CN105229024A - 肾病综合征及相关病状的治疗方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供治疗和/或预防肾病综合征、诸如但不限于与微小病变和膜性肾病相关的肾病综合征和与肾病综合征相关的病状、诸如但不限蛋白尿和水肿以及糖尿病性肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球病的多肽和方法。本公开进一步提供减少蛋白尿和其它如本文所讨论的疾病状态的方法。此类方法包括向对象治疗递送Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物。

Description

肾病综合征及相关病状的治疗方法

相关申请的交叉引用

本申请是2013年3月15日递交的美国申请13/841,240(未决的)的继续。美国申请13/841,240是2012年2月2日递交的美国申请No.13/364,962(未决的)的部分继续。美国申请13/364,962是2011年6月6日递交的国际申请PCT/US11/39255(已弃权)的继续。国际申请PCT/US11/39255要求2010年6月5日递交的美国申请61/351,866(已期满)的优先权。美国申请13/364,962要求2011年2月2日递交的美国申请61/438,854(已期满)的优先权。美国申请13/841,240通过引用整体并入本文。

关于联邦资助研究的声明

本文所述的工作的资金至少部分通过美国国立卫生研究院(NIH)资助号R01DK077073和R01DK090035提供，并且美国政府在本发明中享有某些权利。

技术领域

本公开涉及治疗和预防肾病综合征及其相关病状(诸如但不限于蛋白尿和水肿)的方法。

背景技术

肾病综合征(NS)是指尿中蛋白损失(蛋白尿)、高脂血症(高胆固醇血症和高甘油三酯血症)和水肿的通用术语。肾病综合征涉及肾中细胞诸如足细胞的病变变化。蛋白尿被定义为尿中存在过量的血清蛋白。白蛋白尿，一种特定类型的蛋白尿，是一种白蛋白存在于尿中的病理状态。

足细胞(或内脏上皮细胞)是肾中肾小球毛细血管袢的外层。肾小球过滤血液，阻止大分子诸如蛋白质，并且穿过小分子诸如水、盐和糖，作为形成尿的第一步。足细胞的长突起或者“足突”包裹毛细管，并且停留在肾小球基底膜上。足突通过被称作裂孔隔膜的多孔结构连接。肾小球毛细血管袢的最内层由有孔内皮细胞制备。由肾病综合征影响的肾在肾小球毛细血管袢中具有异常，这引起血液蛋白渗漏，从而导致蛋白尿。

当蛋白在尿中损失时，其血浆浓度降低，从而使水移动至身体其它区域，这导致被称为水肿的肿胀。水肿通常在脚和腿、肚子或腹部(腹水)以及眼周围观察到，但可在任何地方、特别响应于重力发生。此外，由于留在体内的该外液，人们通常体重增加、经历疲劳并且发现他们更少排尿。

许多病状被分类为肾病综合征，包括微小病变(MCD)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、膜性肾病(MN)(也称为膜性肾小球肾炎，MGN)，以及膜增生性肾小球肾炎(MPGN)。多少年来，病理学家发现当在光学显微镜下观察标本时MCD组织没有变化，因而被称为微小病变。随着电子显微镜的出现，现在被称为疾病标志的变化包括足细胞足突的弥漫性缺失、足细胞足突的空泡形成以及微绒毛在内脏上皮细胞上的生长。糖尿病性肾病是肾病综合征的最常见的病因。

高甘油三酯血症可由于降解甘油三酯的酶诸如脂蛋白脂肪酶(LPL)(2-4)活性变化发生。肾病综合征和蛋白尿的病因学中涉及的某些蛋白，此类促血管生成素样4(Angptl4)，抑制LPL的活性。

肾病综合征的分子机制是未知的。在肾病综合征诸如MCD、MN/MGN和MPGN中注意到升高水平的Angptl4，但升高循环水平的Angptl4与肾病综合征中蛋白尿起因无关。然而，Angptl4在肾病综合征(诸如但不限于MCD、FSGS、MN/MGN和MPGN)及相关病状(诸如但不限于蛋白尿)中的作用之前未报道。此外，肾病综合征中蛋白尿和糖皮质激素敏感性的关联及蛋白尿与高甘油三酯血症(肾病综合征的两个关键组分)之间的联系尚未建立。经设计减少蛋白尿的疗法进一步使疾病机制的研究复杂化。例如，用于治疗MCD中蛋白尿的糖皮质激素单独地提高血浆甘油三酯水平(5)，并且在某些形式的肾病综合征诸如MCD(6)中血浆甘油三酯水平的正常滞后于蛋白尿对糖皮质激素的响应。

本公开显示升高循环水平的Angptl4降低肾病综合征及与其相关的病状(诸如但不限于蛋白尿)的严重性。因此，本公开提供治疗和/或预防肾病综合征(诸如但不限于MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN和糖尿病性肾病)的方法，以及缓解与肾病综合征(包括但不限于蛋白尿和水肿)相关的症状的方法。本公开还提供减少蛋白尿和水肿的方法。

附图说明

图1显示aP2-Angptl4TG大鼠的形成和表征。

图1A显示200μg人血浆(n＝4名患者/组，显示裁切的代表性印迹)的2D凝胶分析，并表明与缓解期的MCD患者(即非蛋白尿患者)相比，在复发期的微小病变(MCD)患者中和在膜性肾病(MN)患者中(由箭头表明)存在升高循环水平的Angptl4。

图1B显示用于脂肪组织特异性过表达Angptl4的转基因(TG)大鼠模型(aP2-Angplt4TG)。

图1C显示在aP2-Angptl4TG大鼠中组织特异性过表达Angptl4mRNA(n＝3只大鼠/组)。WAT是白色脂肪组织，BAT是褐色脂肪组织。***P<0.001。

图1D显示200μg血浆的2D凝胶电泳，然后针对Angptl4进行蛋白质印迹(Westernblot)，并表明杂合aP2-Angptl4TG大鼠比野生型大鼠(3月龄，n＝3个印迹/组)具有更高的循环Angptl4水平。

图1E显示200μg血浆的2D凝胶电泳，然后用抗-V5和抗-Angptl4抗体进行蛋白质印迹，并且表明在aP2-Angptl4TG大鼠血浆中存在脂肪组织分泌的V5-标签的Angptl4。

图1F显示来自aP2-Angptl4TG大鼠血浆的抗-N端Angptl4免疫沉淀物的2D凝胶电泳，然后使用凝集素SNAI和抗-Angptl4抗体进行蛋白质印迹，并且确认在aP2-Angptl4中存在循环唾液酸化的Angptl4。

图1G显示来自3月龄的杂合aP2-Angptl4TG大鼠的PAS染色切片(n＝3只大鼠/组)，并且表明正常肾小球形态(放大400x)。

图1H显示使用抗-V5抗体的免疫金EM以特异性检测3月龄的杂合aP2-Angplt4TG雄性大鼠中的转基因蛋白质，并表明选择性位于aP2-Angptl4TG大鼠中的内皮表面上的金颗粒(由箭头指示)。

图2显示升高循环水平的Angptl4与蛋白尿/白蛋白尿的关系。

图2A显示通过GelCode蓝染色的SDSPAGE评估在不同的人和实验疾病情况下尿蛋白分泌(3μg/泳道，除了MCD缓解期)，并表明在aP2-Angptl4TG大鼠中不存在显著的蛋白尿(用*标记的泳道，箭头显示约70kDa的完整白蛋白)。

图2B显示通过ELISA评估白蛋白尿并揭示了杂合雌性aP2-Angptl4TG大鼠与野生型同窝大鼠相比具有较低的白蛋白尿(n＝6只大鼠/组)。

图2C显示通过ELISA评估白蛋白尿并揭示了杂合雄性aP2-Angptl4TG大鼠与野生型同窝大鼠相比具有较低的白蛋白尿(n＝6只大鼠/组)。

图2D显示嘌呤霉素肾病(PAN)，一种肾病综合征的模型，在野生型大鼠和aP2-Angptl4TG大鼠中的诱导，并表明与野生型同窝大鼠(n＝8只大鼠/组)相比，aP2-Angptl4TG大鼠存在较少的蛋白尿。与对应的对照相比，*P<0.05，**P<0.01。

图2E显示重组Angptl4对培养的肾小球内皮细胞(GEnC)具有保护作用。与对应的对照相比，**P<0.01，***P<0.001。

图2F显示在第6天在疾病模型如PAN中在野生型大鼠中Angptl4的上调仅存在于肾小球中，而注意到在第10天(蛋白尿和肾小球Angptl4表达减少)脂肪组织中Angptl4上调(n＝3只大鼠/样品)。与对应的对照相比，**P<0.01，***P<0.001。

图2G显示与野生型大鼠相比，在aP2-Angptl4TG大鼠中基线处和诱导PAN之后升高循环水平的Angptl4导致升高的血浆甘油三酯水平。与对应的对照相比，*P<0.05。

图2H显示与野生型大鼠相比，在aP2-Angptl4TG大鼠中基线处和诱导PAN之后升高循环水平的Angptl4导致降低的肝素后脂蛋白脂肪酶(LPL)活性。与对应的对照相比，*P<0.05。

图3显示用于Taqman实时PCR的引物和探针(SEQIDNO:11-22)。

图4显示在人肾小球疾病的动物模型中重组Angptl4减少蛋白尿。图4(A)显示Thy1.1肾炎(系膜损伤的短期模型)中蛋白尿减少。在雄性Wistar大鼠(n＝4只大鼠/组)中诱导Thy1.1肾炎。在评估基线蛋白尿(第1天)之后，在连续两天(第1&2天，箭头)腹膜内注射来自Angptl4稳定或对照细胞系的浓缩上清液蛋白至BuffaloMna大鼠(n＝4只大鼠/组)中，然后评估蛋白尿。蛋白尿在Angptl4处理的大鼠中始终较低，并且在第5天统计上显著。*P<0.05；**P<0.01。所有值是平均值±SE。图4(B)显示蛋白尿在Thy1.1肾炎(一种系膜损伤的短期模型)中的减少。Thy1.1肾炎在雄性Wistar大鼠中诱导(n＝4只大鼠/组，在第0天注射)。在确认诱导蛋白尿(第1天)之后，将来自Angptl4稳定或对照细胞系的浓缩上清液蛋白在连续两天(第1&2天，箭头)静脉内注射，然后评估蛋白尿。蛋白尿在Angptl4处理的大鼠中始终较低，并且在第5天统计上显著。*P<0.05；**P<0.01。所有值是平均值±SE。

图5显示来自不同物种的Angptl4的氨基酸和cDNA序列。SEQIDNO.1和NO.2显示来自人的氨基酸和cDNA序列(蛋白质变体1同工型a，长型；在位置40和161-164处加下划线的氨基酸序列)；SEQIDNO.3和NO.4显示来自人的氨基酸和cDNA序列(蛋白质变体3同工型b，短型；在位置40和161-164处加下划线的氨基酸序列)；SEQIDNO.5和NO.6显示大鼠的氨基酸和cDNA序列；SEQIDNO.7和NO.8显示小鼠的氨基酸和cDNA；加下划线的是正向测序引物。粗体是反向测序引物。

图6显示升高的循环Angptl4水平为在肾病综合征中形成高甘油三酯血症所需。(A)针对由于原发性肾小球病所导致的肾病综合征患者中血浆Angptl4水平的ELISA。分析的患者数目示于括号内。(B)针对被动型Heymann肾炎(PHN，一种膜性肾病模型)、BuffaloMna(B.Mna，自发形成局灶性节段性肾小球硬化症)和单剂量静脉内嘌呤霉素氨基核苷肾病(PAN，一种微小病变模型)(肾病综合征的所有大鼠模型)中肾病前和肾病阶段的血浆Angptl4水平的ELISA。PHN(C至E)、BuffaloMna大鼠(F至H)及PAN大鼠(I至K)中的蛋白尿、高甘油三酯血症和LPL活性。(L，M)具有升高的循环Angptl4水平的脂肪组织特异性Angptl4过表达大鼠(aP2-Angptl4)、和其中转基因表达的Angptl4不进入循环的3月龄足细胞特异性Angptl4过表达大鼠(NPHS2-Angptl4)中的血浆甘油三酯水平和LPL活性。(n)在使用γ2-NTS诱导肾病综合征之后48小时在Angptl4-/-和+/+小鼠中的血浆甘油三酯水平。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图7显示肾病综合征中循环Angptl4的来源：在(A)被动型Heymann肾炎(PHN)、(B)BuffaloMna大鼠和(C)嘌呤霉素氨基核苷肾病(PAN)中相对于对照的多器官Angptl4mRNA表达。(D)显示诱导轻度PAN之前和之后在蛋白尿NPHS2-Angptl4转基因大鼠中的循环Angptl4水平的血浆的代表性2-维凝胶电泳和血浆的蛋白质印迹。(E)d中2-维凝胶的密度计量学分析。(F)来自患有PAN的NPHS2-Angptl4转基因大鼠的血浆的2-维凝胶电泳和蛋白质印迹，以表明V5-标签的转基因表达的Angptl4在循环中存在。(G和H)在野生型SpragueDawley、aP2-Angptl4和NPHS2-Angptl4转基因大鼠中诱导PAN之后六天的血浆甘油三酯水平(G)和脂蛋白脂肪酶(LPL)活性(H)。空白条对应于本文包括的来自图6(l)和6(m)的数据以用于比较。*P<0.05，**P<0.0，***P<0.001。在图G和图H中，显示转基因大鼠与对应的野生型对照之间的差异的统计显著性。在诱导PAN之前和诱导PAN之后，针对每个大鼠类型，P<0.001。在图A至图C中，表达(水平线)的3倍变化被认为是显著的。

图8显示肾病综合征中Angptl4和LPL的尿损失。(A)来自正常SpragueDawley(SD)、PAN、PHN和BuffaloMna大鼠的尿的代表性还原性(reducing)蛋白质印迹。黑色箭头指向Angptl4条带。白蛋白变红(blush)也在PAN、PHN和BuffaloMna大鼠中在65kDa与70kDa之间显著。(B)使用山羊抗LPL抗体对来自肾病大鼠的尿进行非还原性蛋白质印迹，以评估尿LPL的损失(箭头)。(C)使用抗-LPL单克隆抗体5D2对肾病大鼠尿进行非还原性蛋白质印迹以鉴别活性LPL(箭头)。(D)用于患有PAN的SpragueDawley大鼠中LPL的多器官mRNA表达谱。(E)在aP2-Angptl4转基因大鼠中表达LPL的主要器官的mRNA表达谱。在图D和图E中，表达的3倍变化(水平线)被认为是显著的。

图9显示循环Angptl4对蛋白尿的作用。红色箭头表明抗体或重组蛋白在适当时被注射的时间点。(A)在野生型SpragueDawley大鼠和aP2-Angptl4转基因大鼠中诱导嘌呤霉素氨基核苷肾病(PAN)之后的蛋白尿。(B)在患有PAN的SpragueDawley大鼠中使用抗-Angptl4Ab消耗循环Angptl4对蛋白尿的作用。(C)在注射来自分泌重组大鼠Angptl4的稳定细胞系或对照稳定细胞系的浓缩的上清液之后，BuffaloMna大鼠中的蛋白尿。(D)在严重抗-Thy1.1肾炎(一种系膜损伤模型)中注射来自以上细胞系的重组大鼠Angptl4或对照蛋白对蛋白尿的影响。*P<0.05，**P<0.01。

图10显示使用突变型重组人Angptl4，Angptl4对甘油三酯和蛋白尿的解离影响。(A)显示对LPL结合重要的(氨基酸40和相邻的氨基酸39)和蛋白裂解重要的(氨基酸161至164)的区域中突变的野生型和突变型人Angptl4蛋白的示意图。(B)使用小鼠抗V5抗体和对照小鼠IgG对重组标签的蛋白进行蛋白质印迹以说明完整蛋白的预期尺寸和突变型蛋白中减少的裂解(箭头)。(C)如通过OD450使用来自人Angptl4ELISA试剂盒的试剂评估，在BuffaloMna大鼠(一种局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)模型)中注射55μg重组人蛋白质之后野生型人Angptl4或突变型人Angptl4的血浆水平。(D)在BuffaloMna大鼠中野生型和突变型Angptl4对蛋白尿的影响。*P<0.05，显示其中所有3个研究组单独地不同于对照。(E)在BuffaloMna大鼠中，野生型Angptl4和突变型Angptl4对血浆甘油三酯水平的影响。*与基线相比，针对野生型值，P<0.05。#与野生型相比，针对6小时突变型值，P<0.05。

图11显示循环Angptl4经由其与肾小球内皮αvβ5整合素的相互作用减少蛋白尿。红色箭头表明注射抗β5整合素抗体或免疫前血清的时间点。(A)来自aP2-Angptl4转基因大鼠的肾小球的共聚焦图像表明用肾小球内皮(抗VonWillebrand因子抗体，绿色)共定位从脂肪组织分泌的Angptl4-V5(抗-V5抗体，红色)。(B)使用抗-V5抗体的来自aP2-Angptl4转基因大鼠的肾小球的免疫金电子显微照片，以显示脂肪组织分泌的Angptl4-V5的肾小球内皮细胞表面结合。(C)经纯化的αvβ5整合素与唾液酸化的Angptl4或体外对照的相互作用。叠加线性回归斜率(黑色)。(D)在Angptl4分泌的外周阶段(peripheralphase)期间，在β5整合素-/-和+/+小鼠中使用γ2-肾毒血清(NTS)诱导肾病综合征之后形成蛋白尿，以表明内皮β5整合素-循环Angptl4相互作用对蛋白尿的保护作用。(E)在患有PAN的SpragueDawley大鼠中，使用抗β5整合素抗体阻断内皮β5整合素-Angptl4相互作用对从峰值蛋白尿恢复(与Angptl4分泌的外周阶段对应)的影响。(F)在患有PAN的aP2-Angptl4转基因大鼠中，使用抗β5整合素抗体阻断内皮β5整合素-Angptl4相互作用对从峰值蛋白尿恢复的影响。(G)在Angptl4-/-和+/+小鼠中使用γ2-NTS诱导肾病综合征以确定在Angptl4表达的外周阶段期间缺乏Angptl4是否影响从峰值蛋白尿恢复。肾小球阶段的发现与我们之前公开的研究(来自操作实施例4的参考文献6)一致。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图12显示人血浆的二维凝胶电泳。(A)用抗-Angptl4抗体进行的代表性蛋白质印迹的裁切的图像以显示在膜性肾病(MN)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)和微小病变(MCD)中升高的循环Angptl4水平。Angptl4斑封闭在绿色圆圈/椭圆中。(B)硝酸纤维素膜的丽春红染色成像对应于蛋白质印迹。

图13(A)在注射γ2-NTS后48小时在Angptl4+/+和Angptl4-/-小鼠中的白蛋白尿，对应于图6(n)。从来自操作实施例4的参考文献6的在线增刊再现图像。在研究的第2天显示的类似结果示于图6(h)中。(B)用于图2d中的蛋白质印迹的硝基纤维素膜的丽春红染色的图像。(C)使用正常山羊血清的来自图3b的剥离膜的过暴露的蛋白质印迹。(D)使用正常小鼠IgG的来自图3c的剥离膜的过暴露的蛋白质印迹。(E)在注射重组人野生型Angptl4、人突变型Angptl4和对照蛋白之后12小时至17天在BuffaloMna大鼠中的空腹血浆甘油三酯水平。*P<0.05。

图14：(A)在Angptl4表达的外周阶段期间(第5和7天)，在图11E显示的γ2-NTS注射的Itgb+/+和-/-小鼠中，升高的血浆Angptl4水平。(B)在注射γ2-NTS之后7天，用于图11E中显示的在Itgb+/+小鼠中的Angptl4的多器官mRNA表达谱。(C)在图11F中示出的SpragueDawleyPAN大鼠中的血浆Angptl4水平。(D)在图11F中示出的SpragueDawleyPAN大鼠中的血浆甘油三酯水平。用第0天值进行图A、图C和图D中的所有比较。*P<0.05。

图15显示循环Angptl4在肾病综合征中的原始和生物学作用的示意图。在建立中度至重度蛋白尿之后，骨骼肌、脂肪组织及心脏上调和分泌Angptl4至循环中。该Angptl4的一些结合至肾小球内皮表面上的αvβ5整合素并减少蛋白尿，同时一些结合至并转换活性脂蛋白脂肪酶(LPL)成无活性LPL，其损失在尿中。减少的LPL介导的甘油三酯摄取导致高甘油三酯血症。一些循环Angptl4还损失在尿中。在微小病变(MCD)中，足细胞分泌的低唾液酸化Angptl4在肾小球内发挥局部促蛋白尿作用，然而足细胞分泌的唾液酸化蛋白结合肾小球内皮并渗漏至循环中以诱导高甘油三酯血症。在膜性肾病(MN)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)和非-HIV塌陷性肾小球病(CG)中，足细胞不促进显著量的Angptl4至循环中。

图16(A)人Angptl4ELISA的标准曲线。(B)啮齿类动物Angptl4ELISA的标准曲线。(C)通过蛋白质印迹表征抗-β5整合素抗体8472A。(D)显示在静脉内注射后六小时抗-β5整合素抗体(红色，使用驴抗兔IgG检测)结合至肾小球内皮(蓝色，用小鼠抗-PECAM1抗体标记)的大鼠肾小球的共聚焦图像，从而导致洋红色重叠模式。

图17显示对于人Angptl4的四种突变型的氨基酸和核酸取代。

图18显示使用小鼠抗-V5抗体和对照小鼠IgG标签的图17中显示的重组蛋白的蛋白质印迹，以表明完整蛋白的预期尺寸和突变型蛋白中减少的裂解(箭头)。

图19显示在单一静脉内注射至蛋白尿BuffaloMna大鼠中之后突变型8511的蛋白尿变化的峰水平。

图20显示在注射2种突变型人Angptl4蛋白(15μg)至Zucker糖尿病肥胖大鼠(一种糖尿病性肾病和糖尿病性肾疾病的模型)中之后蛋白尿的减少。

图21显示在注射两种突变型人Angptl4蛋白(15μg)至Zucker糖尿病肥胖大鼠中后蛋白尿的水平。所有*值是相对于第0天的基线值。

图22显示在于Zucker糖尿病肥胖大鼠中注射人Angptl4蛋白(15μg)的2种突变型之后血浆甘油三酯水平没有增加。对于图20-22：*P<0.05，**P<0.01。#P<0.05。

发明内容

在第一方面，本公开提供治疗和/或预防肾病综合征的方法。在一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病性肾病。在另一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD。在另一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MSGS。在另一个实施方案中，肾病综合征由糖尿病病状引起。在一个实施方案中，糖尿病病状是糖尿病性肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球病。所述方法包括向对象施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物的步骤。在一个实施方案中，Angptl4多肽包含SEQIDNO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，氨基酸序列是任何前述序列的具有与野生型Angptl4或Angptl4多肽衍生物相当的活性的片段。在又一个实施方案中，Angptl4多肽衍生物是本文所述的衍生物，并且经修饰具有降低的LPL抑制活性、对裂解耐受、或前述的组合。在一个实施方案中，Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。此类衍生物可基于本文所述的Angplt4多肽中的任一种。Angptl4多肽或多肽衍生物可单独地、作为药物组合物的一部分或与辅助试剂组合以治疗有效剂量施用。在一个实施方案中，此类施用通过提供Angptl4功能治疗肾病综合征。在一个替代实施方案中，此类施用通过提供经修饰的Angptl4功能治疗肾病综合征，诸如但不限于展现出减少的LPL抑制或对裂解耐受的Angptl4功能。

在第二方面，本公开提供治疗和/或预防MCD的方法。所述方法包括向对象施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物的步骤。在一个实施方案中，Angptl4多肽包含SEQIDNO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，氨基酸序列是任何前述序列的具有与野生型Angptl4相当的活性的片段。在又一个实施方案中，Angptl4多肽衍生物是本文所述的衍生物，并且经修饰具有降低的LPL抑制活性、对裂解耐受或前述的组合。在一个实施方案中，Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。此类衍生物可基于本文所述的Angplt4多肽中的任一种。Angptl4多肽或多肽衍生物可单独地、作为药物组合物的一部分或与辅助试剂组合以治疗有效剂量施用。在一个实施方案中，此类施用通过提供Angptl4功能治疗MCD。在一个替代实施方案中，此类施用通过提供经修饰的Angptl4功能治疗MCD，诸如但不限于展现出减少的LPL抑制或对裂解耐受的Angptl4功能。

在第三方面，本公开提供缓解肾病综合征的一个或多个症状、诸如但不限于蛋白尿、高胆固醇血症、高甘油三酯血症和水肿的方法。在一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN和糖尿病性肾病。在另一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD。在另一个实施方案中，肾病综合征由FSGS引起。在另一个实施方案中，肾病综合征由糖尿病病状引起。在一个实施方案中，糖尿病病状是糖尿病性肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球病。所述方法包括向对象施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物的步骤。在一个实施方案中，Angptl4多肽包含SEQIDNO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，氨基酸序列是任何前述序列的具有与野生型Angptl4相当的活性的片段。在又一个实施方案中，Angptl4多肽衍生物是本文所述的衍生物，并且经修饰具有降低的LPL抑制活性、对裂解耐受或前述的组合。在一个实施方案中，Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。此类衍生物可基于本文所述的Angplt4多肽中的任一种。Angptl4多肽或多肽衍生物可单独地、作为药物组合物的一部分或与辅助试剂组合以治疗有效剂量施用。在一个实施方案中，此类施用通过提供Angptl4功能缓解肾病综合征的一个或多个症状。在一个替代实施方案中，此类施用通过提供经修饰的Angptl4功能缓解肾病综合征的一个或多个症状，诸如但不限于展现出减少的LPL抑制或对裂解耐受的Angptl4功能。

在第四方面，本公开提供减少对象蛋白尿的方法。在一个实施方案中，对象正患有肾病综合征。在一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN和糖尿病性肾病。在另一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD。在另一个实施方案中，对象正患有特征在于蛋白尿的病症。在另一个实施方案中，对象正患有糖尿病病状。在另一个实施方案中，蛋白尿由FSGS引起。在一个实施方案中，糖尿病病状是糖尿病性肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球病。所述方法包括向对象施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物的步骤。在一个实施方案中，Angptl4多肽包含SEQIDNO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，氨基酸序列是任何前述序列的具有与野生型Angptl4相当的活性的片段。在又一个实施方案中，Angptl4多肽衍生物是本文所述的衍生物，并且经修饰具有降低的LPL抑制活性、对裂解耐受或前述的组合。在一个实施方案中，Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物被唾液酸化。此类衍生物可基于本文所述的Angplt4多肽中的任一种。Angptl4多肽或多肽衍生物可单独地、作为药物组合物的一部分或与辅助试剂组合以治疗有效剂量施用。在一个实施方案中，此类施用通过提供Angptl4功能减少蛋白尿。在一个替代实施方案中，此类施用通过提供经修饰的Angptl4功能减少蛋白尿，诸如但不限于展现出减少的LPL抑制或对裂解耐受的Angptl4功能。

在第五方面，本公开提供减少对象水肿的方法。在一个实施方案中，对象正患有肾病综合征。在一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN和糖尿病性肾病。在另一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD。在另一个实施方案中，肾病综合征由FSGS引起。在一个特定的实施方案中，水肿由降低的循环水平的血浆蛋白诸如白蛋白引起。在另一个实施方案中，肾病综合征由糖尿病病状引起。在一个实施方案中，糖尿病病状是糖尿病性肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球病。通过施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物的蛋白尿的减少将减少蛋白尿、升高血浆蛋白水平并从而减少水肿。所述方法包括向对象施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物的步骤。在一个实施方案中，Angptl4多肽包含SEQIDNO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，氨基酸序列是任何前述序列的具有与野生型Angptl4相当的活性的片段。在又一个实施方案中，Angptl4多肽衍生物是本文所述的衍生物，并且经修饰具有降低的LPL抑制活性、对裂解耐受或前述的组合。在一个实施方案中，Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物被唾液酸化。此类衍生物可基于本文所述的Angplt4多肽中的任一种。Angptl4多肽或多肽衍生物可单独地、作为药物组合物的一部分或与辅助试剂组合以治疗有效剂量施用。在一个实施方案中，此类施用通过提供Angptl4功能减少水肿。在一个替代实施方案中，此类施用通过提供经修饰的Angptl4功能减少水肿，诸如但不限于展现出减少的LPL抑制或对裂解耐受的Angptl4功能。

在第六方面，本公开提供减少对象高胆固醇血症和/或高甘油三酯血症的方法。在一个实施方案中，对象正患有肾病综合征。在一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN和糖尿病性肾病。在另一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD。在另一个实施方案中，肾病综合征由糖尿病病状引起。在一个实施方案中，糖尿病病状是糖尿病性肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球病。所述方法包括向对象施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物的步骤。在一个实施方案中，Angptl4多肽包含SEQIDNO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，氨基酸序列是任何前述序列的具有与野生型Angptl4相当的活性的片段。在又一个实施方案中，Angptl4多肽衍生物是本文所述的衍生物并且经修饰具有降低的LPL抑制活性、对裂解耐受或前述的组合。在一个实施方案中，Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物被唾液酸化。此类衍生物可基于本文所述的Angplt4多肽中的任一种。Angptl4多肽或多肽衍生物可单独地、作为药物组合物的一部分或与辅助试剂组合以治疗有效剂量施用。在一个实施方案中，此类施用通过提供Angptl4功能减少高胆固醇血症和/或高甘油三酯血症。在一个替代实施方案中，此类施用通过提供经修饰的Angptl4功能减少高胆固醇血症和/或高甘油三酯血症，诸如但不限于展现出减少的LPL抑制或对裂解耐受的Angptl4功能。

在第七方面，本公开提供治疗和/或预防糖尿病病状的方法。在一个实施方案中，糖尿病病状是糖尿病性肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球病。所述方法包括向对象施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物的步骤。在一个实施方案中，Angptl4多肽包含SEQIDNO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，氨基酸序列是任何前述序列的具有与野生型Angptl4相当的活性的片段。在又一个实施方案中，Angptl4多肽衍生物是本文所述的衍生物，并且经修饰具有降低的LPL抑制活性、对裂解耐受或前述的组合。在一个实施方案中，Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物被唾液酸化。此类衍生物可基于本文所述的Angplt4多肽中的任一种。Angptl4多肽或多肽衍生物可单独地、作为药物组合物的一部分或与辅助试剂组合以治疗有效剂量施用。在一个实施方案中，此类施用通过提供Angptl4功能治疗前述病状。在一个替代实施方案中，此类施用通过提供经修饰的Angptl4功能治疗前述病状，诸如但不限于展现出减少的LPL抑制或对裂解耐受的Angptl4功能。

在第八方面，本公开提供用于第一至第六方面的方法的药物组合物。所述组合物包含Anptl4多肽或多肽衍生物中的一种或多种。在一个实施方案中，Angptl4多肽包含SEQIDNO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，氨基酸序列是任何前述序列的具有与野生型Angptl4相当的活性的片段。在又一个实施方案中，Angptl4多肽衍生物是本文所述的衍生物，并且经修饰具有降低的LPL抑制活性、对裂解耐受或前述的组合。在一个实施方案中，Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。此类衍生物可基于本文所述的Angplt4多肽中的任一种。

具体实施方式

在以下讨论中，某些文章和方法将针对背景和介绍性目的描述。不应将本文所含有的任何内容理解为对现有技术的“承认”。申请人明确地保留了权利以在适当的情况下表明本文引用的文章和方法不足以构成在适用的法定条文下的现有技术。

当研究肾病综合征时，值得注意的是从足细胞分泌的Angptl4诱导蛋白尿。更重要的是，如本文所述，在转基因动物模型中循环Angptl4减少蛋白尿。在肾病综合征诸如MCD和MN中注意到升高水平的Angptl4，但升高循环水平的Angptl4与肾病综合征的起因不相关。

尽管升高的Angptl4水平被显示治疗肾病综合征和减少相关的蛋白尿，然而循环中增加的Angptl4经观察可诱导高脂血症(高甘油三酯血症)，诸如但不限于通过抑制LPL。提供升高的循环Angptl4水平的益处而无高脂血症的负面影响将是有利的。此类方法使用如本文所公开的Angptl4多肽衍生物是可能的。

促血管生成素-样蛋白参与高甘油三酯血症和肿瘤转移的发展中，并且在功能上不同于促血管生成素。Angptl4是在肝和脂肪组织中高度表达、在白色脂肪组织和肝中由禁食强烈诱导的PPAR(8)和PPAR(9)靶基因，并且在含氧量正常的情况(10)下是血管内皮细胞的凋亡存活因子。Angptl4是LPL(11)的有效抑制剂，在静脉内注射或腺病毒介导的表达(12，13)之后诱导显著的高甘油三酯血症。其它研究显示经RNA印迹分析(8)Angptl4在心肌细胞和骨骼肌中较少表达，和在全肾中低水平表达。对ANGPTL4基因基于类群的最近研究揭示影响人中甘油三酯水平的变体(14，15)。

本公开显示循环Angptl4在肾病综合征(诸如但不限于MCD、FSGS、MN、MPGN和糖尿病性肾病)中观察到的蛋白尿减少中的决定性作用。

定义

如本文所用的术语“预防”(prevention，prevent，preventing)和“抑制”(suppression，suppress，suppressing)是指作用过程(诸如施用化合物或药物组合物)在疾病或病状的症状、方面或特征发作之前开始以预防或减少此类症状、方面或特征。此类预防和抑制无需完全有用。

如本文所用的术语“治疗”(treatment，treat，treating)是指作用过程(诸如施用化合物或药物组合物)在疾病或病状的症状、方面或特征发作之后开始以消除或减少此类症状、方面或特征。此类治疗无需完全有用。

如本文所用的术语“需要治疗”是指由照料者作出的判断，即患者需要或将受益于治疗。这种判断是基于属于照料者专长的多种因素作出的，但其包括患者由于可通过本公开的方法或化合物治疗的疾病或病状而生病、或即将生病的知识。

如本文所用的术语“需要预防”是指由照料者作出的判断，即患者需要或将受益于预防。这种判断是基于属于照料者专长的多种因素作出的，但其包括患者由于可通过本公开的方法或化合物预防的疾病或病状而生病、或即将生病的知识。

如本文所用的术语“个体”、“对象”或“患者”是指任何动物，包括哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、其它啮齿类动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马或灵长类动物、以及人。术语可指定雄性或雌性或两者，或排除雄性或雌性。

如本文所用的术语“治疗有效量”是指单独或作为药物组合物一部分的化合物的量，其能够对疾病或病状的任何症状、方面或特征具有任何可检测的积极影响。此类影响无需完全有益。当指代Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物时，术语“治疗有效量”是指此类多肽足以减少对象蛋白尿的量。

术语“药学上可接受的衍生物”意指本公开的Angptl4多肽或多肽衍生物的任何药学上可接受的盐、酯、酯的盐、溶剂化物或其它衍生物，其在施用至对象后能够提供(直接或间接)野生型Angptl4的功能；在某些实施方案中，Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物显示降低的的LPL抑制活性或对裂解耐受。特别有利的衍生物是那些当此类多肽施用至对象(如，通过使经口施用的化合物更容易吸收到血液中)时提高本公开的Angptl4多肽或多肽衍生物的生物利用率、增强此类多肽递送至给定生物室、提高溶解度以使得通过注射施用、改变代谢或改变分泌速率的衍生物。在一个实施方案中，衍生物是前药。

除非另有说明，否则术语“药学上可接受的盐”包括可存在于本公开的Angptl4多肽或多肽衍生物中的酸性或碱性基团的盐。

术语“约”和“近似”通常意指鉴于度量的性质或精度，经测量的数量的可接受的误差度或变异度。通常，示例性误差度或变异度在给定值或范围值的20％(％)、优选10％、并更优选5％的范围内。对于生物系统，术语“约”是指可接受的误差的标准偏差、优选不超过给定值的2倍。除非另有说明，否则本文给定的数值数量是近似的，意指当未明确指明时术语“约”或“近似”可被推断。

治疗和预防的方法

本公开提供治疗和/或预防肾病综合征的方法。本公开进一步提供治疗和/或预防MCD、FSGS和/或具有系膜损伤的病状(诸如糖尿病)的方法。本公开进一步提供治疗和/或预防糖尿病病状的方法。在一个实施方案中，糖尿病病状是糖尿病性肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球病。本公开此外提供缓解肾炎综合征的一种或多种症状诸如但不限于蛋白尿、高胆固醇血症、高甘油三酯血症和水肿的方法。再进一步，本公开提供减少蛋白尿的方法。再有，本公开提供减少水肿的方法。本公开此外提供包含Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物中的一种或多种的药物组合物。以下进一步详述了Angptl4多肽衍生物的性质。

在一个实施方案中，本公开的教导内容提供治疗和/或预防需要此类治疗或预防的对象的肾病综合征。在一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD、FSGS、MN/MGN和MPGN。在另一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD。在另一个实施方案中，肾病综合征由FSGS引起。在另一个实施方案中，肾病综合征由糖尿病病状引起。在一个实施方案中，糖尿病病状是糖尿病性肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球病。所述方法包括向对象施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物的步骤。在一个实施方案中，Angptl4多肽包含SEQIDNO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，氨基酸序列是任何前述序列的具有与野生型Angptl4相当的活性的片段。在又一个实施方案中，Angptl4多肽衍生物是本文所述的衍生物，并且经修饰具有降低的LPL抑制活性、对裂解耐受或前述的组合。在一个实施方案中，Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。此类衍生物可基于本文所述的Angplt4多肽中的任一种。Angptl4多肽或多肽衍生物可单独地、作为药物组合物的一部分或与辅助试剂组合以治疗有效剂量施用。在一个实施方案中，此类施用通过提供Angptl4功能治疗肾病综合征。在一个替代实施方案中，此类施用通过提供经修饰的Angptl4功能治疗肾病综合征，诸如但不限于展现出减少的LPL抑制或对裂解耐受的Angptl4功能。此类方法可进一步包括识别需要此类治疗和/或预防的对象。

在一个替代实施方案中，本公开的教导提供治疗和/或预防需要此类治疗或预防的对象的MCD。所述方法包括向对象施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物的步骤。在一个实施方案中，Angptl4多肽包含SEQIDNO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，氨基酸序列是任何前述序列的具有与野生型Angptl4相当的活性的片段。在又一个实施方案中，Angptl4多肽衍生物是本文所述的衍生物，并且经修饰具有降低的LPL抑制活性、对裂解耐受或前述的组合。在一个实施方案中，Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。此类衍生物可基于本文所述的Angplt4多肽中的任一种。Angptl4多肽或多肽衍生物可单独地、作为药物组合物的一部分或与辅助试剂组合以治疗有效剂量施用。在一个实施方案中，此类施用通过提供Angptl4功能来治疗MCD。在一个替代实施方案中，此类施用通过提供经修饰的Angptl4功能治疗MCD，诸如但不限于展现出减少的LPL抑制或对裂解耐受的Angptl4功能。此类方法可进一步包括识别需要此类治疗和/或预防的对象。

在另外的实施方案中，本公开的教导提供缓解肾病综合征的一种或多种症状的方法，所述症状诸如但不限于蛋白尿、高胆固醇血症、高甘油三酯血症和水肿。在一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN和糖尿病性肾病。在另一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD。在另一个实施方案中，肾病综合征由FSGS引起。在另一个实施方案中，肾病综合征由糖尿病病状引起。在一个实施方案中，糖尿病病状是糖尿病性肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球病。所述方法包括向对象施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物的步骤。在一个实施方案中，Angptl4多肽包含SEQIDNO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，氨基酸序列是任何前述序列的具有与野生型Angptl4相当的活性的片段。在又一个实施方案中，Angptl4多肽衍生物是本文所述的衍生物，并且经修饰具有降低的LPL抑制活性、对裂解耐受或前述的组合。在一个实施方案中，Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。此类衍生物可基于本文所述的Angplt4多肽中的任一种。Angptl4多肽或多肽衍生物可单独地、作为药物组合物的一部分或与辅助试剂组合以治疗有效剂量施用。在一个实施方案中，此类施用通过提供Angptl4功能缓解肾病综合征的一种或多种症状。在一个替代实施方案中，此类施用通过提供经修饰的Angptl4功能缓解肾病综合征的一种或多种症状，诸如但不限于展现出减少的LPL抑制或对裂解耐受的Angptl4功能。此类方法可进一步包括识别需要此类治疗和/或预防的对象。

在又一个实施方案中，本公开的教导提供减少对象蛋白尿的方法。在一个实施方案中，对象正患有肾病综合征。在一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN和糖尿病性肾病。在另一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD。在另一个实施方案中，肾病综合征由FSGS引起。在另一个实施方案中，肾病综合征由糖尿病病状引起。在一个实施方案中，糖尿病病状是糖尿病性肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球病。所述方法包括向对象施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物的步骤。在一个实施方案中，Angptl4多肽包含SEQIDNO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，氨基酸序列是任何前述序列的具有与野生型Angptl4相当的活性的片段。在又一个实施方案中，Angptl4多肽衍生物是本文所述的衍生物，并且经修饰具有降低的LPL抑制活性、对裂解耐受或前述的组合。在一个实施方案中，Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。此类衍生物可基于本文所述的Angplt4多肽中的任一种。Angptl4多肽或多肽衍生物可单独地、作为药物组合物的一部分或与辅助试剂组合以治疗有效剂量施用。在一个实施方案中，此类施用通过提供Angptl4功能减少蛋白尿。在一个替代实施方案中，此类施用通过提供经修饰的Angptl4功能减少蛋白尿，诸如但不限于展现出减少的LPL抑制或对裂解耐受的Angptl4功能。此类方法可进一步包括识别需要此类治疗和/或预防的对象。

在又一个实施方案中，本公开的教导提供减少对象水肿的方法。在一个实施方案中，对象正患有肾病综合征。在一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN和糖尿病性肾病。在另一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD。在另一个实施方案中，肾病综合征由FSGS引起。在另一个实施方案中，肾病综合征由糖尿病病状引起。在一个实施方案中，糖尿病病状是糖尿病性肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球病。在一个特定的实施方案中，水肿由降低的循环水平的血浆蛋白诸如白蛋白引起。通过施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物减少蛋白尿将升高减少蛋白尿、升高血浆蛋白水平并从而减少水肿。所述方法包括向对象施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物的步骤。在一个实施方案中，Angptl4多肽包含SEQIDNO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，氨基酸序列是任何前述序列的具有与野生型Angptl4相当的活性的片段。在又一个实施方案中，Angptl4多肽衍生物是本文所述的衍生物，并且经修饰具有降低的LPL抑制活性、对裂解耐受或前述的组合。在一个实施方案中，Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。此类衍生物可基于本文所述的Angplt4多肽中的任一种。Angptl4多肽或多肽衍生物可单独地、作为药物组合物的一部分或与辅助试剂组合以治疗有效剂量施用。在一个实施方案中，此类施用通过提供Angptl4功能减少水肿。在一个替代实施方案中，此类施用通过提供经修饰的Angptl4功能减少水肿，诸如但不限于展现出减少的LPL抑制或对裂解耐受的Angptl4功能。此类方法可进一步包括识别需要此类治疗和/或预防的对象。

在又一个实施方案中，本公开的教导提供减少对象高胆固醇血症和/或高甘油三酯血症的方法。在一个实施方案中，对象正患有肾病综合征。在一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD、FSGS、MN/MGN和MPGN。在另一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD。在另一个实施方案中，肾病综合征由FSGS引起。在另一个实施方案中，肾病综合征由糖尿病病状引起。在一个实施方案中，糖尿病病状是糖尿病性肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球病。所述方法包括向对象施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物的步骤。在一个实施方案中，Angptl4多肽包含SEQIDNO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，氨基酸序列是任何前述序列的具有与野生型Angptl4相当的活性的片段。在又一个实施方案中，Angptl4多肽衍生物是本文所述的衍生物，并且经修饰具有降低的LPL抑制活性、对裂解耐受或前述的组合。在一个实施方案中，Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物被唾液酸化。此类衍生物可基于本文所述的Angplt4多肽中的任一种。Angptl4多肽或多肽衍生物可单独地、作为药物组合物的一部分或与辅助试剂组合以治疗有效剂量施用。在一个实施方案中，此类施用通过提供Angptl4功能减少蛋白尿。在一个替代实施方案中，此类施用通过提供经修饰的Angptl4功能减少蛋白尿，诸如但不限于展现出减少的LPL抑制或对裂解耐受的Angptl4功能。此类方法可进一步包括识别需要此类治疗和/或预防的对象。

在又一个实施方案中，本公开的教导提供治疗和/或预防由糖尿病病状引起的肾病综合征的方法。在一个实施方案中，糖尿病病状是糖尿病性肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球病。所述方法包括向对象施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物的步骤。在一个实施方案中，Angptl4多肽包含SEQIDNO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，氨基酸序列是任何前述序列的具有与野生型Angptl4相当的活性的片段。在又一个实施方案中，Angptl4多肽衍生物是本文所述的衍生物，并且经修饰具有降低的LPL抑制活性、对裂解耐受或前述的组合。在一个实施方案中，Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。此类衍生物可基于本文所述的Angplt4多肽中的任一种。Angptl4多肽或多肽衍生物可单独地、作为药物组合物的一部分或与辅助试剂组合以治疗有效剂量施用。在一个实施方案中，此类施用通过提供Angptl4功能治疗前述病状。在一个替代实施方案中，此类施用通过提供经修饰的Angptl4功能治疗前述病状，诸如但不限于展现出减少的LPL抑制或对裂解耐受的Angptl4功能。

施用Angptl4多肽或衍生物的一些实施方案涉及一种递送多肽至血液的施用形式。在一个实例中，静脉内施用多肽。鉴于适当的剂型，此类施用可经口、皮下或通过如本领域已知的其它方式进行。Angptl4多肽或衍生物可以治疗有效量施用；该量通常将在化合物重量与对象重量比率的某些范围内。在所述方法的一些实施方案中，多肽是以约0.005-150,000μg/kg、0.5-15,000μg/kg、5-1500μg/kg或50-150μg/kg的剂量施用。因此，对于典型的70kg成人，剂量可为0.0035-11,000mg、0.035-1100mg、0.35-110mg或3.5-11mg。施用可定期发生。在所述方法的一些实施方案中，多肽以每14天约一次施用。在其它实施方案中，多肽以每月约两次施用。在另一些其它实施方案中，多肽以每月约一次至每月约两次施用。在另外的实施方案中，多肽以每给定时间段施用一次，所述给定时间段选自由以下组成的组：一天、两天、三天、一周、十天、两周、三周、四周、以及一个月。

筛选方法

本公开还涉及识别有效治疗或预防肾病综合征或与其相关的病状诸如但不限于蛋白尿、高胆固醇血症、高甘油三酯血症或水肿的化合物的方法。在一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD或MN。在另一个实施方案中，肾病综合征的特征在于MCD。在另一个实施方案中，肾病综合征特征在于FSGS。在另一个实施方案中，肾病综合征由糖尿病病状引起。在一个实施方案中，糖尿病病状是糖尿病性肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球病。此类化合物可用作药物组合物中所包含的活性成分或单独施用。在一个实施方案中，所述方法包括确定肾病综合征的病因学中涉及的多肽诸如但不限于Angptl4的水平。

通常，此类筛选方法包括提供表达肾病综合征的病因学中涉及的多肽诸如但不限于Angptl4的测定系统(如以下详述)、将待测试的测试化合物引入至测定系统中及确定测试化合物是否对多肽水平有影响的步骤。所述方法涉及鉴定达到多肽唾液酸化的水平的候选物或测试化合物或试剂(多肽、功能核酸、碳水化合物、抗体、小分子或其它分子)。此类化合物然后可在适当的系统(诸如但不限于本文所述的动物模型系统)中测试以测定经鉴定的化合物的活性。

使用多种测定鉴定候选化合物，诸如但不限于采用表达肾病综合征的病因学中涉及的多肽(诸如但不限于Angptl4)的细胞的测定或使用经分离的多肽的测定。各种测定可采用此类多肽的多种变体(如，全长、生物活性片段、或包含所需多肽的全部或部分的融合蛋白)。此外，此类多肽可源自任何适合的哺乳动物物种(如，人、大鼠或鼠科动物)；在特定的实施方案中，该多肽源自人。

当测定涉及使用全细胞时，所述细胞可天然表达肾病综合征的病因学中涉及的多肽(诸如但不限于Angptl4)，或可经修饰以表达多肽。在后一种情况下，可通过常规分子生物学技术，细胞经修饰以表达所需的多肽，诸如通过用包含此类多肽的病毒感染细胞。所述细胞还可为已被编码此类多肽的核苷酸序列感染的原核细胞或真核细胞。在前文中，可使用全长多肽、含有此类多肽的至少一部分的片段或融合蛋白。示例性测定系统在当前说明书中描述。

各种筛选测定可与需要测量测试化合物对本文讨论的症状、疾病状态和病状的影响的体内测定组合。在此类实施方案中，可评估所述化合物以确定它们是否影响与肾病综合征或与其相关的病状(诸如但不限于蛋白尿或水肿)相关的参数。此类参数包括但不限于，确定1)肾病综合征及相关病状的病因学中涉及的多肽(诸如但不限于Angptl4)的水平和2)就总组分或特定组分而言确定蛋白分泌的水平。

在一个实施方案中，此类筛选测定可通过例如确定多肽(诸如但不限于Angptl4)的水平和检测与在不存在测试化合物的情况下相比较在存在测试化合物的情况下此类多肽水平的差异进行。此类筛选测定可是体外、体内或离体的，并可基于细胞培养物(全细胞或裂解物)或可基于动物模型。本公开的任何测定可用于前述方法中。

适用于筛选方法的测试化合物可从任何适合来源、诸如常规化合物文库获得。测试化合物还可使用本领域已知的组合文库方法中的多种方法中的任何一种获得，所述文库方法包括：生物文库、空间可寻址的平行固相或溶液相文库、需要解卷积的合成文库方法、“一珠一化合物”文库方法和合成文库方法(使用亲和色谱法选择)。生物文库方法限制于肽文库，而其它四种方法适用于化合物的肽、非肽寡聚物或小分子文库。合成分子文库的方法的实例可见于本领域中。化合物的文库可以在溶液中或珠、细菌、孢子、质粒或噬菌体上呈现。

本公开还提供执行本公开的任何方法的试剂盒，其可含有本文公开的或另外可用于实践本公开方法的任何化合物和/或组合物。

Angptl4多肽衍生物的产生和选择

促血管生成素-相关蛋白4是在人中由ANGPTL4基因编码的多肽。该基因是促血管生成素/促血管生成素样基因家族的成员，并且编码具有N-端信号序列(SEQIDNO:1的氨基酸残基1-22)、卷曲螺旋结构域(SEQIDNO:1的氨基酸残基23-170)、连接子区域(SEQIDNO:1的氨基酸残基171-185)和纤维蛋白原C-端结构域(SEQIDNO:1的氨基酸残基186-406)的糖基化分泌蛋白。该基因在缺氧性情况下在内皮细胞中诱导，并且是过氧物酶体增殖活化剂的靶标。编码的蛋白是调控葡萄糖稳态、脂质代谢和胰岛素敏感度中直接涉及的血清激素，并且也用作血管内皮细胞的凋亡存活因子。已经描述了编码不同同工型的可选剪接的转录变体。该基因之前指代为ANGPTL2，但已被重新命名为ANGPTL4。

Angptl4通过断开LPL二聚体分子抑制LPL。Angptl4已明确地确定为导致血浆TG水平升高的血液血浆甘油三酯(TG)清除的有效抑制剂。最近证据表明Angptl4多肽序列的变体影响对甘油三酯的作用，其中某些突变赋予降低的甘油三酯水平，暗示减少的LPL抑制(33和34，每一个通过参考并入以用于Angptl4变体的教导)。此外，已报道了Angptl4多肽以寡聚物形式存在并且寡聚化为抑制LPL活性所需。一旦从细胞分泌，则寡聚物形式在裂解位点裂解(SEQIDNO:1和3的R₁₆₁RKR₁₆₄)以提供单体C-端形式和寡聚N-端形式(34)。Angptl4肽的N-端残基1-187被发现可足以抑制LPL(33)。

人、大鼠和小鼠的氨基酸和cDNA序列提供在图5中，并被命名为SEQIDNO:1-8。本公开涵盖Angptl4多肽和多肽衍生物在本文公开的方法、诸如但不限于治疗和预防方法中的用途。如本文所定义，Angptl4多肽衍生物是指这样的Angptl4多肽，其包括由SEQIDNO:1或3显示的人多肽或SEQIDNO:5或7显示的多肽的氨基酸序列确定的一个或多个插入、缺失和/或取代。

Angptl14衍生物的一些实施方案包含核心结构，其是具有如本文所述的一个或多个取代的SEQIDNO:1、3、5或7中的两个或更多个之间的共有序列。Angptl14衍生物的一个实施方案包含SEQIDNO:1与SEQIDNO:3(两种形式的人Angptl14)之间的共有序列；该共有序列包含：

A—B—C

其中A与SEQIDNO:26至少80％同源、B是0-38个残基的寡肽(任选的连接区域)，及C与SEQIDNO:27至少80％同源。A与SEQIDNO:26的同源性水平和C与SEQIDNO:27的同源性水平当然可能高出80％。这些同源性水平可独立选自80％至100％、例如85％、90％、95％、99％、99.5％和100％。寡肽B的序列可为任何序列。寡肽B的一些实施方案与SEQIDNO:1的位置184-222至少50％同源。在此类实施方案中，同源性水平可选自在50-100％范围内的任何点，出于示例性目的包括60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％和100％。

Angptl14衍生物的另一个实施方案包含所有SEQIDNO:1、3、5和7(人变体、大鼠和小鼠)之间的共有序列；该共有序列包含：

V—W—X—Y—Z

其中V与SEQIDNO:23具有至少80％的同源性，W是0-5个残基的寡肽，X与SEQIDNO:24具有至少80％的同源性，Y是0-38个残基的寡肽(任选的连接区域)，以及Z与SEQIDNO:25具有至少80％的同源性。V与SEQIDNO:23的同源性的水平、X与SEQIDNO:22的同源性的水平及Z与SEQIDNO:25的同源性的水平可高于80％。这些同源性水平可独立地选自80％至100％，例如85％、90％、95％、99％、99.5％和100％。寡肽Y的序列可为任何序列。寡肽B的一些实施方案与SEQIDNO:1的位置184-222至少50％同源。在此类实施方案中，同源性的水平可选自50％至100％范围内的任何点，出于示例性目的包括60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％和100％。

这些共有序列允许在对应于SEQIDNO:1的位置39、40、46、50和53的位置处的取代，其如在本公开中所教导可用于降低LPL抑制活性。它们还允许在对应于SEQIDNO:1的位置63-66的位置处的取代，其如在本公开中所教导可用于提高蛋白对裂解的耐受性。它们还允许在对应于SEQIDNO:1的位置5、67、72、77、167、174、190、230、233、237、251、266、278、291、293、296、307、308、336、338、349、361、371和384的位置处的取代，因为通过在UniProt(www.uniprot.org)上搜索这些已被揭示是已知天然人变体的位点。Angptl14衍生物的特定实施方案包含在这些位置处的以下取代中的一种或多种：P5L、S67R、R72L、G77R、E167K、P174S、E190Q、E196K、R230C、G233R、F237V、P251T、T266M、R278Q、V291M、L293M、E296V、P307S、V308M、R336C、D338E、W349C、G361R、G361S、R371Q和R384W。此类天然存在的取代将被期望用于保存所述蛋白的功能。

在一个实施方案中，将Angptl4多肽的氨基酸残基移除并用不同氨基酸残基替代。可如本文所述或如本领域已知那样构建变体。如此构建的变体可使用本文所述的方法和测定评估以筛选活性。

当在本文中使用时，当用于指代氨基酸时单个字母具有以下含义：

G

甘氨酸

P

脯氨酸

W

色氨酸

H

组氨酸

A

丙氨酸

V

缬氨酸

K

赖氨酸

R

精氨酸

L

亮氨酸

I

异亮氨酸

Q

谷氨酰胺

N

天冬酰胺

M

甲硫氨酸

C

半胱氨酸

E

谷氨酸

D

天冬氨酸

F

苯丙氨酸

Y

酪氨酸

S

丝氨酸

T

苏氨酸

在一个实施方案中，变体包含Angptl4多肽的氨基酸序列的变化，所述变化减少Angptl4抑制LPL或耐受裂解的能力。所示变化可为该区域一个或多个残基的替代、缺失和/或取代。在本领域中已描述此类变化(参见参考文献33和34，对于该教导其通过引用并入本文中)。在一个实施方案中，此类变化在SEQIDNO:1的残基1-187、SEQIDNO:3的残基1-182、SEQIDNO:26的残基1-182、SEQIDNO:23的任何残基以及SEQIDNO:24的残基1-79中发生。

Angptl4多肽衍生物的衍生物的一些实施方案在SEQIDNO:1的位置39-55(DEMNVLAHGLLQLGQGL)处不同于人野生型序列；该区域对应于SEQIDNO:1、3、5、7、22和24的位置39-55。衍生物的另外实施方案包含在位置39-55处的序列，所述序列不是DEMNVLAHGLLQLGQGL(SEQIDNO:1的位置39-55)也不是DKMNVLAHGLLQLGQGL(SEQIDNO:28)。Angptl4多肽衍生物的另外实施方案在位置39、40、46、50和53处具有至少一个取代，使得V的位置39-40不是DE、V的位置46不是H、V的位置50不是Q，及V的位置53不是Q。

在一些实施方案中，此类变化在SEQIDNO:1、3、5、7、22或24的位置40处发生。在一个实施方案中，位置40处的氨基酸(野生型Angptl4中带负电的谷氨酸残基)被中性氨基酸或带正电的氨基酸替代。在一个特定实施方案中，所述变化是E40K取代。在另一个特定实施方案中，所述变化是E40A取代。E40K和E40A取代已显示减少Angptl4对LPL的抑制，但不干扰该多肽的表达、分泌、加工及其它功能。在一个另外特定的实施方案中，位置40处的变化选自下表1所示的那些。在又一个实施方案中，SEQIDNO:1、3、5、7、21或24的位置39处的氨基酸(野生型Angptl4中的带负电的天冬氨酸残基)被中性的或带正电的氨基酸替代。在一个实施方案中，取代是D39A取代或D39K取代。在一个另外特定的实施方案中，SEQIDNO:1、3、5、7、21或24的位置39处的变化选自下表1所示的那些。在某些实施方案中，所述多肽变体可含有位置40处的前述变化之一、位置39处的前述变化之一或前述的组合。在一个特定实施方案中，所述多肽含有D39K取代和E40K取代、D39A取代和E40K取代、或D39K取代和E40A取代。在一个另外特定的实施方案中，多肽衍生物在位置39-40处的序列选自由以下组成的组：DK、KE、DA和AE。在又一个实施方案中，多肽衍生物在位置39-40处的序列不是DE。

在另一个实施方案中，所述衍生物包含Angptl4多肽的负责多肽裂解的区域中的一种或多种变化。在一个实施方案中，该区域是Angptl4的R₁₆₁RKR₁₆₄区域(对应于SEQIDNO:1、3、5、7和26的位置161-164，和SEQIDNO:24的位置63-66)。所述变化可为该区域中一个或多个残基的替代、缺失和/或取代。R₁₆₁RKR₁₆₄区域已显示负责Angptl4的寡聚物形式的裂解，从而释放N-端序列的寡聚物和C-端序列的单体。具有突变裂解位点的Angptl4的形式显示比野生型多肽在循环中以更高的水平积累。此外，预防Angptl4多肽的裂解稳定经观察在本公开中有效的Angptl4的寡聚物形式。在一个实施方案中，R₁₆₁RKR₁₆₄区域的所有4个氨基酸残基被改变，使得序列不是RRKR；在一个替代实施方案中，R₁₆₁RKR₁₆₄区域的任何1、2或3个氨基酸残基被改变。在另一个实施方案中，位置161、162或164处的精氨酸残基被甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代，并且位置163处的赖氨酸残基被甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸或丝氨酸取代。在一个特定的实施方案中，R₁₆₁RKR₁₆₄序列被选自由以下组成的组的序列替代：GAAG(SEQIDNO:29)、GSGS(SEQIDNO:80)、GVVA(SEQIDNO:49)、SGGG(SEQIDNO:87)和VAVA(SEQIDNO:90)。在一个另外特定的实施方案中，R₁₆₁RKR₁₆₄序列被AAVV替代。替代SEQIDNO:1或3的整个R₁₆₁RKR₁₆₄区域的示例性氨基酸序列提供于下表2中。

在另一个实施方案中，R₁₆₁RKR₁₆₄序列中的一个或多个氨基酸经改变去除能够裂解Angplt4的酶的共有结合位点，使得Angptl4耐受裂解。在一个实施方案中，所述酶是前蛋白转化酶并且共有结合位点是RXKR、RXRR、RR或KR，其中X是任何氨基酸。在进行此类改变期间，一个或多个氨基酸可被缺失或用甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸或丝氨酸取代或本文讨论其它取代中的任何一个取代。

在又一个实施方案中，所述变体包含负责多肽寡聚的Angptl4多肽的区域中的一个或多个变化。在一个实施方案中，该区域是Angptl4的C₇₆和/或C₈₀区域。C₇₆和/或C₈₀区域已显示涉及Angptl4多肽(34，对于该教导，该参考文献被包括在本文中)的寡聚。所述变化可为该区域中的一个或多个残基的替代、缺失和/或取代。在一个特定实施方案中，位置76和80处仅一个半胱氨酸残基被取代；在一个替代实施方案中，位置76和80两处的半胱氨酸残基均被取代。在一个实施方案中，位置76和80处的半胱氨酸残基中的至少一个被丙氨酸或丝氨酸独立取代；在另一个实施方案中，两个半胱氨酸残基被丙氨酸或丝氨酸取代。

在另一个实施方案中，所述变体包含抑制Angptl4多肽寡聚物裂解的Angplt4的R₁₆₁RKR₁₆₄区域中的一个或多个变化，及位置40处减少Angptl4对LPL活性的抑制的变化。本文讨论的任何变化被包括。

在一个实施方案中，本公开提供具有SEQIDNO:9或10的氨基酸序列的Angptl4多肽变体。SEQIDNO:9显示于图4中并包括SEQIDNO:1的Angptl4的野生型序列，除了在位置39、40、76、80和161-164处分别由X₃₉、X₄₀、X₇₆、X₈₀、X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄表示的取代之外。SEQIDNO:10示于图4中并包括SEQIDNO:3的Angptl4的野生型序列，除了位置39、40、76、80和161-164处分别由X₃₉、X₄₀、X₇₆、X₈₀、X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄表示的取代之外。

在SEQIDNO:9和10中，X₃₉可为A、G、P、V、L、I、M、C、F、Y、W、H、R、Q、N、S、T或K。在一个实施方案中，X₃₉是中性或带正电的氨基酸。在另一个实施方案中，X₃₉可为A或K。在又一个实施方案中，X₃₉可为D。

在SEQIDNO:9和10中，X₄₀可为A、G、P、V、L、I、M、C、F、Y、W、H、R、Q、N、S、T或K。在一个实施方案中，X₄₀是中性或带正电的氨基酸。在另一个实施方案中，X₄₀可为A或K。在又一个实施方案中，X₄₀可为E。在又一个实施方案中，当X₃₉不是D时X₄₀可为E且当X₄₀不是E时X₃₉可为D。

在SEQIDNO:9和10中，X₇₆和X₈₀中的至少一个可被取代。在一个实施方案中，X₇₆和X₈₀独立为A或S或C。在一个实施方案中，X₇₆和X₈₀中的一个可为A或S，并且X₇₆和X₈₀中的另一个是C。在另一个实施方案中，X₇₆和X₈₀的两者可独立地为A或S。在又一个实施方案中，X₇₆和X₈₀的两者可为C。

在SEQIDNO:9和10中，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的至少一个可被取代。在一个实施方案中，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄的全部四个被取代；在一个替代实施方案中，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄的1、2或3个被取代。在另一个实施方案中，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄独立为D、R、K、G、A、V或S。在又一个实施方案中，全部4个被表2中引用的组合所取代。

本公开涵盖任何形式的前述的组合。此外，SEQIDNO:9和10中命名的残基可用如表3中所命名的保守氨基酸取代，或可用存在+/-1或更小的亲水指数差异的残基取代，或用存在+/-1或更小的亲水性值差异的残基取代。

在一个实施方案中，X₃₉是D、X₄₀是A或K、X₇₆和X₈₀是C且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄独立地被D、R、K、G、A、V或S取代，可选地前提是X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的至少一个是SEQIDNO:1或3中不存在的氨基酸。在另一个实施方案中，X₃₉是D、X₄₀是A或K、X₇₆和X₈₀是C且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄选自表2中显示的组合。在又一个实施方案中，X₃₉是D、X₄₀是A或K、X₇₆和X₈₀是C且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄是GSGS或GAAG。

在另外的实施方案中，X₃₉是D、X₄₀是A或K、X₇₆和X₈₀中的一个是A或S且X₇₆和X₈₀中的另一个是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄独立地被D、R、K、G、A、V或S取代，可选地前提是X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的至少一个是SEQIDNO:1或3中不存在的氨基酸。在另一个实施方案中，X₃₉是D、X₄₀是A或K、X₇₆和X₈₀中的一个是A或S且X₇₆和X₈₀中的另一个是C，及X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄选自表2中显示的组合。在又一个实施方案中，X₃₉是D、X₄₀是A或K、X₇₆和X₈₀中的一个是A或S且X₇₆和X₈₀中的另一个是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄是GSGS或GAAG。

在一个实施方案中，X₃₉是A或K、X₄₀是E、X₇₆和X₈₀是C及X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄独立地被D、R、K、G、A、V或S取代，可选地前提是X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的至少一个是SEQIDNO:1或3中不存在的氨基酸。在另一个实施方案中，X₃₉是A或K、X₄₀是E、X₇₆和X₈₀是C，及X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄选自表2中显示的组合。在又一个实施方案中，X₃₉是A或K、X₄₀是E、X₇₆和X₈₀是C、及X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄是GSGS或GAAG。

在一个实施方案中，X₃₉是D、X₄₀是K、X₇₆和X₈₀是C、及X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄独立地被D、R、K、G、A、V或S取代，可选地前提是X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的至少一个是SEQIDNO:1或3中不存在的氨基酸。在另一个实施方案中，X₃₉是D、X₄₀是K、X₇₆和X₈₀是C且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄选自表2中显示的组合。在又一个实施方案中，X₃₉是D、X₄₀是K、X₇₆和X₈₀是C且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄是GSGS或GAAG。

在一个实施方案中，X₃₉是D、X₄₀是K、X₇₆和X₈₀中的一个是A或S且X₇₆和X₈₀中的另一个是C，及X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄独立地被D、R、K、G、A、V或S取代，可选地前提是X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的至少一个是SEQIDNO:1或3中不存在的氨基酸。在另一个实施方案中，X₃₉是D、X₄₀是K、X₇₆和X₈₀中的一个是A或S且X₇₆和X₈₀中的另一个是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄选自表2中显示的组合。在又一个实施方案中，X₃₉是D、X₄₀是K、X₇₆和X₈₀中的一个是A或S且X₇₆和X₈₀中的另一个是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄是GSGS或GAAG。

在一个实施方案中，Angptl4衍生物基于Angplt4的片段。适合的片段包括保留野生型Angplt4的活性的任何片段，或者100或更多个连续氨基酸的任何片段。在一个实施方案中，此类片段基于SEQIDNO:1的氨基酸1-187或SEQIDNO:3的氨基酸1-182。此类片段可具有在前段落中描述的氨基酸取代。

Angptl4多肽衍生物可具有与野生型Angptl4多肽活性相比相当的或增加的(在一个实施方案中，50％或更多)的活性；可替选地，Angptl4多肽衍生物可具有与野生型Angptl4多肽活性相比降低的活性(在一个实施方案中，小于50％)。在一个特定的实施方案中，Angptl4多肽衍生物具降低的抑制LPL的能力，并且显示增加的裂解耐受性。

如本领域普通技术人员已知的，可选择缺失、添加和取代以产生所需的Angptl4多肽衍生物。例如，具有类似性质的氨基酸的保守取代或取代被期望是可接受的。此外，特异性缺失、插入和取代可正面或负面影响某种Angptl4多肽活性但不影响不同的Angptl4多肽活性。

对SEQIDNO:1或3或5或7中的任何一个的氨基酸序列的保守修饰，包括其组合(及对编码核苷酸对应的修饰)将产生Angptl4多肽衍生物，所述Angptl4多肽衍生物具有与天然存在的Angptl4多肽的功能特性和化学特性类似的功能特性和化学特性，同时将非所需的性质诸如LPL抑制活性最小化。相反，对Angptl4多肽的功能特性和/或化学特性的大量修饰可通过选择SEQIDNO:1或3或5或7中的任何一个的氨基酸序列(包括其组合)中的取代实现，其在对维持取代区域中分子主链的结构影响方面显著不同。

例如，“保守氨基酸取代”可涉及用非天然残基取代天然氨基酸残基，使得对此位置处氨基酸残基的极性或电荷几乎没有或没有影响。此外，多肽中的任何天然残基还可被丙氨酸取代。

保守氨基酸取代还涵盖非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而非通过生物系统中的合成并入。这些包括肽模拟物，及其它反向或倒置形式的氨基酸部分。本领域技术人员应理解本文所述的核酸和多肽分子可化学合成以及通过重组方式生成。

天然存在的残基基于常见的侧链性质可分为如下几类：1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；3)酸性的：Asp、Glu；4)碱性的：His、Lys、Arg；5)影响链朝向的残基：Gly、Pro；及6)芳族的：Trp、Tyr、Phe。

例如，非保守取代可涉及这些类别中的一个类别的成员交换另一个类别的成员。可将此类取代的残基引入至与非人Angptl4多肽直系同源物同源的Angptl4多肽衍生物的区域，或引入至该分子的非同源区域。

在进行此类变化的过程中，可考虑氨基酸的亲水指数。基于它们的疏水性和电荷特性对各个氨基酸分配亲水指数，这些是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

在本领域中理解赋予蛋白质交互生物功能的亲水性氨基酸指数的重要性(Kyte等，J.Mol.Biol.，157:105-131，1982)。已知某些氨基酸可被取代为具有类似亲水指数或得分的其它氨基酸，并且仍然保留类似的生物活性。

在基于亲水指数进行改变的过程中，可使用亲水性指数在+/-2范围内的氨基酸的取代；在一个替代实施方案中，亲水性指数在+/-1内；在又一个可替代的实施方案中，亲水性指数在+/-0.5内。

本领域也应理解可基于亲水性对类似氨基酸进行有效的取代。如由其相邻的氨基酸的亲水性控制的多肽的最大局部平均亲水性与蛋白的生物性质相关。

以下亲水性值可被分配给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。

在基于类似亲水性值进行改变的过程中，可使用亲水性值在+/-2内的氨基酸的取代；在一个替代实施方案中，亲水性值在+/-1内；在又一个可替代的实施方案中，亲水性值在+/-0.5内。

所需的氨基酸取代(无论保守还是不保守)可在需要此类取代的时间由本领域技术人员所确定。例如，氨基酸取代可用于鉴别Angptl4多肽的重要残基，或者增加或减少Angptl4多肽与特定结合靶的亲和力，从而提高或降低Angptl4多肽活性。

示例性氨基酸取代示于表3中。

技术人员将能够使用已知的技术确定适合的如SEQIDNO:1、3、5、7、9、10和20-24中的任一个所示的多肽的变体，包括其组合。为了鉴定该分子的可被改变而不破坏活性的适合区域，本领域的技术人员可靶向不被认为对活性重要的区域。例如，当已知具有来自相同类别或其它类别的类似活性的类似多肽时，本领域的技术人员可比较Angptl4多肽与此类类似多肽的氨基酸序列。通过这样的比较，人们可鉴定分子的在类似多肽之间保守的残基和部分。应理解，Angptl4多肽中相对于此类类似多肽不保守的区域中的变化将不太可能不利地影响Angptl4多肽的生物活性和/或结构。本领域的技术人员也将得知，甚至在相对保守区域中，人们可用化学类似的氨基酸取代天然存在的残基，同时保留活性(保守氨基酸残基取代)。因此，甚至对于生物活性或结构重要的区域可经受保守氨基酸取代而不会破坏生物活性或不会不利地影响多肽结构。

此外，本领域的技术人员可评述结构-功能研究，所述研究鉴定类似多肽中对活性或结构重要的残基。鉴于此类比较，人们可预测Angptl4多肽中对应于对类似多肽中活性或结构重要的氨基酸残基的氨基酸残基的重要性。本领域的技术人员可选择化学上类似的氨基酸取代用于Angptl4多肽中此类预测的重要氨基酸残基。

本领域的技术人员还可分析与类似多肽中此结构相关的三维结构和氨基酸序列。鉴于此信息，本领域的技术人员可就其三维结构而言预测Angptl4多肽的氨基酸残基的比对。本领域的技术人员可选择不对经在蛋白表面上预测的氨基酸残基进行基团变化，因为此类残基可参与与其它分子重要的相互作用。此外，本领域的技术人员可产生在每个所需的氨基酸残基处含有单一氨基酸取代的测试Angptl4多肽衍生物。然后可使用本领域技术人员已知并如本文所讨论的活性测定筛选所述衍生物。此类衍生物可用于集中有关适合取代的信息。例如，如果人们发现对特定氨基酸残基的变化导致破坏的、非所需的减少或不适合的活性，则具有此类变化的衍生物应避免。换言之，基于从此类常规实验集中到的信息，本领域的技术人员可容易地确定在此应单独地或与其它突变组合而被避免的另外取代的氨基酸。

多个科学出版物已经根据氨基酸序列的分析致力于预测二级结构(参见Chou等，Biochemistry，13(2):222-245，1974；Chou等，Biochemistry，113(2):211-222，1974；Chou等，Adv.Enzymol.Relat.AreasMol.Biol.，47:45-148，1978；Chou等，Ann.Rev.Biochem.，47:251-276,1979；和Chou等，Biophys.J.，26:367-384，1979)。此外，计算机程序当前可用于协助预测多肽二级结构。实例包括那些基于Jameson-Wolf分析的那些程序(Jameson等，Comput.Appl.Biosci.，4(1):181-186，1998；和Wolf等，Comput.Appl.Biosci.，4(1):187-191；1988)、程序PepPlot.RTM.(Brutlag等，CABS，6:237-245,1990；和Weinberger等，Science，228:740-742，1985)，及用于蛋白三级结构预测的其它新程序(Fetrow.等，Biotechnology，11:479-483，1993)。

此外，计算机程序当前可用于协助预测二级结构。预测二级结构的一种方法基于同源性建模。例如，具有超过30％的序列同一性或超过40％的类似性的两条多肽或蛋白通常具有类似的结构拓扑。蛋白结构数据库(PDB)的当前成长已经提供了对二级结构增强的可预测性，包括在多肽结构或蛋白结构内潜在数目的倍数(参见Holm等，Nucl.Acid.Res.，27(1)：244-247，1999)。

预测二级结构的另外方法包括“穿线”(Jones,D.，Curr.Opin.Struct.Biol.，7(3):377-87，1997；Suppl等，Structure，4(1):15-9，1996)、“性质分析”(Bowie等，Science，253:164-170，1991；Gribskov等，Meth.Enzym.，183:146-159，1990；和Gribskov等，Proc.Nat.Acad.Sci.，84(13):4355-4358，1987)及“进化连锁”(参见Home，同上和Brenner，同上)。

本文讨论的任何多肽还可含有用于鉴定或纯化多肽的序列；此类序列的一个实例是C-端V5标签。前述还包含编码此类多肽(包括本文所述的多肽衍生物)的核酸序列(诸如但不限于cDNA序列)。

组合物

本公开的有用组合物可包含用于本公开治疗和预防方法的本公开的一种或多种多肽；有用组合物还包含编码用于本公开的治疗和预防方法的本公开的一种或多种多肽的一种或多种核酸。所公开的组合物可包含与药学上可接受的载体组合的一种或多种此类化合物。此类载体和配制方法的实例可见于Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(第20版，Lippincott，Williams&Wilkins，DanielLimmer，编者)。为了形成适用于施用的药学上可接受的组合物，此类组合物将含有治疗有效量的化合物。

本公开的药物组合物可用于本公开的治疗和预防方法。将此类组合物以足以递送治疗有效量的化合物的量施用给对象，从而在本文公开的治疗和预防方法中有效。治疗有效量可根据多种因素诸如但不限于对象状况、体重、性别和年龄而变化。其它因素包括施用模式和位点。药物组合物可以本领域已知的任何方法提供给对象。示例性施用途径包括但不限于皮下、静脉内、局部、上皮、经口、骨内和肌内。可将本公开的组合物施用给对象仅一次或施用给对象超过一次。此外，当所述组合物施用给对象超过一次时，可诸如但不限于每天一次、每周一次或每月一次使用多种方案。所述组合物还可以每天超过一次施用给对象。治疗有效量和适当的给药方案可通过常规测试鉴定以获得最佳活性，同时将任何潜在的副作用最小化。此外，共同施用或连续施用其它试剂可为所需的。

治疗有效量可在化合物质量与对象质量之间比率的范围内。在所述组合物的一些实施方案中，治疗有效量是约0.005-150,000μg/kg、0.5-15,000μg/kg、5-1500μg/kg或50-150μg/kg。因此，对于典型的70kg成人，治疗有效量可为0.0035-11,000mg、0.035-1100mg、0.35-110mg或3.5-11mg。施用可定期发生。

本公开的组合物可全身施用，诸如通过静脉内施用、或诸如通过局部注射或通过施加糊剂或乳膏剂局部施用。在含有Angptl4多肽或衍生物的组合物的一些实施方案中，所述药物将适用于递送多肽至血液。此类适合类型的药物包括保护多肽免于消化的静脉内制剂、肌内制剂、经皮糊剂或乳膏剂、经皮贴剂、栓剂和经口剂型。

在一个实施方案中，提供可呈适合的质粒或载体形式的核酸，其编码本公开的Angptl4多肽或Angptl4多肽变体。将此类核酸通过本领域已知的适合的方法(例如，电穿孔)引入至可从对象获得的细胞中。在一个实施方案中，所述细胞是脂肪细胞。可测定所述细胞表达Angptl4多肽或多肽衍生物(在一个实施方案中，多肽的表达可通过如本文所讨论的多肽上标签的存在来确定)。然后可将表达多肽衍生物或Angptl4多肽的细胞引入至对象中。在一个实施方案中，将所述细胞通过皮下注射施用给对象；还可使用其它施用方法，包括本文讨论的那些。然后所述细胞表达循环中吸收的Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物。

本公开的组合物可另外包含改善所述化合物的溶解度、半衰期、吸收等的试剂。此外，本公开的组合物可另外包含减弱所述化合物的非所需的副作用和/或降低所述化合物的毒性的试剂。此类试剂的实施例描述于多种文本中，诸如但不限于Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(第20版，Lippincott，Williams&Wilkins，DanielLimmer，编者)。

本公开的组合物可以适于施用的各种各样的剂型施用。例如，所述组合物可以诸如但不限于以下的形式施用：片剂、胶囊、囊剂、锭剂、含片、丸剂、粉末剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、溶液、混悬剂、酏剂、糖浆剂、软膏剂、乳膏剂、糊剂、乳剂或用于静脉内施用或注射的溶液。其它剂型包括经皮施用、经由贴剂结构或软膏剂。任何前述剂型可经修饰以提供定时释放和/或持续释放制剂。

在本公开中，药物组合物可还包含药学上可接受的载体，所述载体包括但不限于媒介物、佐剂、表面活性剂、助悬剂、乳化剂、惰性填充剂、稀释剂、赋形剂、湿润剂、粘合剂、润滑剂、缓冲剂、崩解剂和载体以及助剂(诸如但不限于着色剂和调味剂)(在本文中通指载体)。通常，药学上可接受的载体对活性化合物是化学惰性的，并在使用条件下没有有害的副作用或毒性。药学上可接受的载体可包括聚合物和聚合物基质。药学上可接受的载体的性质可根据采用的特定剂型和组合物的特性而不同。

例如，对于以固体形式经口施用，诸如但不限于片剂、胶囊、囊剂、锭剂、含片、丸剂、粉末剂或颗粒剂，所述化合物可与经口无毒的药学上可接受的惰性载体(诸如但不限于惰性填充剂、适合的粘合剂、润滑剂、崩解剂和助剂)组合。适合的粘合剂包括但不限于淀粉，明胶，天然糖诸如葡萄糖或β-乳糖，玉米甜味剂，天然的和合成的树胶诸如阿拉伯树胶、黄蓍胶或海藻酸钠，羧甲基纤维素，聚乙二醇，蜡等。用于这些剂型的润滑剂包括但不限于油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。片剂形式可包括以下的一个或多个：乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、微晶纤维素、阿拉伯树胶、明胶、瓜尔胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸以及本文所述的其它载体。锭剂形式可包含调味剂(通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶)中的活性成分，以及包含在惰性基质(诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)中的活性成分的糖果锭剂、乳剂、凝胶等，除活性成分外还含有本领域已知的载体。

对于经口液体形式，诸如但不限于酊剂、溶液、混悬剂、酏剂、糖浆剂，可将本公开的核酸分子溶解于稀释剂诸如水、盐水或醇中。此外，经口剂型可包含适当有利的助悬剂或分散剂，诸如合成和天然树胶，例如黄蓍胶、阿拉伯树胶、甲基纤维素等)。此外，当所需或必要时，还可将适合的试剂和着色剂或其它助剂掺入到组合物中。可采用的其它分散剂包括甘油等。

适用于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性的、等渗的无菌注射溶液(其可含有赋予制剂以与患者血液等渗的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质)，及水性和非水性的无菌混悬剂(其可包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。在添加或不添加药学上可接受的表面活性剂(诸如但不限于皂、油或去污剂)、助悬剂(诸如但不限于果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素)或乳化剂及其它药物佐剂的情况下，所述化合物可在生理上可接受的稀释剂诸如无菌液体或液体混合物中施用，所述无菌液体或液体混合物包括水、盐水、水性右旋糖及相关糖溶液、醇(诸如乙醇、异丙醇或十六烷醇)、二醇(诸如丙二醇)或聚乙二醇(诸如聚(乙二醇)400)、丙三醇缩酮(诸如2,2-二甲基-1,3-二恶茂烷-4-甲醇)、醚、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯或乙酰化脂肪酸甘油酯。

可用于胃肠外制剂中的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的特定实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿脂油和矿物油。适用于胃肠外制剂的脂肪酸包括聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，诸如脱水山梨糖醇单油酸酯和环氧乙烷与疏水性基质的高分子量加合物(通过环氧丙烷与丙二醇、油酸、硬脂酸和异硬脂酸缩合形成)。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是适合的脂肪酸酯的实例。适用于胃肠外制剂中的皂包括脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐，并且适合的去污剂包括(a)阳离子去污剂，诸如例如二甲基二烷基铵卤化物和烷基吡啶鎓卤化物，(b)阴离子去污剂，诸如例如烷基磺酸盐、芳基磺酸盐和烯烃磺酸盐，烷基硫酸盐、烯烃硫酸盐、醚硫酸盐、及单甘油酯硫酸盐及磺基琥珀酸盐，(c)非离子去污剂，诸如例如脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物，(d)两性去污剂，诸如例如烷基β-氨基丙酸盐和2-烷基咪唑啉季铵盐，和(e)其混合物。

适合的防腐剂和缓冲剂可用于此类制剂中。为了最小化或消除在注射位点处的刺激，此类组合物可含有一种或多种具有约12至约17的亲水亲油平衡(HLB)的非离子表面活性剂。此类制剂中表面活性剂的量在约5重量％至约15重量％的范围内。

含有本公开的核酸分子的局部剂型诸如但不限于软膏剂、乳膏剂、糊剂、乳剂，可与本领域熟知的各种载体材料诸如醇、芦荟胶、尿囊素、甘油、维生素A和维生素E油、矿物油、PPG2丙酸肉豆蔻酯等掺混，以形成醇溶液、局部清洁剂、清洁乳膏剂、护肤凝胶、护肤乳液和洗发剂(呈乳膏或凝胶制剂形式)。还可使用皮肤剥离素或皮肤研磨制剂的纳入。可将此类局部制剂施加至贴剂、绷带或敷料用于经皮递送，或可施加至绷带或敷料用于直接递送至伤口位点或皮肤损伤位点。

还可以脂质体递送系统的形式诸如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡施用本公开的化合物。脂质体可从多种磷脂，诸如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。此类脂质体还可含有单克隆抗体以直接递送脂质体至特定细胞类型或细胞类型组。

本公开的化合物还可与作为可靶向的药物载体的可溶性聚合物偶联。此类聚合物可包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或经棕榈酰残基取代的聚氧化乙烯聚赖氨酸。此外，本发明的化合物可与一类可生物降解的聚合物偶联，所述聚合物可用于实现药物的控制释放，例如聚乳酸、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯及水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。

操作实施例

在以下结果中，使用的方法是本公开的方法部分和其中引用的参考文献中指出的那些方法。以下的一些结果描述于ClementLC等，“PodocytesecretedAngiopoietin-like4mediatesproteinuriainglucocorticoid-sensitivenephroticsyndrome,”NatureMedicine，2011年1月(对于其中所含的关于Angptl4多肽的用途的公开内容，该参考文献在此通过引用并入)中。

1.肾病综合征患者具有升高水平的循环Angptl4

肾病综合征患者具有升高循环水平的Angptl4多肽。通过2D凝胶电泳分析来自诊断患有MCD和MN的患者和处于MCD复发的患者的200μg人血浆(n＝4名患者/组)，并使用抗-Angptl4抗体制备蛋白质印迹(图1A)。图1A显示仅患有MCD复发和MN的患者具有提高水平的Angptl4(由箭头表明)。这种形式的Angptl4作为中性pI形式存在，并作为单体和寡聚物存在。

2.aP2-Angptl4TG大鼠具有升高循环水平的Angptl4

开发用于脂肪细胞特异性Angptl4过表达的转基因大鼠模型并将其示于图1B(aP2-Angptl4TG)中。分析正常表达Angptl4的器官中mRNA表达证实表达的特异性，其中Angplt4在褐色脂肪组织(BAT)和白色脂肪组织(WAT)中检测到(图1C)。

对200μg血浆进行2D凝胶电泳、然后使用抗-Angptl4抗体进行的蛋白质印迹揭示了杂合aP2-Angptl4TG大鼠比野生型大鼠具有更高循环Angptl4水平(图1D)(3月龄，n＝3个印迹/组)。图1E显示对200μg血浆进行2D凝胶电泳、然后使用抗-Angptl4和抗-V5抗体进行蛋白质印迹显示在aP2-Angptl4TG大鼠血浆中存在脂肪组织分泌的V5-标记的Angptl4。对来自aP2-Angptl4TG大鼠血浆的免疫沉淀的Angptl4进行2D凝胶电泳(使用针对Angptl4的N-端具有特异性的抗体)，然后使用抗-Angptl4或抗-凝集素进行蛋白质印迹。SNAI抗体揭示在循环中存在经唾液酸化的Angptl4多肽。

通过光学显微术(图1G)和电子显微术(未显示)，aP2-Angptl4TG大鼠具有形态上正常的肾小球，并且肾小球Angptl4表达未改变。这与Angptl4的足细胞特异性表达相反，其中此类表达导致肾小球缺陷，包括在1至5个月内逐渐形成足突消失(参见美国临时申请No.61/351,865(2010年6月5日递交)，针对此类教导其在此通过引用被并入)。

使用抗-V5抗体特异性检测3月龄杂合aP2-Angptl4TG雄性大鼠中转基因表达蛋白的免疫金EM表明在内皮表面上选择性检测，表明循环Angptl4中阶和高阶寡聚物不进入GBM并且在内皮表面上具有受体。循环Angptl4的作用与人和实验肾病综合征相关，因为当蛋白尿减少时在肾病综合征的较晚阶段注意到Angptl4的脂肪组织上调。

3.升高循环水平的Angptl4与蛋白尿和白蛋白尿的关系

为了检测Angptl4蛋白尿(包括白蛋白尿)的循环水平之间的关系，在aP2-Angptl4TG大鼠中分析蛋白尿。如通过尿蛋白分析所确定，图2A显示aP2-Angptl4TG不表现出蛋白尿。在图2A中通过GelCode蓝染色的SDSPAGE分析尿蛋白(3μg/泳道，除了MCD缓解期)(密度计量学读数在每个泳道下提供)。完整白蛋白条带在70kDa(由箭头指明)处观察到。如可见，缓解期中的WT大鼠、aP2-Angptl4TG大鼠和MCD患者在经分析的尿样中几乎未显示出或未显示出完整白蛋白，其中NPHS2-Angplt4TG大鼠(大鼠转基因模型，具有足细胞特异性Angptl4表达并显示形成患有蛋白尿的MCD；参见美国临时申请No.，其在此针对此类教导通过引用并入)、MCD复发大鼠、MN复发大鼠以及PAN大鼠(肾病综合征的大鼠模型)显示出较强的指示白蛋白尿的白蛋白染色。图2B显示雌性杂合aP2-Angptl4雌性TG大鼠与WT同窝对照相比具有减少的白蛋白尿。图2C显示aP2-Angptl4杂合雄性TG大鼠具有相同的结果。图2D显示与WT同窝大鼠相比aP2-Angptl4TG大鼠展现出在嘌呤霉素肾病(PAN模型；肾病综合征的大鼠模型)中减少的蛋白尿。如上所表明，aP2-Angptl4TG大鼠具有较高的循环Angptl4水平，所述Angptl4在中性等电点处或附近迁移并被唾液酸化。这些结果显示了循环Angptl4在减少蛋白尿和肾病综合征中的作用。

由于脂肪组织分泌的结合至肾小球内皮的Angptl4的内皮结合，进行实验以确定重组Angptl4对肾小球上皮细胞(GEnC)的影响以研究在该大鼠模型中较低的基线白蛋白尿和较少的PAN诱导的蛋白尿是否由肾小球内皮保护所介导。通过添加过氧化氢并至培养基中使GEnC经受氧化损伤，并用来自对照稳定细胞系、Angptl4-HEK293细胞系(分泌高等电点(pI)、低唾液酸化的Angptl4)或用ManNAc孵育的Angptl4-HEK293细胞系(中性pI，正常唾液酸化的Angptl4)的浓缩的上清液(600μg/孔)孵育。应注意高pI形式的Angptl4在MCD中从足细胞大量分泌。LDH的释放被评价为细胞损伤的标记物。对没有过氧化氢损伤的对照细胞给出的相对得分为1。高pIAngptl4增加GEnC损伤，然而中性pIAngptl4(其包括大部分循环Angptl4)在所有测量的时间点具有显著的保护性。(n＝3个读数/情况)。

在第6天野生型PAN大鼠中Angptl4的上调仅在肾小球中发生，然而注意到脂肪组织中的上调在第10天(蛋白尿和肾小球Angptl4表达减少)(n＝3大鼠/样品)(图2F)。因此，循环Angptl4水平的提高与循环Angptl4在肾病综合征中的保护作用和蛋白尿减少一致。循环Angptl4的作用可能与人和实验MCD相关，因为当蛋白尿减少时在PAN的较晚阶段注意到脂肪组织的Angptl4上调。此外，与野生型大鼠相比，在aP2-Angptl4TG大鼠中，基线和诱导PAN后升高的循环Angptl4水平导致升高的血浆甘油三酯水平(图2G)并且减少肝素后脂蛋白脂肪酶活性(图2H)。

为了说明Angptl4治疗递送至循环中的效力，将野生型Angptl4或对照蛋白施用给Buffalo/Mna大鼠(一种FSGS模型)或至Wistar大鼠(其中Thy1.1肾炎，一种系膜损伤的短期模型，被诱导)(图4A和图4B)。野生型重组Angptl4多肽通过收集重组蛋白产生。使Angptl4-HEK293稳定或pcDNA3.1-HEK293对照稳定的细胞系在15cm皿中生长至汇合，用温热PBS洗涤两次并用不含血清的DMEM在无酚红、有25mMManNAc或无25mMManNAc的情况下孵育48小时。收集细胞并浓缩上清液。在每个注射时间点使用来自一个15cm皿的浓缩的上清液。

Buffalo/Mna大鼠在约2月龄时自发出现模拟人FSGS的病变，包括局灶性和节段性病变(光学显微术)、足细胞足突消失(电子显微术)及蛋白尿。所述大鼠随着它们逐渐变老出现蛋白尿逐渐增加。用于以上研究的大鼠是雄性和5月龄。抗-Thy1.1肾炎通过注射150μg抗-Thy1.1(Ox-7杂交瘤)或对照IgGIV至不同组的雄性Wistar大鼠诱导(100-125gm，n＝4只大鼠/组)。

在Buffalo/Mna大鼠模型中，在第0天进行对基线蛋白尿的评估。在连续两天(第1&2天，箭头)将Angptl4或对照蛋白腹膜内注射至BuffaloMna大鼠中(n＝4只大鼠/组)。隔日评估蛋白尿，并将其表达为基线值的百分比。在重组Angptl4处理的大鼠中注意到蛋白尿的显著减少。

在Thy1.1肾炎模型中，在第1天证实蛋白尿。在连续两天(第1&2天，箭头)，向大鼠静脉内注射重组Angptl4或对照蛋白。然后评估蛋白尿。如图4B所示，蛋白尿始终在Angptl4处理的大鼠中较低，并且在第5天统计上显著。

这些结果显示Angptl4治疗递送至循环中是肾病综合征(诸如但不限于微小病变、局灶性节段性肾小球硬化症、膜性肾病/膜性肾小球肾炎、膜增生性肾小球肾炎)，或者糖尿病病状(诸如但不限于糖尿病性肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球病)的有效疗法。此外，这些结果显示Angptl4治疗递送至循环中是与肾病综合征相关的病状(诸如但不限于蛋白尿、高胆固醇血症、高甘油三酯血症和水肿)的有效疗法。在一个实施方案中，Angptl4多肽是具有降低的LPL抑制活性、对裂解耐受的衍生物，或本文所述的衍生物。施用此类衍生物将保留Angptl4治疗的有益影响而无与抑制LPL活性相关的不利影响(诸如升高的血浆甘油三酯水平)。

用于实施例1-3的方法

克隆全长大鼠Angptl4，和生成针对全长重组Angptl4的抗体

将来自我们先前实验(7)的1218bp的全长大鼠Angptl4开放阅读框，不包括终止密码子，克隆至pcDNA3.1/V5-HisB中以用于真核表达，和克隆至pET28a中以用于原核表达。表达经纯化的全长蛋白的大肠杆菌用于在兔中产生多克隆抗体(Proteintechgroup，Inc.ChicagoILUSA)，所述多克隆抗体通过ELISA和蛋白质印迹测试。将抗体反应条带从GelCode蓝染色的凝胶切离、胰蛋白酶消化，并且通过MALDI-TOF/TOF确认Angptl4肽序列的存在。抗血清的一部分是针对抗原的纯化的亲和力。除非另外指出，否则所述的所有研究使用该抗体。针对大鼠Angptl4的N-端部分的另外多克隆抗体(氨基酸7-86，不包括信号肽)在兔中类似地升高。

人肾小球疾病动物模型中蛋白尿的诱导

所有动物研究被机构IACUC批准。在WT大鼠中诱导蛋白尿动物模型(n＝4只大鼠/组)描述于括号中的前述出版物中：PAN(7)、PHN(7)、具有糖皮质激素的PAN(20)、非-HIV塌陷性肾小球病(18)、肾毒血清诱导的异源性阶段蛋白尿(7)。通过注射200mcg抗-Thy1.1(Ox-7杂交瘤)或对照IgGIV至不同组的雄性Wistar大鼠(100-125gm，n＝4只大鼠/组)中诱导抗-Thy1.1肾炎，并且在24小时和72小时后处死大鼠。

以下技术描述于现有出版物中：Taqman实时PCR(26)、共聚焦成像(7)、原位杂交(27)、免疫金EM(26)、用于蛋白质印迹的肾小球提取和加工(26)、通过PEI方法评估电荷(28)。对于阿尔新蓝染色，将染色溶液的pH使用乙酸调节至2.5，并且0.1％核速红溶液用作复染剂。使用Image-Pro软件(MediaCybernetics，Inc.，BethesdaMD，USA)，评估肾小球基底膜阿尔新蓝染色的密度计量学(20个肾小球/大鼠，3只大鼠/组)。使用Gel-ProAnalyzer软件(MediaCybernetics，Inc.)评估2D凝胶蛋白质印迹的密度计量学。Taqman实时PCR引物和探针列于图3中。对于原位杂交，用于大鼠Angptl4的地高辛标记的探针包括ORF的bp1至bp548。

为了获得用于肝素后LPL活性的样品，向大鼠静脉内注射10单位/100gm重量的猪科动物肝素15分钟，之后安乐死，并使用来自RoarBiomedical，Inc(纽约NY)的测定测量活性。在空腹状态下测量血清甘油三酯。

注射NTS至Angptl4-/-小鼠中

Angptl4-/-小鼠由EliLily公司(印第安纳波利斯，USA)作为善意礼物提供给SanderKersten。研究方案由瓦赫宁根大学的动物研究委员会批准。向11周龄的雄性Angptl4-/-或+/+小鼠(n＝4只小鼠/组)静脉内注射1.5mgγ2-NTS或正常绵羊血清(SigmaAldrichSt.LouisMOUSA)，在48小时时收集点尿样品，在72小时处死小鼠，收集血浆用于生物化学测量，并保存肾以用于组织学分析。通过ELISA(Bethyllaboratories，MontgomeryTXUSA)评估尿白蛋白并通过质谱分析测量尿肌酸酐。为了评估足突消失，在对照处理的Angptl4+/+小鼠透射电子显微照片中首先测试足突的平均宽度(10个等间隔读数/回路、3个回路/肾小球、3个肾小球/肾、3个肾/组)。消失被描述为平均宽度超过2.5倍的增加。在NTS处理的或对照处理的Angptl4-/-小鼠中对总足突和消失的足突进行计数。

利用存档的人样品的研究

在InstitutoNacionaldeCardiologia(墨西哥城)对经由IRB批准的方案获得的样品进行存档的(archived)人肾活检物的免疫染色(n＝5个活检物/情况)。用于这些研究的对照肾活检物是性别和年龄匹配的方案移植前活检物。用于2D凝胶电泳和蛋白质印迹的存档的人血清(n＝4个样品/情况)获自先前公开的研究(29)。

转基因大鼠的产生

通过克隆具有C-端V5标签的大鼠Angptl4cDNA(包括信号序列)于正好在聚腺苷酸尾上游的NotI位点处，在含有5.4Kb小鼠aP2启动子构建体(30)(购自AddgeneInc.CambridgeMAUSA)的载体中生成aP2-Angptl4TG大鼠(脂肪组织特异性)构建体。

通过显微注射消化的DNA构建体至受精的SpragueDawley卵子中、植入到假孕宿主SpragueDawley雌性中产生转基因大鼠(在密歇根大学进行)，并对所得后代通过常规PCR和TaqMan基因组DNA实时PCR策略使用构建体特异性和对照基因组催乳素引物及探针组合进行基因分型(图3)。产生用于脂肪组织特异性表达的三个建立者系。呈现来自经4代两者都是稳定的aP2-Angptl4TG大鼠系375(3个拷贝)的数据。尿总蛋白使用Bradford方法评估(Bioradlaboratories，HerculesCAUSA)，且白蛋白尿通过ELISA评估(Bethyllaboratories，MontgomeryTXUSA)。

利用GEnC的体外研究

对于GEnC研究，使经培养的大鼠GEnC(32)在6孔板中生长至75％汇合(n＝3个孔/情况)，用温热的PBS、含有200μMH2O2的无血清RPMI、连同600μg/孔的对照稳定的细胞系上清液、或Angptl4-HEK293稳定的细胞系上清液、或ManNAc处理的Angptl4-HEK293细胞系上清液洗涤两次。在24小时、36小时和48小时时对各孔取样。使用细胞毒性检测试剂盒(RocheDiagnostics，Mannheim德国)测量LDH释放。OD492值表达为未添加H₂O₂或稳定细胞系上清液的各孔读数的比率。

统计分析

通过ANOVA进行对三个或更多组中涉及的蛋白尿或基因表达差异的分析，使用GraphPadInStat软件(3.05版)进行事后分析检验。对于两组比较，在MicrosoftExcel2003中使用未配对的学生t检验。

4.循环促血管生成素样-4将肾病综合征中的蛋白尿与高甘油三酯血症联系起来

在肾病综合征中蛋白尿与高脂血症(高甘油三酯血症和高胆固醇血症)之间关系的分子机制是未知的。在该研究中，显示升高血浆水平的糖蛋白Angptl4将由于膜性肾病(MN)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)和微小病变(MCD)导致的肾病综合征中的蛋白尿与高甘油三酯血症联系起来。循环Angptl4具有近中性等电点(pI)，并且在形成中度至重度蛋白尿之后大部分从骨骼肌、脂肪组织和心脏分泌。先前已经显示，在MCD中另外的早期足细胞表达高pIAngptl4(其诱导蛋白尿)和中性pIAngptl4。使用脂肪组织过表达Angptl4的转基因大鼠(aP2-Angptl4)和重组Angptl4，显示循环Angptl4通过结合至肾小球内皮αvβ5整合素减少蛋白尿，同时还通过阻断脂蛋白脂肪酶(LPL)介导的甘油三酯摄取诱导高甘油三酯血症。高甘油三酯血症在肾病Angptl4-/-小鼠中不存在。肾病Angptl4-/-和Itgb5-/-小鼠，及注射有抗-β5整合素抗体的肾病大鼠具有峰值蛋白尿的延迟恢复。此外，在LPL结合位点处具有突变的重组人Angptl4可减少蛋白尿而不影响血浆甘油三酯水平。总之，循环Angptl4减少蛋白尿同时还诱导高甘油三酯血症，并且主要从外周器官作为对肾病范围蛋白尿的全身反应产生。

背景

联系蛋白尿与高脂血症(即肾病综合征的两个关键标志)的分子途径是未知的。高脂血症具有两个部分，高胆固醇血症和高甘油三酯血症1。在过去，高胆固醇血症响应于蛋白尿和低白蛋白血症导致脂蛋白的肝合成增加(2)。然而，蛋白尿与增加的肝脂蛋白合成之间的精确的分子联系仍然是未知的。高甘油三酯血症的发展受到的关注少得多。血浆甘油三酯水平的主要决定因素是调节组织从循环摄取甘油三酯的内皮结合脂蛋白脂肪酶(LPL)的活性(3)。缺乏LPL的小鼠出现极高的甘油三酯水平并在出生后很快死亡(4)。当前研究显示LPL蛋白而非mRNA的活性和表达在肾病综合征中减少(5)。这种LPL蛋白活性和表达的减少或者其与肾病综合征中的蛋白尿关系的分子机制尚未确定。

我们实验室的最近研究显示在微小病变(MCD)中足细胞和循环中的Angptl4表达增加(6，7)。为了研究足细胞-分泌的Angptl4的生物作用，产生了两种类型的转基因大鼠模型。NPHS2-Angptl4转基因大鼠(其在肾小球内从足细胞选择性过表达Angptl4)出现大量的白蛋白尿而不升高循环Angptl4水平。相反，选择性过度产生Angptl4和从脂肪组织分泌Angptl4的aP2-Angptl4转基因大鼠出现高循环Angptl4水平，但并非是蛋白尿的。进一步研究显示足细胞在肾病综合征中分泌出两种不同形式的Angptl4：低唾液酸化的高pI形式和唾液酸化的中性pI形式。用唾液酸前体N-乙酰基-D-甘露糖胺(ManNAc)处理将高pIAngptl4体内转化为中性pIAngptl4，并且显著减少白蛋白尿/蛋白尿。相反，在正常大鼠和肾病大鼠和人中循环Angptl4几乎全部由被唾液酸化的中性pIAngptl4组成。

据信，Angptl4可通过使LPL失活而阻断LPL活性(8)，其减少了甘油三酯更新并导致高甘油三酯血症(9)。对人ANGPTL4基因进行的基于种群的测序研究揭示了在约3％的具有E40K变体的欧美人群中的低血浆甘油三酯水平(10)。随后的研究显示具有E40K变体的重组Angptl4不能抑制LPL体外活性(11)。循环中的Angptl4倾向于裂解为N-端片段(含有LPL抑制区域和卷曲螺旋结构域，形成寡聚物)和C-端片段(含有纤维蛋白原样结构域，保留单体)，并且使氨基酸161与164之间的Angptl4裂解区域突变改善全长蛋白的稳定性(11)。我们利用Angptl4的这些性质以开发具有潜在的治疗意义的突变体。

在当前研究中，探索了循环Angptl4在肾病综合征中的生物学作用。我们注意到在MN、FSGS和MCD中升高水平的Angptl4和甘油三酯，及降低的LPL活性。此外，患有肾病综合征的Angptl4-/-小鼠不出现高甘油三酯血症。在肾病综合征的大鼠模型中，已经出现主要来源于严重蛋白尿后的骨骼肌、脂肪组织和心脏的升高的循环Angptl4。在一些实验MCD中，一些循环Angptl4还来源于足细胞。在肾病啮齿类动物中，升高的循环Angptl4(无论是通过转基因表达还是通过注射重组蛋白)通过结合至肾小球内皮αvβ5整合素提高了甘油三酯水平并减少了LPL活性，而且还减小了蛋白尿。不存在β5整合素、或使用特异性抗体体内阻断β5整合素、或不存在循环Angptl4均减缓了从峰值蛋白尿恢复。因此，Angptl4是蛋白尿与高甘油三酯血症之间的第一个直接分子联系。可能主要刺激外周Angptl4分泌以有助于减少肾病综合征中的进行性蛋白尿，而且还使结合至LPL并诱导高甘油三酯血症终止。

结果

增加的循环Angptl4水平确定在肾病综合征中形成高甘油三酯血症：

当与正常健康志愿者比较时，通过ELISA注意到在未治疗的由于MCD、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、非-HIV塌陷性肾小球病(CG)和膜性肾病(MN)导致的肾病综合征患者中显著升高的空腹血浆Angptl4水平(图6(a)，图12)。为了确定升高的血浆Angptl4水平是否可能与肾病综合征中的高甘油三酯血症和LPL活性相关，我们研究了被动型Heymann肾炎(PHN，一种MN模型)(12，13)、自发出现FSG的BuffaloMna大鼠(14，15)及嘌呤霉素氨基核苷肾病(PAN，一种MCD模型)(12)中的血浆Angptl4、甘油三酯和肝素后LPL活性(图6(b))。在这些模型中在它们出现了中度至重度蛋白尿之后而非之前，空腹血浆Angptl4升高。在PHN和BuffaloMna大鼠中，当血浆Angptl4水平升高且血浆LPL活性降低时，注意到显著的高甘油三酯血症(图6(c)-(h))。在PAN中，高甘油三酯血症贯穿蛋白尿存在、在蛋白尿已经正常化后持续，并且与LPL活性降低密切相关(图6(i)-(k))。从出现升高的循环Angptl4水平而无蛋白尿⁶的aP2-Angptl4转基因大鼠的脂肪组织过表达Angptl4，还诱导了高甘油三酯血症并降低了LPL活性(图6(l)和(m))。相反，3月龄NPHS2-Angptl4转基因大鼠不出现升高的甘油三酯水平或降低的LPL活性，在所述转基因大鼠中从足细胞过表达的Angptl4导致蛋白尿但不渗漏至循环中。这些过表达研究表明使Angptl4进入至循环中为出现高甘油三酯血症所必需。为了研究Angptl4在肾病综合征中出现高甘油三酯血症中的相对重要性，严重的异源性阶段补体-和白细胞-依赖性蛋白尿在Angptl4–/–和+/+小鼠中使用γ2-肾毒血清(NTS)诱导(图6(n))。当与Angptl4+/+小鼠比较时，高甘油三酯血症在注射有NTS的Angptl4–/–小鼠中不存在，尽管这些小鼠患有显著的蛋白尿(图13(a))。这些研究显示循环Angptl4是肾病综合征中高甘油三酯血症的重要介体。

肾病综合征中升高的循环Angptl4的来源

为了确定升高的循环Angptl4的来源，我们在肾病综合征大鼠模型中进行了多器官Angptl4mRNA表达谱。在PHN中第9天(图7(a))，与升高的循环Angptl4水平(图6(b))和重度蛋白尿相对应(图6(c))，在骨骼肌、白色脂肪组织(WAT)、褐色脂肪组织(BAT)和心脏中注意到明显上调。在第5天早期，在肾小球和肝中注意到的瞬时轻度上调已消失。在具有升高的Angptl4水平(图6(b))和中度至重度蛋白尿(图6(f))的4.5月龄BuffaloMna大鼠中(图7(b))，在心脏中注意到明显上调。在该模型中未看到Angptl4的肾小球上调。在PAN即一种肾病综合征的自限性急性模型中，升高的循环Angptl4水平在疾病的整个期间发生(图6(b))。在蛋白尿递增阶段期间(第6和10天)肾小球/足细胞Angptl4的明显上调(图7(c))之前也已有描述(6)。该Angptl4上调的“肾小球”阶段(第6和第10天)之后是“外周”阶段(第14和21天)，在此期间缺乏肾小球上调并且注意到在骨骼肌、WAT和BAT中明显上调。因为在NPHS2-Angptl4转基因大鼠中来自足细胞的Angptl4的单基因过表达不提高循环Angptl4水平，所以大鼠血浆的2维凝胶蛋白质印迹研究在“肾小球”阶段期间在这些大鼠中诱导轻度PAN之后进行(图7(d)、7(e)、13(b))。与野生型PAN大鼠相比，在NPHS2-Angptl4转基因PAN大鼠注意到显著更高循环水平的Angptl4。该循环蛋白可与抗-V5抗体反应(图7(f))，从而确认其足细胞来源，因为转基因表达的蛋白在其C-端末端被V5标记。与增加的循环转基因过表达的Angptl4一致，具有PAN的aP2-Angptl4和NPHS2-Angptl4转基因大鼠比野生型PAN大鼠具有更高的血浆甘油三酯和更低的LPL活性(图7(g)和7(h))。

肾病综合征中LPL和Angptl4的尿损失

与正常SpragueDawley大鼠不同，肾病大鼠在尿中损失Angptl4(图8(a))，从而表明在肾病状态中，循环Angptl4水平低估了的总Angptl4产生。然而正常大鼠降解通过从循环肝摄取的Angptl4释放的LPL(16)，在肾病综合征的尿中注意到额外的损失(图8(b)，图13(c)中的对照血清印迹)。与5D2具有反应性(图8(c)，补充图7(d)中对照血清印迹)，选择性结合活性LPL的单克隆抗体表明活性LPL也在重度蛋白尿期间在尿中损失。此外，肾病PAN大鼠不能增加LPLmRNA表达，直至蛋白尿大幅度减少(图8(d))。通过比较，非蛋白尿性aP2-Angptl4转基因大鼠可响应于升高的Angptl4水平，上调骨骼肌和心脏中的LPL表达(图8(e))。这些因素可有助于维持肾病综合征中的Angptl4-介导的高甘油三酯血症。

增加的循环Angptl4减少蛋白尿

在aP2-Angptl4转基因和野生型SpragueDawley大鼠中诱导PAN揭示了在转基因大鼠中显著较低的蛋白尿(图9(a))，表明循环Angptl4具有抗-蛋白尿作用。为了测试该抗-蛋白尿作用是否由循环Angptl4特异性诱导，将之前表征的兔抗-大鼠Angptl4抗体(6)在蛋白尿发作之后注射到野生型PAN大鼠中以部分耗尽循环Angptl4水平，并注意到增加的蛋白尿(图9(b))。接着，将重组唾液酸化大鼠Angptl4静脉内注射至BuffaloMna大鼠(图9(c))和抗-Thy1.1肾炎大鼠(一种系膜损伤模型)(图9(d))中。在两种情况下，注意到蛋白尿显著减少。

具有减少的LPL灭活的人Angptl4突变体减少蛋白尿

为了将Angptl4对甘油三酯摄取的LPL介导的影响与其对蛋白尿的影响分开，在两个位点生成具有突变的人Angptl4的pcDNA3.1V5HisB构建体(图10(a))。在已知对结合至LPL重要的位点(氨基酸40或39)处或附近进行一组突变。在已知参与全长Angptl4裂解的区域(氨基酸161至164)中进行另一种突变。

接着，开发基于HEK293的稳定细胞系用于这些突变体和野生型质粒，并且在无血清情况下收集含有重组蛋白的上清液。为了确保Angptl4的充分唾液酸化，添加ManNAc(N-乙酰基-D-甘露糖胺)至培养基。然后通过蛋白质印迹使用抗-V5抗体评估野生型Angptl4和重组Angptl4，并且注意到适当大小的突变体蛋白迁移和减少的裂解(图10(b))。在单次静脉内注射等量的人重组Angptl4至蛋白尿BuffaloMna大鼠中之后，注意到突变体蛋白具有更高的峰水平(图10(c))。在单次注射之后2周，在野生型和突变体蛋白中，注意到蛋白尿的显著减少(最低点的平均值±SE作为基线百分比：野生型8525，53.8±6.3；突变体8501，35.9±12.1；突变体8515，41.2±7.2)(图10(d))。在注射后3和6小时，与野生型而非突变体Angptl4注射的大鼠中的基线相比，血浆甘油三酯水平显著更高(图10(e))。在6小时，相较于野生型蛋白注射的大鼠，在突变体蛋白注射的大鼠中甘油三酯水平显著更低。12小时与第17天之间的空腹甘油三酯水平在野生型与突变体Angptl4注射的大鼠之间无区别，并且类似于对照(图13(e))。

循环Angptl4通过结合至肾小球内皮αvβ5整合素减少蛋白尿：

使用抗-V5抗体对aP2-Angptl4TG大鼠肾共聚焦成像显示脂肪组织分泌的Angptl4-V5与肾小球内皮共定位(图11(a))。使用免疫金EM，肾小球内皮表面上、大部分在内皮细胞-肾小球基底膜界面的区域中注意到该Angptl4-V5(图11(b))。使用从稳定细胞系分泌的重组大鼠Angptl4，我们显示模拟肾病状态的循环Angptl4的经唾液酸化的Angptl4蛋白使得培养的大鼠肾小球内皮细胞(GEnC)免于氧化损伤，然而低唾液酸化的Angptl4，一种在PAN和NPHS2-Angptl4TG大鼠中的包括约一半的足细胞-分泌的Angptl4的促-蛋白尿形式，增加氧化损伤的影响(图11(c))。

因为Angptl4最近显示结合β5整合素(17)，所以确定循环Angptl4对蛋白尿的保护作用是否经由结合至肾小球内皮中存在的αvβ5整合素介导。该蛋白：蛋白相互作用使用重组大鼠Angptl4和经纯化的人αvβ5整合素涂覆的板得以确认，并且注意到较强的剂量依赖性结合(R²0.996)(图11(d))。在β5整合素敲除(Itgb5-/-)和野生型(Itgb5+/+)小鼠中使用2-NTS诱导肾病综合征揭示了在恢复阶段(第5和第7天)期间在敲除小鼠中蛋白尿的水平高得多(图11(e))，所述恢复阶段与在该模型中来自骨骼肌和脂肪组织的循环Angptl4产生的外周阶段一致(补充图14(a)和(b))。这表明峰值蛋白尿(第3天后)的减少受到通过结合αvβ5整合素发挥抗-蛋白尿作用的循环蛋白样Angptl4的存在的影响。为了阻断αvβ5整合素–Angptl4相互作用，在从峰值蛋白尿恢复期间(第10天后，对应于循环Angptl4产生的外周阶段)，在PAN中，将针对β5整合素胞外部分的抗体(抗-β5整合素抗体)或免疫前血清注射到野生型(SpragueDawley)大鼠(图11(f)，补充图14(c)和(d))和aP2-Angptl4转基因大鼠(图11(g))中。在所述两个模型中注意到恢复显著延迟。最终，肾病综合征在Angptl4+/+和Angptl4-/-小鼠中被诱导，并且在循环Angptl4产生的外周阶段期间注意到从峰值蛋白尿恢复的显著延迟(第7天)，其在Angptl4-/-小鼠中缺乏(图11(h))。在肾小球阶段期间，Angptl4-/-小鼠中较低水平的蛋白尿与我们之前公开的足细胞分泌的低唾液酸化Angptl4(6)作为该模型中蛋白尿的若干诱因之一的描述一致。

另外的突变体

研究了四种添加突变体蛋白：8496、8506、8511和8520。如图17所示，每一种在位置39、40或161-164处具有至少一个氨基酸取代。如上所述开发并培养基于HEK293的稳定细胞系，以表达突变体蛋白。将所有四种突变体蛋白用V5、用抗-V5抗体标记，然后通过蛋白质印迹使用抗-V5抗体评估，并且注意到适当大小的突变体蛋白的迁移和减少的裂解。结果显示与野生型相比，经由蛋白质印迹裂解蛋白的量在突变体中显著减少(图18)。在单次静脉内注射等量的突变体8511蛋白至蛋白尿性BuffaloMna大鼠中之后，注意到突变体8511具有更高的峰值水平(图19)。红色箭头表明注射重组蛋白的单个时间点。将两种突变体人Angptl4蛋白(15μg)注射到Zucker糖尿病肥胖大鼠(一种糖尿病性肾病和糖尿病性肾疾病的模型，n＝4只大鼠/组)中，之后注意到升高循环水平的突变体蛋白(图20)，连同蛋白尿减少(图21)，但血浆甘油三酯水平未显著升高(图22)。*P<0.05，**P<0.01。#P<0.05。所有*值相对于基线第0天值。

讨论

不希望受任何给定的假想模型束缚，该研究显示循环Angptl4是肾病综合征中的关键分子介体(图15)。其首次描述了该综合征的两个关键组分，即蛋白尿和高甘油三酯血症，如何在分子水平上连接。肾小球通过在不同疾病之间不同的机制对发生蛋白尿是关键的。通过使用MN和FSGS动物模型，两种病状通常与蛋白尿和水肿的亚急性发作相关，这表明外周器官、特别是骨骼肌、脂肪组织和心脏，响应于通过上调Angptl4表达增加蛋白尿。在该阶段仅来源于这些外周器官的循环Angptl4具有两个有效作用。首先，其结合至肾小球内皮中的αvβ5整合素并减少蛋白尿，从而表明增加循环Angptl4的主要目的是试图减少蛋白尿。其次并且可能的是，升高的循环Angptl4水平的一个不期望的后果是其结合至LPL(其生理功能)、减少的甘油三酯摄取和高甘油三酯血症。重要的是阐明本文讨论的蛋白尿与高甘油三酯血症之间的联系不涉及蛋白尿的主要发病机制，但涉及其通过循环Angptl4减少/修饰。在人肾病综合征中蛋白尿发作与高甘油三酯血症出现之间的滞后也由Angptl4的外周产生解释，因为其需要中度至重度蛋白尿(在人中至少3.5克/24小时)来形成该响应。早期，在这两种动物模型中的轻度蛋白尿与外周器官Angptl4响应、升高的血浆Angptl4或提高的甘油三酯水平不相关。因为Angptl4从外周组织分泌的增加也是对空腹的生理上响应(18)，增加的Angptl4外周产生可能是身体用于遏制肾病综合征中过度尿蛋白损失的空腹-样响应的一部分。

从水肿和蛋白尿急性发作的PAN大鼠(一种MCD模型)中学习到了另外有趣的教训。在前研究(6)显示MCD中的足细胞产生两种不同类型的Angptl4：诱导蛋白尿的高pI低唾液酸化形式，和与循环Angptl4相同的中性pI唾液酸化形式。除其它因素外，不足的唾液酸基质在MCD中的足细胞产生高pIAngptl4中起到主要作用，并且使用唾液酸前体N-乙酰基-D-甘露糖胺使高pIAngptl4体内转化为中性pIAngptl4减少蛋白尿。与FSGS和MN不同，低唾液酸化Angptl4的肾小球上调在该疾病中出现蛋白尿起到关键作用。循环经唾液酸化的Angptl4在PAN模型持续的整个期间仍保持升高，其来源于初始部分的肾小球(即肾小球阶段)和稍后阶段的骨骼肌和脂肪组织(即外周阶段)。该文章中的体外研究显示在氧化应激的情况下高pIAngptl4增加而中性pIAngptl4减少内皮损伤。对高pIAngptl4的进一步研究超过了本文章的范围。在该文中用于体内研究的所有重组Angptl4是中性pI唾液酸化形式。如同MN和FSGS的大鼠模型一样，PAN大鼠还出现Angptl4上调的外周阶段，其显著有助于在第10天后蛋白尿减少。

在所有模型中蛋白尿减少的重要介体是肾小球内皮中的Angptl4–αvβ5整合素相互作用，因为在敲除小鼠中不存在β5整合素或Angptl4或者使用针对β5整合素胞外部分的抗体阻断该相互作用减少了蛋白尿的下降率。在PAN中Angptl4产生的外周阶段的另一种作用是甚至在蛋白尿消退之后维持轻度高甘油三酯血症(第21天)。之前，在MCD儿童中，类似的残余高甘油三酯血症在他们进入缓解期后已有记录(19)。可能的是循环Angptl4也可与其它肾小球细胞表面分子相互作用以发挥其保护作用。存在寻求Angptl4结合至肾小球内皮αvβ5整合素的两个原因。首先，共聚焦成像和免疫金电子显微术显示在aP2-Angptl4转基因大鼠中从脂肪组织分泌的Angptl4-V5特异性结合至肾小球中的内皮细胞。其次，αvβ5仅是体内显示与Angptl4相互作用的肾小球内皮细胞上表达的整合素。另一种主要肾小球内皮整合素，αvβ3，不与Angptl4相互作用(17)(由我们确认，数据未显示)。将来将探索Angptl4结合至内皮αvβ5整合素从而减少蛋白尿的精确机制。推测的内皮–足细胞反馈回路可能受到影响。

另一个有趣观察是在单基因过表达之后使Angptl4进入至循环中是器官依赖性的。类似于在过去出现的心脏特异性Angptl4过表达转基因小鼠(20)，在NPHS2-Angptl4大鼠的足细胞中Angptl4的单基因过表达不自动允许进入循环中。相反，脂肪组织中的过表达(aP2-Angptl4转基因大鼠(6)，aP2-Angptl4转基因小鼠(18))可靠地提高循环Angptl4水平。使得足细胞分泌的Angptl4进入至循环中，如在SpragueDawley大鼠PAN肾小球阶段和患有PAN的NPHS2-Angptl4转基因大鼠中注意到的，可能需要肾小球中产生的尚未鉴定的其它蛋白的活性。这也很好地符合同时影响多个基因和蛋白的表达的人肾小球疾病。因此，循环Angptl4的全身可用性和作用可能受到作为所述疾病过程一部分的多个器官中改变的其它基因/蛋白影响，并且也受到肾病状态中Angptl4和LPL的尿损失影响。

循环Angptl4的抗-蛋白尿作用可能已经在糖皮质激素用于治疗许多不同类型的肾小球疾病的功效中起到部分作用。糖皮质激素对Angptl4表达的影响是器官依赖性的。然而它们减少了MCD足细胞中的Angptl4表达(6)，它们显示可增加小鼠中Angptl4的脂肪组织表达(21)。将来的研究可探索糖皮质激素是否诱导从脂肪组织分泌足量的Angptl4至循环中，该作用是否为体内剂量依赖性，以及这是否也在肾病综合征中发生。

其它可溶性蛋白已牵涉于人肾小球疾病的发病机理中。从足细胞分泌并也存在于循环中的血管内皮生长因子显示参与人血栓性微血管病的发展，并经由所表达的特异性受体发挥其对内皮和足细胞表面的生物作用(22)。从先兆子痫胎盘过量分泌的可溶性fms-样酪氨酸激酶1(23)和可溶性内皮糖蛋白(24)参与肾小球内皮病的发病机理。然而，这些蛋白牵涉于疾病发病机理中，并且不是对疾病的全身反应。可溶性尿激酶受体suPAR最近显示具有主要通过结合至足细胞αvβ3整合素发挥的促-蛋白尿作用(25)。抗-蛋白尿性Angptl4与促-蛋白尿性suPAR之间的共同特点是循环蛋白与肾小球整合素的相互作用。相同组进行的随访研究显示suPAR水平也在具有NPHS2基因突变的FSGS患者中升高(26)。这将表明在这些具有NPHS2突变的患者中，suPAR升高是一种对肾小球疾病的全身反应。在此类情况下，SuPAR连接一类循环蛋白(由Angptl4例示)，所述循环蛋白响应肾小球损伤或蛋白尿而增加并具有影响潜在肾小球疾病的病程的有效作用。一旦鉴定了影响非-HIV塌陷性肾小球病的发病机理的推测的循环蛋白(27，28)，不久该列表就将增长。

最后，突变型人Angptl4能够极其显著地减少蛋白尿(平均峰值减少约60％)而不显著影响血浆甘油三酯水平，并且在单次静脉内注射之后至少两周有效。这些重组蛋白有希望用于进一步开发为肾小球疾病的治疗剂。总之，循环Angptl4是肾病综合征的一种重要的生物介体，并且代表蛋白尿与高甘油三酯血症之间的关键环节。

用于操作实施例4的方法

用于人和啮齿类动物Angptl4的ELISA

用于测量来自患者和对照血浆样品的人Angptl4的夹心ELISA购自R&DSystem(MinneapolisMN，USA)。标准曲线在1.25ng/ml与40ng/ml之间校正，并具有0.98的R²值。(补充图16(a))

为了测量血浆中的大鼠Angptl4和小鼠Angptl4，开发了一种新型ELISA测定。针对氨基酸22至101获得绵羊抗-大鼠Angptl4抗体(5006B)，并且通过蛋白质印迹使用之前公开的兔抗-大鼠Angptl4抗体(6)作为阳性对照来表征特异性。活性还使用重组Angptl4吸收，并且记录通过蛋白质印迹和免疫荧光导致的反应性损失。使用来自基于之前公开的HEK293的稳定细胞系的浓缩的上清液将所述测定标准化，所述稳定细胞系分泌重组大鼠Angptl4。将各孔用0.1mg与0.5mg之间的浓缩的上清液涂覆。在阻断和洗涤后，添加10μg绵羊抗-大鼠Angptl4抗体，然后洗涤、16ng/孔的驴抗绵羊IgHRP(Jacksonlaboratories)、洗涤和TMB系统试剂，并且在ELISA读板仪上在OD450nm处测量。获得具有R²为0.998的线性关系的标准曲线(图16(b))。为了分析啮齿类动物血浆，将各孔以一式两份涂覆50μl血浆，然后进行如上详述的步骤。获得来自含有所有试剂减去研究样品的空白对照孔的读数，并从中减去研究样品的读数。每个时间点测量最少4个样品。

用于ELISA测定的人血浆样品获自在UAB(PIChugh)，InstitutoNacionalDeCardiologia，墨西哥城(PIAvila-Casado)进行的IRB批准的研究，并且来自之前公开的研究(6)。

动物研究

之前公开了NPHS2-Angptl4和aP2-Angptl4转基因大鼠的产生和表征(6)。BuffaloMna大鼠经由MTA获自MasaoMitsuyama博士(京都大学，日本京都)。除非另外说明，否则对BuffaloMna大鼠与年龄和性别匹配的SpragueDawley和Wistar大鼠进行所有的比较。因为结果类似，故仅给出来自与SpragueDawley大鼠的比较的数据。Itgb5-/-小鼠和对照129S1/SvImJ小鼠购自JacksonLaboratories(BarHarborMEUSA)。Angptl4-/-小鼠由EliLilly公司提供给SanderKersten。对Angptl4-/-小鼠进行的所有研究由瓦赫宁根大学(WageningenUniversity)的动物伦理委员会(AnimalEthicsCommittee)批准。所有其它动物研究由实验动物照护及使用委员会(阿拉巴马大学，伯明翰)批准。

之前已经描述了单一静脉内给药PAN(n＝4只大鼠/组)、PHN(n＝4只大鼠/组)和抗-Thy1.1肾炎(n＝4只大鼠/组)的诱导(12,13)。对于全剂量PAN，使用嘌呤霉素氨基核苷(Sigma化学公司，St.LouisMOUSA)15mg/100g。对于轻度PAN，将剂量减少至7.5mg/100g。之前描述了使用绵羊抗-大鼠肾毒血清的γ2级分(NTS，来自DavidSalant，波士顿医药中心的友善馈赠)诱导补体-依赖性和白细胞-依赖性肾病综合征(n＝4只小鼠/组)(29)。对于将兔抗-大鼠Angptl4抗体(6)注射到PAN大鼠中(n＝3只大鼠/组)的动物研究，将500μl抗体或免疫前血清以每个剂量注射。通过蛋白质印迹确认抗体消耗循环Angptl4。在大鼠PAN研究中每剂量注射的抗-β5整合素抗体或免疫前血清的体积如下：SpragueDawley大鼠PAN(250μl)；aP2-Angptl4转基因大鼠PAN(500μl)。

对于多器官基因表达研究，将器官样品在安乐死之后立即快速冷冻在液氮中(3只大鼠或小鼠/器官样品，汇集的)。白色脂肪组织获自腹部、褐色脂肪组织获自肩胛间区域、骨骼肌获自大腿、肝冷冻完整或样品获自左叶和右叶、心脏冷冻完整、和大鼠肾冷冻并随后用作肾小球分离。在小鼠实验中，将肾在使用免疫磁珠安乐死之后立即通过心脏灌注，并且然后用作肾小球分离。12个cDNA模板从每个汇集的器官产生，并且基因表达通过Taqman实时PCR评估。

注射重组大鼠Angptl4和人Angptl4

之前描述了从基于HEK293细胞的稳定细胞系收集唾液酸化大鼠Angptl4(6)。将含有大鼠Angptl4的浓缩HEK293Angptl4或空的pcDNA3.1V5His载体稳定细胞系上清液(1.8mg，源自大约200ml的培养基)在BuffaloMna大鼠(n＝4只大鼠/组)和Thy1.1大鼠(n＝4只大鼠/组)研究中以每剂量注射。对于将重组人野生型Angptl4、突变型Angptl4和对照蛋白注射至BuffaloMna大鼠中的研究(n＝3只大鼠/组)中，每剂量使用55μg的于浓缩上清液或等量的对照稳定细胞系上清液(通过蛋白测定平衡)中的重组蛋白(通过ELISA定量)。

肝素后LPL活性

在安乐死之前15分钟向大鼠静脉内注射10单位/100g重量的猪科动物肝素，并使用来自RoarBiomedical，Inc(纽约NYUSA)的测定方法测量活性(30)。使用来自Cayman化学公司(AnnArborMIUSA)的自动分析仪(一些研究)或试剂盒，测量在空腹状态的血清甘油三酯。

之前已经描述了以下技术：在代谢笼中的18小时尿收集、测量蛋白尿、小鼠尿白蛋白和肌酸酐、2D凝胶电泳和蛋白质印迹、共聚焦成像、免疫金电子显微术、提取总RNA、产生cDNA模板(2μg总RNA/模板)、实时PCR(6、12、13、31)。在实时PCR实验中，mRNA表达的三倍变化被认为是显著的，并且已经由我们在先前的文献中验证(13,31)。使用山羊抗-LPL抗体(SantaCruzBiotechnology，SantaCruzCAUSA)和特异性鉴定活性二聚体LPL的5D2单克隆抗体(来自JohnBrunzell，华盛顿大学的馈赠)进行针对LPL的蛋白质印迹(32)。使用ImageQuantTL7.0软件(GEHealthcare，WaukeshaWIUSA)进行2D凝胶蛋白质印迹的密度计量学。小鼠抗-PECAM1抗体购自BDPharmingen(SanDiegoCAUSA)。使用的所有二级抗体购自JacksonImmunoResearch实验室(WestGrovePAUSA)，并且具有针对非靶种类的最小背景反应性。

开发人Angptl4突变型构建体和稳定细胞系

使用基于PCR的诱变使人Angptl4克隆突变。如前所述，pcDNA3.1V5His载体中的野生型和突变型人Angptl4克隆用于开发基于HEK293的稳定细胞系(6)。当用于收集蛋白时，无血清DMEM包含25mMN-乙酰基-D-甘露糖胺(ManNAc)，即一种唾液酸前体，以确保分泌至培养基的重组蛋白的足够唾液酸化。如前所述，收集蛋白并浓缩上清液(6)。使用ELISA对重组人Angptl4定量。

内皮细胞研究

使无血清条件下生长24小时的经培养的大鼠GEnC经受H₂O₂(200μM)诱导的应激，并与等量的来自Angptl4-HEK293或对照-HEK293稳定细胞系的浓缩上清液共孵育。使用细胞毒性试剂盒(RocheAppliedScienceIndianapolis，USA)，将在24小时、48小时和72小时时于上清液中的LDH水平测量为细胞损伤的度量。

αvβ5整合素平板测定

将96孔板用5ng人纯化的αvβ5整合素/孔涂覆、用具有1％BSA的TBST阻断、然后与增加数量的来自分泌大鼠Angptl4-V5的稳定细胞系的浓缩上清液孵育。使用抗-V5HRP抗体(LifeTechnologies，GrandIslandNYUSA，1:2500)检测V5标签，使用TMB过氧化酶底物和溶液(KPL，Inc.，GaithersburgMDUSA)形成反应，并且在Lab系统MultiscanMCC340(ThermoFisherScientific，WalthamMAUSA)在450nm下读取。

抗-β5整合素抗体的产生和表征

针对人β5整合素胞外区段的部分产生融合蛋白，以在兔中产生两种多克隆抗体(抗体8472A，氨基酸35-460，包括整合素β结构域；抗体8472B，氨基酸461至719，包括整合素β尾)。在吸收(absorbingout)对于重组人β5整合素的反应性之前和之后通过蛋白质印迹测试两种抗体的特异性。在恢复阶段期间，通过在SpragueDawley大鼠中诱导PAN(n＝3只大鼠/组)和静脉内注射两个剂量的每种抗体进行试点研究以评估β5整合素的体内阻断(即蛋白尿的较慢恢复)。因为8472A的功效比8472B高数倍，故8472A(图16(c))被用于进一步研究(n＝4只大鼠/组)。静脉内注射该抗体、然后对肾小球共聚焦成像，显示至肾小球中的内皮的定位(图16(d))。

统计分析

在MicrosoftExcel2010中，使用未配对的学生t-检验进行两个组之间的差异分析。对于三个或更多个组，使用具有分析后检验的ANOVA(使用raphPadInStat软件，3.10版)。

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表4:

序列表的图示

SEQIDNO:1人Angptl4多肽的变体1

SEQIDNO:2人Angptl4的变体1的cDNA序列

SEQIDNO:3人Angptl4多肽的变体2

SEQIDNO:4人Angptl4的变体2的cDNA序列

SEQIDNO:5大鼠Angptl4多肽

SEQIDNO:6大鼠Angptl4多肽的cDNA序列

SEQIDNO:7小鼠Angptl4多肽

SEQIDNO:8小鼠Angptl4多肽的cDNA序列

SEQIDNO:9具有取代的人Angptl4多肽的变体1

SEQIDNO:10具有取代的人Angptl4多肽的变体2

SEQIDNO:11-22PCR引物和探针(参见文本)

SEQIDNO:23具有取代的N-端多物种共有序列

SEQIDNO:24具有取代的中心多物种共有序列

SEQIDNO:25具有取代的C-端多物种共有序列

SEQIDNO:26具有取代的N-端人共有序列

SEQIDNO:27具有取代的C-端人共有序列

SEQIDNO:28人Angptl4多肽DKMNVLAHGLLQLGQGL的突变型变体

SEQIDNO:29-90表2序列

SEQIDNO:91用于扩增aP2-Angptl4构建体的反向引物

SEQIDNO:92用于鉴定aP2-Angptl4构建体的探针

SEQIDNO:93编码SEQIDNO:80肽的cDNA

SEQIDNO:94编码SEQIDNO:87肽的cDNA

Claims (57)

1.一种具有降低的LPL抑制活性和增加的裂解耐受性的Angptl4多肽衍生物，所述Angptl4多肽衍生物包括以下的结构：

V—W—X—Y—Z，其中

V是与SEQIDNO:23具有至少95％的同源性的序列，其中，位置39-55不是DEMNVLAHGLLQLGQGL；

W是具有0-5个残基的寡肽；

X是与SEQIDNO:24具有至少95％的同源性的序列，其中，位置63-66不是RRKR、GSGS或SGGG；

Y是具有0-38个残基的寡肽；并且

Z是与SEQIDNO:25具有至少95％的同源性的序列。

2.一种如权利要求1所述的Angptl4多肽衍生物在制造用于治疗或预防选自肾病综合征的疾病状态和特征在于蛋白尿的疾病状态的药物中的用途。

3.一种用于治疗或预防选自肾病综合征的疾病状态和特征在于蛋白尿的疾病状态的方法；所述方法包括向需要其的对象施用药学上有效量的包含如权利要求1所述的Angptl4多肽衍生物的药物组合物。

4.一种用于治疗或预防选自肾病综合征的疾病状态和特征在于蛋白尿的病症的药物组合物；所述组合物包含药学上可接受的载体和如权利要求1所述的Angptl4多肽衍生物。

5.权利要求1-4中任一项，其中，在SEQIDNO:23的位置39-40处的序列不是DE。

6.权利要求1-5中任一项，其中，SEQIDNO:23的位置39是带正电的残基或中性残基。

7.权利要求1-6中任一项，其中，SEQIDNO:23的位置40是带负电的残基或中性残基。

8.权利要求1-7中任一项，其中，SEQIDNO:23的位置40选自表1示出的残基。

9.权利要求1-8中任一项，其中，EQIDNO:23的位置39是D或A。

10.权利要求1-9中任一项，其中，SEQIDNO:23的位置40是K、A或E。

11.权利要求1-10中任一项，其中，SEQIDNO:23的位置39是D或A，并且其中，SEQIDNO:23的位置40是K、A或E。

12.权利要求1-11中任一项，其中，在SEQIDNO:23的位置39和位置40处的序列选自由DK、DA和AE组成的组。

13.权利要求1-12中任一项，其中，SEQIDNO:24的位置63-66中的一个或多个位置独立地选自由D、R、K、A和V组成的组。

14.权利要求1-13中任一项，其中，SEQIDNO:24的位置63-66中的全部位置独立地选自由D、R、K、G、A和V组成的组。

15.权利要求1-14中任一项，其中，SEQIDNO:24的位置63-66中的一个或多个位置独立地选自由G、A、S和V组成的组。

16.权利要求1-15中任一项，其中，SEQIDNO:24的位置63-66中的全部位置独立地选自由G、A和V组成的组。

17.权利要求1-16中任一项，其中，在SEQIDNO:24的位置63-66处的序列选自表2。

18.权利要求1-17中任一项，其中，在SEQIDNO:24的位置63-66处的序列选自GAAG、GVVA、AAVV和VAVA。

19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述Angptl4多肽衍生物与SEQIDNO:9具有至少95％的序列同源性。

20.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述Angptl4多肽衍生物与SEQIDNO:10具有至少95％的序列同源性。

21.权利要求1-20中任一项，其中，在SEQIDNO:24的位置63-66处的序列是GVVA。

22.权利要求1-21中任一项，其中，在SEQIDNO:23的位置39-40处的序列是DA，并且在SEQIDNO:24的位置63-66处的序列是GVVA。

23.权利要求1-20中任一项，其中，在SEQIDNO:23的位置39-40处的序列是DK，并且在SEQIDNO:24的位置63-66处的序列是GAAG。

24.权利要求1-20中任一项，其中，在SEQIDNO:23的位置39-40处的序列是DK，并且在SEQIDNO:24的位置63-66处的序列是AAVV。

25.权利要求1-20中任一项，其中，在SEQIDNO:23的位置39-40处的序列是AE，并且在SEQIDNO:24的位置63-66处的序列是VAVA。

26.权利要求1-19中任一项，其中，所述结构是SEQIDNO:9，其中，在SEQIDNO:9的位置39-40处的序列是DA，其中，SEQIDNO:9的位置76是C，其中，SEQIDNO:9的位置80是C，并且其中，在SEQIDNO:9的位置161-164处的序列是GVVA。

27.权利要求1-19中任一项，其中，所述结构是SEQIDNO:9，其中，在SEQIDNO:9的位置39-40处的序列是DK，其中，SEQIDNO:9的位置76是C，其中，SEQIDNO:9的位置80是C，并且其中，在SEQIDNO:9的位置161-164处的序列是GAAG。

28.权利要求1-19中任一项，其中，所述结构是SEQIDNO:9，其中，在SEQIDNO:9的位置39-40处的序列是DK，其中，SEQIDNO:9的位置76是C，其中，SEQIDNO:9的位置80是C，并且其中，在SEQIDNO:9的位置161-164处的序列是AAVV。

29.权利要求1-19中任一项，其中，所述结构是SEQIDNO:9，其中，在SEQIDNO:9的位置39-40处的序列是AE，其中，SEQIDNO:9的位置76是C，其中，SEQIDNO:9的位置80是C，并且其中，在SEQIDNO:9的位置161-164处的序列是VAVA。

30.权利要求1-18和20中任一项，其中，所述结构是SEQIDNO:10，其中，在SEQIDNO:10的位置39-40处的序列是DA，其中，SEQIDNO:10的位置76是C，其中，SEQIDNO:10的位置80是C，并且其中，在SEQIDNO:10的位置161-164处的序列是GVVA。

31.权利要求1-18和20中任一项，其中，所述结构是SEQIDNO:10，其中，在SEQIDNO:10的位置39-40处的序列是DK，其中，SEQIDNO:10的位置76是C，其中，SEQIDNO:10的位置80是C，并且其中，在SEQIDNO:10的位置161-164处的序列是GAAG。

32.权利要求1-18和20中任一项，其中，所述结构是SEQIDNO:10，其中，在SEQIDNO:10的位置39-40处的序列是DK，其中，SEQIDNO:10的位置76是C，其中，SEQIDNO:10的位置80是C，并且其中，在SEQIDNO:10的位置161-164处的序列是AAVV。

33.权利要求1-18和20中任一项，其中，所述结构是SEQIDNO:10，其中，在SEQIDNO:10的位置39-40处的序列是AE，其中，SEQIDNO:10的位置76是C，其中，SEQIDNO:10的位置80是C，并且其中，在SEQIDNO:10的位置161-164处的序列是VAVA。

34.权利要求1-4中任一项，其中，V—W—X—Y—Z具有结构：

A—B—C，其中

A与SEQIDNO:26具有至少95％的同源性，其中，在位置39-55处的序列不是DEMNVLAHGLLQLGQGL，并且其中，位置63-66不是RRKR、GSGS或SGGG；

B是具有0-38个残基的寡肽；并且

C与SEQIDNO:27具有至少95％的同源性。

35.权利要求1-34中任一项，其中，所述Angptl4多肽衍生物被唾液酸化。

36.如权利要求2、3和5-35中任一项所述的用途或方法，包括以约0.05μg/kg至150,000μg/kg的剂量施用所述药物组合物至所述对象。

37.如权利要求2、3和5-36中任一项所述的用途或方法，包括以约50μg/kg至150μg/kg的剂量施用所述药物组合物至所述对象。

38.如权利要求2、3和5-37中任一项所述的用途或方法，包括约每14天一次施用所述药物组合物至所述对象。

39.如权利要求2、3和5-38中任一项所述的用途或方法，包括约每个月两次施用所述药物组合物至所述对象。

40.如权利要求2、3和5-39中任一项所述的用途或方法，包括约每个月一次至约每个月两次施用所述药物组合物至所述对象。

41.如权利要求2、3和5-40中任一项所述的用途或方法，包括递送所述Angptl4多肽衍生物至所述对象的血液的步骤。

42.如权利要求2、3和5-41中任一项所述的用途或方法，包括递送所述Angptl4多肽衍生物至所述对象的肾的步骤。

43.如权利要求2、3和5-42中任一项所述的用途或方法，包括静脉内施用所述药物组合物至所述对象。

44.如权利要求2、3和5-43中任一项所述的用途或方法，其中，所述施用减少水肿、减少蛋白尿、升高血浆白蛋白水平、减少高胆固醇血症、减少高甘油三酯血症或前述的组合。

45.如权利要求2、3和5-44中任一项所述的用途或方法，包括减少所述对象中的蛋白尿。

46.权利要求2-45中任一项，其中，所述肾病综合征与微小病变、局灶性节段性肾小球硬化症、膜性肾病/膜性肾小球肾炎、膜增生性肾小球肾炎或糖尿病病状相关。

47.权利要求2-46中任一项，其中，所述肾病综合征与微小病变相关。

48.权利要求2-47中任一项，其中，所述肾病综合征与糖尿病性肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球病相关。

49.权利要求2-48中任一项，其中，所述肾病综合征呈现出选自由以下组成的组的症状：水肿、高脂血症、低蛋白血症、高胆固醇血症和蛋白尿。

50.一种分离的编码如权利要求1和5-34中任一项所述的Angptl4多肽衍生物的多核苷酸。

51.一种遗传修饰生物体，包括如权利要求50所述的多核苷酸。

52.一种体外表达系统，包括如权利要求50所述的多核苷酸。

53.如权利要求4-34中任一项所述的药物组合物，包含约0.035mg至1100mg的所述Angptl4多肽衍生物。

54.如权利要求4-34和53中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物被配制用于静脉内递送。

55.如权利要求4-34和53中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物被配制用于经皮递送。

56.如权利要求4-34和53-55中任一项所述的药物组合物，包括递送所述Angptl4多肽衍生物至所述血液的方式。

57.如权利要求4-34和53-55中任一项所述的药物组合物，包括递送所述Angptl4多肽衍生物至所述肾的方式。