KR20150128336A

KR20150128336A - 텔로머라제 펩티드를 유효성분으로 포함하는 뇌혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20150128336A
Application number: KR1020140055580A
Authority: KR
Inventors: 김상재; 고성호
Original assignee: 주식회사 젬백스앤카엘; 김상재
Priority date: 2014-05-09
Filing date: 2014-05-09
Publication date: 2015-11-18
Also published as: KR102232319B1

Abstract

본 발명은 텔로머라제 펩티드를 유효성분으로 포함하는 뇌혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 혈액 및 산소공급 부족으로 인한 뇌세포의 사멸을 억제하고, 세포의 증식 및 활성을 증가시키며, 신경줄기세포에서 독성이 나타나지 않는 것이 확인 되었다. 따라서 생체 내에서 안정성이 높으며, 뇌혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물로서 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

텔로머라제 펩티드를 유효성분으로 포함하는 뇌혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating cerebrovascular diseases comprising a telomerase peptide as an active ingredient}

본 발명은 텔로머라제 펩티드를 유효성분으로 포함하는 뇌혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

국내 통계청 자료에 따르면 연간 뇌혈관 질환 사망자는 약 10만 명당 약 56.5명에 이르고, 매년 약 6만명 이상의 뇌졸중 환자가 발생하며, 약 20만명 이상의 환자가 투병중에 있을 것으로 추정되고 있다. 뇌졸중은 노인에서 발병률이 높은 질환 이지만 최근 일상 업무의 과도한 스트레스와 술, 담배, 운동 부족 및 육류 위주의 식사 등 무절제한 생활양식으로 인해 30~40대의 뇌졸중 발병률이 전체 뇌졸중 환자의 1/4를 차지할 정도로 발병 연령이 젊은 층으로 확산되고 문제시 되고 있다.

이와 같은 뇌졸중은 뇌혈관이 막히거나 터져서 발생하는 병으로, 뇌경색과 뇌출혈 두 가지 유형으로 나뉜다. 뇌경색은 허혈성 뇌혈관 질환이라 부르며, 뇌혈관이 막혀서 뇌에 혈액과 산소 공급이 원활하지 못해서, 뇌세포가 죽게 되어 발생하는 질환이다. 한편, 뇌출혈은 출혈성 뇌혈관 질환이라 부르며, 뇌혈관이 터져 피가 흐르고 고여서 뇌 손상이 오는 경우이다. 상기 뇌경색과 뇌출혈은 뇌의 기능을 상실시키며, 이로 인해 반신마비, 언어장애 및 의식장애 등이 나타나며, 심할 경우 사망에 이른다.

상기 허혈성 뇌혈관 질환은 뇌의 혈류가 감소되어 뇌세포에 산소와 포도당의 공급이 이루어지지 않아 해마 CAI 영역에 지연성 신경세포사 (delayed neuronal death)가 유발되어 발생하는 질환이다 Kirino, Brain Res., 239, p57-69, 1982).또한, 허혈성 뇌질환은 혈전증 (thrombosis), 색전증 (embolism), 일과성 허혈발작 (transient ischemic attack) 및 소경색 (lacume) 등으로 세분류 된다.

뇌졸중과 같은 허혈 손상의 분자생물학적 기전은 뇌실질의 특정 부위에 혈액 공급이 차단되면 산소 및 포도당의 공급 중단으로 세포막 내 이온 channel을 유지하기에 충분한 ATP 공급이 불가능해지고 NDMA (N-methyl-D-aspartic acid) 수용체, AMPA (a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propinoic acid) 및 메타보트로픽 글루타메이트 수용체 (metabotropic glutamate receptor)의 연속적인 활성의 유도를 통한 칼슘이온의 세포 내 유입을 증가 시킨다 (Science, 244, p1360-1362, 1989). 칼슘의 세포 내 유입은 글루타메이트 및 아스팔테이트가 과도하게 방출되어 프리 라디칼을 포함하는 세포 독성 분자가 생성되어 DNA 및 세포막 등의 세포 구조물을 파괴하여 신경세포 사망을 촉진하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 뇌혈관 질환을 치료 또는 예방하기 위한 뇌혈관 질환의 예방 또는 치료효과가 있는 우수한 치료제 개발은 매우 시급한 실정이다.

Brain Res., 239, p57-69, 1982 Science, 244, p1360-1362, 1989

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 뇌혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 일측면에 따른 목적은 뇌혈관 질환의 예방 또는 치료에 효과적이고, 세포독성이 나타나지 않는 안전성이 뛰어난 뇌혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일측면에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 포함하는 뇌혈관 질환 예방 또는 조성물이 제공될 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물에 있어서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편일 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 뇌혈관 질환의 예방 및 치료용일 수 있다.

본 발명의 다른측면에 따르면, 상기 뇌혈관 질환 예방 및 치료용 조성물을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 특징으로 하는 뇌혈관 질환을 치료 및 예방하는 방법이 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 텔로머라제 펩티드를 유효성분으로 포함하는 뇌혈관 질환 예방 치료에 효과적이고, 세포독성이 나타나지 않는 안전성이 뛰어나 뇌혈관 질환 예방 또는 치료에 매우 유용하게 사용 될 수 있다.

도 1는 저산소성 환경 표지 인자인 HIF-1а의 발현량을 확인한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 도면으로 저산소 환경에 대한 노출 시간이 증가할수록 HIF-1а의 발현량이 증가됨을 확인한 결과도면이다.
도 2a는 저산소 환경에서 8시간 노출 시킨 후, 텔로머라제 펩티드를 1, 10, 및 50 μM으로 처리하여 흡광도를 통해 세포사멸의 감소를 확인한 도면이다.
도 2b는 저산소 환경에서 8시간 노출 시킨 후, 텔로머라제 펩티드를 1, 10, 및 50 μM으로 처리하여 Annexin V 염색 및 프로피디움 요오드 화물을 통해 세포사멸의 감소를 확인한 도면이다.
도 2c는 저산소 환경에서 8시간 노출 시킨 후, 텔로머라제 펩티드를 1, 10, 및 50 μM으로 처리하여 Tunnel 어세이를 통해 세포사멸의 감소를 확인한 도면이다.
도 2d는 저산소 환경에서 8시간 노출 시킨 후, 텔로머라제 펩티드를 1, 10, 및 50 μM으로 처리하여 세포사멸의 감소를 확인한 도면이다.
도 3는 저산소 환경에서 8시간 노출 시킨 후, 텔로머라제 펩티드를 1, 10, 및 50 μM으로 처리하여 세포의 증식 (proliferation)이 증가됨을 확인한 도면이다.
도 4는 저산소 환경에서 8시간 노출 시킨 후, 텔로머라제 펩티드를 1, 10, 및 50 μM으로 처리하여 세포의 이동 (migration)이 증가됨을 확인한 도면이다.
도 5a는 저산소 환경에 의한 산화성 손상에 대한 텔로머라제 펩티드의 보호효과를 확인한 도면이다.
도 5b는 저산소 환경에 의한 산화성 손상을 텔로머라제 펩티드 1, 10, 및 50 μM으로 처리하여 활성산소가 감소함을 확인한 도면이다.
도 6는 저산소 환경에서 대뇌피질 신경세포를 8시간 노출 시킨 후, 텔로머라제 펩티드를 1, 10, 및 50 μM으로 처리하여 세포사멸의 감소를 확인한 도면이다.
도 7는 저산소 환경에서 대뇌피질 신경세포의 산화성 손상을 텔로머라제 1, 10, 및 50 μM으로 처리하여 활성산소가 감소함을 확인한 도면이다.
도 8는 저산소 환경에서 8시간 노출 시킨 후, 텔로머라제 펩티드를 1, 10, 및 50 μM으로 처리하여 미토콘드리아 DNA 손상을 확인한 도면이다.
도 9는 염증반응, TCA cycle, ATP cycle 관련 signal, 세포이동, GPCR 등에 관련한 스팟에서 신경보호효과를 입증하고 세포성 아밀로이드 베타와 텔로머라제 펩티드의 활성기전을 확인할 수 있는 신호를 확인한 도면이다.
도 10는 저산소 환경에서 8시간 노출 시킨 후, 텔로머라제 펩티드를 1, 10, 및 50 μM으로 처리하여 항체 마이크로 어레이 (Antibody Microarray)를 통해 세포사멸, 세포주기, neurobiology, 세포골격 (cytoskeleton), 신호전달 과정 (signal transduction) 및 핵단백질을 확인한 도면이다.
도 11는 뇌혈관 질환 관련 단백질의 발현량을 확인한 웨스턴블랏 결과 도면이다. 저산소 환경에서 1시간 또는 8시간 노출시킨 후, 텔로머라제 펩티드 (μM)의 증가에 따라 세포생존 신호인 pAKT, HSTF-1의 발현량 증가 및 세포사멸신호인 GSK3β caspase-3와 염증반응의 대표신호인 COX-2의 발현량의 감소를 확인하였다.
도 12는 뇌 이미지에서 infarct volume이 형성된 자리를 측정하고 infarct volume을 산출한 도면이다.
도 13는 텔로머라제 펩티드 투여 전 허혈성 동물 모델의 증상 여부를 확인하기 위해 실시한 behavioral test를 실시한 결과이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

텔로미어(telomere)는 염색체의 말단에 반복적으로 존재하는 유전 물질로서, 해당 염색체의 손상이나 다른 염색체와의 결합을 방지한다고 알려져 있다. 세포가 분열할 때마다 텔로미어의 길이는 조금씩 짧아지는데, 일정한 횟수 이상의 세포 분열이 있게 되면 텔로미어는 매우 짧아지고, 그 세포는 분열을 멈추고 죽게 된다. 반면 텔로미어를 길게 하면 세포의 수명이 연장된다고 알려져 있으며, 그 예로 암세포에서는 텔로머라제(telomerase)라는 효소가 분비되어 텔로미어가 짧아지는 것을 막기 때문에, 암세포가 죽지 않고 계속 증식할 수 있다고 알려져 있다.

본 발명의 일측면에서, 서열번호 1의 펩티드, 서열번호 1의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제, 구체적으로 인간 (Homo sapiens) 텔로머라제에서 유래한 펩티드를 포함한다.

본 명세서에 개시된 펩티드는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 펩티드는, 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그 단편들과 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산이 변화된 펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 아미노산 변화는 펩티드의 물리화학적 특성이 변경되도록 하는 성질에 속한다. 예를 들어, 펩티드의 열안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변경시키고, 최적의 pH를 변화시키는 등의 아미노산 변화가 수행될 수 있다.

본 명세서에서 "아미노산"이라 함은 자연적으로 펩티드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 일측면에서 펩티드는 D-아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있다. 한편, 본 발명의 다른 측면에서 펩티드는 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산 등을 포함할 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)를 포함), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예컨대, 이황화물 브릿지의 형성) 를 포함한다. 또한, 펩티드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제(crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다.

본 명세서에 개시된 펩티드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩티드일 수 있다. 한편, 본 명세서에 개시된 펩티드는 서열번호 1의 단편들인 펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수 있다. 인공 변이체에서 뿐만 아니라 야생형 폴리펩티드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩(folding) 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 보존성 치환의 예들은 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)의 군의 범위 내에 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly, 그리고 이들과 반대인 것들이다. 보존적 치환의 다른 예는 다음 표와 같다.

원래 아미노산	예시적인 잔기 치환	바람직한 잔기 치환
Ala (A)	val; leu; ile	Val
Arg (R)	lys; gln; asn	Lys
Asn (N)	gln; his; asp, lys; arg	Gln
Asp (D)	glu; asn	Glu
Cys (C)	ser; ala	Ser
Gln (Q)	asn; glu	Asn
Glu (E)	asp; gln	Asp
Gly (G)	ala	Ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	Arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; norleucine	Leu
Leu (L)	norleucine; ile ; val; met; ala; phe	Ile
Lys (K)	arg; gln; asn	Arg
Met (M)	leu; phe; ile	Leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	Tyr
Pro (P)	ala	Ala
Ser (S)	thr	Thr
Thr (T)	ser	Ser
Trp (W)	tyr; phe	Tyr
Tyr (Y)	trp; phe ; thr; ser	Phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; norleucine	Leu

펩티드의 생물학적 특성에 있어서의 실재적인 변형은 (a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면 시트 또는 나선 입체 구조를 유지하는데 있어서의 이들의 효과, (b) 표적 부위에서의 상기 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는데 있어서의 이들의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어서의 이들의 효과가 상당히 상이한 치환부를 선택함으로써 수행된다. 천연 잔기는 통상의 측쇄 특성에 기준하여 다음 그룹으로 구분된다:

(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또다른 부류로 교환함으로써 이루어질 것이다. 펩티드의 적당한 입체 구조를 유지하는 것과 관련이 없는 어떠한 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 상기 분자의 산화적 안정성을 향상시키고 이상한 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 상기 펩티드에 가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다

펩티드의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변화된 것이다. 변화란 의미는 펩티드에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 펩티드 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 나타낸다.

펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된 것이다. N-연결된이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.

펩티드로의 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 언급된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 수행된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 이러한 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 최초 항체의 서열에 부가하거나 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).

또한, 본 발명의 일측면에 따른 서열번호 1의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 세포 내 독성이 낮고, 생체 내 안정성이 높다는 장점을 가진다.

서열 번호 1에 기재된 펩티드는 아래 표 2과 같다. 아래 표 2의 "이름"은 펩티드를 구별하기 위해 명명한 것이다. 본 발명의 일측면에서, 서열 번호 1에 기재된 펩티드는 인간 텔로머라제의 전체 펩티드를 나타낸다. 본 발명의 다른 일측면에서, 서열 번호 1의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제에 포함된 펩티드 중 해당 위치의 펩티드를 선별해 합성한 "합성 펩티드"를 포함한다. 서열번호 2는 전체 텔로머레이즈의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

서열번호	이름	텔로머라제 상 위치	서열	길이
1	pep1	[611-626]	EARPALLTSRLRFIPK	16 aa
2		[1-1132]	MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRR GAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGT TLTALEAAANPALPSDFKTILD??	1132 aa

본 발명의 일측면에 따른 뇌혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물의 일측면에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 0.1 ㎍/㎎ 내지 1 ㎎/㎎, 구체적으로 1 ㎍/㎎ 내지 0.5 ㎎/㎎, 더 구체적으로 10 ㎍/㎎ 내지 0.1 ㎎/㎎의 함량으로 포함할 수 있다. 상기 범위로 포함하는 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐만 아니라, 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 포함하는 것이 적절할 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물은 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함하는 모든 동물에 적용될 수 있다.

본 발명의 일측면에서 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 (comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 텔로머라제 유래 펩티드를 유효성분으로 포함하는 뇌혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하 등으로 투여될 수 있다.

경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

각 제형은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.

상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 구체적으로는 1 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 더 구체적으로는 10 ㎍/kg/일 내지 1 mg/kg/일, 보다 더 구체적으로는 50 ㎍/kg/일 내지 100 ㎍/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적으로만 의도된 것이지 본 발명을 한정하고자 하는 의도가 아니다. 명사 앞에 개수가 생략된 용어는 수량을 제한하고자 하는 것이 아니라 언급된 명사 물품이 하나 이상 존재하는 것을 나타내는 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 열린 용어로 해석된다(즉, "comprising(포함하지만 이에 한정되지는 않는)"의 의미).

수치의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 수치들을 개별적으로 언급하는 것을 대신하는 것 이며, 다른 언급이 없는 한, 각 수치는 개별적으로 명세서에 언급되어 있는 것과 동일하게 본 명세서에 적용된다. 모든 범위의 한계 값들은 그 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합 가능하다.

본 명세서에 언급된 모든 방법들은 달리 명시되어 있거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 어느 한 실시예 및 모든 실시예 또는 예시적 언어 (예컨대, "~과 같은")를 사용하는 것은, 청구범위에 포함되어 있지 않는 한, 단지 본 발명의 기재를 용이하게 하기 위함이지 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 어떤 비청구된 구성요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 해석 되어서는 아니된다. 다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구체예들은 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 최적의 모드를 포함한다. 바람직한 구체예들의 변이들이 앞선 기재를 읽으면 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 그러한 변이를 적절히 이용하길 기대하고, 발명자들은 본 명세서에 기재된 것과 다른 방식으로 본 발명이 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은, 특허법에 의해 허용되는 것과 같이, 첨부된 특허청구범위에서 언급된 발명의 요지의 균등물 및 모든 변형들을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변이들 내에서 상기 언급된 구성요소들의 어떤 조합이라도 여기서 반대로 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 예시적인 구체예들을 참조하여 구체적으로 나타내어지고 기술되었지만, 당업자들은 하기 청구범위에 의해 정의되는 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서도 형태 및 디테일에서 다양한 변화가 행해질 수 있음을 잘 이해할 것이다 .

이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 펩티드의 합성

서열번호 1의 펩티드(이하 "PEP 1"이라 함)를 종래에 알려진 고상 펩티드 합성법에 따라 제조하였다. 구체적으로, 펩티드들은 ASP48S(Peptron, Inc., 대한민국 대전)를 이용하여 Fmoc 고상 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통해 C-말단부터 아미노산 하나씩 커플링함으로써 합성하였다. 다음과 같이, 펩티드들의 C-말단의 첫번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

NH₂-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin

NH₂-Ala-2-chloro-Trityl Resin

NH₂-Arg(Pbf)-2-chloro-Trityl Resin

펩티드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-term이 Fmoc으로 보호(protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu (t-butylester), Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sulfonyl) 등으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, Trt-Mercaptoacetic acid.

커플링 시약(Coupling reagent)으로는 HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] /NMM [4-Methylmorpholine] 를 사용하였다. Fmoc 제거는 20%의 DMF 중 피페리딘(piperidine in DMF)을 이용하였다. 합성된 펩티드를 Resin에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) [TFA (trifluoroacetic acid) /TIS (triisopropylsilane) / EDT (ethanedithiol) / H₂O=92.5/2.5/2.5/2.5] 를 사용하였다.

아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상태를 이용하여 여기에 해당 아미노산들을 각각 반응시키고 용매로 세척한 후 탈보호하는 과정을 반복함으로써 각 펩티드를 합성하였다. 합성된 펩티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고, 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다.

본 실시예에 사용된 펩티드에 대해 고성능 액체 크로마토 그래피 결과, 모든 펩티드의 순도는 95% 이상이었다.

PEP 1 제조에 관한 구체적인 과정을 설명하면 다음과 같다.

1) 커플링

NH₂-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin 에 보호된 아미노산(8당량)와 커플링 시약 HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량) 을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

2) Fmoc 탈보호

20%의 DMF 중의 피페리딘(piperidine in DMF) 을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

3) 1과 2의 반응을 반복적으로 하여 펩티드 기본 골격 NH₂-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-chloro-Trityl Resin)을 만들었다.

4) 절단(Cleavage): 합성이 완료된 펩티드 Resin에 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) 을 가하여 펩티드를 Resin에서 분리하였다.

5) 얻어진 혼합물에 냉각 디에틸 에테르를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 펩티드를 침전시킨다.

6) Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 분말 형태로 제조하였다.

실시예 2: 신경줄기 세포 및 대뇌피질 신경세포의 배양

신경줄기세포는 임신일 13일째 랫드 (rat) 배아의 머리에서 대뇌피질을 분리한 후, 일주일간 염기성 섬유모세포증식인자 (Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF))(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 처리하여 신경줄기세포를 배양하였다. 대뇌피질 신경세포는 임신일 16일째 랫드 (rat) (spraguee.Dawley, Orient Bio, Kyungki, Korea) 배아의 대뇌피질로부터 분리한 후, complete PMEM 배지에서 배양하였다. 배양 이틀 후, 비 신경세포들은 24시간 동안 5LM 시토신 아라비노시드 (cytosine arabinoside)를 처리하여 분리하였다. 7일간 배양한 성숙배양(Mature Culture) 만 실험에 사용하였으며, 대뇌피질로부터 획득한 신경세포의 분포(population)는 대략 79.7% 이다.

실시예 3: 저산소성 및 OGD (Oxygen Glucose Deprivation) 환경에 의한 신경독성 및 텔로머라제 펩티드 처리에 의한 신경 줄기세포 및 대뇌피질 신경세포의 보호효과 분석

저산소성 환경에 의한 신경줄기세포의 세포독성을 확인할 수 있는 생체 외 (in-vitro) 저산소성 환경을 조성하기 위해, 5 mol % CO₂0.2 mol % O₂ 및 94.8 mol % N₂의저산소 챔버 (Hypoxic chamber)를 구축하였으며, 상기 저산소 챔버에서 0 내지 24시간까지 신경줄기세포를 배양하여 세포생존도를 확인하였다. 상기 저산소 챔버가 저산소 환경을 잘 이루고 있는지 여부는 저산소 환경의 표지인자인 HIF-1а를 웨스턴블랏으로 확인하였다. 상기 챔버내에서 세포가 배양되는 시간이 증가할수록 HIF-1а의 발현량이 증가하는 것으로부터 저산소성 환경을 확인하였다 (도 1 참조). 그 결과 저산소성 환경에 의해 증가되었던 세포 사멸이 텔로머라제 펩티드에 의해 효과적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 텔로머라제 펩티드 1μM 농도에서부터 효과를 보였다.

이 후, 저산소 환경에 의한 신경줄기세포의 신경독성변화를 확인하기 위해 저산소 챔버 (Hypoxic chamber)에서 8시간 동안 여러 농도의 GV1001을 처리한 후 저산소성 신경독성 정도를 LDH 어세이, DAPI 염색 어세이 및 TUNEL 염색 어세이, BrdU 어세이, 세포이동 어세이 분석으로 평가하였다.

실시예 3-1. TBS (trypan Blue Staining) 염색 및 LDH (Lactate Dehydrogenase Release) 어세이 실시

신경줄기세포의 생존율은 TBS 염색 어세이로 확인하였다. 10㎕ 신경줄기세포를 10㎕ TBS용액에서 2분 동안 배양하였다. 헤모사이토미터 (haemocytometer)를 이용하여 염색되지 않은 살아 있는 세포 수를 세었고, 비색분석법 (colorimetric assay)키트를 (Roche Boehringer-mannheim, In, USA) 이용하여 LDH양을 측정하였다 (도 2a 참조). 세포 활성은 ELISA 리더를 이용하여 490nm에서 실시하였고, 비교 파장은 690nm를 이용하여 표준화하였다.

실시예 3-2. BrdU 어세이 실시

신경줄기세포의 증식률은 BRdU 어세이로 확인하였다. 신경줄기세포를 10μM BrdU 배지에서 2시간 동안 배양한 후 세포 증식률을 BrdU Labeling and Detection 키트 (Roche Boehringer-Mannheim, In. USA)를 이용하여 BrdU 양을 측정하였다 (도 3 참조). 세포 증식은 ELISA 리더를 이용하여 370nm에서 실시하였고, 비교 파장은 492nm을 이용하여 표준화하였다. 저산소성 환경에 의해 40~50% 줄어들었던 세포 증식률이 감소하였고 GV1001을 전처리 한 군에서 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다.

실시예 3-3. 세포이동 어세이 실시

신경줄기세포의 이동능력은 세포이동 어세이로 확인하였다. 신경줄기세포를 upper 챔버에 분주하여 8시간동안 저 산소 환경에서 배양한 후 QCM 24웰 비색분석법 (colorimetric assay) 키트 (Chemicon, Temecula, CA)를 이용하여 세포막을 통해 이동한 신경줄기세포를 측정하였다. 저 산소 환경에 의해 줄어들었던 세포이동이 GV1001 처리에 의해 증가하는 것을 확인하였다 (도 4 참조).

실시예 3-4. Annexin V 염색 및 프로피디움 요오드 화물 (Propidium iodide) 실시

Annexin V 및 프로피디움 요오드 화물은 FITC Annexin V Apoptosis Detection 키트 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 측정하였다 (도 2b 참조). 대뇌피질 신경세포들을 Oxygen Glucose Deprivation 에 노출 시킨 후 여러 농도의 GV1001 (1, 10, 50mM)과 8시간 처리하였다. 세포 세척 후, 1x binding 버퍼 용액에 재부유 시킨 후 5mL FITC Annexin V 및 10mL 프로피디움 요오드 화물을 처리하였다. 15분 동안 배양한 후 유동세포 분석법 (flow cytometry) (Accuri C6 Flow cytometer, BD Biosciences)를 이용하여 샘플을 분석하였다.

실시예 3-4. 자유 라디칼 (Free Radical) 생성 측정

자유 라디칼 생성 측정을 위해 신경줄기세포를 30분간 저산소 환경에 노출시킨 후 fluorescent probe 2,7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCHF_DA)와 배양하고 여러 농도의 GV1001로 처리하였다. 세포 내 DCF의 축적양은 ELISA 리더기 (Synergy H1 Hybrid reader, BioTek Instruments, Winnoski, USA)를 이용하여 90nm에서 실시하였고, 비교 파장은 490nm을 이용하여 표준화하였다. 저산소성 환경에 의해 활성산소가 증거하고, GV1001과 함께 처리한 군에서는 증가한 활성산소가 감소함을 확인하였다 (도 5a 및 도 5b 참조).

실시예 3-5. 산화 미토콘드리아 DNA 손상 어세이 (Oxidative mitochondrial DNA damage assay) 실시

산화 미토콘드리아 DNA 손상은 OxiSelect Oxidative DNA Damage ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. Purelink Genomic DNA Mini 키트 (Invitrogen)을 사용하여 미토콘드리아 DNA를 추출 후, anti-OHdH 단일클론 항체 및 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated 2차 항체를 처리하였다. 처리한 샘플은 authentic 8 ??OHdG (Cell Biotics)를 사용하여 기본값으로 정량한 후, ELISA 플레이트 리더기 (Synergy H1, BioTek Instruments) 를 이용하여 450nm에서 미토콘드리아 DNA 손상을 측정하였다 (도 8 참조).

실시예 3-6. 미토콘드리아 막 전위(membrane potential) 어세이 실시

96웰 플레이트에 웰당 5x10⁵/mL가 되도록 신경줄기 세포를 분주 한후 저산소 환경에서 여러 농도의 GV1001 (1, 10, 50mM)과 처리 후 8시간 배양하였다. 미토콘드리아 막 전위는 JC-1 mitochondrial membrane potential 어세이 키트 (Abnova)를 사용하여 측정하였고 ELISA 플레이트 리더기 (Synergy H1 Hybrid reader, BioTek Instruments)를 이용하여 분석하였다. JC-1 J와 응집된 건강한 세포들은 fluorescence setting 에서 rhodamine (excitation/emsission = 540/570nm)또는 texas red로 나타났다. 반대로 사멸 또는 건강하지 못한 세포들은 JC-1 모노머 (monomers)의 형태로 FITC setting 485/535nm에서 나타났다.

실시예 3-7. Immunocytochemistry 실시

세포 내 신경줄기세포의 발현을 확인하기 위해, 1x10신경줄기세포를 쳄버웰에 분주한 후 20mM Oxygen Glucose Deprivation 환경에 노출시킨 후 각 다른 농도의 GV1001 (1, 10, 50 mM)을 8시간 동안 처리하였다. 각 세포들은 고정 및, 투과하, 억제 과정을 거친 후, 60분간 배양하였다. 배양 후 2% 정상혈청 및 mouse anti-nestin (1:100; Abcam), rabbit anti-Ki67 (1:100; Abcam), rabbit antidoublecortin (1 mg/mL; Abcam), rabbit anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) (1:5000; Abcam), rabbit anti-Tuj1 (1 mg/mL; Abcam), and mouse anti-GalC (1 mg/mL; Millipore)와 같은 1차 항체를 처리하여 24시간 배양하였다. 다음 날 goat-anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Molecular Probes), anti-rabbit tetramethylrhodamine (Molecular Probes), 및 goat-anti-mouse Alexa Fluor 488 (Molecular Probes)와 같은 2차 항체를 처리하여 60분간 배양하였다. 세포 세척 후, mounting medium으로 슬라이드에 세포를 고정한 후, 올림푸스 형광 현미경 또는 공초첨 레이저 현미경 (Leica)를 사용하여 세포를 관찰하였다.

실시예 4. 아밀로이드 베타 및 저산소성 신경독성에 대한 텔로머라제 펩티드 신경보호 효과 기전으로 PI3K 경로에 대한 영향에 관한 분석

Phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/AKT에 의한 텔로머라제 펩티드의 영향을 확인하였다. PI3K 경로는 다양한 성장인자 및 조절인자에 의해 활성화되며 신경세포 성장 및 생존의 정상적인 조절에 관여한다. AKT 신호전달경로는 여러 proapoptotic factor를 비활성하며 이미 잘 알려진 대표적 세포사멸 신호인 GSK3β의 활성을 억제시킨다. 따라서 본 실험에서 이러한 PI3K 경로에 대한 저산소성 환경 및 텔로머라제 펩티드의 효과를 확인하기 위해 phosphorylated Akt (pAkt) (Ser473), phosphorylated glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) (Ser9), B cell lymphoma-2 (Bcl-2), 및 cleaved caspase-3 (Asp175)의 발현량을 프로테오믹스 및 웨스턴 블랏 실험으로 확인하였다 (도 9 및 도 11 참조).

실시예 4-1. 프로테오믹스

실험예 4-1-1. 단백질 샘플 준비

배양한 신경줄기세포는 PBS로 세척 후 분해 용액 (7M urea, 2M Thiourea containing 4%(w/v) 3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS), 1%(w/v) dithiothreitol (DTT), 2%(v/v) pharmalyte, and 1mM benzamidine)으로 처리한 후 10초간 Sonoplus (Brandelin electronic, Germany)를 이용하여 초음파 처리하였다. 단백질 추출 후, 1시간 동안 15,000 x g 에서 원심분리 수행하였다. 용해된 샘플은 2D 겔 전기영동법을 실시하였고, 단백질 농도는 브래드포드 (Bradford)를 실시하였다.

실험예 4-1-2. 2D 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법 (PAGE)

IPG dry strips (4-10 NL IPG, 24cm, Genomine, Korea)를 7M urea, 2M thiourea containing 2% 3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS), 1% dithiothreitol (DTT), and 1% pharmalyte 로 12내지 16시간 동안 표준화 한 후 200ug의 샘플로 처리하였다. Multiphor ll electrophoresis unit 과 EPS 3500 XL power supply (Amersham Bioscence)를 이용하여 등전점전기영동 (isoelectric focusing)을 실시하였다. Second dimention 수행 이전에 스트립을 equilibrium 버퍼 (50mM Tris-Cl, pH6.8 containing 6M urea, 2% SDS and 30% glycerol)로 10분간 배양하고 1% DTT 및 2.5% iodoacetamide로 표준화하였다. 표준화한 스트립은 SDS-PAGE 겔 (20 x 24cm, 10-16%)에 삽입 후, Hoefer DALT 2D 시스템 (Amersham Biosciences)을 사용하여 겔 전기영동을 실시하였다.

실험예 4-1-3. 이미지 분석

PDQuest (version 7.0, BioRad) 소프트웨어를 사용하여 디지털화한 이미지의 정량 분석을 실시하였다. 각 스팟의 정량은 total valid spot intensity를 사용하여 표준화 하였으며, 대조군의 발현 양상과 발현차이가 두 배 이상 벗어나는 스팟만 선택하였다 (도 9 참조).

실시예 4-2. 펩티드 질량 지문법 (Peptide Mass Fingerprinting) 실시

단백질을 식별하기 위해, 펩타이드 질량 지문법 (Peptide Mass Fingerprinting)을 사용하였다. 단백질 스팟을 트립신 (trypsin) (Promega, Madison, WI)을 사용하여 절개 및 분해 한 후, 50% acetonitrile/0.1% TFA의 alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid와 혼합한 후, Fernandez J et al에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 분석 (Microflex LRF 20, BrukerDaltonics) 을 수행하였다. 스펙트라 (spectra)는 스펙트럼당 300 샷으로 수집하였으며, Trypsin auto-digestion peak (m/z 842.5099, 2211.1046)을 이용하여 two point internal calibration으로 보정하였다. Flex Analysis 3.0을 사용하여 peak list를 작성하였으며, MASCOT (Matrixscience) 펩타이드 질량 지문법을 사용하여 단백질 식별을 하였다.

실시예 4-3. 웨스턴 블랏 (Western Blot) 실시

Ki67, p85α phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), phosphorylated Akt (pAkt) (Ser473), phosphorylated glycogen synthase kinase-3β (pGSK-3β) (Ser9), COX-2, cytosolic cytochrome c and cleaved caspase-3 (Asp175)의 레벨을 웨스턴 블랏을 통해 분석하였다 (도 11 참조). 5x10⁶세포들을 PBS 용액으로 세척 후 30분간 분해버퍼 (lysis buffer) buffer [50 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.02% sodium azide, 0.2% SDS, 100 μg/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF), 50 μl/ml aprotinin, 1% Igepal 630, 100 mM NaF, 0.5% sodium deoxy choate, 0.5 mM EDTA, 0.1 mM EGTA]로 처리하였다. 세포 핵 및 깨지지 않은 세포들은 원심분리를 통해 분리하였다. 미토콘드리아 및 세포질은 세포질 시토크롬 레벨 (cytosolic cytochrome C level) 분석을 위해 미토콘드리아/세포질 분핵 키트 (Mitochondria/Cytosol Fraction Kit) (Abcam, UK)를 사용하여 분리하였다. 8시간 동안 여러 농도의 GV1001 처리 후 Oxygen Glucose Deprivation 환경 조건에서 배양한 신경줄기세포들은 차가운 PBS 용액으로 세척 후, dithiothreitol (DTT)와 프로테아제 억제제 (protease inhibitors)를 포함한 1.0mL의 1 x 세포질 추출 버퍼 혼합 용액에 재부유하였다. 10분간 얼음에서 배양 후, 세포 현탁액은 30내지 50회 균질화 하고 10분간 4℃에서 3,000rpm으로 원심분리 실시하였다. 상층액은 30분간 13,000 rpm에서 미토콘드리아 분핵 (pellet)과 세포질 분핵 (supernatants)를 분리하기 위해 원심분리를 실시하였다. 미토콘드리아 펠렛은 isolation 버퍼 용액으로 한 번 세척 후, DTT와 프로테아제 억제제를 포함한 미토콘드리아 추출 버퍼에 용해하였다. 동일한 양 (30μg)의 단백질을 포함하는 샘플은 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide 겔 전기 영동법 (SDS-PAGE)를 사용하여 분해하고, nitrocellulose 세포막 (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)로 이동하였다. 세포막은 5% skim milk 로 차단하고 anti-Ki67 (1:200, Abcam, UK), anti-p85α PI3K (1:1000, Millipore), anti-pAkt (1:500, Cell Signaling, Beverly, MA, USA), anti-pGSK-3β (Ser9) (1:500, Cell Signaling, Beverly, MA, USA), anti-cytochrome c (1:200, Cell Signaling), and anti-cleaved caspase-3 (Asp 175) (1:1000, Cell signaling, Beverly, MA, USA)와 같은 특정한 1차 항체로 처리하였다. Nitrocellulose 세포막은 0.05% Tween-20 (TBST) 을 포함하는 Tris-buffered saline 으로 세척한 후, HRP 결합된 토끼 항체 또는 항 쥐 항체 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)로 처리 후, ECL detection (Amersham Pharmacia Biotech)을 수행 하였다. 블랏은 이미지 분석기 (GE Healthcare Image Quant LAS 4000)를 사용하여 정량 하였다.

실시예 4-4. 항체 마이크로 어레이 (Antibody microarray) 실시

Panorama Antibody Microarray Signaling 키트 (Sigma-Aldrich)를 사용하여 항체 마이크로 어레이를 실시하였다 (도 10 참조). 1.5x10⁷세포들을 100mm 배양접시에 분주한 후 1μM의 GV1001로 처리한 후 Oxygen Glucose Deprivation 조건에서 8시간 배양하였다. 배양한 세포들을 수집 후, Cy3 및 Cy5로 라벨 표시한 후, 항체 마이크로 어레이 (Sigma-Aldrich)를 분석하였다. GenePix Personal 4100A 스캐너 (Molecular Devices)를 사용하여 어레이 슬라이드를 스킨하였고, GenePix Pro 5.0 (Molecular Devices)를 사용하여 데이터 분석을 실시하였다.

실시예 5: 허혈성 동물모델에서의 텔로머라제 펩티드 처리에 의한 신경세포 보호효과 분석

실시예 5-1. 허혈성 손상 동물모델 제작

9주령 male SD 랫드 (rat) (한국 ㈜ 오리엔트 바이오)를 FORANE 를 이용하여 isofluran으로 마취시켰다. 마치된 랫드는 목 부위에 털을 제거하고 표피를 잘랐다. 침샘과 근육을 들어내고 common carotid artery (CCA)를 Silk를 이용하여 고정하였다. External Carotid artery (ECA) 또한 Silk로 묶어 artery를 막은 후, internal carotid artery (ICA)를 Silk로 고정하였다. ECA와 ICA 사이에 hole을 만든 후 2cm의 코팅된 나일론을 넣은 후 ICA를 ligation 하였다. 나일론이 삽입된 시간은 occlusion time으로 기록하였다. 1군은 대조군, 2군은 6um/ml, 3군은 30uM/ml, 4군은 60uM/ml을 투여하였다. GV1001을 투여 전 증상 여부를 확인 하기 위하여, Neurobehavioral function test를 실시하여 Stroke Surgery 후에 증상이 없는 모델은 각 군에서 제외 시켰다 (도 13 참조).

실시예 5-2. TTC 염색 실시

수술 24시간 후 랫드 희생하여 뇌를 분리하였다. 분리한 랫드 뇌는 brain mold에 놓은 후 2mm 간격으로 자른 후 2% TTC 용액에 약 20분간 담가두었다. 20분 후 3% 포름알데히드 용액으로 교체하였다. 상기와 같이 획득한 6개 뇌 조각은 스캐너를 이용하여 이미지를 획득하였다. Image J 프로그램을 이용하여 Brain 이미지에서 infarct volume이 형성된 자리를 측정하여 1개의 brain infarct volume을 산출하였다 (도 12 참조).

<110> KAEL-GEMVAX CO., LTD. KIM, Sangjae <120> Composition for preventing or treating cerebrovascular diseases comprising a telomerase peptide as an active ingredient <130> 14p261/ind <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 1132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser 1 5 10 15 His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly 20 25 30 Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg 35 40 45 Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60 Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu 65 70 75 80 Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val 85 90 95 Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro 100 105 110 Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr 115 120 125 Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val 130 135 140 Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val 145 150 155 160 Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr 165 170 175 Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly 180 185 190 Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg 195 200 205 Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg 210 215 220 Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg 225 230 235 240 Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp 245 250 255 Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val 260 265 270 Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala 275 280 285 Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His 290 295 300 Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro 305 310 315 320 Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly 325 330 335 Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro 340 345 350 Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser 355 360 365 Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln 370 375 380 Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His 385 390 395 400 Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg 405 410 415 Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln 420 425 430 Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu 435 440 445 Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe 450 455 460 Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser 465 470 475 480 Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser 485 490 495 Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met 500 505 510 Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys 515 520 525 Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe 530 535 540 Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe 545 550 555 560 Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr 565 570 575 Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His 580 585 590 Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln 595 600 605 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 610 615 620 Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val 625 630 635 640 Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser 645 650 655 Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg 660 665 670 Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg 675 680 685 Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro 690 695 700 Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile 705 710 715 720 Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln 725 730 735 Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His 740 745 750 Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser 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Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly 965 970 975 Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn 980 985 990 Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln 995 1000 1005 Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln 1010 1015 1020 Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala 1025 1030 1035 1040 Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu 1045 1050 1055 Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp 1060 1065 1070 Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr 1075 1080 1085 Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser 1090 1095 1100 Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn 1105 1110 1115 1120 Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp 1125 1130

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 텔로머라제 펩티드를 유효성분으로 포함하는 뇌혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 텔로머라제 펩티드는 Ki67, pAKT, HSTF-1 또는 phopho-GSK-3 β단백질의 발현을 조절하는 것을 특징으로 하는 뇌혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 텔로머라제 펩티드의 함량은 0.1μg/ml 내지 1mg/ml인 뇌혈과 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제에서 선택된 하나 이상을 포함하는 뇌혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 뇌혈관 질환은 뇌졸중, 뇌경색 및 뇌출혈 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 뇌혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 뇌혈관 질한 예방 또는 치료용 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 뇌혈관 질환의 예방 및 치료방법.