поддержания центральной нервной системы (ЦНС).
- 46. Способ по п.45, где указанная потеря нейронов ассоциирована с нейродегенеративным нарушением, повреждением нервов или ишемией.
- 47. Способ по п.46, где указанным нарушением является боковой амиотрофический склероз; мышечная атрофия спинного мозга; прогрессирующая мышечная атрофия спинного мозга; мышечная атрофия детей младшего возраста или юношеская мышечная атрофия, полиомиелит или постполиосиндром; нарушение, вызванное воздействием токсина, травма мотонейронов, повреждение мотонейронов или- 26 013230 повреждение нерва; повреждение, которое влияет на мотонейроны; потеря мотонейронов, ассоциированная со старением; аутосомная или связанная с полом мышечная дистрофия; болезнь Альцгеймера; болезнь Паркинсона; диабетическая невропатия; периферическая невропатия; эмболический или геморрагический инсульт; связанное с алкоголем повреждение головного мозга или где указанный полипептид или удлиненный полипептид вводят с целью восстановления нервов после травмы.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US66280205P | 2005-03-18 | 2005-03-18 | |
PCT/GB2006/000773 WO2006097682A1 (en) | 2005-03-18 | 2006-03-03 | Mechano growth factor peptides and their use |
PCT/GB2006/001012 WO2006097764A1 (en) | 2005-03-18 | 2006-03-20 | Mecano growth factor peptides and their use |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200702012A1 EA200702012A1 (ru) | 2008-02-28 |
EA013230B1 true EA013230B1 (ru) | 2010-04-30 |
Family
ID=36498806
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200702012A EA013230B1 (ru) | 2005-03-18 | 2006-03-20 | Пептиды механофактора роста и их применение |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20060211606A1 (ru) |
JP (1) | JP2008533114A (ru) |
CN (1) | CN101300269A (ru) |
BR (1) | BRPI0608450A2 (ru) |
EA (1) | EA013230B1 (ru) |
MX (1) | MX2007011487A (ru) |
WO (1) | WO2006097682A1 (ru) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9926968D0 (en) * | 1999-11-15 | 2000-01-12 | Univ London | Treatment of neurological disorders |
GB0202906D0 (en) | 2002-02-07 | 2002-03-27 | Univ London | Prevention of myocardial damage |
TWI427084B (zh) | 2006-06-09 | 2014-02-21 | Novartis Ag | 穩定化之類胰島素生長因子多肽 |
JP5515319B2 (ja) | 2009-02-23 | 2014-06-11 | 富士レビオ株式会社 | 脂肪細胞への分化誘導培地及び方法 |
CN101891812B (zh) * | 2010-07-09 | 2012-10-17 | 山西大学 | 力生长因子多肽及其制备方法和用途 |
CN103031277B (zh) * | 2011-09-29 | 2015-07-15 | 重庆大学 | 力生长因子在制备无血清培养耐受型哺乳动物工程细胞中的应用 |
CN103694340B (zh) * | 2013-12-09 | 2015-07-01 | 重庆大学 | 重组蛋白igf1-24及其应用 |
CN105254766B (zh) * | 2015-10-26 | 2018-10-16 | 中国航天员科研训练中心 | 机械生长因子MGF E domain肽在调控记忆相关基因和miRNA表达中的应用 |
CN111195350A (zh) * | 2020-01-15 | 2020-05-26 | 重庆大学 | IGF1和IGF1Ec24联合在制备促进组织修复与再生的药物中的应用 |
CN116836227B (zh) * | 2023-05-24 | 2023-12-08 | 艾一生命科技(广东)有限公司 | 一种合成多肽在维持干细胞干性中的应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001036483A1 (en) * | 1999-11-15 | 2001-05-25 | University College London | Use of the insulin-like-growth factor i isoform mgf for the treatment of neurological disorders |
WO2003066082A1 (en) * | 2002-02-07 | 2003-08-14 | University College London | Use of the insulin-like-growth factor i splice variant mgf for the prevention of myocardial damage |
WO2003068949A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Nicholas Beaumont | Treatment of muscle damage |
Family Cites Families (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4447356A (en) * | 1981-04-17 | 1984-05-08 | Olivera Baldomero M | Conotoxins |
US5080891A (en) * | 1987-08-03 | 1992-01-14 | Ddi Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols |
SE8703625D0 (sv) * | 1987-09-18 | 1987-09-18 | Kabivitrum Ab | New medical use |
US5122614A (en) * | 1989-04-19 | 1992-06-16 | Enzon, Inc. | Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides |
US5093317A (en) * | 1989-06-05 | 1992-03-03 | Cephalon, Inc. | Treating disorders by application of insulin-like growth factor |
US5652214A (en) * | 1989-06-05 | 1997-07-29 | Cephalon, Inc. | Treating disorders by application of insulin-like growth factors and analogs |
US5194596A (en) * | 1989-07-27 | 1993-03-16 | California Biotechnology Inc. | Production of vascular endothelial cell growth factor |
US5350836A (en) * | 1989-10-12 | 1994-09-27 | Ohio University | Growth hormone antagonists |
JPH0725794B2 (ja) * | 1990-03-23 | 1995-03-22 | 呉羽化学工業株式会社 | 新規なペプチド |
DK0597033T3 (da) * | 1991-08-01 | 1997-06-02 | Genentech Inc | IGF-1 til forbedring af den neurale tilstand |
US5861373A (en) * | 1991-08-01 | 1999-01-19 | Genentech, Inc | IGF-1 to improve the neural condition |
FR2687681B1 (fr) * | 1992-02-20 | 1995-10-13 | Transgene Sa | Conjugues polyethyleneglycol-hirudine, leur procede de preparation et leur emploi pour le traitement des thromboses. |
KR960700745A (ko) * | 1993-02-26 | 1996-02-24 | 더글라스 에이. 빙햄 | 비(b)형 간염 바이러스에 대한 세포독성 티(t) 임파세포 응답반응을 유도하는 펩티드(peptides for inducing cytotoxic t lymphocyte responses to hepatitis b virus) |
US5840900A (en) * | 1993-10-20 | 1998-11-24 | Enzon, Inc. | High molecular weight polymer-based prodrugs |
US5730990A (en) * | 1994-06-24 | 1998-03-24 | Enzon, Inc. | Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates |
US5650496A (en) * | 1995-04-14 | 1997-07-22 | Cephalon, Inc. | IGF-I purification process |
GB9605124D0 (en) * | 1996-03-11 | 1996-05-08 | Royal Free Hosp School Med | Method of treating muscular disorders |
US6214966B1 (en) * | 1996-09-26 | 2001-04-10 | Shearwater Corporation | Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution |
WO1998049198A1 (en) * | 1997-04-30 | 1998-11-05 | Enzon, Inc. | Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof |
WO1999046283A1 (en) * | 1998-03-09 | 1999-09-16 | Zealand Pharmaceuticals A/S | Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis |
US20030180284A1 (en) * | 1998-11-05 | 2003-09-25 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Prevention and treatment of HCV infection employing antibodies directed against conformational and linear epitopes |
GB0011278D0 (en) * | 2000-05-10 | 2000-06-28 | Univ London | Repair of nerve damage |
WO2002072766A2 (en) * | 2001-03-09 | 2002-09-19 | Board Of Regents, Universitx Of Texas System | Induction of tumor immunity by variants of folate binding protein |
DE10163130B4 (de) * | 2001-12-20 | 2009-05-14 | Cyto Tools Gmbh | Apoptotisch wirksame Peptide und diese umfassende pharmazeutische Zusammensetzungen |
CN1649897A (zh) * | 2002-03-01 | 2005-08-03 | 普罗特米克斯公司 | Falp蛋白 |
US20040022726A1 (en) * | 2002-06-03 | 2004-02-05 | Goldenberg David M. | Methods and compositions for intravesical therapy of bladder cancer |
CA2506490A1 (en) * | 2002-11-25 | 2004-06-10 | Zealand Pharma A/S | Peptide gap junction modulators |
JP2007525188A (ja) * | 2003-05-16 | 2007-09-06 | インターミューン インコーポレイテッド | 合成ケモカイン受容体リガンドおよびその使用方法 |
PT2272868E (pt) * | 2003-06-05 | 2015-07-07 | Genentech Inc | Terapêutica de combinação para distúrbios de células b |
JP2006527772A (ja) * | 2003-06-19 | 2006-12-07 | イーライ リリー アンド カンパニー | メラノコルチン3受容体(mc3r)作用薬ペプチドの用途 |
US7365127B2 (en) * | 2005-02-04 | 2008-04-29 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Process for the preparation of polymer conjugates |
-
2006
- 2006-03-03 JP JP2008501392A patent/JP2008533114A/ja active Pending
- 2006-03-03 WO PCT/GB2006/000773 patent/WO2006097682A1/en not_active Application Discontinuation
- 2006-03-20 BR BRPI0608450-8A patent/BRPI0608450A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-03-20 EA EA200702012A patent/EA013230B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-03-20 MX MX2007011487A patent/MX2007011487A/es not_active Application Discontinuation
- 2006-03-20 US US11/378,624 patent/US20060211606A1/en not_active Abandoned
- 2006-03-20 CN CNA2006800166532A patent/CN101300269A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001036483A1 (en) * | 1999-11-15 | 2001-05-25 | University College London | Use of the insulin-like-growth factor i isoform mgf for the treatment of neurological disorders |
WO2003066082A1 (en) * | 2002-02-07 | 2003-08-14 | University College London | Use of the insulin-like-growth factor i splice variant mgf for the prevention of myocardial damage |
WO2003068949A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Nicholas Beaumont | Treatment of muscle damage |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
DLUZNIEWSKA JOANNA ET AL.: "A strong neuroprotective effect of the autonomous C-terminal peptide of IGF-1 Ec (MGF) in brain ischemia", THE FASEB JOURNAL : OFFICIAL PUBLICATION OF THE FEDERATION OF AMERICAN SOCIETIES FOR EXPERIMENTAL BIOLOGY. NOV 2005, vol. 19, no. 13, November 2005 (2005-11), pages 1896-1898, XP002384222, ISSN: 1530-6860, the whole document * |
SPATOLA A.F.: "Peptide backbone modifications: a structure-activity analysis of peptides containing amide bond surrogates", 1983, CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES, AND PROTEINS, PAGE(S) 267-357, XP002086355, see particularly, pages 338-345 * |
VERONESE F.M.: "Peptide and protein PEGylation - a review of problems and solutions", BIOMATERIALS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS BV., BARKING, GB, vol. 22, no. 5, 1 March 2001 (2001-03-01), pages 405-417, XP004227886, ISSN: 0142-9612, see particularly par.1 * |
YANG S.Y. ET AL.: "Corrigendum to "Different roles of the IGF-I Ec peptide (MGF) and mature IGF-I in myoblast proliferation and differentiation" [FEBS LETTERS, 522(2004), 156-160]", FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 580, 2006, page 2530, XP002384303, ISSN: 0014-5793, the whole document * |
YANG S.Y. ET AL.: "Different roles of the IGF-I Ec peptide (MGF) and mature IGF-I in myoblast proliferation and differentiation", FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 522, no. 1-3, 3 July 2002 (2002-07-03), pages 156-160, XP004369264, ISSN: 0014-5793, the whole document * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2006097682A1 (en) | 2006-09-21 |
CN101300269A (zh) | 2008-11-05 |
EA200702012A1 (ru) | 2008-02-28 |
JP2008533114A (ja) | 2008-08-21 |
MX2007011487A (es) | 2009-02-16 |
BRPI0608450A2 (pt) | 2010-01-12 |
US20060211606A1 (en) | 2006-09-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EA013230B1 (ru) | Пептиды механофактора роста и их применение | |
US10195250B2 (en) | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders | |
US20220016224A1 (en) | Methods and compositions for treating aging-associated conditions | |
JP6571333B2 (ja) | 改変ミニヘプシジンペプチドおよびその使用方法 | |
EP2950807B1 (en) | Compositions and methods of use in treating metabolic disorders | |
JP5977814B2 (ja) | 増殖分化因子15(gdf−15)を使用して代謝障害を治療または改善する方法 | |
JP2018535964A (ja) | 線維芽細胞増殖因子(fgf)1アナログによるステロイド誘導性高血糖の処置 | |
US7863017B2 (en) | TAT-utrophin as a protein therapy for dystrophinopathies | |
CA2601227A1 (en) | Mecano growth factor peptides and their use | |
AU2003282660C1 (en) | Vasoregulating compounds and methods of their use | |
CN105229024A (zh) | 肾病综合征及相关病状的治疗方法 | |
US20160271265A1 (en) | Insulin-like growth factor mimetics for use in therapy | |
US20140303093A1 (en) | Micro-utrophin polypeptides and methods | |
AU2003287289B2 (en) | Promotion of peroxisomal catalase function in cells | |
US11241478B2 (en) | Adenovirus-associated viral vectors for expressing variants of tetratricopeptide repeat (TPR)-containing Rab8b interacting (TRIP8b) protein in neurons and uses thereof for treating major depressive disorder (MDD) | |
EP3261659B1 (en) | Compositions and methods for vascular protection against reperfusion injury after myocardial ischemia | |
JP2006515168A5 (ru) | ||
WO2024158298A1 (en) | Methods and agents for treating respiratory inflammation and associated diseases and conditions | |
WO2024158300A1 (en) | Methods and agents for treating soft tissue inflammation and associated diseases and conditions |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |