CN112689762A - 用于lc-ms/ms蛋白质组学基因分型的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

公开了使用液相色谱/串联质谱(LC‑MS/MS和2D‑LC‑MS/MS)用于基因型的蛋白质组学分析的方法和系统。在某些实施方案中，在分析中使用的样品包括干燥的体液。

Description

用于LC-MS/MS蛋白质组学基因分型的方法和系统
相关申请
本申请要求2018年6月1日提交的美国临时专利申请号62/679,133、2018年6月1日提交的美国临时专利申请号62/679,286和2018年6月4日提交的美国临时专利申请号62/680,256的优先权。美国临时专利申请号62/679,133、62/679,286和62/680,256的公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本文公开的主题涉及用于LC-MS/MS蛋白质组学基因分型的方法和系统。
背景技术
在医学领域中通常需要确定特定遗传基因座处的基因型。例如，Apo脂蛋白L1(ApoL1)的两种遗传变体，称为G1和G2，存在于很大一部分的非裔美国人中。具有两种ApoL1风险变体(G1/G1、G2/G2或G1/G2)的个体处于增加的发展非糖尿病性肾脏疾病的风险中。此外，已经证明，当使用具有两种ApoL1风险变体的非裔美国人的供体器官时，肾移植受体平均经历较早的同种异体移植物衰竭。通过蛋白质组学方法进行的蛋白质测序可以通过鉴定感兴趣的基因编码的相应蛋白质变体来鉴定基因型，相对于常规基因(DNA)测序和转录物(RNA)测序，这可能具有实际益处。这可以通过对包含蛋白质变体的体液进行蛋白质组学分析来完成；但是，当远程或自身样品采集是有利的时，从体液产生干燥的样品用于蛋白质组学分析可能是优选的。
发明内容
在一些实施方案中，本文公开的主题提供了用于蛋白质组学确定样品中感兴趣的基因型的方法和系统。所述方法可以以多种方式实施。
例如，公开了一种用于确定受试者中感兴趣的基因的基因型的方法，所述方法包括：提供来自所述受试者的生物样品；以及使用质谱检测所述样品中存在的至少一种等位基因特异性替代肽；并基于所述至少一种等位基因特异性替代肽(即，蛋白质组学谱)确定基因型。在一个实施方案中，所述方法可以包括提供来自受试者的体液，其中所述体液包含来源于感兴趣的基因的蛋白质；将所述体液沉积在固体基底上，其中允许所述体液干燥以产生干燥的样品；消化所述干燥的样品以产生至少一种等位基因特异性替代肽；基于通过质谱检测的所述至少一种等位基因特异性替代肽(即蛋白质组学谱)的存在或不存在确定所述体液的基因型。在一个实施方案中，质谱包括液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)。在一些实施方案中，液相色谱包括高效液相色谱(HPLC)。
所述方法可以包括以下步骤：消化生物样品中来源于感兴趣的基因的蛋白质或肽以产生对等位基因(即，基因型)编码的蛋白质变体具有特异性的等位基因特异性替代肽，其中所述替代肽包含蛋白质组学谱。在某些实施方案中，所述方法可以进一步包括检测至少一种共同替代肽的存在，该共同替代肽对于由感兴趣的基因的等位基因编码的所有蛋白质变体是共有的。因此，在某些实施方案中，蛋白酶消化可产生对于该基因存在的各种等位基因而言共有的共同替代肽(或质控肽)。在一个实施方案中，通过将针对至少一种等位基因特异性替代肽的测量的响应与针对至少一种共同替代肽的测量的响应进行比较，来确定至少一种等位基因特异性替代肽的存在或不存在。
在一些实施方案中，可以使用蛋白酶胰蛋白酶进行消化步骤。或者，可以使用用于蛋白质水解的其他蛋白酶或化学物质。同样，在一些实施方案中，来源于感兴趣的基因的蛋白质在消化之前被变性以促进消化。
在一些实施方案中，一种或多种内标可以用于检测一种或多种肽。例如，可以通过将替代肽的测量的响应与添加至个体样品中的其内标的响应进行比较来确定特异于基因型的等位基因特异性替代肽的存在或不存在。在一些实施方案中，内标是等位基因特异性替代肽的稳定的同位素标记的类似物。另外和/或可替代地，可以通过将替代肽的测量的响应与其作为内标添加至个体样品的稳定的同位素标记的类似物的响应进行比较来确定至少一种共同替代肽的存在或不存在。
在一个实施方案中，测量的响应是从等位基因特异性替代肽产生的至少一个碎片离子的MS/MS转变特征的峰面积比。另外和/或可替代地，测量的响应可以是由共同替代肽产生的至少一个碎片离子的MS/MS转变特征的峰面积比。例如，在一个实施方案中，在MS/MS过程中对于每个肽产生碎片离子。在碎片离子来自C末端的情况下，碎片离子可以表示为“y”。在碎片离子来自N末端的情况下，碎片离子可以表示为“b”。另外，碎片离子可以通过氨基酸残基的数量来鉴定。例如，对于具有序列LNILNNNYK(SEQ ID NO.4)的肽，碎片离子y4将具有序列NNYK。在一个实施方案中，结果可以报告为轻(未标记的)肽(例如，在蛋白质的胰蛋白酶消化后)的峰面积比(PAR)相对重(稳定的同位素标记的)肽的PAR。这可以为未标记的胰蛋白酶肽提供标准化响应。
所述方法可以应用于任何蛋白质。在一个实施方案中，蛋白质是ApoL1。例如，对于ApoL1，等位基因特异性替代肽可以具有来源于野生型等位基因(SEQ ID NO.1)的氨基酸序列LNILNNNYK(SEQ ID NO.4)，或者可以具有来源于G1等位基因(SEQ ID NO.2)的氨基酸序列LNMLNNNYK(SEQ ID NO.5)，或者可以具有来源于G2等位基因(SEQ ID NO.3)的氨基酸序列LNILNNK(SEQ ID NO.6)。同样对于ApoL1，共同替代肽可以具有SETAEELK(SEQ ID NO.7)和/或VAQELEEK(SEQ ID NO.8)的氨基酸序列，其中共同替代肽存在于野生型、G1或G2等位基因中的每一个中。对于这些肽的测量，质谱可以测量表3中的至少一种转变。此外，对于ApoL1，可以通过比较针对至少一种等位基因特异性替代肽的测量的响应与针对至少一种等位基因特异性替代肽的表2中列出的稳定的同位素标记的类似物的测量的响应来确定至少一种等位基因特异性替代肽的存在或不存在。
如本文所公开的，来自受试者的多种体液可包含由感兴趣的基因等位基因编码的蛋白质变体。在一些情况下，体液是干燥的血浆或干燥的红细胞，其通过将血液添加至固定红细胞从而允许血浆分离的基底上而产生。在一些实施方案中，生物样品是在合适的基底上采集的干燥的血液、干燥的尿液或干燥的唾液。
还公开了用于执行本文公开的蛋白质组学方法的系统。例如，公开了一种用于确定受试者中感兴趣的基因的基因型的系统，该系统包括：用于提供包含来源于感兴趣的基因的蛋白质的干燥体液的装置；用于使干燥的体液经历消化以产生针对蛋白质的所述至少一种等位基因特异性替代肽和任选地所述至少一种共同替代肽的工作站；任选地，用于色谱纯化所述至少一种等位基因特异性替代肽和所述至少一种共同替代肽的任选的至少一种稳定的同位素标记的类似物的工作站；和用于通过质谱分析所述至少一种等位基因特异性替代肽以确定生物样品中所述至少一种等位基因特异性替代肽的存在或量的工作站。
在一个实施方案中，用于提供干燥体液的装置包括用于在基底上固定红细胞并将其与血浆分离的装置。此外，在一个实施方案中，该系统可以进一步包括用于添加针对蛋白质的所述至少一种等位基因特异性替代肽和任选地所述至少一种共同替代肽的稳定的同位素标记的内标的工作站。此外，在某些情况下，用于质谱的工作站包括串联质谱仪和/或用于质谱的工作站包括高效液相色谱(HPLC)。该系统本质上可以是高通量的。此外，在某些情况下，工作站中的至少一个由计算机控制。
附图简要说明
这样已以一般的方式描述了本发明，现在将参考非限制性附图，这些附图不必按比例绘制。
图1显示了ApoL1野生型(SEQ ID NO.1)、G1(SEQ ID NO.2)和G2(SEQ ID NO.3)蛋白质变体，以及由根据本公开内容的实施方案的每种蛋白质变体的胰蛋白酶消化产生的等位基因特异性替代肽的氨基酸序列。野生型(WT)特异性替代肽是LNILNNNYK(SEQ IDNO.4)。G1特异性替代肽是LNMLNNNYK(SEQ ID NO.5)。G2特异性替代肽是LNILNNK(SEQ IDNO.6)。
图2显示了根据本公开内容的实施方案的通过胰蛋白酶消化WT、G1和G2变体产生的某些ApoL1共同替代肽。质控肽1是SETAEELK(SEQ ID NO.7)。质控肽2是VAQELEEK(SEQ IDNO.8)。
图3显示了根据本公开内容的实施方案的用于从全血沉积到层流纸基底上来分离和干燥红细胞和血浆以产生干燥的血浆的某些方法，以及用于采集和干燥全血(即，干燥的血斑)的时间过程。
图4显示了根据本公开内容的实施方案的用于确定ApoL1基因型的方法。
图5显示了根据本公开内容的实施方案的用于高通量蛋白质组学基因分型的系统。
图6显示了根据本公开内容的实施方案的ApoL1等位基因的替代肽检测模式，其中圆圈表示阳性，菱形或空框表示阴性。
图7显示了根据本公开内容的实施方案的ApoL1基因型的定性分配，其中圆圈指示阳性，菱形或空框指示阴性。在图中，q1和q2代表质控肽。
图8显示了根据本公开内容的实施方案的ApoL1基因型的半定量评估。
图9显示了与血液的Sanger DNA测序相比，使用干燥的血浆和液体血浆的蛋白质组学基因分型的比较。
图10显示了根据本公开内容的实施方案的ApoL1野生型(WT)肽作为增加血红蛋白浓度的函数的评估。如上文对于野生型(WT)肽和重稳定同位素内标(IS)的图所示，对具有5mg/dL血红蛋白、518mg/dL血红蛋白、2073mg/dL血红蛋白和8300mg/dL血红蛋白的样品进行评估。
图11显示了根据本公开内容的实施方案的ApoL1 WT、G1和G2肽作为固定在层流纸上并从1/4英寸冲床收获的干燥的血浆的函数的滴定。x轴表示样品是液体血浆(20uL)，还是使用固体基底分离的干燥的血浆，其中显示了所取样的基底(即“冲床”)的大致尺寸和形状。
图12显示了根据本公开内容的实施方案的使用液体血浆(黑圈)或干燥的血浆(灰圈)来产生质控肽和等位基因特异性肽的胰蛋白酶消化时间过程。在30分钟时间点的消化量以垂直阴影表示。
图13显示了根据本公开内容的实施方案的在23℃或37℃下储存长达28天的干燥的血浆中的野生型和等位基因特异性替代肽的稳定性。
图14显示了根据本公开内容的实施方案的用于通过LC-MS/MS进行蛋白质组学基因分型的系统。
发明详述
现在将在下文中参考所附描述和附图来更全面地描述本文公开的主题，其中显示了本文公开的主题的一些但不是全部实施方案。本文公开的主题可以以许多不同的形式来体现，并且不应该被解释为限于在此阐述的实施方案；相反，提供这些实施方案是为了使本公开内容满足适用的法律要求。贯穿全文，类似的数字表示类似的元素。
受益于前述描述和相关附图中呈现的教导，本文阐述的本文公开的主题的许多修改和其他实施方案将由本公开内容的主题所属领域的技术人员想到。因此，应当理解，本文公开的主题不限于所公开的特定实施方案，并且修改和其他实施方案旨在被包括在所附权利要求的范围内。尽管本文使用了特定术语，但是它们仅在一般和描述性意义上使用，而不是出于限制的目的。本公开内容利用以下所示的缩略语。
缩略语
APCI＝大气压化学电离
CV＝变异系数
EDTA＝乙二氨四乙酸
HTLC＝高湍流(通量)液相色谱
HPLC＝高效液相色谱
IS＝内标
LC＝液相色谱
LLE＝液液萃取
LOB＝空白限
LOQ＝定量限
LLOQ＝定量下限
MS/MS＝串联质谱
N＝重复次数
N/A＝不适用
PAR＝峰面积比
QC＝质量控制
R＝相关系数
SST＝系统适用性测试
ULOQ＝定量上限
2D-LC-MS/MS＝与串联质谱联用的二维液相色谱
(LC)-LC-MS/MS＝与质谱联用的二维液相色谱
(LC)-MS/MS＝与串联质谱联用的液相色谱
定义
尽管相信以下术语是本领域普通技术人员很好理解的，但是提出以下定义以促进对本文公开的主题的解释。在整个说明书中可以找到其他定义。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本文描述的主题所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施方案中阐述的数值被尽可能精确地报告。但是，任何数值都固有地包含必定由它们各自的测试测量中存在的标准偏差引起的某些误差。此外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如，规定的范围“1至10”应被视为包括最小值1和最大值10之间(包括端值)的任何和所有子范围；也就是说，以最小值1或更大的值(例如1至6.1)开头，并且以最大值10或更小的值(例如5.5至10)结尾的所有子范围。另外，任何被称为“并入本文”的参考文献应理解为整体并入。
当在本申请包括权利要求书中使用时，术语“一个”、“一种”和“该”是指“一个或多个/一种或多种”。因此，例如，除非上下文明显相反，否则提及“一个细胞”包括多个这样的细胞(例如，多个细胞)，等等。
如本文所用，术语“生物标志物”或“感兴趣的生物标志物”是可以提供关于生物体的生理状态的生物学信息的任何生物分子。在某些实施方案中，生物标志物的存在或不存在可以是提供有用信息的。在其他实施方案中，生物标志物的水平可以是提供有用信息的。在一个实施方案中，感兴趣的生物标志物可以包括肽、激素、核酸、脂质或蛋白质。或者，可以测量其他生物标志物。在一个实施方案中，生物标志物可以包括来源于ApoL1的肽。在各种实施方案中，该肽可以是野生型肽、G1变体或G2变体。
如本文所用，术语“体液”是指从生物学来源(包括但不限于动物、细胞培养物、器官培养物等)获得的液体样品。合适的样品包括血液、血浆、血清、尿液、唾液、泪液、脑脊液或其他液体抽吸物，所有这些样品都能够沉积到基底上以进行采集和干燥。在一个实施方案中，体液可以在干燥之前在基底上分离。例如，可以将血液沉积到纸质基底和/或层流装置上，其限制了红细胞的迁移，从而允许在干燥之前分离血浆级分，以产生干燥的血浆样品用于分析。
如本文所用，术语“个体”和“受试者”可互换使用。受试者可以包括动物。因此，在一些实施方案中，生物样品获自哺乳动物，包括但不限于狗、猫、马、大鼠、猴子等。在一些实施方案中，生物样品获自人受试者。在一些实施方案中，受试者是患者，即将其自身呈现在临床环境中以诊断、预后或治疗疾病或病况的活人。
如本文所用，受试者可以包括动物。因此，在一些实施方案中，生物样品获自哺乳动物，包括但不限于狗、猫、马、大鼠、猴子等。在一些实施方案中，生物样品获自人受试者。在一些实施方案中，受试者是患者，即将其自身呈现在临床环境中以诊断、预后或治疗疾病或病况的活人。
如本文所用，术语“纯化”或“分离”或其派生词不一定指从样品基质中除去除一种或多种感兴趣的分析物以外的所有材料。相反，在一些实施方案中，术语“纯化”或“分离”是指相对于样品基质中存在的一种或多种其他组分富集一种或多种感兴趣的分析物的量的方法。在一些实施方案中，可以使用“纯化”或“分离”程序去除样品的可能干扰感兴趣的生物标志物的检测的一种或多种组分，例如，可能干扰通过质谱对分析物的检测的一种或多种组分。
如本文所用，“色谱”是指其中由于化学实体在固定液相或固相周围或上方流动时化学实体的差异分布而将由液体或气体携带的化学混合物分离成组分的过程。
如本文所用，“液相色谱”(LC)是指当流体均匀地过滤通过细碎物质的柱或通过毛细管通道时选择性阻滞流体溶液的一种或多种组分的过程。阻滞是由于当流体相对于一种或多种固定相移动时混合物的组分在一种或多种固定相与主体流体(即流动相)之间的分布所致。“液相色谱”包括反相液相色谱(RPLC)、高效液相色谱(HPLC)和高湍流液相色谱(HTLC)。
如本文所用，术语“HPLC”或“高效液相色谱”是指其中通过迫使流动相在压力下通过固定相(通常为紧密填充柱)来提高分离度的液相色谱。
色谱柱通常包括介质(即填充材料)以促进化学部分的分离(即分级分离)。介质可以包括微小的颗粒。颗粒可以包括与各种化学部分相互作用的键合表面，以促进化学部分例如在本文实验中定量的生物标志物分析物的分离。一种合适的键合表面是疏水键合表面，例如烷基键合表面。烷基键合表面可以包括C-4、C-8或C-18键合的烷基基团，优选C-18键合的基团。色谱柱可以包括用于接收样品的入口和用于排出包含经分级分离的样品的流出物的出口。在该方法中，样品(或预纯化的样品)可以在入口处施加到柱子上，用溶剂或溶剂混合物洗脱，以及在出口处排出。可以选择不同的溶剂模式以洗脱不同的感兴趣的分析物。例如，可以使用梯度模式、等度模式或多型(即混合)模式进行液相色谱。在一个实施方案中，HPLC可在具有C18固相的多重分析HPLC系统上进行，使用水:甲醇作为流动相进行等度分离。
如本文所用，术语“分析柱”是指具有足够色谱板以实现测试样品基质的组分分离的色谱柱。优选地，以允许确定一种或多种感兴趣的分析物的存在或量的方式分离从分析柱洗脱的组分。在一些实施方案中，分析柱包含平均直径为约5μm的颗粒。在一些实施方案中，分析柱是官能化的二氧化硅或聚合物-二氧化硅混合物，或聚合物颗粒或整体式二氧化硅固定相，例如苯基-己基官能化的分析柱。
分析柱可以与“提取柱”区分开，“提取柱”通常用于从非保留材料分离或提取保留的材料，以获得“纯化”样品用于进一步纯化或分析。在一些实施方案中，提取柱是官能化的二氧化硅或聚合物-二氧化硅杂合物或聚合物颗粒或整体式二氧化硅固定相，例如Poroshell SBC-18柱。
术语“中心切割”是指在色谱图中选择感兴趣的区域，并对在该感兴趣的区域内洗脱的分析物进行第二分离，例如第二维度中的分离。
如本文所用，术语“基质辅助激光解吸电离”或“MALDI”是指其中将非挥发性样品暴露于激光辐照的方法，该激光辐照通过各种电离途径(包括光电离、质子化、去质子化和团簇衰变)使样品中的分析物解吸和电离。对于MALDI，将样品与能量吸收基质混合，这有助于分析物分子的解吸。
本文使用的术语“表面增强激光解吸电离”或“SELDI”是指其中将非挥发性样品暴露于激光辐照的另一种方法，该激光辐照通过各种电离途径(包括光电离、质子化、去质子化和团簇衰变)使样品中的分析物解吸和电离。对于SELDI，样品通常与优先保留一种或多种感兴趣的分析物的表面结合。如在MALDI中一样，此过程也可以使用能量吸收材料来促进电离。
如本文所用，术语“电喷雾电离”或“ESI”是指其中使溶液沿较短长度的毛细管通过的方法，在毛细管的末端施加高正或负电势。在到达管的末端时，溶液可以被蒸发(雾化)成在溶剂蒸气中的非常小的溶液液滴的喷射或喷雾。这种液滴的雾气可以流过蒸发室，该蒸发室被稍微加热以防止冷凝并蒸发溶剂。随着液滴变小，表面电荷密度增加，直到类似电荷之间的自然排斥导致离子以及中性分子被释放为止。
如本文所用，术语“电离”和“离子化”是指产生具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的那些离子，而正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的那些离子。
如本文所用，术语“解吸”是指从表面去除分析物和/或使分析物进入气相。
如本文所用，术语“溶血”是指红细胞膜的破裂，其导致血红蛋白和其他细胞内容物释放到血浆或血清中，并且术语“血脂过多”是指血液中过量的脂肪或脂质。
如本文所用，“液体血浆”是从患者抽血获得的血浆，其与红细胞分离但仍保持液态。液体血浆通常通过放血或静脉穿刺从受试者获得。
如本文所用，“干燥的血浆”是已被允许干燥的血浆。如本文更详细描述的，干燥的血浆可以在通过使血浆迁移通过固体基底的孔(例如通过层流)与红细胞分离后产生，所述固体基底的孔限制细胞的迁移。
如本文所用，“采样纸”或“过滤器”或“过滤膜”或“层流纸”或“层流装置”是可互换使用的术语，是指用于采集干燥的血液和血浆的固体基底，其可以包括可在上面点样血液并允许血浆从红细胞迁移出来以产生基本上为血浆并在干燥后提供干燥的血浆的样品的区域的滤纸或膜。
如本文所用，“基因型”是存在于可编码蛋白质序列的基因中的两个等位基因的DNA序列。
如本文所用，“替代肽”是来源于蛋白质并提供有关蛋白质的序列信息的肽。如本文所用，术语“变体特异性替代肽”和/或“等位基因特异性替代肽”和/或“基因型特异性替代肽”是来源于蛋白质并且具有直接归因于编码蛋白质的基因的DNA序列的独特氨基酸序列的肽。等位基因特异性替代肽的序列的确定可用于推断基因的至少一个等位基因的基因型。因此，如本文所用，“等位基因特异性替代肽”是提供有关编码蛋白质的等位基因的序列信息的肽。例如，对于ApoL1，野生型替代肽表示蛋白质来源于野生型等位基因，而G1替代肽表示蛋白质来源于G1等位基因，和G2替代肽表示蛋白质来源于G2等位基因。
如本文所用，“共同替代”肽或“质控肽”或“质控替代肽”是具有在感兴趣的基因座处的DNA序列可能变化时不变化的独特的氨基酸序列的肽。因此，如本文所用，“共同替代肽”或“质控肽”包括野生型等位基因以及所有被询问的等位基因所共有的肽序列。共同替代肽的序列的确定不会随感兴趣的基因座处的基因型的变化而变化，并因此可以用作内部对照以区分真实的阴性信号和样品处理错误。
如本文所用，“蛋白质变体”是具有不同于最常见或野生型序列的氨基酸序列的蛋白质。
如本文所用，“蛋白质组学谱”是可用于确定个体的在感兴趣的基因座处的基因型的替代肽的谱。
通过LC-MS/MS分析APOL1基因型
因此，本发明的实施方案涉及用于基因型的蛋白质组学分析的方法和系统。本发明可以以多种方式实施。
通过LC-MS/MS分析等位基因特异性蛋白质组学谱的方法
在一个实施方案中，本发明包括一种用于确定受试者的基因型的方法，所述方法包括：将体液提供到基底上并干燥；使干燥的体液经历消化以从其中包含的蛋白质变体产生等位基因特异性替代肽；使用质谱检测样品中存在的等位基因特异性替代肽；并基于等位基因特异性替代肽的蛋白质组学谱确定基因型。因此，在一个实施方案中，提供了一种用于确定受试者中感兴趣的基因的基因型的方法，所述方法包括：提供来自所述受试者的体液，所述体液包含来源于所述感兴趣的基因的蛋白质；将所述体液沉积在固体基底上，其中允许所述体液干燥以产生干燥的样品；消化所述干燥的样品以产生针对所述蛋白质的至少一种等位基因特异性替代肽；使用质谱检测经消化的样品中存在的至少一种等位基因特异性替代肽；并且基于至少一种等位基因特异性替代肽的存在或不存在或量来确定所述受试者的基因型。在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括测量对于所述感兴趣的基因的每种基因型所共有的至少一种共同替代肽的量。此外，在一个实施方案中，通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析至少一种等位基因特异性替代肽。在某些实施方案中，所述方法可以进一步包括通过检测等位基因特异性替代肽来测量由感兴趣的基因等位基因编码的一种或多种蛋白质变体的量。在某些实施方案中，所述方法可以进一步包括检测由感兴趣的基因的等位基因编码的所有蛋白质变体所共有的至少一种共同替代肽的存在。因此，在某些实施方案中，蛋白酶消化可产生对于该基因存在的各种等位基因所共有的共同替代肽(或质控肽)。在一个实施方案中，通过将针对至少一种等位基因特异性替代肽的测量的响应与针对至少一种共同替代肽的测量的响应进行比较来确定至少一种等位基因特异性替代肽的存在或不存在。
在一些实施方案中，用蛋白酶胰蛋白酶进行消化。或者，其他蛋白酶和化学物质可用于蛋白质水解。此外，在一些实施方案中，来源于感兴趣的基因的蛋白质在消化之前被变性以促进消化。
在某些情况下，可以使用一种或多种内标。在一些实施方案中，可以在消化步骤之前添加内标。例如，可通过将针对至少一种等位基因特异性替代肽的测量的响应与针对至少一种等位基因特异性替代肽的添加至样品中的稳定的同位素标记的类似物的测量的响应进行比较来确定至少一种等位基因特异性替代肽的存在或不存在。另外和/或可替代地，可以通过将针对共同替代肽的测量的响应与针对稳定的同位素标记的共同替代肽的响应进行比较来确定至少一种共同替代肽的存在或不存在。
在一个实施方案中，在MS/MS过程中针对每个肽产生碎片离子。在碎片离子来自C末端的情况下，碎片离子可以表示为“y”。在碎片离子来自N末端的情况下，碎片离子可以表示为“b”。另外，碎片离子可以通过氨基酸残基的数量来鉴定。例如，对于具有序列LNILNNNYK(SEQ ID NO.4)的肽，碎片离子y4将具有序列NNYK。在一个实施方案中，结果可以报告为轻(未标记的)肽(例如，在蛋白质的胰蛋白酶消化后)的峰面积比(PAR)相对重(稳定的同位素标记的)肽的PAR。这可以为未标记的胰蛋白酶肽提供标准化响应。
所述方法可以应用于任何蛋白质。在一个实施方案中，蛋白质是ApoL1。例如，对于ApoL1，等位基因特异性替代肽可以具有来源于野生型等位基因(SEQ ID NO.1)的氨基酸序列LNILNNNYK(SEQ ID NO.4)，或者可以具有来源于G1等位基因(SEQ ID NO.2)的氨基酸序列LNMLNNNYK(SEQ ID NO.5)，或者可以具有来源于G2等位基因(SEQ ID NO.3)的氨基酸序列LNILNNK(SEQ ID NO.6)。同样对于ApoL1，共同替代肽可以具有SETAEELK(SEQ ID NO.7)和/或VAQELEEK(SEQ ID NO.8)的氨基酸序列，其中共同替代肽存在于野生型、G1或G2等位基因中的每一个中。对于这些肽的测量，质谱可以测量表3中的至少一种转变。此外，对于ApoL1，可以通过比较针对至少一种等位基因特异性替代肽的测量的响应与针对至少一种等位基因特异性替代肽的表2中列出的稳定的同位素标记的类似物的测量的响应来确定至少一种等位基因特异性替代肽的存在或不存在。
如本文所公开的，可以使用各种体液。在某些情况下，体液可以是血浆或血液。在一些实施方案中，体液可用于产生干燥的血浆。或者，体液可包括干燥的血液、干燥的尿液或干燥的唾液中的至少一种。
此外，在一些实施方案中，可以在电离用于质谱之前对样品进行纯化步骤。纯化步骤可以包括色谱。如本文所讨论的，在某些实施方案中，色谱包括高效液相色谱(HPLC)。LC步骤可包括一个LC分离或多个LC分离。在一个实施方案中，色谱分离包括提取和分析液相色谱。另外或替代地，可以使用高湍流液相色谱(HTLC)(也称为高通量液相色谱)。
纯化可包括除HPLC或其他类型的色谱分离技术以外的步骤。在替代实施方案中，所述方法可以包括液液萃取、支撑液萃取或稀释中的至少一种。在一个实施方案中，将样品稀释到可用于LC和/或MS(例如，LC-MS/MS或2D-LC-MS/MS)的溶剂或溶剂混合物中。
作为非限制性实例，本公开内容的方法已经应用于ApoL1基因型的蛋白质组学分析。野生型(WT)等位基因和风险变异等位基因(G1和G2)编码ApoL1，其在384位或388-389位具有独特的氨基酸序列(图1)。胰蛋白酶消化ApoL1后(例如，图1和2)，每个变体形式因此产生来源于残基382至390(在G2缺失的情况下为382至388)的独特的蛋白水解肽，其可以作为替代物通过LC-MS/MS针对相应ApoL1变体的存在进行检测(图6和图7)。因此，使用本文公开的系统和方法，可以通过干燥的血液或干燥的血液级分的分析对在全血中循环的ApoL1的蛋白质序列中的相应突变进行鉴定，从而确定ApoL1的三个遗传变体-野生型(WT)、G1和G2(图3)。
图3显示了与具有干燥的血斑但没有从血液中分离的血浆的纸相比，具有使用血浆分离器条分离出的干燥的红细胞和干燥的血浆的区域的基底(参见图3左侧小图，分别是上面的和下面的图)。图3的右侧显示了随时间的分离程度。尽管干燥的血斑是临床分析中常用的样品，但分析可能会受到来源于红细胞(例如血红蛋白)的干扰。由于血浆和细胞通过纸的不同迁移，层流纸可用于从细胞成分中分离出沉积的血液的血浆级分，从而得到可以干燥和测定的无细胞血浆级分。
一种或多种替代肽的鉴定可通过首先使干燥的血液级分(即干燥的血浆)变性，然后进行胰蛋白酶消化以产生特异于ApoL1的三种变体形式的蛋白水解替代肽来实现(图4)。然后可以通过LC-MS/MS直接分析经消化的血浆，以确定各个替代肽的存在或不存在，以推断相关ApoL1变体的存在或不存在(图4和图5)。
还可以监测所有三种(即，WT、G1和G2)ApoL1变体之间共有的两种共同替代肽(即，质控肽)以用于对样品处理进行质控(图2)。例如，可能存在另一个迄今未知的ApoL1变体，其编码残基382或390之间的不同氨基酸突变。如果个体对该突变纯合(或对于两个此类未知突变是杂合的)，这将导致没有可检测到的变体特异性替代肽。为了将其与样品处理错误区分开来，对通过胰蛋白酶消化产生的与变体特异性替代肽相邻的另外两个替代肽(无论ApoL1变体如何，在所有经过适当处理的样品中其都应可检测到)进行了监测。因此，对这两个“质控替代肽”中的一个或多个的检测证实了适当的样品处理，使得可以随后对变体特异性替代肽检测进行可靠的解释，而无需担心经处理的样品的完整性。
替代肽(变体或质控)的存在或不存在可以通过将替代肽的测量的响应与其稳定的同位素标记的类似物的响应进行比较来确定，该稳定的同位素标记的类似物作为内标在胰蛋白酶消化之前添加至样品中。基于检测到的替代肽的模式，可以确定样品/个体的基因型。
图4显示了根据本公开内容的实施方案的使用干燥的血浆(来自纸基底的3x1/4”ID的圆形冲床)(例如，采样纸)来确定ApoL1基因型的方法。可以将样品(即干燥的血浆)添加至消化缓冲液。在高温短暂孵育(例如56℃下30分钟)以使样品中存在的蛋白质变性后，可添加胰蛋白酶和内标并允许进行消化(例如37℃下30分钟)。接下来可以添加甲酸以终止胰蛋白酶消化并沉淀酸不溶性物质(即脱氧胆酸盐)，并将上清液的等分式样添加至LC-MS/MS系统。
然后可以通过高通量LC-MS/MS分析样品。图5显示了用于高通量蛋白质组学基因分型的系统。在一个实施方案中，优化LC方法参数以确保每种替代肽的同量异位干扰物的色谱分离，这导致具有3.5分钟的总运行时间的LC方法。在多重LC系统例如ARI TranscentTMTLX-4上使用时，进样可与每1.5分钟交错的进样并行进行，以改善质谱分析的工作周期。
图6显示了根据本公开内容的实施方案的ApoL1的替代肽检测模式。因此，纯合野生型(WT/WT)的受试者将具有WT肽以及两个共同肽(SETAEELK和VAQELEEK)。类似地，对G1等位基因(G1/G1)或G2等位基因(G2/G2)纯合的受试者将分别具有G1或G2肽，以及两个共同肽(SETAEELK和VAQELEEK)。对WT、G1或G2杂合的受试者将表现出所示的模式(图6)。
图7显示了根据本公开内容的实施方案的ApoL1基因型的定性分配。显示了来源于所有六种潜在基因型的个体的示例色谱图。使用两个SRM转换检测所有五种替代肽。当个体中存在ApoL1变体时，相应的变体特异性替代肽在色谱图中清晰可见/被检测到。当个体中不存在ApoL1变体时，相应的变体特异性替代肽在色谱图中明显不可见/未检测到。值得注意的是，两种质控替代肽存在于所有六个个体中，而与基因型无关。
图8显示了根据本公开内容的实施方案的ApoL1基因型的半定量评估。在该实验中，对于给定的变体特异性替代肽，基于相应色谱图的可视化解释，将数百个样品和样品库作为液体血浆进行分析，并定性分配为阴性(三角形/菱形)或阳性(圆形)。基于与在相关的阴性样品中测量的重同位素标记的等位基因特异性肽(轻:重肽峰面积比，PAR)相比在y轴上显示为未标记的等位基因特异性肽的片段(例如野生型等位基因特异性肽的y6+或y5+)的峰面积比的每个转变的标准化响应，将检测限计算为平均标准化响应加上四(4)个标准偏差，在检测限以下，样品将被分类为确定性阴性。变体特异性替代肽的确定性阳性检测的阈值被计算为相关阴性样品中的平均标准化响应加上12个标准偏差。
图9显示了使用干燥的血浆相对液体血浆生物样品的DNA测序和蛋白质组学基因分型的比较。从209位非裔美国人供体那里获得了匹配的液体和干燥的血浆样品用于蛋白质组学分析，以及获得全血用于Sanger测序。通过Sanger测序确定的每个供体的基因型与从液体和干燥的血浆样品通过蛋白质组学分析分配的基因型完全一致，表明蛋白质组学分析对于感兴趣的生物标志物的LC-MS/MS/分析是可行的选择。
图10显示了根据本公开内容的实施方案的ApoL1野生型(WT)肽作为血红蛋白浓度的函数的评估。在一些实施方案中，血红蛋白可以以两种重要方式干扰感兴趣的生物标志物的检测。首先，在较高血红蛋白浓度下，对于WT-替代肽在两个SRM转变中的一个中观察到了同量异位干扰物，这混淆了WT阴性基因型(即G1/G1、G2/G2或G1/G2)样品的解释。第二，观察到基质效应，由于离子抑制其导致较低的分析响应。
图11显示了根据本公开内容的实施方案的ApoL1 WT、G1和G2肽作为固定在滤纸上并从1/4英寸冲床收获的干燥的血浆的函数的滴定。评估了提供对液体血浆的等价分析响应所需的干燥的血浆冲床的横截面和数量，以确保液体血浆和干燥的血浆的等价测定性能。考虑了不同的横截面，以确定哪种对于以96孔板的形式实施最实用。使用以下基因型评估了三个个体：WT/WT、WT/G1和WT/G2。相对于液体血浆，每种替代肽的相对响应在个体和基因型之间是一致的，表明干燥的血浆中的响应恢复仅与所分析的总表面积有关。基于这些分析，得出的结论是，对于野生型肽(WT)以及G1和G2，可以从96至126mm2的干燥的血浆中获得20uL液体血浆的等价分析响应。WT图显示了可以使用的其他切出形状的示例。信号通常与每个样品使用的切出量成正比。
图12显示了根据本公开内容的实施方案的使用液体血浆或干燥的血浆的胰蛋白酶消化时间过程。在0至120分钟之间的时间过程分析中，评估了在消化液体和干燥的血浆过程中每种替代肽的形成。在3至120分钟之间的9个时间点采集液体血浆消化的样品。图谱指示每个ApoL1变体的消化从液体血浆样品和干燥的血浆样品以相似的方式进行。因此，约2小时后实际上有100％的消化。
图13显示了根据本公开内容的实施方案的来自干燥的血浆的蛋白质变体测量的稳定性。可以看出，即使在23摄氏度(正常存储条件)或37摄氏度下28天后，样品也提供替代肽的相似的测量的响应。
用于LC-MS/MS蛋白质组学基因分型的系统
其他公开的实施方案包括系统。例如，公开了一种用于确定受试者中感兴趣的基因型的蛋白质组学谱的系统，该系统包括：用于提供测试样品的装置，所述测试样品包含来源于感兴趣的遗传基因座的蛋白质或等位基因特异性替代肽；用于使样品经受蛋白酶消化蛋白酶以产生等位基因特异性替代肽的工作站；任选地，用于色谱纯化一种或多种等位基因特异性替代肽的工作站；和用于通过质谱分析一种或多种等位基因特异性替代肽以确定生物样品中等位基因特异性替代肽的存在或量的工作站。在一个实施方案中，公开了一种用于确定受试者中感兴趣的基因的基因型的系统，该系统包括：用于提供包含来源于所述感兴趣的基因的蛋白质的干燥的体液的装置；用于使干燥的体液经受消化以产生针对该蛋白质的所述至少一种等位基因特异性替代肽和任选地所述至少一种共同替代肽的工作站；任选地，用于色谱纯化至少一种等位基因特异性替代肽的工作站；和用于通过质谱分析所述至少一种等位基因特异性替代肽以确定生物样品中所述至少一种等位基因特异性替代肽的存在或量的工作站。在一个实施方案中，蛋白质是ApoL1。
在某些实施方案中，用于提供生物样品的装置可以包括在基底上固定红细胞并将其与血浆分离的装置。该系统可以进一步包括用于添加针对蛋白质的所述至少一种等位基因特异性替代肽和任选地所述至少一种共同替代肽的稳定的同位素标记的内标的工作站。
此外，如下面详细描述的，用于质谱的工作站可以包括串联质谱仪。在一个实施方案中，质谱以电喷雾电离(ESI)模式操作。
此外，用于色谱的工作站可以包含单独的或一起使用的各种类型的色谱，例如但不限于液-液色谱和/或高效液相色谱(HPLC)和/或本文所述的其他类型的色谱。
此外在某些实施方案中，工作站中的至少一个是由计算机自动化和/或控制的。例如，如本文所述，在某些实施方案中，至少一些步骤是自动化的，使得几乎不需要人工干预。
在一个实施方案中，用于色谱分离的工作站包括至少一个执行液相色谱(LC)的装置。在一个实施方案中，用于液相色谱的工作站包括用于提取色谱的柱子。另外地或可替代地，用于液相色谱的工作站包括用于分析色谱的柱子。在某些实施方案中，用于提取色谱和分析色谱的柱子包括单个工作站或单个柱子。例如，在一个实施方案中，液相色谱用于从样品中的其他组分(其在提取或稀释样品后与感兴趣的生物标志物共纯化)中纯化感兴趣的生物标志物。
系统还可包括用于通过质谱分析色谱分离的一种或多种感兴趣的生物标志物以确定测试样品中一种或多种生物标志物的存在或量的工作站。在某些实施方案中，使用串联质谱(MS/MS)。例如，在某些实施方案中，用于串联质谱的工作站包括AppliedBiosystems API5500或API6500三重四极杆或thermo Q-Exactive质谱仪。
系统还可包括用于部分纯化或变性来自生物样品的肽和/或蛋白质和/或稀释样品的工作站。在一个实施方案中，用于提取的工作站包括用于免疫亲和富集蛋白质变体或所得替代肽的工作站。用于免疫亲和富集的工作站可包括用于操作、洗涤和剥除结合免疫亲和试剂的固体吸附剂的装置和试剂。在某些情况下，使用同位素标记的内标来标准化程序中可能发生的生物标志物的损失。
在某些实施方案中，本发明的方法和系统可包括多个液相色谱步骤。因此，在某些实施方案中，使用二维液相色谱(LC)。例如，在一个实施方案中，本发明的方法和系统可包括将样品或来源于样品的肽从LC提取柱转移至分析柱。在一个实施方案中，从提取柱到分析柱的转移是通过中心切割技术完成的。在另一个实施方案中，通过色谱聚焦技术进行从提取柱到分析柱的转移。可替代地，可以通过柱切换技术完成从提取柱到分析柱的转移。这些转移步骤可以手动完成，也可以是在线系统的一部分。
本文描述了可用于提取或分析液相色谱的包含固定相和流动相的各种柱子。用于提取液相色谱的柱子可以取决于感兴趣的生物标志物而变化。在一些实施方案中，提取柱是官能化的二氧化硅或聚合物-二氧化硅杂合物或聚合物颗粒或整体式二氧化硅固定相，例如Poroshell SBC-18柱。用于分析液相色谱的柱子可以取决于分析物和/或用于提取液相色谱步骤的柱子而变化。例如，在某些实施方案中，分析柱包含平均直径为约5μm的颗粒。
如本文所述，在某些实施方案中，质谱仪可以包括串联质谱仪(MS/MS)。例如，在本发明的方法和系统的一个实施方案中，串联质谱包括三重四极杆串联质谱仪。在其他实施方案中，串联质谱仪可以是混合质谱仪，例如四极杆-oribtrap或四极杆飞行时间质谱仪。
串联MS/MS可以以多种模式运行。在一个实施方案中，串联MS/MS质谱仪以电喷雾电离(ESI)模式操作。在一些实施方案中，分析物和内标的定量以选择的反应监测模式(SRM)进行。
在某些实施方案中，本发明的系统和方法可以提供多重或高通量测定。例如，本发明的某些实施方案可包括用于蛋白质组学分析的多重液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)或二维或串联液相色谱串联质谱(LC)-LC-MS/MS)方法。
在一些实施方案中，使用串联MS/MS系统。如本领域技术人员已知的，在串联MS质谱法中，在电离之后选择前体离子，并且对该前体离子进行碎片化以产生产物(即，碎片)离子，借此使一种或多种产物离子经受第二阶段的质量分析以用于检测。因此，可以针对与多于一种基因型相对应的肽(即，ApoL1、WT、G1、G2和共同肽)分析样品，因为在串联质谱方法中，肽具有不同的前体离子和产物离子(即，不同的转变)。
然后可以基于由串联MS测量的特征性转变的量来检测感兴趣的分析物。在一些实施方案中，串联质谱仪包括三重四极杆质谱仪。在一些实施方案中，串联质谱仪以阳离子电喷雾电离(ESI)模式操作。或者，可以使用其他电离方法诸如基质辅助激光解吸/电离(MALDI)进行电离。在一些实施方案中，分析物和内标的检测是以选择的反应监测模式(SRM)进行的。
在其他实施方案中，在程序中的适当点(例如，在消化之前)，将标记有重稳定同位素的替代肽添加至样品中，以校正任何步骤中的不完全消化和/或样品损失。
在替代实施方案中，在电离期间用于加热样品的温度可以在100℃至约1000℃的范围内，并且包括其中的所有范围。在一个实施方案中，在以电喷雾模式使用的质谱仪的界面内在500℃±100℃下进行脱水步骤。在一个实施方案中，将样品在界面处加热几微秒以发生脱水。在替代实施方案中，加热步骤进行少于1秒，或少于100毫秒(msec)，或少于10毫秒，或少于1毫秒，或少于0.1毫秒，或少于0.01毫秒，或更少0.001毫秒。
图14显示了本发明的系统的实施方案。如图14所示，该系统可以包括用于将可以包含感兴趣的生物标志物的样品处理到采样容器(例如96孔微量滴定测定孔)中的工作站(104)。在一个实施方案中，将样品等分到一个或多个容器中以促进蛋白酶消化和/或富集和/或样品稀释。用于等分的工作站可以包括用于丢弃未在分析中使用的生物样品部分的容器。
该系统可以进一步包括用于向样品添加内标的工作站(108)。在一个实施方案中，内标包括用重的、稳定的同位素标记的感兴趣的生物标志物。因此，用于添加内标的工作站可以包括安全特征以促进向样品添加同位素标记的内标溶液。在一些实施方案中，该系统还可以包括用于富集、蛋白质沉淀和/或样品稀释的工作站(110)。
该系统还可包括用于样品的液相色谱(LC)的工作站。如本文所述，在一个实施方案中，用于液相色谱的工作站可包括提取液相色谱柱(112)。用于液相色谱的工作站可以包括包含固定相的柱子，以及包含用作流动相的溶剂的容器或器皿。在一个实施方案中，流动相包含甲醇和水、乙腈和水或其他可与水性挥发性缓冲溶液混溶的溶剂的梯度。因此，在一个实施方案中，工作站可以包括适当的管线和阀，以调节施加至一个或多个柱子的个体溶剂的量。此外，工作站可以包括用于从LC中去除和丢弃不包含感兴趣的生物标志物的那些级分的装置。在一个实施方案中，将不包含感兴趣的生物标志物的级分连续地从柱子中去除，并送至废料器皿中用于去污并丢弃。
该系统还可包括分析LC柱(114)。分析柱可促进进一步纯化和浓缩感兴趣的生物标志物，这可能是进一步表征和定量所需要的。
此外，该系统可以包括用于表征和定量等位基因特异性替代肽的工作站。在一个实施方案中，该系统可包括用于源内电离的工作站(115)和用于生物标志物的质谱(MS)的工作站(116)。在一个实施方案中，用于质谱的工作站包括用于串联质谱(MS/MS)的工作站。此外，用于表征和定量的工作站可以包括用于数据分析的工作站(118)和/或计算机(102)以及用于分析MS/MS结果的软件。在一个实施方案中，分析包括等位基因特异性替代肽的鉴定和定量。
在一些实施方案中，一个或多个纯化或分离步骤可以“在线”进行。如本文所用，术语“在线”是指以如下方式执行的纯化或分离步骤：将测试样品放置(例如注射)到系统中，其中系统的各个组件可操作地连接并且在一些实施方案中彼此流体连通。在线系统可以包括用于从一个容器中取出样品的等分试样并将这些等分试样转移到另一容器中的自动进样器。例如，可以使用自动进样器在提取后将样品转移到LC提取柱上。另外地或可替代地，在线系统可以包括一个或多个进样入口，用于将从LC提取柱分离的级分注入到LC分析柱上。另外地或可替代地，在线系统可以包括一个或多个用于将LC纯化的样品注入MS系统的进样入口。因此，在线系统可以包括一个或多个柱子，包括但不限于，提取柱，包括HTLC提取柱，并且在一些实施方案中，包括分析柱。另外或可替代地，该系统可以包括检测系统，例如质谱仪系统。在线系统还可以包括一个或多个泵；一个或多个阀；和必要的管道。在这种“在线”系统中，感兴趣的测试样品和/或分析物可以从系统的一个组件传递到另一组件而无需离开系统，例如，无需进行采集然后放置在系统的另一个组件中。
在一些实施方案中，在线纯化或分离方法可以是自动化的。在这样的实施方案中，一旦设置和启动过程，就可以在不需要操作员干预的情况下执行步骤。因此，在各种实施方案中，该系统或系统的一部分可以由一个或多个计算机(102)控制。因此，在某些实施方案中，本发明可以包括用于控制系统的各种组件(包括泵、阀、自动进样器等)的软件。这样的软件可用于通过精确定时的样品和溶质添加以及流速来优化提取过程。
尽管方法中的一些或全部步骤和构成该系统的工作站可以是在线的，但在某些实施方案中，一些或全部步骤可以“离线”执行。与术语“在线”相反，术语“离线”是指与先前和/或随后的纯化或分离步骤和/或分析步骤分开进行的纯化、分离或提取程序。在这样的离线程序中，通常将感兴趣的分析物例如在提取柱上或通过液体/液体萃取与样品基质中的其他组分分离，然后采集以用于随后引入到另一色谱或检测器系统中。离线程序通常需要操作员手动干预。
在某些实施方案中，液相色谱可以包括高湍流液相色谱或高通量液相色谱(HTLC)。参见，例如，Zimmer等人,J.Chromatogr.A 854:23-35(1999)；还参见美国专利号5,968,367；5,919,368；5,795,469；和5,772,874。传统的HPLC分析依赖于柱填料，其中样品流过柱子的层流是从样品中分离感兴趣的分析物的基础。在这样的柱中，分离是扩散过程。湍流(诸如由HTLC柱和方法所提供的)可以提高传质速率，从而改善所提供的分离特性。在一些实施方案中，高湍流液相色谱(HTLC)(单独使用或与一种或多种纯化方法结合)可用于在质谱之前纯化感兴趣的生物标志物。在这样的实施方案中，可以使用捕获分析物的HTLC提取盒提取样品，然后进行洗脱并在电离之前在第二HTLC柱上或在分析HPLC柱上色谱分离。因为可以以自动化方式连接这些色谱程序中涉及的步骤，所以可以使分析物纯化过程中对操作员参与的要求最小化。此外，在一些实施方案中，使用高湍流液相色谱样品制备方法可以消除对包括液体-液体萃取在内的其他样品制备方法的需要。因此，在一些实施方案中，可以将测试样品例如生物流体直接放置(例如注射)到高湍流液相色谱系统上。
例如，在典型的高湍流或湍流液相色谱系统中，可以将样品直接注射到填满大(例如，>25微米)颗粒的窄(例如，0.5mm至2mm内径乘以20至50mm长)柱子上。当对柱子施加流速(例如，每分钟3-500mL)时，柱子的相对窄的宽度导致流动相的速度增加。存在于柱子中的大颗粒可以防止增加的速度引起背压并促进颗粒之间形成涡流，从而在柱子内产生湍流。
在高湍流液相色谱中，分析物分子可迅速与颗粒结合，并且通常不会沿柱子的长度散开或扩散。这种减少的纵向扩散通常提供感兴趣的分析物从样品基质的更好和更快的分离。此外，柱子内的湍流减小了通常在分子行进通过颗粒时在分子上产生的摩擦力。例如，在传统的HPLC中，最接近颗粒行进的分子沿柱子的移动比在颗粒之间的路径中心流过的那些更慢。流速的这种差异导致分析物分子沿柱子的长度扩散。当将湍流引入柱子中时，分子上来自颗粒的摩擦力可忽略不计，从而减少纵向扩散。
本发明的方法和系统可以使用质谱来检测和定量感兴趣的生物标志物。如本文所用，术语“质谱”或“MS”通常是指基于离子的质荷比或“m/z”来过滤、检测和测量离子的方法。在MS技术中，一个或多个感兴趣的分子被电离，以及随后将这些离子引入质谱仪，在质谱仪中，由于电场的组合，离子遵循空间中取决于质量(“m”)和电荷(“z”)的路径。
在某些实施方案中，质谱仪使用“四极杆”系统。在“四极杆”或“四极杆离子阱”质谱仪中，振荡射频(RF)场中的离子经历与电极之间施加的直流(DC)电势、RF信号的振幅和m/z成比例的力。可以选择电压和振幅，使得只有具有特定m/z的离子才能通过四极杆的长度，而其他所有离子都被偏转。因此，四极杆仪器既可以充当注入到仪器中的离子的“质量过滤器”也可以充当“质量检测器”。
在某些实施方案中，使用串联质谱。参见，例如，题为“Methods and Apparatusfor Tandem Mass Spectrometry”的美国专利号6,107,623，其全部内容通过引用并入本文。此外，可以通过使用“串联质谱”或“MS/MS”来增强MS技术的选择性。串联质谱(MS/MS)是一组质谱方法的名称，其中将从样品产生的“母体或前体”离子破碎以产生一个或多个“碎片或产物”离子，随后通过第二个MS程序对其进行质量分析。MS/MS方法可用于分析复杂混合物，尤其是生物样品，部分原因是MS/MS的选择性可以最小化在分析之前进行大量样品净化的需要。在MS/MS方法的实例中，前体离子从样品产生并通过第一质量过滤器以选择具有特定质荷比的那些离子。然后，通常通过在合适的离子容纳装置中与中性气体分子发生碰撞，使这些离子破碎，以生成产物(碎片)离子，其质谱由电子倍增检测器记录。如此产生的产物离子质谱指示了前体离子的结构，并且质量过滤的两个阶段可以消除复杂混合物的常规质谱中存在的来自干扰物质的离子。
在一个实施方案中，本发明的方法和系统使用三重四极杆MS/MS(参见，例如，Yost,Enke in Ch.8of Tandem Mass Spectrometry,Ed.McLafferty,pub.John Wiley andSons,1983)。三重四极杆MS/MS仪器通常由两个四极杆质量过滤器组成，这些过滤器由碎裂装置隔开。在一个实施方案中，该仪器可以包括仅以RF模式操作作为离子容纳或传输装置的四极杆质量过滤器。在一个实施方案中，四极杆可进一步包括1毫托至10毫托压力下的碰撞气体。许多其他类型的“混合”串联质谱仪也是已知的，并且可以在本发明的方法和系统中使用，包括轨道阱分析仪和四极杆过滤器的各种组合。这些混合仪器通常包括用于第二阶段的质量分析的高分辨率的轨道阱分析仪(参见，例如，Hu Q,Noll RJ,Li H,Makarov A,Hardman M,Graham Cooks R.The Orbitrap:a new mass spectrometer.J MassSpectrom.2005；40(4):430-443)。使用高分辨率质量分析仪可能会非常有效地将化学噪音降低到非常低的水平。
对于本发明的方法和系统，可以使用多种方法来产生离子，包括但不限于电子电离、化学电离、快速原子轰击、场解吸和基质辅助激光解吸电离(“MALDI”)、表面增强激光解吸电离(“SELDI”)、光子电离、电喷雾电离和电感耦合等离子体。
在那些实施方案中，例如MS/MS，其中前体离子被分离以用于进一步的碎片化，碰撞诱导的解离(“CID”)可以被用来产生碎片离子以用于进一步的检测。在CID中，前体离子通过与惰性气体的碰撞获得能量，然后通过被称为“单分子分解”的过程破碎。必须在前体离子中沉积足够的能量，以使离子中的某些键可以由于振动能量的增加而断裂。
在一些实施方案中，为了获得所需的分析选择性和灵敏度，本文公开的2D-LC-MS/MS方法包括多重样品制备程序。例如，在某些实施方案中，使用在每个孔或多个样品管中具有透析膜的96孔板进行样品的透析。另外地或可替代地，多重系统可以包括交错的多重LC和MS样品入口系统。此外，本发明的方法和系统可以包括多个柱切换方案，和/或中心切割(LC-LC或2D-LC)技术，和/或MS检测之前的LC分离。在一些实施方案中，本发明的方法和系统可以包括与串联质谱仪(MS/MS)系统(例如，三重四极杆MS/MS系统)偶联的多重二维液相色谱系统。这样的实施方案提供了交错的、并行的样品输入到MS系统中。
因此，可以将多个样品各自施加到单独的提取柱上。一旦样品已各自流过提取柱，就可以将它们各自直接转移(例如，通过柱切换)至第二组分析柱。当每个样品从分析柱洗脱时，可以将其转移到质谱仪中用于鉴定和定量。
可以通过本文公开的LC-MS/MS和2D-LC-MS/MS方法同时或顺序地分析多种分析物。适于通过本文公开的方法进行分析的示例性分析物包括但不限于肽、类固醇激素、核酸、维生素等。在回顾本文公开的主题之后，本领域的普通技术人员将认识到，可以通过本文公开的方法和系统来分析其他类似的分析物。因此，在替代实施方案中，所述方法和系统可用于定量类固醇激素、蛋白质和肽激素，肽和蛋白质生物标志物，滥用的药物和治疗性药物。例如，可以使用模块化方法开发策略对每种分析物的关键参数进行优化，以提供经过高度调整的生物分析测定。因此，某些步骤可以取决于如本文公开进行测量的分析物而改变。
此外，本发明的方法和系统的实施方案可以使用少得多的样品提供对于测量的许多分析物可获得的等价灵敏度。例如，通过使用此优化程序，对于干燥的血浆，约10纳摩尔/L的ApoL1的LLOQ相当于约20μL的液体血浆。这样小的样品量使采样(通常通过手指刺穿)变得更加容易。
实施例
在以下实施例中阐述了来自本文公开的方法的分析验证和标准操作程序的其他数据。
已经包括以下实施例以给本领域的普通技术人员提供指导以用于实施本文公开的主题的代表性实施方案。鉴于本公开内容和本领域技术人员的一般水平，本领域技术人员可以理解，以下实施例仅是示例性的，并且在不脱离本文公开的主题的范围的情况下可以采用许多改变、修改和变更。
实施例1
用于ApoL1基因分型的LC-MS/MS
通过LC-MS/MS测量了ApoL1的两种遗传变异(称为G1和G2)以及野生型等位基因。
除了标准的血清和血浆样品外，基因测试还利用在将血液沉积在基底上的血液采集装置上获得的样品。这些采集装置提供了一种计量机制，其将确定量的血液点样到血浆分离条上。这种自动化旨在为患者提供更简单的采样机制。干燥的血液是替代性的样品采集过程，其使用手指棒和血浆分离条代替血清或血浆管的静脉穿刺采集。采集条的功能核心是特殊的血液分离器材料，其限制细胞从施加部位的迁移，同时允许血浆的横向流动。这种选择性迁移将侧流材料中的细胞和血浆分离开来，类似于从血清分离管的离心获得的分离。可以使用已建立的实验室程序分析来自分离材料的标准化穿孔部分的干燥的血浆，代替液体血浆或血清。
通过鉴定全血中循环的ApoL1的蛋白质序列中的相应突变确定ApoL1的三种遗传变体-野生型(WT)、G1和G2。这是通过首先使血清或血浆样品变性，然后通过胰蛋白酶消化以产生特异于ApoL1的三种变体形式的蛋白水解替代肽来实现的。然后，通过LC-MS/MS直接分析消化的血浆，以确定相应替代肽的存在或不存在，以推断相关ApoL1变体的存在或不存在。还对所有三个ApoL1变体中共有的两个替代肽进行了监测，以用于质控样品处理。通过比较替代肽的测量的响应与其稳定的同位素标记的类似物的响应来确定替代肽的存在或不存在，所述稳定的同位素标记的类似物在胰蛋白酶消化之前作为内标添加至样品等分试样中。基于检测到的替代肽的模式，确定样品/个体的基因型。
测定总结和替代肽特异性
表1-替代肽特异性
Figure BDA0002806150510000291
Figure BDA0002806150510000301
*G1风险等位基因包含两种单核苷酸变体1024A>G(Ser342Gly)和1152T>G(Ile384Met)，其是几乎完全不平衡的(即在大多数时间一起出现)。这种LC-MS/MS测定不测试1024A>G(Ser342Gly)的存在。
内标储备溶液
下面的合成的、稳定的同位素标记的肽的内标储备材料商购(New EnglandPeptide)为用于氨基酸分析的0.1mg(100μg，净)的干燥的等分试样。
表2-内标肽
Figure BDA0002806150510000302
通过将0.4mL具有0.1％甲酸的0.001％的两性洗涤剂3-16直接添加至单个0.1mg的小瓶中制得～200μg/mL的溶液来制备了各个内标储备溶液。在使用前，将这些内标储备溶液孵育15分钟，并且如果未在4小时内使用，则在-70℃冷冻。
使用前，使用NanoDropTM2000c分光光度计在205nm处通过UV吸光度确定每种储备溶液的准确浓度，其中在340nm处进行基线校正。用具有0.1％甲酸的0.001％的两性洗涤剂3-16进行空白处理后，在NanoDropTM基座上以至少10次重复对每个储备液进行测量。平均吸光度(A205)应在0.3至1.2，具有小于3％的CV，并用于基于0.1cm的路径长度(b)和0.031mL/μg/cm的消光系数(ε205)根据以下等式来计算储备液浓度(C储备液)：
Figure BDA0002806150510000311
对照准备
阴性对照–阴性对照为30mg/mL人血清白蛋白(HSA)。
阳性对照：阳性对照是男性血浆库(Golden West Biologicals，目录号MSG15000M)。该对照用作WT变体的阳性对照，并且用作G1和G2变体的“弱阳性”对照。
WT/G1 EDTA血浆对照A：合并来自WT/WT、G1/G1和WT/G1个体的EDTA血浆样品，以确保G1和WT变体的平衡比例。该对照用作WT和G1变体的阳性对照，同时用作G2变体的阴性对照。
WT/G2 EDTA血浆对照B：合并来自WT/WT、G2/G2和WT/G2个体的EDTA血浆样品，以确保G2和WT变体的平衡比例。该对照用作WT和G2变体的阳性对照，同时用作G1变体的阴性对照。
G1/G2 EDTA血浆对照C：合并来自G1/G1、G2/G2和G1/G2个体的EDTA血浆样品，以确保G1和G2变体的平衡比例。该对照用作G1和G2变体的阳性对照，同时用作WT变体的阴性对照。在用于建立测定间重复性的前20个批次中的每一个中，包括以下全血QC样品各自的至少一个重复，作为在将180μL沉积到横向流动基底上后至少2小时产生的以从血浆分离干燥的血细胞的干冲床。
WT/G1 LiHep全血对照A：合并来自WT/WT、G1/G1和WT/G1个体的肝素锂全血样品，以确保G1和WT变体的平衡比例。该对照用作WT和G1变体的阳性对照，同时用作G2变体的阴性对照。
WT/G2 LiHep全血对照B：合并来自WT/WT、G2/G2和WT/G2个体的肝素锂样品，以确保G2和WT变体的平衡比例。该对照用作WT和G2变体的阳性对照，同时用作G1变体的阴性对照。
G1/G2 LiHep全血对照C：合并来自G1/G1、G2/G2和G1/G2个体的肝素锂全血样品，以确保G1和G2变体的平衡比例。该对照用作G1和G2变体的阳性对照，同时用作WT变体的阴性对照。
测定程序
在室温(20–25℃)下将对照、样品、消化缓冲液和工作内标(IS)解冻。将对照和样品的等分试样(例如20μL)吸移到2mL 96-深孔板的孔中。阴性对照接受两个等分试样。对于干燥的血浆样品，通常使用来自横向流动基底的干燥的血浆的三(3)个1/4”直径的冲床来代替20μL的液体样品。接下来，将180μL消化缓冲液(50mM Tris-HCl，0.675mM DTT，6.75mg/mLDOC，pH 8.0)添加至每个孔中。然后密封板孔，并在离心5-30秒后，将板在Thermomixer上于56℃和1500rpm下孵育30分钟(以允许蛋白质变性和发生干燥的血浆的提取)。
此时，将每种肽的内标添加至每个孔中(除了接受20μL 0.001％的两性洗涤剂3-16的双阴性对照以外)。将胰蛋白酶溶液(在50mM乙酸中的32mg/mL胰蛋白酶)的等分试样(25μL)添加至每个孔中，并在密封每个孔后，将板离心5–30秒，然后在Thermomixer上于37℃和1500rpm下孵育30分钟，以允许发生消化。消化完成后(30分钟)，将1000μL淬灭缓冲液(具有2％甲酸的0.001％(w/v)两性洗涤剂3-16)加入每个孔中。然后将孔用箔纸密封，并将样品在1500–3500rpm下混合1分钟。离心(在3500rpm下10分钟)后，将200uL上清液转移至新的1mL 96-深孔板中的孔中，并对样品进行处理以用于LC-MS/MS。
HPLC-MS/MS
使用Aria Transcend TX4系统(Thermo-Fischer)进行HPLC，该系统由8台1200SL系列二元泵和4台1200系列真空脱气机组成，并使用甲酸在水和乙腈中的梯度。选定的反应监测(SRM，即MS/MS)采用API 5500串联质谱仪(Sciex，Toronto Canada)和带有电喷雾的Turbo VTM离子源。下表3中显示了生成的各种碎片离子的SRM转变。例如，对于未标记的质控肽1，453.724→690.367的转变测量为主要转变，而453.724→217.082m/z的转变测量为次要转变。由于较大的分子(例如蛋白质和肽)通常具有多于1个电荷(对于胰蛋白酶肽通常为2或3个电荷)，因此不会少见的是，Q1中的肽具有较小的质量(m)与电荷(z)之比(即，其中z＝2)，但随后在碎片化过程中失去电荷，使得Q3分离出较大的m/z(即，其中z＝1)。
表3–SRM转变
Figure BDA0002806150510000331
Figure BDA0002806150510000341
Sanger测序
基因组DNA的Sanger测序使用以下引物。
PCR扩增
ApoL1 F2 5'-CGACCTGGTCATCAAAAGCCTTGAC-3'(SEQ ID NO.9)
ApoL1 R2 5’-GGAGGCAGAGCTTGCAGTGAGCTG-3’(SEQ ID NO.10)
测序反应
ApoL1 F1 5'-AGACGAGCCAGAGCCAATC-3'(SEQ ID NO.11)
ApoL1 R1 5'-CTGCCAGGCATATCTCTCCT-3'(SEQ ID NO.12)
使用66℃退火温度对基因组DNA进行30个循环的PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳分离扩增的产物，并用虾碱性磷酸酶/核酸外切酶I处理DNA以用于测序。
数据分析
在所有色谱峰的积分(integration)后(例如，在Analyst中)，对每个样品的原始分析响应(峰面积)进行如下处理：
1.用每个替代肽的主要转变的响应除以匹配的标记的内标肽的主要转变的响应-这是主要分析物：内标峰面积比(主要PAR)。
2.用每个替代肽的次要转变的响应除以匹配的标记的内标肽的次要转变的响应-这是次要分析物：内标峰面积比(次要PAR)。
3.将每个替代肽的主要PAR和次要PAR与PAR阈值表中的值进行比较，以确定PAR分类。
表4
PAR阈值表
Figure BDA0002806150510000351
基于样品中观察到的替代肽的模式(阳性＝1，阴性＝0)，可以使用模式表(表5)定义样品的基因型。如果在模式表中未找到在样品中检测到和未检测到的替代肽的模式，则认为基因型是不确定的，并可以重新注入提取的样品和/或重新提取原始样品。将结果与通过Sanger测序的结果进行比较。
表5
模式表
Figure BDA0002806150510000352
Figure BDA0002806150510000361
实施例2-实施方案
通过参考以下非限制性实施方案可以更好地理解本公开内容。
A1.一种用于确定受试者中感兴趣的基因的基因型的方法，所述方法包括：
提供来自所述受试者的体液，所述体液包含来源于所述感兴趣的基因的蛋白质；
将所述体液沉积在固体基底上，其中允许所述体液干燥以产生干燥的样品；
消化所述干燥的样品以产生针对所述蛋白质的至少一种等位基因特异性替代肽；
使用质谱检测经消化的样品中存在的至少一种等位基因特异性替代肽；和
基于所述至少一种等位基因特异性替代肽的存在或不存在或量来确定所述受试者的基因型。
A2.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中所述消化步骤用蛋白酶胰蛋白酶进行。
A3.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中含有来源于所述感兴趣的基因的蛋白质的所述干燥的样品在消化之前被变性。
A4.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析所述至少一种等位基因特异性替代肽。
A5.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其进一步包括测量对于所述感兴趣的基因的每种基因型所共有的至少一种共同替代肽的量。
A6.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中所述至少一种等位基因特异性替代肽的存在或不存在是通过将针对所述至少一种等位基因特异性替代肽的测量的响应与针对至少一种共同替代肽的测量的响应进行比较来确定的。
A7.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中所述至少一种等位基因特异性替代肽的存在或不存在是通过将针对所述至少一种等位基因特异性替代肽的测量的响应与针对所述至少一种等位基因特异性替代肽的稳定的同位素标记的类似物的测量的响应进行比较来确定的。
A8.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中所述至少一种共同替代肽的存在或不存在是通过将针对所述至少一种共同替代肽的测量的响应与针对所述至少一种共同替代肽的稳定的同位素标记的类似物的测量的响应进行比较来确定的。
A9.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中添加所述至少一种等位基因特异性替代肽的稳定的同位素标记的类似物作为内标。
A10.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中添加所述至少一种共同替代肽的稳定的同位素标记的类似物作为内标。
A11.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中将所述等位基因特异性替代肽的测量的响应标准化至所述至少一种等位基因特异性替代肽的稳定的同位素标记的类似物的测量的响应。
A12.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中将所述共同替代肽的测量的响应标准化至所述至少一种共同替代肽的稳定的同位素标记的类似物的测量的响应。
A13.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中在所述消化步骤之前添加等位基因特异性替代肽的内标。
A14.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中在所述消化步骤之前添加共同替代肽的内标。
A15.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中所述测量的响应是从所述等位基因特异性替代肽产生的至少一个碎片离子的MS/MS转变特征的峰面积比。
A16.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中所述测量的响应是从所述共同替代肽产生的至少一个碎片离子的MS/MS转变特征的峰面积比。
A17.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是ApoL1。
A18.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中所述等位基因特异性替代肽具有来源于野生型等位基因(SEQ ID NO.1)的氨基酸序列LNILNNNYK(SEQ ID NO.4)，或具有来源于G1等位基因(SEQ ID NO.2)的氨基酸序列LNMLNNNYK(SEQ ID NO.5)，或具有来源于G2等位基因(SEQ ID NO.3)的氨基酸序列LNILNNK(SEQ ID NO.6)。
A19.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其进一步包括确定具有SETAEELK(SEQ ID NO.7)或VAQELEEK(SEQ ID NO.8)的氨基酸序列的共同替代肽的量，其中所述共同替代肽存在于野生型、G1或G2等位基因的每一个中。
A20.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中所述质谱测量表3中的至少一种转变。
A21.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中所述至少一种等位基因特异性替代肽的存在或不存在是通过将针对所述至少一种等位基因特异性替代肽的测量的响应与针对所述至少一种等位基因特异性替代肽的表2中列出的稳定的同位素标记的类似物的测量的响应进行比较来确定的。
A22.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中所述液相色谱包括高效液相色谱(HPLC)。
A23.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中所述干燥的样品是来自分离的全血的干燥的血浆。
A24.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中所述干燥的样品是来自分离的全血的干燥的红细胞。
A25.前述或后续实施方案中任一项所述的方法，其中所述干燥的样品是干燥的血液、干燥的尿液或干燥的唾液中的至少一种。
B1.一种用于确定受试者中感兴趣的基因的基因型的系统，所述系统包括：
用于提供干燥的体液的装置，所述干燥的体液包含来源于所述感兴趣的基因的蛋白质；
用于使所述干燥的体液经历消化以产生针对所述蛋白质的至少一种等位基因特异性替代肽和任选地至少一种共同替代肽的工作站；
任选地，用于色谱纯化所述至少一种等位基因特异性替代肽和所述至少一种共同替代肽的任选的至少一种稳定的同位素标记的类似物的工作站；和
用于通过质谱分析所述至少一种等位基因特异性替代肽以确定生物样品中所述至少一种等位基因特异性替代肽的存在或量的工作站。
B2.前述或后续实施方案中任一项所述的系统，其中用于提供生物样品的装置包括用于在基底上固定红细胞并将其与血浆分离的装置。
B3.前述或后续实施方案中任一项所述的系统，其还包括用于添加针对所述蛋白质的所述至少一种等位基因特异性替代肽和任选地所述至少一种共同替代肽的稳定的同位素标记的内标的工作站。
B4.前述或后续实施方案中任一项所述的系统，其中用于质谱分析的工作站包括串联质谱仪。
B5.前述或后续实施方案中任一项所述的系统，其中用于色谱的工作站包括高效液相色谱(HPLC)
B6.前述或后续实施方案中的任一项所述的系统，其中所述工作站中的至少一个由计算机控制。
B7.前述或后续实施方案中任一项所述的系统，其中所述蛋白质是ApoL1。
本说明书中提及的所有文件均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，对本发明的所描述的实施方案的各种修改和变化对于本领域技术人员将是明显的。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，要求保护的本发明不应不适当地限制于这样的特定实施方案。实际上，对本领域技术人员来说明显的对所描述的实施本发明的方式的各种修改都被本发明覆盖。

Claims (32)

1.一种用于确定受试者中感兴趣的基因的基因型的方法，所述方法包括：
提供来自所述受试者的体液，所述体液包含来源于所述感兴趣的基因的蛋白质；
将所述体液沉积在固体基底上，其中允许所述体液干燥以产生干燥的样品；
消化所述干燥的样品以产生针对所述蛋白质的至少一种等位基因特异性替代肽；
使用质谱检测经消化的样品中存在的至少一种等位基因特异性替代肽；和
基于所述至少一种等位基因特异性替代肽的存在或不存在或量来确定所述受试者的基因型。
2.权利要求1所述的方法，其中所述消化步骤是用蛋白酶胰蛋白酶进行的。
3.权利要求1-2中任一项所述的方法，其中包含来源于所述感兴趣的基因的蛋白质的所述干燥的样品在消化之前被变性。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析所述至少一种等位基因特异性替代肽。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其进一步包括测量对于所述感兴趣的基因的每种基因型所共有的至少一种共同替代肽的量。
6.权利要求5所述的方法，其中所述至少一种等位基因特异性替代肽的存在或不存在是通过将针对所述至少一种等位基因特异性替代肽的测量的响应与针对至少一种共同替代肽的测量的响应进行比较来确定的。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述至少一种等位基因特异性替代肽的存在或不存在是通过将针对所述至少一种等位基因特异性替代肽的测量的响应与针对所述至少一种等位基因特异性替代肽的稳定的同位素标记的类似物的测量的响应进行比较来确定的。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述至少一种共同替代肽的存在或不存在是通过将针对所述至少一种共同替代肽的测量的响应与针对所述至少一种共同替代肽的稳定的同位素标记的类似物的测量的响应进行比较来确定的。
9.权利要求7-8中任一项所述的方法，其中添加所述至少一种等位基因特异性替代肽的稳定的同位素标记的类似物作为内标。
10.权利要求7-9中任一项所述的方法，其中添加所述至少一种共同替代肽的稳定的同位素标记的类似物作为内标。
11.权利要求7-10中任一项所述的方法，其中将所述等位基因特异性替代肽的测量的响应标准化至所述至少一种等位基因特异性替代肽的稳定的同位素标记的类似物的测量的响应。
12.权利要求7-11中任一项所述的方法，其中将所述共同替代肽的测量的响应标准化至所述至少一种共同替代肽的稳定的同位素标记的类似物的测量的响应。
13.权利要求9所述的方法，其中在所述消化步骤之前添加所述内标。
14.权利要求10所述的方法，其中在所述消化步骤之前添加所述内标。
15.权利要求6-14中任一项所述的方法，其中所述测量的响应是从所述等位基因特异性替代肽产生的至少一个碎片离子的MS/MS转变特征的峰面积比。
16.权利要求6-14中任一项所述的方法，其中所述测量的响应是从所述共同替代肽产生的至少一个碎片离子的MS/MS转变特征的峰面积比。
17.权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是ApoL1。
18.权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述等位基因特异性替代肽具有来源于野生型等位基因(SEQ ID NO.1)的氨基酸序列LNILNNNYK(SEQ ID NO.4)，或具有来源于G1等位基因(SEQ ID NO.2)的氨基酸序列LNMLNNNYK(SEQ ID NO.5)，或具有来源于G2等位基因(SEQ ID NO.3)的氨基酸序列LNILNNK(SEQ ID NO.6)。
19.权利要求1-18中任一项所述的方法，其进一步包括确定具有SETAEELK(SEQ IDNO.7)和/或VAQELEEK(SEQ ID NO.8)的氨基酸序列的共同替代肽的量，其中所述共同替代肽存在于野生型、G1或G2等位基因的每一个中。
20.权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述质谱测量表3中的至少一种转变。
21.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述至少一种等位基因特异性替代肽的存在或不存在是通过将针对所述至少一种等位基因特异性替代肽的测量的响应与针对所述至少一种等位基因特异性替代肽的表2中列出的稳定的同位素标记的类似物的测量的响应进行比较来确定的。
22.权利要求4所述的方法，其中所述液相色谱包括高效液相色谱(HPLC)。
23.权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述干燥的样品是来自分离的全血的干燥的血浆。
24.权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述干燥的样品是来自分离的全血的干燥的红细胞。
25.权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述干燥的样品是干燥的血液、干燥的尿液或干燥的唾液中的至少一种。
26.一种用于确定受试者中感兴趣的基因的基因型的系统，所述系统包括：
用于提供干燥的体液的装置，所述干燥的体液包含来源于所述感兴趣的基因的蛋白质；
用于使所述干燥的体液经历消化以产生针对所述蛋白质的至少一种等位基因特异性替代肽和任选地至少一种共同替代肽的工作站；
任选地，用于色谱纯化所述至少一种等位基因特异性替代肽和所述至少一种共同替代肽的任选的至少一种稳定的同位素标记的类似物的工作站；和
用于通过质谱分析所述至少一种等位基因特异性替代肽以确定生物样品中所述至少一种等位基因特异性替代肽的存在或量的工作站。
27.权利要求26所述的系统，其中所述用于提供干燥的体液的装置包括用于在基底上固定红细胞并将其与血浆分离的装置。
28.权利要求26-27中任一项所述的系统，其还包括用于添加针对所述蛋白质的所述至少一种等位基因特异性替代肽和任选地所述至少一种共同替代肽的稳定的同位素标记的内标的工作站。
29.权利要求26-28中任一项所述的系统，其中用于质谱的工作站包括串联质谱仪。
30.权利要求26-29中任一项所述的系统，其中用于色谱的工作站包括高效液相色谱(HPLC)。
31.权利要求26-30中任一项所述的系统，其中所述工作站中的至少一个由计算机控制。
32.权利要求26-31中任一项所述的系统，其中所述蛋白质是ApoL1。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3521828A1 (en) * 2018-01-31 2019-08-07 Centogene AG Method for the diagnosis of hereditary angioedema
US20220251650A1 (en) * 2019-09-23 2022-08-11 Gateway Genomics, Llc Methods, compositions, and kits for determining the sex of a fetus
EP4361284A3 (en) * 2019-12-09 2024-05-29 Gen-Probe Incorporated Quantification of polynucleotide analytes from dried samples
CN113009036A (zh) * 2021-03-05 2021-06-22 天津汉科生物科技有限公司 一种检测性激素的试剂盒、性激素样品前处理方法及同时检测多种性激素的方法
EP4370903A1 (en) * 2021-07-12 2024-05-22 ISA Pharmaceuticals B.V. Improved substance quantification in complex mixtures
WO2024054382A1 (en) * 2022-09-06 2024-03-14 Purdue Research Foundation Methods for employing mass spectrometry techniques to sequence and analyze biological molecules
CN116466010B (zh) * 2023-06-15 2023-08-25 四川普锐特药业有限公司 一种用于脂质纳米粒中多种脂质组分定量检测的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008529027A (ja) * 2005-02-01 2008-07-31 キングス カレッジ ロンドン スクリーニング法
WO2012024189A2 (en) * 2010-08-20 2012-02-23 The J. David Gladstone Institutes Compositions and methods for determining predisposition to developing metabolic syndrome
CN103649329A (zh) * 2010-11-26 2014-03-19 ImmuneXpress有限公司 诊断和/或筛选剂及其用途
CN105229024A (zh) * 2013-03-15 2016-01-06 Uab研究基金会 肾病综合征及相关病状的治疗方法
EP3139171A1 (en) * 2015-09-02 2017-03-08 Labsystems Diagnostics Oy Novel methods and kits for detecting of urea cycle disorders using mass spectrometry
EP3163303A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-03 Biocross, S.L. Methods for apolipoprotein detection
WO2017173390A1 (en) * 2016-03-31 2017-10-05 Applied Proteomics, Inc. Biomarker database generation and use

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5772874A (en) 1995-11-02 1998-06-30 Cohesive Technologies, Inc. High performance liquid chromatography method and apparatus
EP0840893B1 (en) 1996-01-19 1999-09-15 Cohesive Technologies Inc. High performance liquid chromatography method and apparatus
GB9717926D0 (en) 1997-08-22 1997-10-29 Micromass Ltd Methods and apparatus for tandem mass spectrometry
US6040135A (en) 1998-03-06 2000-03-21 Biosafe Laboratories, Inc. Method for correcting for blood volume in a serum analyte determination
US6699175B2 (en) 2000-10-23 2004-03-02 Ethicon, Inc. Apparatus and method for the measurement of the resistance of the urethral sphincter
EP1356121A2 (en) 2001-02-01 2003-10-29 Ciphergen Biosystems, Inc. Improved methods for protein identification, characterization and sequencing by tandem mass spectrometry
EP1267170A1 (en) 2001-06-07 2002-12-18 Xzillion GmbH & CO.KG Method for characterising polypeptides
DE10158860B4 (de) 2001-11-30 2007-04-05 Bruker Daltonik Gmbh Massenspektrometrische Proteingemischanalyse
US7611670B2 (en) 2002-04-23 2009-11-03 Home Access Health Corporation Quantitative analysis of a biological sample of unknown quantity
US20060094121A1 (en) 2002-11-18 2006-05-04 Ludwig Institute For Cancer Research Method for analysing amino acids, peptides and proteins
US7473892B2 (en) 2003-08-13 2009-01-06 Hitachi High-Technologies Corporation Mass spectrometer system
US20090087913A1 (en) 2007-10-01 2009-04-02 Mds Analytical Technologies, A Business Unit Of Mds Inc.,Doing Business Through Its Sciex Division Analysis of conjugated metabolites of alcohol consumption
EP2780716B1 (en) 2011-11-15 2019-07-31 Centogene AG Method for the diagnosis of niemann-pick disease
WO2017006964A1 (ja) 2015-07-06 2017-01-12 富士フイルム株式会社 血液検査キット、その部材及びそれらの製造方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008529027A (ja) * 2005-02-01 2008-07-31 キングス カレッジ ロンドン スクリーニング法
WO2012024189A2 (en) * 2010-08-20 2012-02-23 The J. David Gladstone Institutes Compositions and methods for determining predisposition to developing metabolic syndrome
CN103649329A (zh) * 2010-11-26 2014-03-19 ImmuneXpress有限公司 诊断和/或筛选剂及其用途
CN105229024A (zh) * 2013-03-15 2016-01-06 Uab研究基金会 肾病综合征及相关病状的治疗方法
EP3139171A1 (en) * 2015-09-02 2017-03-08 Labsystems Diagnostics Oy Novel methods and kits for detecting of urea cycle disorders using mass spectrometry
EP3163303A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-03 Biocross, S.L. Methods for apolipoprotein detection
WO2017173390A1 (en) * 2016-03-31 2017-10-05 Applied Proteomics, Inc. Biomarker database generation and use

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DUFRESNE 等: "Freeze-dried plasma proteins are stable at room temperature for at least 1 year", 《CLINICAL PROTEOMICS》, vol. 14, pages 1 - 14, XP021250281, DOI: 10.1186/s12014-017-9170-0 *
MARTIN 等: "Dried Blood Spot Proteomics: Surface Extraction of Endogenous Proteins Coupled with Automated Sample Preparation and Mass Spectrometry Analysis", 《JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY FOR MASS SPECTROMETRY》, vol. 24, pages 1242 - 1249, XP035354589, DOI: 10.1007/s13361-013-0658-1 *
MOAT 等: "Newborn screening for sickle cell disorders using tandem mass spectrometry: three years’ experience of using aprotocol to detect only the disease states", 《ANNALS OF CLINICAL BIOCHEMISTRY》, vol. 54, no. 5, pages 601 - 611 *
ROSTING 等: "High Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry in Nontargeted Bottom-up Proteomics of Dried Blood Spots", 《JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH》, vol. 17, pages 1997 - 2004, XP055622531, DOI: 10.1021/acs.jproteome.7b00746 *
ZHOU 等: "Rapid detection and quantification of apolipoprotein L1 genetic variants and total levels in plasma by ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry", 《RAPID COMMUN MASS SPECTROM》, vol. 27, no. 23, pages 2639 - 2647, XP055505781, DOI: 10.1002/rcm.6734 *

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