KR102268955B1

KR102268955B1 - 항분비 인자 17

Info

Publication number: KR102268955B1
Application number: KR1020197004698A
Authority: KR
Inventors: 스테판 랑게
Original assignee: 란트만넨 아스-팍토르 아베
Priority date: 2016-07-18
Filing date: 2017-07-18
Publication date: 2021-06-25
Also published as: CN109563142A; MX2019000594A; JP2019524742A; JP6999638B2; US20190345210A1; US11407796B2; CA3030316A1; WO2018015379A1; ES2886642T3; KR20190029703A; NZ749158A; EP3484909A1; CA3030316C; EP3484909B1; AU2017299131B2; AU2017299131A1

Abstract

본 발명은 적어도 1.8시간의 t_1/ ₂을 갖는 단리된 재조합 또는 합성 제조된 항분비 인자(AF: Antisecretory Factor) 17이라고 불리는 신규 펩티드에 관한 것이다. 상기 펩티드는, 예를 들어, 동물 및 인간에서 병리학적 체액 수송 또는 염증 반응을 정상화하는데 유용하다. AF-17 및 AF-17의 약학 조성물은, 예를 들어, TBI 및/또는 TBI와 관련된 2차 뇌 손상의 치료 및/또는 예방뿐 아니라, 후천적 뇌 손상의 치료 및/또는 예방, 그리고 암 치료의 최적화에도 사용될 수 있다.

Description

항분비 인자 17

항분비 인자(AF: antisecretory factor)는 염증을 억제하고 체액 수송을 조절하는 단백질 복합체이다. AF 복합체는 변형된 프로테아좀에 존재한다. 항분비 인자(AF) 단백질 서열상의 아미노산 위치 35 내지 50에 위치하는 항설사 서열 AF-16을 포함하는 합성 펩티드는 이미 특성화되었다(WO 97/08202호; WO 05/030246호). AF16은 혈장에서 빠르게 분해되는 것으로 알려져 있다. 본 발명은 AF-16의 디술피드를 신속하게 형성하여 아미노산 위치 2(C2)에서 시스테인 디술피드를 포함하는 AF-16(이하 AF-17이라 불림)을 생성하는 혈장에서의 AF-16의 주요 대사 과정을 개시한다. 가역성인 이 작용은 분명히, 신속한 펩티다아제 분해로부터 AF16을 보호한다. 이러한 놀라운 통찰에 기초하여, 본 발명은 최초로 AF-17을 포함하는 합성 펩티드를 개시하며, 이는 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 때 실질적으로 연장된 AF16의 반감기를 제공한다.

항분비 인자( AF )

항분비 인자(AF)는 본래 설사증 및 장내 염증의 예방을 제공하는 것으로 기재되었던 41 kDa 단백질이다(검토를 위해, 문헌[The antisecretory factor: synthesis, anatomical and cellular distribution, and biological action in experimental and clinical studies. Int Rev Cytol, 2001. 210: p. 39-75.] 참조). 항분비 인자(AF) 단백질은 서열 분석되었으며 그 CDNA는 클로닝되었다. 항분비 활성은 항설사 서열의 적어도 4∼16, 예를 들어, 특히 4, 6, 7, 8 또는 16개의 아미노산을 포함하는 항분비 인자(AF) 단백질 서열상의 아미노산 위치 35 내지 50(즉, 항설사 서열/공통 서열)에 위치하는 펩티드에 의해 주로 발휘되는 것으로 보인다. 면역화학적 및 면역조직화학적 조사는 항분비 인자(AF) 단백질이 존재하며 또한 체내에서 대부분의 조직 및 기관에 의해 합성될 수 있다는 것을 밝혔다. 항설사/공통 서열 또는 이의 단편을 포함하는 합성 펩티드는 이전에 특성화되었다(WO 97/08202호; WO 05/030246호). 항분비 인자(AF) 단백질 및 펩티드는 이전에, 예를 들어 콜레라 독소의 투여 후 장에서 그리고 중추신경계 내의 맥락총에서, 병리학적 체액 수송(pathological fluid transport) 및/또는 염증 반응을 정상화하는 것으로 개시되었다(WO 97/08202호). 따라서, AF의 내인성 합성 또는 첨가된 AF의 흡수를 유도하는 능력을 가진 식품 및 사료가, 예를 들어 WO 97/08202호에서, 부종, 설사, 탈수 및 염증의 치료에 유용한 것으로 제안되었다. WO 98/21978호는 항분비 인자(AF) 단백질의 형성을 유도하는 식품의 생산을 위한 효소 활성을 갖는 생성물의 용도를 개시한다. WO 00/038535호는 천연 항분비 인자(AF) 단백질(NASP: native antisecretory factor protein)이 풍부한 식료품을 추가로 개시한다.

항분비 인자(AF) 단백질 및 이의 단편은 또한 세포의 손실 및 획득과 관련된 병태의 치료에서 신경 조직의 복구, 및 줄기세포, 간세포(progenitor cell) 및 이로부터 유도된 세포의 증식, 세포 자멸사, 분화 및/또는 이동을 개선하고(WO 05/030246호), 구획 증후군의 치료 및/또는 예방(WO 07/126363호)에서와 같이 고안압증의 치료 및/또는 예방에도 동일하게 효과적임(WO 07/126364호)이 밝혀졌다.

본 발명자들은 AF가 막 내 지질 래프트, 수용체 및/또는 카베올라(caveola)의 구조, 분포 및 다중 기능을 모니터하고/거나 이에 유익하게 영향을 미치며, 따라서 세포막 내의 지방 래프트 및/또는 카베올라의 구조적 해체 및 기능장애의 치료 및/또는 예방에 유용할 수 있음을 추가로 밝혔다(WO 07/126365호).

또한, 본 발명자들은 동일한 항분비 인자(AF) 단백질뿐 아니라, 이의 펩티드 및 단편이 막횡단 단백질의 생물학적 활성화, 예를 들어, FAK 및 CAP를 통한 NKCC1에 개입할 수 있으며, 따라서, 병리학적 및/또는 교란된(perturbed) 세포에서 이온 채널의 병리학적 활성을 직접 조절할 수 있어, 상기 세포에서 세포 내 압력 및 막 횡단 단백질 기능을 효과적으로 정상화하고, 이에 따라, 예를 들어 암 요법에서, 사용되는 약물 흡수를 향상시킨다는 것을 입증할 수 있었다(WO 2010/093324호).

본 발명자들은 혈액으로부터 AF1(항분비 인자 1)로 명명된 단백질을 단리하고 이의 코딩 유전자를 서열 분석하였다. 나중에, AF1은 19S 프로테아좀 서브유닛의 구성 요소임이 밝혀졌으며, 그에 따라 PSMD4, RPN10 또는 S5a로 명명되었다. 또한, 박테리아 엔테로톡신 및 가공 곡물이 장의 염증 및 체액 분비를 억제하는 항분비 인자(AF)의 변형된 형태를 유도할 수 있음을 보였다. 이 변형된 형태의 AF는 다당류 아가로오스에 결합하는 것으로 밝혀졌다. α- 메틸 글루코시드로 용리한 후, 그 농도를 ELISA로 측정할 수 있었다.

놀랍게도, 최근에 프로테아좀이 가공 곡물(SPC) 섭취 후 보체 인자 C3과 반응한다는 것이 입증되었다. 이 반응은 이전에는 은폐된 항분비 에피토프를 노출시키고, 프로테아좀/보체 복합체 형성은 C3을 이의 비활성 형태 C3c로 분리시킨다.

따라서, AF-16의 투여가 유익할 질병은 많다. 불행히도, 투여되었을 때 환자의 체내에서 매우 짧은 반감기를 갖는 것으로 나타났다.

본 발명은 투여되었을 때 환자의 체내에서 실질적으로 연장된 반감기를 갖는 단리된, 재조합 또는 합성 제조된 보호된 AF16 대사 산물(본원에서는 AF-17로 지칭함)을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 3에 나타낸 아미노산 서열(AF-16) 및 서열 번호 3의 아미노산 위치 2에 시스테인 디술피드를 포함하며, 항분비 활성을 갖는, 이후에 AF-17(서열 번호 7에 나타냄)로 지칭되는 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드, 또는 동등한 기능적 활성을 갖는 그의 약학적 활성 염에 관한 것이다.

다양한 종에서 AF16의 상대적인 안정성은 [도 12]에 나타낸다. 본원에서 최초로 문서화된 바와 같이, 종과 관계없이, AF16은 시험관 내 반감기(t_1/2)가 10분 이하로 신속하게 사라진다. 또한, 본 발명자들은 최초로, 투여 후 펩티드 AF-16의 분자 운명을 결정할 수 있었으며, 이로써 AF의 약리학적 작용의 약물 동태학적 기초에 대해 완전하게 이해하고 시험관 내 반감기(t_1/2)가 개선된 신규 AF 펩티드(AF-17)을 개발하여, 활성 AF 물질을 필요로 하는 환자에게 투여한 후에 이의 운명을 모니터하기 위한 수단을 개선하고 결과적으로 활성 물질 AF 및/또는 AF 펩티드의 투여 요법을 최적화하기 위한 수단을 개선할 수 있었다.

본 발명은 최초로, AF16의 시스테인 디술피드(AF-17)로서 AF의 주요 대사 산물을 확인한다. 가역성인 AF16의 신속한 디술피드 형성은 분명히, 신속한 펩티다아제 분해로부터 AF16을 보호하며, 이는 AF16이 훨씬 높은 정도로 완전하게 그의 표적에 도달하도록 할 수 있는 보호 기능이고/거나, 이는 활성 AF 물질을 필요로 하는 환자에게 투여한 후에 이의 운명을 모니터하기 위한 수단을 개선하고 결과적으로 활성 물질 AF 및/또는 AF 펩티드의 투여 요법을 최적화한다.

본원에서 밝혀진 바와 같이, 본 발명자들은 최초로, AF-17를 합성하고 이의 시험관 내 약물 동태학 특성을 연구하여, AF-17이 이를 필요로 하는 환자에게 직접 투여될 수 있고, AF-17이, 예를 들어 실험 3에서 나타낸 바와 같이, 콜레라 독소 투여 후 장내에서 같이, 병리학적 체액 수송 및/또는 염증 반응을 정상화하는 데에 적어도 AF-16 만큼 효과적이라는 것을 입증한다. AF-16은 병리학적 체액 수송 및/또는 염증 반응의 정상화, TBI, 종양 및/또는 종양 관련 합병증의 치료 및/또는 예방, 암, 구획 증후군 교모세포종, 당뇨병 및 설사의 치료, 주어진 약물, 예컨대 소분자 약물의 세포 흡수의 최적화, 신경 보호, 그리고 카베올라의 정상화로부터 선택되어(이에 제한되지 않음), 매우 다양한 질환 및 병태에서 효과적임이 앞서 밝혀졌고, AF-17이 AF-16의 자연 발생 대사 산물임을 고려하면, AF-16이 효과적임이 공지된 동일한 질환 및/또는 병태를 치료하는데 본원에 개시된 AF-17이 적어도 AF-16 만큼 효과적이라고 추정할 수 있다.

따라서, 본 발명은 항분비 인자(AF) 단백질(AF-17)로 이루어진, 이를 포함하는, 이로부터 유래된 및/또는 이에 기초한 신규의 개선된 단리된 재조합 또는 합성의 활성 펩티드 및 약제에 있어 이의 용도를 개시한다. 특히, 본 발명은 외상성 뇌 손상(TBI: Traumatic Brain Injury)을 치료하기 위한 본원에서 기술된 AF-17의 용도에 관한 것이다.

더욱이, 수년 동안 항분비 단백질(AF)에 대한 광범위한 연구로부터 잘 알려진 바와 같이, 내인성 단백질은 단백질의 핵심 활성 서열(AF-6, 서열 번호 2에 나타냄)이 완전하기만 한다면 모두 유사한 항분비 효과가 입증된 더 작은 많은 펩티드로 전사 후 프로세싱(processing)된다. 따라서 자연환경에서 항분비 단백질(AF)이 AF-6을 포함하는 더 작은 펩티드로 분해되고/거나 전사 후 프로세싱될 것이며, 더 작은 펩티드의 대사 산물이 AF-16의 관찰된 운명과 유사하게 적어도 AF-6의 유일한 시스테인에서, 즉 서열 번호 2에 나타낸 바와 같이 AF-6의 아미노산 위치 1에서 디술피드에 의해 또한 보호될 것은 당연하다.

따라서, 본 발명은 또한 서열 번호 1에 나타낸 항분비 인자(AF) 단백질(AF)의 단편 및/또는 동등한 활성을 갖는 그의 상동체에 상응하며, 적어도 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열(AF-6)을 포함하고 서열 번호 2의 아미노산 위치 1에 시스테인 디술피드를 포함하며, 항분비 활성을 갖고, 서열 번호 1에 나타낸 항분비 인자(AF)의 단백질(AF)의 동일한 단편 및/또는 그의 상동체로 이루어지고 서열 번호 2의 아미노산 위치 1에 시스테인을 포함하지 않는 펩티드와 비교하여 개선된 시험관 내 반감기(t_1/2)를 갖는, 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드, 또는 동등한 기능적 활성을 갖는 그의 약학적 활성 염에 관한 것이다.

바람직한 본 실시양태에서, 본 발명의 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드는 서열 번호 3에 나타낸 아미노산 서열(AF-16) 및 서열 번호 3의 아미노산 위치 2에 시스테인 디술피드를 포함한다.

본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드는 6∼25 개의 아미노산 길이, 바람직하게는 7∼17, 6∼16, 7∼20, 7∼17, 16∼25, 16∼20, 17∼20, 17∼25, 예를 들어 6, 7, 8, 9, 16 또는 17 개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 이는 적어도 6, 7, 16 또는 17 개의 아미노산 길이 및/또는 많아야 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 개의 아미노산 길이이다.

본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드는 전형적으로 서열 번호 7에 나타낸 아미노산 서열(VC(C)HSKTRSNPENNVGL), 또는 서열 번호 8에 나타낸 아미노산 서열(C(C)HSKTR)), 또는 서열 번호 9에 나타낸 아미노산 서열(VC(C)HSKTR)을 포함한다.

본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드는 전형적으로 서열 번호 7에 나타낸 아미노산 서열(VC(C)HSKTRSNPENNVGL), 또는 서열 번호 8에 나타낸 아미노산 서열(C(C)HSKTR)), 또는 서열 번호 9에 나타낸 아미노산 서열(VC(C)HSKTR)로 이루어진다.

본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드는 전형적으로 t_1/2이 적어도 0.2시간, 바람직하게는 적어도 0.25시간, 0.3시간, 0.4시간, 0.5시간, 1시간, 또는 1.5시간, 1.9시간, 2.0시간, 2.5시간, 예를 들어 t_1/ ₂이 적어도 1.8시간이다.

또한, 본 발명은 약제에 사용하기 위한, 예를 들어 병리학적 체액 수송, 감염, 염증, 염증 반응, TBI, TBI 관련 병태, 종양, 종양 관련 합병증, 암, 구획 증후군, 교모세포종, 당뇨병 및 설사로 이루어진 목록으로부터 선택된 질환 및 병태를 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 활성 물질의 세포 흡수의 최적화, 신경 보호 및/또는 카베올라의 정상화를 위한 본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드 및 적합한 약학 담체를 포함하는 약학 및/또는 화장품 조성물이 고려된다.

본 발명에 따른 약학 및/또는 화장품 조성물은 병리학적 체액 수송, 감염, 염증, 염증 반응, TBI, TBI 관련 병태, 종양, 종양 관련 합병증, 암, 구획 증후군, 교모세포종, 당뇨병, 및 설사로 이루어진 목록으로부터 선택된 질환 및 병태를 치료 및/또는 예방하는 데 있어서의 용도를 목적으로 한다. 본 발명은 또한 활성 물질의 세포 흡수의 최적화, 신경 보호 및/또는 카베올라의 정상화를 위한 본 발명에 따른 약학 및/또는 화장품 조성물에 관한 것이다.

또한, 병리학적 체액 수송 및/또는 염증 반응의 정상화를 필요로 하는 환자에서 병리학적 체액 수송 및/또는 염증 반응의 정상화 방법, 및/또는 활성 성분의 세포 흡수의 최적화, 신경 보호 및/또는 카베올라의 정상화를 위한 방법, 및/또는 병리학적 체액 수송, 감염, 염증 반응, TBI, TBI 관련 병태, 종양, 종양 관련 합병증, 암, 구획 증후군, 교모세포종, 당뇨병 및 설사로 이루어진 목록으로부터 선택된 질환 및 병태를 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 동물 또는 인간에게 본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드 또는 상기 펩티드를 포함하는 약학 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 서열 번호 7, 8 또는 9에 나타낸 아미노산 서열을 본질적으로 갖는 펩티드에 대한 항체뿐만 아니라, 포유류 및 인간을 비롯한 동물과 같은 생물체에서 상기 단백질 또는 그의 상동체 또는 단편을 검출하는 데 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.

또한, 본원에서 서열 번호 1 내지 9 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열을 본질적으로 갖는 펩티드로서 적어도 서열 번호 1의 아미노산(aa) 위치 36, 서열 번호 2의 aa 위치 1, 서열 번호 3의 aa 위치 2, 및/또는 서열 번호 4의 aa 위치 2에서 적어도 하나의 시스테인 디술피드를 포함하는 펩티드를 코딩하는 핵산의 상응하는 펩티드를 제조하기 위한 용도를 제공한다.

도 1
시스테인의 산화. A: 술펜산, B: 술핀산, C: 술폰산
도 2
AF16의 N-에틸 말레이미드 유사체(AF16-NEM)
도 3
AF16 (A) 및 AF16-NEM (B)의 인간 혈장 및 완충액 안정성
도 4
인간 혈장에서 LC-MS로 검출된 AF16의 분해 산물
도 5
Caco-2 세포의 존재하에서 AF16 분해. +PI는 프로테아제 억제제 칵테일을 나타낸다.
도 6
Caco-2 세포의 존재하에서 AF16 분해의 대사 산물 형성 동역학. 청색 마름모 AF16. 적색 사각형 AF16 + 억제제 칵테일
도 7
Caco-2 세포의 존재하에서 AF16 분해의 대사 산물 형성 동력학. 청색 마름모 AF16. 적색 사각형 AF16 + 억제제 칵테일
도 8
Caco-2 세포의 존재하에서 AF16 분해의 대사 산물 형성 동력학. 청색 마름모 AF16. 적색 사각형 AF16 + 억제제 칵테일
도 9
Caco-2 세포의 존재하에서 AF16의 분해. 결정된 구조물의 제안된 경로
도 10
10℃에서 20시간에 걸친 상이한 침전 방법에 따른 AF16의 상대적인 안정성
[도 10]은 동일한 샘플을 20시간에 걸쳐 3회 반복 주입한 결과를 나타낸다. TCA와 MeCN은 시간 경과에 따라 양호하고 명백한 안정성을 나타냄이 명백하다. 20시간에 ZnO₄와는 약간의 손실이 나타난다. 시간 경과에 따라 MeOH과는 상당한 손실이 나타난다. 아마도, AF16은 MeOH과는 안정하지만, 펩티드의 용해도가 알콜성 혼합물에서 제한될 수 있다고 알려져 있기 때문에 펩티드 침전으로 인해 손실된다.
도 11
10℃에서 20시간에 걸친 상이한 침전 방법에 따른 AF16의 상대적인 안정성
[도 11]은 MS 강도(이온 카운트)의 관점에서 상기에서 획득된 데이터를 서로 비교하여 다이어그램으로 나타낸다. TCA 침전은 가장 강한 신호를 나타내었고 기준으로 설정되었다. 비유기적 방법이 뒤떨어짐이 분명하며, 이는 아마도 동시에 용출되는 억제 이온으로 인한 것일 것이다. 최상의 안정성을 갖는 두 가지 방법(TCA 및 MeCN)은 민감도에서 500배 넘는 차이를 나타내므로 계속적인 연구를 위해 TCA를 선택하여 연구 전체에 사용하였다.
도 12
10℃에서 20시간에 걸친 상이한 침전 방법을 이용한 AF16의 상대적인 안정성
도 13
인간(위) 및 래트(아래) 혈장에서 AF16 및 확인된 대사 산물의 동역학
도 14
592.3/594.4 대사 산물의 증강 해상도 스캔
도 15
혈장 침전제로서 ZnSO₄ 및 +/- DTT를 사용한 AF16 및 확인된 대사 산물의 동역학. A: 인간 + DTT, B: 인간 - DTT, C: 래트 + DTT 및 D: 래트 - DTT. AF16은 채워진 원으로 표시된다.
도 16
인간 혈장에서 확인된 주요 생성물의 상대적인 형성
도 17
래트 혈장에서 확인된 주요 생성물의 상대적인 형성
도 18
서열 목록

정의 및 약어

약어

IFP(interstitial fluid pressure): 간질액 압력;

PBS(phosphate buffered saline): 인산염 완충 식염수;

AF: 항분비 인자, 전장 AF 단백질(서열 번호 1에 나타냄);

AF-6: 헥사 펩티드 CHSKTR(서열 번호 2에 나타냄);

AF-7: 아미노산 C(C)HSKTR로 구성된 펩티드(서열 번호 8에 나타냄);

AF-16: 아미노산 VCHSKTRSNPENNVGL로 구성된 펩티드(서열 번호 3에 나타냄);

AF-17: 아미노산 VC(C)HSKTRSNPENNVGL로 구성된 펩티드(서열 번호 7에 나타냄);

AF-8: 셉타 VCHSKTR(서열 번호 4에 나타냄);

AF-9: 아미노산 VC(C)HSKTR로 구성된 펩티드(서열 번호 9에 나타냄);

옥타 펩티드 IVCHSKTR(서열 번호 5에 나타냄);

펩타 펩티드 HSKTR(서열 번호 6에 나타냄);

SPC(Specially Processed Cereals): 특수 가공 곡류;

RTT: AF(ASP)의 함량을 측정하기 위한 SE 9000028-2호(공개 번호 466331호)에 공개된 래트의 소장에서 표준화된 분비 반응의 측정 방법;

AF: 항분비 인자;

ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay): 효소 결합 면역 흡착 분석;

PBS(phosphate buffered saline): 인산 완충 식염수;

AP(alkaline phosphatase): 알칼리 포스파타아제;

BSA(bovine serum albumin): 소 혈청 알부민;

mAb(monoclonal antibody): 단클론 항체 ;

LC-MS/MS: 나노플로우 액체 크로마토그래피-이중 질량 분석(nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry);

PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis): 폴리아크릴아미드 겔 전기영동;

HSV1(herpes simplex virus-1): 단순 포진 바이러스-1;

TBI: 외상성 뇌 손상

정의

단백질은 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 아미노산 잔기로 구성된 생물학적 거대분자이다. 아미노산의 선형 중합체로서 단백질은 폴리펩티드로도 지칭된다. 전형적으로, 단백질은 50∼800개의 아미노산 잔기를 가지므로 약 6,000 내지 약 수십만 달톤 이상의 범위의 분자량을 가진다. 작은 단백질은 펩티드, 폴리펩티드 또는 올리고펩티드로 지칭된다. 용어 "단백질", "폴리펩티드", "올리고펩티드" 및 "펩티드"는 본원에서 호환적으로 사용될 수 있다. 펩티드는 매우 적은 수의 아미노산 잔기, 예를 들어 2∼50개의 아미노산 잔기(aa)를 가질 수 있다.

용어 "항분비"는 본원에서 분비 및/또는 체액 수송을 억제하거나 감소시키 것을 지칭한다. 본원에서, 용어 "항분비 인자 단백질", "항분비 인자(AF) 단백질", "AF-단백질", AF, 또는 그의 상동체, 유도체 또는 단편은 WO 97/08202호에서 정의된 바와 같은 용어 "항분비 인자" 또는 "항분비 인자 단백질"과 호환적으로 사용될 수 있고, 이는 항분비 인자(AF) 단백질 또는 펩티드 또는 항분비 및/또는 동등한 기능적 및/또는 유사한 활성을 갖는 그의 상동체, 유도체 및/또는 단편, 또는 상기 폴리펩티드의 기능을 변경시키지 않는 이의 변형을 지칭한다. 그러므로 본원에서 "항분비 인자", "항분비 인자 단백질", "항분비 펩티드", "항분비 단편", 또는 "항분비 인자(AF) 단백질"은 또한 이의 유도체, 상동체 또는 단편을 지칭할 수 있는 것으로 이해해야 한다. 이들 용어는 모두 본 발명의 명세서에서 호환적으로 사용될 수 있다. 더욱이, 본원에서, 용어 "항분비 인자"는 "AF"로 약칭될 수 있다. 본원에서 항분비 인자(AF) 단백질은 또한 이전에 WO97/08202호 및 WO 00/38535호에서 정의된 바와 같은 항분비 특성을 갖는 단백질을 지칭한다. 항분비 인자는 또한 예를 들어, WO 05/030246호에 개시되었다.

SPC ^ⓒ는 특수 가공 곡물(SPC)을 포함하는 의료용 식품이다.

본원에서, "의료용 식품"은 항분비 인자(AF) 단백질과 함께 제조되거나, 대안적으로, 내인성 AF의 합성 및/또는 활성화를 유도하는 능력을 가진 식품, 사료 또는 식품 보충제, 또는 특별 식이 용도의 식품을 지칭한다. 상기 식품은 유체 또는 고체 형태, 예를 들어 액체 또는 분말의 임의의 적합한 식품, 또는 임의의 다른 적합한 식료품일 수 있다. 그러한 물질의 예는 WO 0038535호 또는 WO 91/09536호에서 찾아볼 수 있다.

또한, 용어 항분비 인자로 의도된 살로붐 ( Salovum ) ^ⓒ은 예를 들어, SE 900028-2호 및 WO 00/38535호에서 개시되고 하기에 추가로 설명된 바와 같은, 고함량의 항분비 인자(NASP)를 갖는 난황에 제공될 수 있는 천연 항분비 인자(NASP)이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 최초로, AF16의 시스테인 디술피드(AF-17)로서 AF의 주요 대사 산물을 확인한다. 가역성인 AF16의 신속한 디술피드 형성은 분명히, 신속한 펩티다아제 분해로부터 AF16을 보호하고, 이는 AF16이 훨씬 높은 정도로 완전하게 그의 표적에 도달하도록 할 수 있는 보호 기능이며, 활성 AF 물질을 필요로 하는 환자에게 투여한 후 이의 운명을 모니터하기 위한 수단을 개선하고 결과적으로 활성 AF 성분, 전장 AF, AF의 단편 및/또는 AF 펩티드의 투여 요법을 최적화한다. 본원에서 최초로 문서화된 바와 같이, 시험관 내 반감기(t_1/2)가 개선된 신규의 합성 제조되거나 단리된 재조합 AF 펩티드(AF-17)를 개시하며, 이는 활성 AF 물질의 투여를 필요로 하는 환자에게 투여한 후 활성 AF 물질의 운명을 모니터하기 위한 수단을 개선하고 결과적으로 활성 AF 및/또는 AF 펩티드의 투여 요법을 최적화하기 위한 수단을 개선할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 3에 나타낸 아미노산 서열(AF-16) 및 서열 번호 3의 아미노산 위치 2에 시스테인 디술피드를 포함하며, 항분비 활성을 갖는, 이후 AF-17(서열 번호 7에 나타냄)로 지칭되는 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드 또는 동등한 기능적 활성을 갖는 그의 약학적 활성 염에 관한 것이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열(AF-6) 및 서열 번호 3의 아미노산 위치 1에 시스테인 디술피드를 포함하며, 항분비 활성을 갖는, 이후 AF-7(서열 번호 8에 나타냄)로 지칭되는 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드 또는 동등한 기능적 활성을 갖는 그의 약학적 활성 염에 관한 것이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 4에 나타낸 아미노산 서열(AF-8) 및 서열 번호 4의 아미노산 위치 2에 시스테인 디술피드를 포함하며, 항분비 활성을 갖는, 이후 AF-9(서열 번호 9에 나타냄)로 지칭되는 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드 또는 동등한 기능적 활성을 갖는 그의 약학적 활성 염에 관한 것이다.

본원에서 밝혀진 바와 같이, 본 발명자들은 최초로, 예를 들어 실험 3에서 나타낸 바와 같이, 콜레라 독소 투여 후 장내에서 같이, 병리학적 체액 수송 및/또는 염증 반응을 정상화하는데에 적어도 AF-16 만큼 효과적인 본 발명에 따른 펩티드를 개시한다. 본 발명에 따른 펩티드는 병리학적 체액 수송 및/또는 염증 반응의 정상화, TBI, 종양 및/또는 종양 관련 합병증의 치료 및/또는 예방, 암, 구획 증후군 교모세포종, 당뇨병 및 설사의 치료, 주어진 약물의 세포 흡수의 최적화, 신경 보호, 그리고 카베올라의 정상화로부터 선택되어(이에 제한되지 않음), 매우 다양한 질환 및 병태에서 효과적이다.

따라서, 본 발명은 항분비 인자(AF) 단백질(AF-17)로 이루어진, 이를 포함하는, 이로부터 유래된 및/또는 이에 기초한 신규의 개선된, 단리된 재조합 또는 합성 활성 펩티드 및 약제에 있어 이의 용도를 개시한다. 특히, 본 발명은 병리학적 체액 수송, 감염, 염증, 염증 반응, TBI, TBI 관련 병태, 종양, 종양 관련 합병증, 암, 구획 증후군, 교모세포종, 당뇨병 및 설사로 이루어진 목록으로부터 선택된 질환 및 병태의 치료 및/또는 예방, 활성 물질의 세포 흡수의 최적화, 또는 신경 보호 및/또는 카베올라의 정상화를 위한, 본원에서 기재된 AF-17, AF-7 및/또는 AF-9의 하나 이상의 조합의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 항분비 인자(AF) 단백질(AF-17)로 이루어진, 이를 포함하는, 이로부터 유래된 및/또는 이에 기초한 신규의 개선된, 단리된 재조합 또는 합성 활성 펩티드, 특히 항분비 인자(AF) 17로 불리는 신규 펩티드를 개시한다. 펩티드는 예를 들어 인간을 포함한 동물에서 병리학적 체액 수송 및/또는 염증 반응을 정상화하는 데 사용된다. 또한, AF-17은 면역 검출, 성장 동물을 위한 사료 첨가제 및 부종, 탈수 및/또는 염증과 관련된 질환에 대한 설사약 및 약물로서 사용될 수 있다.

항분비 인자

항분비 인자는 체내에서 자연적으로 발생하는 단백질의 한 부류이다. 인간 항분비 인자 AF 단백질은 뇌하수체에서 단리될 때 382∼288개의 아미노산을 포함하는 41 kDa 단백질이다. 본 발명에 따른 활성 부위는 항분비 인자(AF) 단백질 서열상에 단백질의 N-말단에 가까운 영역, 특히 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 163, 보다 구체적으로는 아미노산 서열 위치 35 내지 50에서 단백질에 위치될 수 있다. AF의 생물학적 효과는 상기 공통 서열의, 서열 번호 2(AF-6)에 나타낸 바와 같이, 적어도 6개의 아미노산을 포함하는, 또는 폴리펩티드 및/또는 펩티드의 생물학적 기능을 변경시키지 않는 이의 변형을 포함하는 임의의 펩티드 또는 폴리펩티드에 의해 발휘된다.

본 발명자들은 항분비 인자가 모든 세포에서 주요한 구성 요소, 26 S 프로테아좀, 보다 구체적으로는 19 S/PA 700 캡의 서브유닛을 구성하는 단백질 S5a 및 Rpn10과 어느 정도 상동성이 있음을 보였다. 본 발명에서, 항분비 인자(AF) 단백질은 동일한 기능적 특성을 갖는 상동 단백질의 부류로서 정의된다. 항분비 인자는 또한 트롬보스폰틴-1에 결합한다고 알려지고 암의 진행과 관련된 또 다른 단백질 이소형인 안지오시딘과 매우 유사하다.

본 발명에 따른 항분비 인자(AF) 단백질 및/또는 펩티드의 상동체, 유도체 및 단편은 모두 유사한 생물학적 활성을 갖는다. 본원에서 상동체, 유도체 및 단편은 자연 발생 항분비 인자(AF) 단백질의 것들에 상응하는 적어도 6개의 아미노산(서열 번호 2에 나타냄)을 포함하며, 이들은 또한 폴리펩티드 및/또는 펩티드의 본질적인 생물학적 기능을 변경시키지 않고 항분비 인자의 생물학적 활성을 최적화하기 위하여 하나 이상의 아미노산을 변화시켜 변형될 수 있다.

본원에서 유도체는 하나 이상의 아미노산이 변형된 또는 비천연 아미노산일 수 있는 또 다른 아미노산으로 치환된 부분 치환 또는 변형에 의해 또는 직접적으로 또 다른 물질로부터 유도된, 본원에서 정의된 바와 같은 항분비 인자와 동등한 활성 및/또는 기능적 동등한 활성을 갖는 단백질로 의도된다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항분비 인자 유도체는 N 말단 보호기 및/또는 C 말단 보호기를 포함할 수 있다. N 말단 보호기의 한 예는 아세틸을 포함한다. C 말단 보호기의 한 예는 아미드를 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 항분비 인자(AF) 단백질, 펩티드, 상동체, 유도체 및/또는 단편의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한, 예를 들어 적어도 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 임의의 아미노산 서열은 또한 본 발명의 범위 내인 것으로 간주한다.

기준 아미노산 서열과 적어도, 예를 들어 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질, 그의 상동체, 유도체, 펩티드 및/또는 단편은, 아미노산 서열이 기준 아미노산 서열의 각 100개의 아미노산마다 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 점을 제외하고는, 예를 들어 펩티드의 아미노산 서열이 기준 서열과 동일하다는 것으로 의도된다. 달리 말하면, 기준 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 수득하기 위해, 기준 서열 내 아미노산의 5% 이하가 결실되거나 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있거나, 기준 서열 내 전체 아미노산의 5% 이하의 아미노산의 개수가 기준 서열에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이러한 돌연변이는 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카복시 말단 위치에서 또는 이들 말단 위치 사이 어디에서든지 기준 서열 내의 아미노산 중에서 개별적으로 또는 기준 서열 내의 하나 이상의 인접한 그룹에서 산재되어 발생할 수 있다.

본 발명에서, 동일성을 결정하는데 국소 알고리즘 프로그램이 가장 적합하다. 국소 알고리즘 프로그램(예를 들어, 스미스 워터만(Smith Waterman))은 한 서열 내 부분 서열을 두 번째 서열의 부분 서열과 비교하여, 부분 서열의 조합 및 이들 부분 서열의 정렬을 찾아, 최고의 전체 유사성 점수를 산출한다. 내부 갭이 허용되는 경우 벌점이 부과된다. 국소 알고리즘은 단일 도메인, 또는 단지 하나의 결합 부위를 공통으로 가진 두 개의 다중 도메인 단백질을 비교하는데 적합하다.

동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용 가능한 프로그램으로 체계화되어 있다. 두 서열 사이의 동일성 및 유사성을 결정하는데 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J et al (1994)) BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul, S.F. et al (1990))가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 다른 공급처(BLAST Manual, Altschul, S.F. et al, Altschul, S.F. et al (1990))로부터 공개적으로 이용 가능하다. 각 서열 분석 프로그램은 디폴트(default) 스코어링 매트릭스와 디폴트 갭 벌점을 가진다. 일반적으로 분자생물학자들은 사용하는 소프트웨어 프로그램에 의해 설정된 디폴트 설정을 사용할 것으로 예상된다.

본원에서 정의된 항분비 인자(AF) 단백질 또는 펩티드 또는 동등한 활성을 갖는 그의 상동체, 유도체 및/또는 단편은 6개 이상의 아미노산, 예를 들어 6∼16개의 아미노산, 예를 들어 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 항분비 인자는 7, 9 또는 17개의 아미노산으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항분비 인자(AF) 단백질, 그의 상동체, 유도체, 펩티드 및/또는 단편은 6, 7, 8, 9, 15, 16 또는 17개의 아미노산으로 이루어진다.

바람직한 본 실시양태에서, 항분비 활성을 갖는 단리된 재조합 및/또는 합성 펩티드 AF-17(서열 번호 7에 나타냄), 또는 동등한 기능적 활성을 갖는 그의 약학적 활성 염은 서열 번호 3에 나타낸 아미노산 서열(AF-16) 및 서열 번호 3의 아미노산 위치 2에 시스테인 디술피드를 포함한다.

다른 바람직한 실시양태에서, 항분비 활성을 갖는 단리된 재조합 및/또는 합성 펩티드 또는 동등한 기능적 활성을 갖는 그의 약학적 활성 염은 적어도 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열(AF-6) 및 서열 번호 2의 아미노산 위치 1에 시스테인 디술피드를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 항분비 활성을 갖는 단리된 재조합 및/또는 합성 펩티드 또는 동등한 기능적 활성을 갖는 그의 약학적 활성 염은 적어도 서열 번호 4에 나타낸 아미노산 서열(AF-8) 및 서열 번호 4의 아미노산 위치 2에 시스테인 디술피드를 포함한다.

본 발명에 따른 항분비 인자(AF) 단백질, 그의 상동체, 유도체, 펩티드 및/또는 단편은 생체 내 또는 시험관 내에서 제조될 수 있으며, 예를 들어 재조합으로, 합성적으로 및/또는 화학적으로 합성될 수 있고/거나 항분비 인자의 천연 발생원으로부터, 예를 들어 돼지 뇌하수체 또는 조류알로부터 단리될 수 있다. 제조 후, 본 발명에 따른 항분비 인자(AF) 단백질, 그의 상동체, 유도체, 펩티드 및/또는 단편은 예를 들어 더 작은 항분비의 활성 단편으로의 화학 또는 효소 절단에 의해, 및/또는 아미노산의 변형에 의해, 및/또는 펩티드 내 시스테인의 디술피드 결합을 통한 서열 번호 2의 아미노산 위치 1 또는 서열 번호 3의 아미노산 위치 2에서의 시스테인의 첨가에 의해 추가로 프로세싱될 수 있다.

현재 정제에 의해 순수한 형태의 항분비 인자(AF) 단백질을 얻을 수는 없다. 그러나 이전에 WO 97/08202호 및 WO 05/030246호에서 개시된 바와 같이, 생물학적으로 활성인 항분비 인자 단백질을 재조합으로 또는 합성적으로 제조할 수 있다. WO 97/08202호는 또한 7∼80개의 아미노산의 상기 단백질의 생물학적 활성 단편의 제조를 개시한다.

본원에서, 본 발명에 따른 항분비 인자(AF) 단백질, 그의 상동체, 유도체, 펩티드 및/또는 단편은 포유류(인간 제외)에서 제조된 항분비 인자(AF) 단백질의 천연 대사 산물, 또는 재조합으로 제조되고 경우에 따라 화학적으로 변형되거나, 합성 제조된 펩티드일 수 있다.

본 발명에 따른 항분비 인자(AF) 단백질, 그의 상동체, 유도체, 펩티드 및/또는 단편은 N 말단 보호기 및/또는 C 말단 보호기를 추가로 포함할 수 있다. N 말단 보호기의 한 예는 아세틸을 포함한다. C 말단 보호기의 한 예는 아미드를 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항분비 인자(AF) 단백질, 그의 상동체, 유도체, 펩티드 및/또는 단편은 서열 번호 7 내지 9, 즉 아미노산의 일반적인 한 문자 약어를 사용하여 VC(C)HSKTRSNPENNVGL(서열 번호 7, 본원에서 AF-17로도 지칭됨)), C(C)HSKTR(서열 번호 8, 본원에서 AF-7로도 지칭됨), VC(C)HSKTR(서열 번호 9, 본원에서 AF-9로도 지칭됨) 중에서 선택된다. 수반되는 서열 목록에 명시된 바와 같이, 상기 명시된 서열의 아미노산 중 일부는 다른 아미노산으로 대체될 수 있다.

또한, 본 발명은 서열 번호 7 내지 9에 따른 임의의 펩티드 중 둘 이상의 조합을 의도한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 둘 이상의 항분비 인자(AF) 단백질, 그의 상동체, 유도체, 펩티드 및/또는 단편을 포함하는 본원에 개시된 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.

디술피드

본원에서, 디술피드는 일반 구조 R-S-S-R을 갖는 작용기를 지칭한다. 결합은 또한 SS-결합 또는 디술피드 다리라고 불리며, 일반적으로 2개의 티올 기의 커플 링에 의해 유도된다. 공식적인 용어로, 연결은 그 동류체(congener), 퍼옥시드(R-O-O-R)와 유사하게 퍼설피드이다.

시스테인(Cys 또는 C로 약칭함)은 화학식 HO₂CCH(NH₂)CH₂SH를 갖는 세미 필수 단백질 생성성(proteinogenic) 아미노산이다. 이는 코돈 UGU와 UGC에 의해 코딩된다. Cys의 티올 측쇄는 종종 친핵체로서 효소 반응에 참여한다. 티올은 산화되기 쉬워 많은 단백질에서 중요한 구조적 역할을 하는 디술피드 유도체 시스테인을 생성한다.

시스테인 잔기는 화학적으로 가장 관련된 아미노산 중 하나이며, 이는 전형적으로 산화 환원 화학 반응에 참여하지만 반응성 산소 종이나 대사 변형된 비생체성분(xenobiotics)/약물과 같은 반응성 친전자체에 대한 친핵체로도 참여한다. AF16은 서열 번호 2의 위치 2에 하나의 시스테인 잔기를 함유한다. 따라서, AF-17 또는 본 출원에 따른 임의의 다른 디술피드 포함 펩티드, 예를 들어 AF-7 및 AF-9(그러나 이에 제한되지는 않음)는 황의 산화, 다른 시스테인과의 반응(디술피드 형성), 친전자체와의 반응으로부터 보호되므로, 단백질 분해 활성에 대해 더 큰 탄력성을 갖는다.

합성

디술피드 결합은 일반적으로 설프히드릴(-SH) 기의 산화로부터 형성된다. 공기와 과산화수소를 포함한 다양한 산화제는 이 반응을 촉진한다. 이러한 반응은 설펜산 중간체를 통해 진행되는 것으로 생각된다. 실험실에서는, 일반적으로 염기의 존재하에서 요오드를 사용하여 티올을 디술피드로 산화시킨다. 대안적으로, 단백질 내 디술피드 결합은 종종 티올-디술피드 교환에 의해 형성된다. 이러한 반응은 일부 경우에 효소에 의해 매개되고 다른 경우에는 특히 촉매량의 염기의 존재하에서, 평형 제어하에 있다.

유기 합성에 적용하기 위한 많은 전문적인 방법이 디술피드를 형성하기 위해 개발되어 본 발명에 따른 합성 AF-17 또는 AF-7 또는 AF-9 또는 AF-7-기반 AF-디술피드 펩티드를 제조하는 데 사용될 수 있다.

AF16은 [도 3a]에 나타낸 바와 같이 혈장에 대한 고도의 민감도를 나타낸다. 분해 동역학은 0.4시간의 시험관 내 반감기(t_1/2)를 나타낸다. AF-17은 t_1/2 = 1.8시간으로 거의 5배 더 높은 안정성을 가질 것으로 예상된다. AF16은 전신 순환에서 효소 및 화학적 분해에 매우 민감하다. AF-17은 시스테인 모이어티가 변형되면서 효소 또는 화학적 반응에 대해서 더 큰 탄력성을 갖는다.

Caco-2 세포 투과성 실험 중에 AF16의 정량적 예비(pilot) 실험은 명백히 펩티드의 급속한 소실을 나타냈다(미제시). 소장과 이와 같은 Caco-2 세포의 꼭대기 쪽에는 솔 가장자리 펩티다아제가 존재한다고 잘 알려져 있다. AF16의 분해 동역학은 8분의 t_1/2로 기재된 바와 같이 매우 빠르다.

실험 1에서 기술한 바와 같이 AF16과 유사한 양의 동위원소로 표지된 펩티드를 래트 및 인간의 혈장에서 인큐베이션하였다. 전체 스캔 MS 데이터의 분석을 위해, 사이엑스(Sciex)의 대사 산물 확인 소프트웨어인 라이트사이트(Lightsight)를 사용하여, 인큐베이션된 MS 반응을 정성 대조군(QC: quality control) 샘플과 비교하고 비전하(specific mass over charge)(m/z) 값으로 명백한 피크를 대사 산물로서 할당한다. 가장 큰 대사 산물 피크 영역을 순위 매겼으며 어떤 경우 MS/MS 조각화(fragmentation)로 확인하였다. 스카이라인(Skyline) 방법을 사용하여 확인된 펩티드의 조각화를 예측하였으나, 민감한 MRM 방법을 설계하는 것을 도움받아 적은 양을 모니터할 수 있었다.

표 6은 30분 인큐베이션 시 확인된 생성물 및 그의 상대량을 열거한다. MS 민감도는 달라질 수 있어서 개별 퍼센트는 변경될 수 있다. 결과를 검토한 결과, 확인된 피크의 상대적인 면적에 따르면 표 6에서 M1로 표시된 한 대사 산물이 다른 것보다 훨씬 컸음이 명백하였다. 그러나 확인된 질량 쌍(m/z 625/630)은 이화 생성물과 전혀 일치하지 않았다(단백질 분해성 펩티드 결합 절단으로 예상됨). 이 쌍은 이제 AF16의 시스테인 디술피드(AF-17)로서 확인된다.

의학적 치료

TBI

외상성 뇌 손상(TBI)은 광범위한 증상과 장애를 가진 복합적인 상해이다. 외상성 뇌 손상(TBI)은 두개 내 손상으로도 알려져 있으며, 뇌가 외부 힘에 의해 외상으로 손상될 때 발생한다. TBI는 중증도, 기전(폐쇄 또는 관통성 두부 손상), 또는 다른 특징(예를 들어, 특정 위치에 또는 광범위한 영역에 발생)에 따라 분류될 수 있다. 본원에서, TBI는 또한 두부 손상을 포함하는 것을 의미한다. 즉, 두피 및 두개골과 같은 뇌 이외의 구조에 대한 손상을 포함할 수 있다.

TBI는 전 세계적으로, 특히 어린이와 청소년에서, 사망 및 장애의 주요 원인이다. 원인에는 낙상, 차량 사고, 및 폭력 등이 포함된다. 뇌 외상은 머리에 집중된 충격, 두개골 내에서 갑작스런 가속/감속, 또는 움직임과 갑작스러운 충돌의 복합적인 조합의 결과로 발생할 수 있다. 상해의 순간에 야기되는 손상 외에도 뇌 외상은 상해 후 수분 내지 수일 내에 일어나는 다양한 현상인 2차 손상을 일으킨다. 뇌 혈류 및 두개골 내 압력에서의 변화를 포함하는 이러한 과정은 초기 상해로 인한 손상에 실질적인 한 원인이 된다.

TBI는 여러 가지 신체적, 인지적, 사회적, 정서적 및 행동적 영향을 일으킬 수 있으며 결과는 완전한 회복에서 영구적인 장애 또는 사망에 이르기까지 다양하다.

본원에서, 하기 용어 및 정의-폐쇄성 두부 손상, 개방 두부 손상, 미만성 축삭 손상, 타박상, 관통성 외상, 및 2차 손상-는 TBI의, 또는 TBI에 관련된 상이한 상해를 지칭하며, 이들 모두는, 서열 번호 1에 나타낸 항분비 인자(AF) 단백질의 단편 및/또는 동일한 활성을 갖는 그의 상동체에 상응하며, 적어도, 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열(AF-6)을 포함하고 서열 번호 2의 아미노산 위치 1에 시스테인 디술피드를 포함하며, 예를 들어 서열 번호 3에 나타낸 아미노산 서열(AF-16)을 포함하고 서열 번호 3의 아미노산 위치 2에 시스테인 디술피드를 포함하는 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드, 또는 동일한 기능적 활성을 갖는 그의 약학적 활성 염을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계에 의해 치료될 수 있다.

서열 번호 1에 나타낸 항분비 인자(AF) 단백질의 단편 및/또는 동일한 활성을 갖는 그의 상동체에 상응하며, 적어도, 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열(AF-6)을 포함하고 서열 번호 2의 아미노산 위치 1에 시스테인 디술피드를 포함하며, 예를 들어 서열 번호 3에 나타낸 아미노산 서열(AF-16)을 포함하고 서열 번호 3의 아미노산 위치 2에 시스테인 디술피드를 포함하는 본원에 개시된 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드, 또는 동일한 기능적 활성을 갖는 그의 약학적 활성 염은 부종, 및 염증 및 세포 손상 또는 사망을 촉진하는 화학 물질의 방출과 같은 2차 TBI를 치료 및/또는 예방하는데 특히 유용하다. 이는 뇌의 부종을 유발하여 두개 내압을 증가시키고 뇌척수액이 두개골에서 배출되는 것을 방해할 수 있다. 이는 압력과 뇌 손상을 더욱 증가시킨다. 이것이 제어되거나 예방되지 않으면 뇌가 두개골 기저부를 탈출하여(뚫고 나가) 호흡 부전 및 사망을 유발할 수 있다. 이 2차 손상의 예방은 상해 후 응급 의료의 중심이 된다.

따라서, 본 발명은 바람직한 본 실시양태에서 2차 TBI 손상을 치료 및/또는 예방하기 위한 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 동일하게 2차 TBI 손상을 치료 및/또는 예방하기 위한 본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드의 용도, 2차 TBI 손상을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드, 및 2차 TBI 손상을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 환자에게 본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드를 상기 환자를 치료 및/또는 치유하고/거나 TBI 손상의 증상을 예방하기에 충분한 양으로 투여하는 단계에 의한 방법에 관한 것이다.

2차 TBI 손상은 다음을 포함한다:

· 두개 내 출혈(두개골 내부 출혈)

· 뇌부종

· 증가된 두개 내압(두개골 내부의 압력)

· 산소 부족과 관련된 뇌 손상

· 관통성 외상에 일반적인 두개골 내부의 감염

· 세포 사멸을 유발하는 화학적 변화

· 두개골 내부의 체액 증가(뇌수종)

후천적 뇌 손상

후천적 뇌 손상은 선천성, 출산시 외상, 유전성 또는 퇴행성 이외의 상해이다. 이는 외상성 뇌 손상을 포함한다. 비-외상성 유형의 후천적 뇌 손상에서, 뇌는 일반적으로 광범위하게 손상을 입는다. 이 손상은 일반적으로 외상성 뇌 손상에 포함되지 않지만 증상은 동일한 범위를 나타낸다. 흔한 원인은 무산소증와 저산소증이다. 이들은 뇌의 산소 결핍 및 뇌의 산소 부족이다. 이들은 호흡, 심장 마비 또는 출혈과 함께 물리적인 문제로 인해 발생할 수 있다. 또한, 약물과 중독이 후천적 외상성 뇌 손상을 일으킬 수 있다. 일산화탄소 중독은 뇌 손상을 일으킬 수 있는 중독의 한 예이다.

서열 번호 1에 나타낸 항분비 인자(AF) 단백질(AF)의 단편 및/또는 동일한 활성을 갖는 그의 상동체에 상응하며, 적어도, 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열(AF-6)을 포함하고 서열 번호 2의 아미노산 위치 1에 시스테인 디술피드를 포함하며, 예를 들어 서열 번호 3에 나타낸 아미노산 서열(AF-16)을 포함하고 서열 번호 3의 아미노산 위치 2에 시스테인 디술피드를 포함하는 본원에 개시된 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드, 또는 동일한 기능적 활성을 갖는 그의 약학적 활성 염은 후천적 뇌 손상을 치료 및/또는 예방하는데 동일하게 유용하다.

따라서, 본 발명은 바람직한 본 실시양태에서 후천적 뇌 손상을 치료 및/또는 예방하기 위한 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 동일하게 후천적 뇌 손상을 치료 및/또는 예방하기 위한 본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드의 용도, 후천적 뇌 손상을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드, 및 후천적 뇌 손상을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드를 충분한 양으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계에 의한 방법에 관한 것이다.

암

한 실시양태에서, 본 발명은 교모세포종과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 암을 치료하는 방법으로서, 서열 번호 1에 나타낸 항분비 인자(AF) 단백질(AF)의 단편 및/또는 동일한 활성을 갖는 그의 상동체에 상응하며, 적어도, 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열(AF-6)을 포함하고 서열 번호 2의 아미노산 위치 1에 시스테인 디술피드를 포함하며, 예를 들어 서열 번호 3에 나타낸 아미노산 서열(AF-16)을 포함하고 서열 번호 3의 아미노산 위치 2에 시스테인 디술피드를 포함하는 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드, 또는 동일한 기능적 활성을 갖는 그의 약학적 활성 염을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 특징으로 하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 발명의 한 실시양태에서 최적화된 약물 흡수 및 추가 약학 물질의 전달을 용이하게 하는 데 사용될 수 있다.

교모세포종과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 암에 걸린 포유동물을 치료하는 상기 방법은 바람직한 본 실시양태에서 식품, 식료품 및/또는 식품 보충제를 상기 환자에게 공급함으로써 최적화된 약물 흡수 및 추가 약학 물질의 전달을 용이하게 하기 위한 AF의 내인성 생산을 유도하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 약학 물질 및/또는 제제는 본원에서 항암제, 항종양제, 방사선 요법, 면역학적 물질 및/또는 세포 및 항생제 물질, 외상 후 손상을 표적화하는 약물, 신경 퇴화를 표적화하는 약물, 및 염증성 질환에 대한 약물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 추가의 약학 물질은 교모세포종(GBM 종양)과 같은, 그러나 이에 제한되지는 않는 암의 치료에서 나노 입자 및/또는 이의 제제의 형태일 수 있다.

이하, 본 발명의 실시양태를 상세히 설명할 것이다. 하기 개별적으로 개시된 실시양태는 단리 또는 합성 펩티드의 실시예 및 펩티드의 의도된 용도이다. 본 발명은 이들 실시예에 제한되지 않는다.

구획 증후군

또한, 본 발명은 한 실시양태에서 구획 증후군을 치료 및/또는 예방하기 위한 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 동일하게 구획 증후군을 치료 및/또는 예방하기 위한 본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드의 용도, 구획 증후군을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드, 및 구획 증후군을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 본 발명에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드를 충분한 양으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계에 의한 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 구획 증후군 또는 이의 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 서열 번호 1에 나타낸 항분비 인자(AF) 단백질(AF)의 단편 및/또는 동일한 활성을 갖는 그의 상동체에 상응하며, 적어도, 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열(AF-6)을 포함하고 서열 번호 2의 아미노산 위치 1에 시스테인 디술피드를 포함하며, 예를 들어 서열 번호 3에 나타낸 아미노산 서열(AF-16)을 포함하고 서열 번호 3의 아미노산 위치 2에 시스테인 디술피드를 포함하는 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드, 또는 동일한 기능적 활성을 갖는 그의 약학적 활성 염을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 특징으로 하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 발명의 한 실시양태에서 최적화된 약물 흡수 및 추가 약학 물질의 전달을 용이하게 하는 데 사용될 수 있다.

실험 부분

실시예 1

항분비 인자 단백질의 펩티드 단편(AF16)의 효과는 여러 그룹에 의해 다양한 약리학적 설정에서 상당히 잘 연구되어 있다. 대부분의 연구는 단백질 또는 펩티드의 약리학적/생리학적 효과에 초점을 두었다. 그러나 AF16의 약물 동태학적 관점을 다루는 보고는 적다. 따라서, 다양한 기질에서의 모든 시험은 AF 또는 아마도 이의 첨가된 펩티드 단편이 효과를 일으키는 분자 종이라고 가정하였다. 다른 실험실에서의 이전의 연구들은 AF 또는 AF16이 예를 들어, 인간 또는 설치류 혈장에서 분해에 민감하다는 사실을 명시하였으나 상세한 연구가 수행되지는 않았다.

본 실험은 인간 혼주(pooled) 혈장뿐만 아니라 AF16 약리학 연구에서 일반적으로 사용되는 Caco-2 세포의 존재하에서도 AF16 펩티드의 시험관 내 약물 동역학 및 분자 운명을 이해하려는 연구결과를 요약한다.

재료 및 방법

재료

고형 물질의 AF16과 안정한 동위원소로 표지된(SIL: stable isotopically labeled) AF16 IS는 랜트만넨(Lantm

nnen)의 얀 브룬(Jan Bruhn)이 제공하였다. 살그렌스카(Sahlgrenska) 병원의 에와 요한센(Ewa Johansson)이 제공한 정보에 따르면 펩티드는 약 70%의 순도를 가지며 다른 성분은 4 x 트리플루오로아세트산(TFA)과 미지 배수의 H₂O이다. 그러나 간단히 하기 위해 펩티드에 관한 모든 농도는 100%로 간주한다. 이 가정은 상대적인 기준이기 때문에 본원에 제시된 결과에는 영향을 미치지 않는다. 다른 모든 화학 물질 및 소모품은 일반적인 공급업체로부터 구입하였다.

AF16의 알킬화 및 산화

AF16의 산화를 시험하기 위해 50% 과산화수소(H₂O₂) 용액을 사용하였다. 0.1 M 중탄산 암모늄 중 15 μM AF16의 1 ㎖ 용액에 2 ㎕ H₂O₂를 첨가하였다(최종 농도 35 mM). 혼합 직후, 질량 분석기(MS)에 용액을 주입(직접 주입)하여 산화 생성물을 확인하였다. 산화 최종 생성물인 술폰산만이 검출되었으며 이의 민감한 다중 반응 방법(MRM: multiple reaction method)을 설계하였다(표 1). 동반 실험에서, 과량의 디티오트레이톨(DTT)을 첨가하여 DTT가 산화를 방지하였음을 보였다.

HPLC 유리 바이알에서 10 ㎕ 0.1 M NEM을 PBS 중의 2 mg/ml AF16 250 ㎕와 혼합하여 약 1 mM 용액을 얻어 AF16의 N-에틸 말레이미드(NEM) 알킬화 변이체(AF16-NEM)를 제조하였다. MS 분석 전에 샘플을 밀봉하여 주위 온도에서 30분 동안 방치하였다. 30분 후 AF16의 5% 미만이 남아 있었고 AF16-NEM의 민감한 MRM 방법을 설계하였다(표 1).

인간 혈장 및 Caco -2 세포에서 AF16 안정성

37℃에서 HPLC 유리 바이알 내 인간 혼주 혈장(4명의 기증자, 2명의 여성 + 2명의 남성)을 사용하여 혈장에서 AF16 및 AF16-NEM 안정성 시험을 수행하였다(20 μM 인큐베이션 농도). 4가지 상이한 기질을 시험하였다: 혈장:등장성 67 mM 인산칼륨 pH 7.4(KP)(1:1), 혈장:KP + 0.1 mM DTT, KP 및 KP + 0.1 mM DTT. 인큐베이션 시간은 0, 1.5 및 3시간이었다. 지시된 시간에 50㎕ 분액을 추출하고, 150 ㎕의 얼음 냉각된 메탄올에서 켄칭/침전시켜 분석할 때까지 동결하였다. UPLC-MS/MS로 상대적 정량을 수행하였다.

Caco-2 세포의 존재하에서 AF16의 운명에 대한 조사를 3회에 걸쳐 실시하였다. 먼저, 0, 15, 30 및 60분에 걸쳐 MRM 방법을 사용하여 정량적 측정을 수행하였다(표 1). 여기에서, AF16 또는 이의 가능한 술폰산 대사 산물을 정점과 바닥 가쪽 구획 모두에서 모니터하였다(미제시). 두 번째 실험은 60분 인큐베이션 중에 AF16의 운명에 대한 정성적인 측정이었다. HBSS 완충액 중 50 μM AF16을 Caco-2 세포 단층의 꼭대기 쪽에서 인큐베이션하고 5, 10, 20, 30 및 60분에 100 ㎕ 분액을 추출하였다. 샘플을 100㎕ MeCN/H₂O를 함유하는 96-웰 플레이트에 넣었다. 플레이트를 밀봉하고 전체 스캔 UPLC-MS 분석(하기 및 표 2 참조)까지 동결하였다. 세 번째 실험은 두 번째를 그대로 반영하였으며 유일한 차이점은 구조 설명을 돕기 위해 AF16:AF16 IS(1:1)의 HBSS 용액을 사용하였다는 것이다.

분석 절차

상이한 분석으로부터의 모든 샘플을 UPLC-MS/MS로 분석하였다. 다음 시스템을 사용하였다: 워터스 어퀴티(Waters Acquity) UPLC(Waters Corp.)에 연결된 워터스 XEVO TQ 삼중 사극자 질량 분석기(전기 분무 이온화, ESI). 크로마토그래피 분리를 위해, C18 BEH 1.7μm 칼럼 2x100mm(Waters Corp.)에서 일반적인 구배를 사용하였다(1% 이동상 B에서 50%까지의 3분에 걸친 전체 실행). 이동상 A는 0.05% TFA로 이루어졌으며 이동상 B는 100% 아세토니트릴로 이루어졌다. 유속은 분당 0.5 ml였다. 5 ㎕의 샘플을 주입하고 표 1에 보고된 질량 분석기 설정으로 실행하였다. 전체 스캔 MS 분석에서 10 ㎕를 주입한 것(전체 루프)을 제외하고는 동일한 크로마토그래피 설정을 사용하였다. MS는 표 1에서의 콘(cone) 전압을 사용하여 100-400 또는 400-700 m/z 창에서 이온을 스캔하도록 설정하였다. 표 2에서 선택한 모체 이온의 딸이온 스캔 분석을 위해 충돌 에너지를 10, 20 및 40V 사이에서 단계별로 설정하였다. AF16의 모체 이온, 제안된 전하 및 체류 시간 및 확인된 대사 산물을 표 2에 열거한다.

결과

AF16의 알킬화 및 산화

시스테인 잔기는 화학적으로 가장 관련된 아미노산 중 하나이며, 이는 전형적으로 산화 환원 화학 반응에 참여하지만 반응성 산소 종이나 대사 변형된 비생체성분/약물과 같은 반응성 친전자체에 대한 친핵체로도 참여한다. AF16은 하나의 시스테인 잔기를 함유하기 때문에 시험관 내에서 산화 또는 기타 변형에 대해 민감성을 나타내는지 검사하는 것이 중요하였다. 우선, 가능한 술펜산, 술핀산 및 술폰산 유도체의 분석 MS 방법을 설계할 수 있는지 확인하기 위해 과산화수소로 AF16을 산화시켰다(도 1). 과산화수소는 낮은 차수의 화학 종을 검출하기에 너무 강한 산화제로 입증되어 술폰산 유사체에 대한 방법만을 설계하였다.

후속 실험에서 시스테인의 역할을 더 연구하기 위해 S-알킬화 시약 N-에틸 말레이미드(NEM)를 사용하여 알킬화된 변이체를 생성하였다(도 2). 따라서 NEM 변형된 AF16은 황의 산화, 다른 시스테인과의 반응(디술피드 형성), 친전자체와의 반응으로부터 보호되고 비천연 아미노산이 되어 아마도 단백질 분해 활성에 대해 더 큰 탄력성을 갖는다.

인간 혈장에서 AF16의 안정성

AF16, 안정한 동위원소로 표지된(SIL) AF16 및 알킬화 유사체 AF16-NEM을 인간 혈장:0.1M 인산 칼륨 pH 7.4(KP)(1:1), 인간 혈장:KP(1:1) + 1mM DTT, KP 또는 KP + 1mM DTT 중 1μM로 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하여 안정성을 조사하였다. 혈장에 완충 능력을 제공하고 결과를 pH 관련 효과와 혼동하지 않기 위해 KP를 포함하였다. 결과는 [도 3]에 나타낸다.

AF16은 [도 3a]에 나타난 바와 같이 혈장에 대해 고도의 민감도를 나타낸다. 분해 동역학은 0.4시간의 시험관 내 반감기(t_1/2)를 나타낸다. DTT를 포함함으로써 t_1/2를 1.1시간까지 증가시키는 보호 효과를 나타내는 것으로 보인다. 흥미롭게도, 비천연 AF16 유사체(도 3b)는 t_1/2 = 1.8시간으로 거의 5배 더 높은 안정성을 나타낸다. 또한, 여기서 DTT는 t_1/2 = 4.2시간으로 보호 효과를 부여한다. 이러한 결과는 AF16이 전신 순환에서 효소 및 화학적 분해에 매우 민감하다는 것을 나타낸다. 또한, AF16은 시스테인 모이어티가 변형될 경우 효소 또는 화학적 반응에 대해 더 큰 탄력성을 갖는다는 것을 보여준다, 두 화합물 모두에서 DTT의 효과는 이해하기가 더 어렵지만, 아마도, DTT가 카보닐 생성물, 예를 들어 모두 AF16에 존재하는 트레오닌, 리신, 아르기닌 및 프롤린의 형성과 같은 일반적인 산화 반응을 방지한다는 것을 반영할 것이다. AF16, SIL-AF16 및 AF16-NEM의 3시간 인큐베이션에 대한 전체 스캔 LC-MS 분석은 약간 흥미로운 결과를 나타냈다. [도 4]를 참조한다. 두 가지 뚜렷한 분해 산물, 이론적인 단편 VCHSK-TRSNP, TRSNP-ENNVGL 및 ENNVGL을 생성하는 5번째 펩티드 결합(리신과 트레오닌) 및 10번째 결합(프롤린과 글루타메이트)에서의 절단이 발견되었다. TRSNP-ENNVGL 및 ENNVGL 단편은 LC-MS에 의해 검출되었지만 VCHSK-TRSNP는 검출되지 않았다. 아마도 검출되지 않은 단편은 인큐베이션 중에 추가의 분해를 거쳤을 것이다. 흥미롭게도, AF16-NEM과의 인큐베이션에서, 위치 5에서 뚜렷한 단백질 분해가 발생하지 않았으며, 이는 N-말단에 작용하는 프로테아제, 예를 들어 아미노펩티다아제가 배제됨을 나타낸다.

Caco -2 세포 존재시 AF16 안정성

Caco-2 세포 투과성 실험 중에 AF16의 정량적 예비 실험은 명백히 펩티드의 급속한 소실을 나타냈다(미제시). 소장과 이와 같은 Caco-2 세포의 꼭대기 쪽에는 솔 가장자리 펩티다아제가 존재한다고 잘 알려져 있다. 이를 더 조사하기 위해 별도의 실험을 설계하였다. Caco-2 세포를 꼭대기 쪽에서 프로테아제 억제제 칵테일이 있거나 없이 50 μM AF16에 노출하고, 1시간에 걸쳐 샘플을 채취하였다. AF16 분해에 대한 결과는 [도 5]에 나타낸다.

AF16의 분해 동역학은 t_1/ ₂이 8분으로 기재된 바와 같이 매우 빠르다. 억제제 칵테일은 분해를 상당히 지연시키지만(t_1/2 = 57분), 복잡한 동역학을 완전히 나타내지는 않는다. AF-16의 분자 운명을 이해하기 위해 LC-MS 분석을 수행하였다. 억제제가 있거나 없이 인큐베이션 시에, 혈장 안정성 실험과 비교하여 여러 가지 새로운 대사 산물이 검출되었다. 그러나 이는 더 높은 인큐베이션 농도의 사용에 따른 것일 수 있다. [도 6] 내지 [도 8]은 실험 시간 경과에 따른 대사 산물 M1 내지 M9의 형성 동역학을 보여주며 [도 9]는 이들 생성물에 대해 시험적으로 결정된 구조를 보여준다.

표 3은 각각 30분 및 60분 후의 각각의 분자 종의 상대량 ± 억제제 칵테일을 나타낸다. 분명하게 주요한 대사 산물(> 10%)은 굵은 숫자로 나타낸다. 그러나 표 3에서 같이 비교할 때 각각의 모든 이온은 유사한 MS 민감도를 갖는다고 가정함을 언급하는 것이 중요하다. 확인된 모든 생성물은 특정 펩티드 결합에서의 절단과 관련이 있다. 제시된 아미노산 조성을 표 4에 나타낸다.

억제제 칵테일이 없으면, 30분 인큐베이션 후 3가지 분명한 대사 산물, M1, M3 및 M6이 가장 두드러진다. 60분 인큐베이션 후 M3과 M6은 모두 감소하는 반면 M1은 선형적으로 계속 증가한다(도 6A/C 및 7C). [도 9]에 제안된 경로를 보면, 타당하게는 M3의 추가의 N-말단 펩티드 절단이 M1을 생성한다고 추정된다. M6의 구조와 20분 후에 상대적으로 빠른 감소를 알지 못한다면, M6이 M1의 형성에 기여한다고 나타낼 수 있다. 다른 대사 산물이 M1의 추가적인 분해 산물일 것임을 시사하지만 이는 물론 더 느린 경로에 의해 더 직접적인 방식으로도 형성될 수 있다.

억제제 칵테일은 단백질 분해 효소인 베스타틴(아미노펩티다아제), 디프로틴 A(디펩티딜펩티다아제 IV) 및 캅토프릴(안지오텐신 전환 효소, 카복시펩티다아제)의 3가지 억제제로 이루어진다. 흥미롭게도 이들 효소의 억제로 인해 M1, M3 및 M6의 형성이 효과적으로 최소화됨을 나타낸다. 더욱이, [도 4], [도 9] 및 표 4에 나타난 이론적인 생성물 M7은 비교적 선형 방식으로 형성되며 억제제에 의해 안정화되는 것으로 보인다. 이는 N-말단 작용 프로테아제의 억제와 일치한다. [도 8A]는 M7이 억제제 없이 초기에 매우 빠르게 형성됨을 시사하지만, 효율적으로 추가로 대사될 가능성이 있다. 비교적 작지만 주요 대사 산물인 M8과 M9는 아직 확인되지 않았다. 이 두 대사 산물은 아마도 상기에 언급한 펩티드 결합 절단보다 더 복잡한 화학으로부터 유래할 것이다. 그러나 미지의 대사 산물 M6, M8 및 M9의 구조를 이해하고 이미 구조적으로 할당된 것을 입증하기 위해, SIL로 표시된 AF16을 사용하여 추가 실험을 수행하였다. 그러나 이 실험에서 M6은 SIL 아미노산을 함유하고 M8과 M9는 함유하지 않는다는 사실에서 더 이상의 정보 부분을 추출할 수 없었다. 그러나 이것은 더 연구되어야 한다.

또한, Caco-2 세포와의 60분 인큐베이션 시간 후 바닥 가쪽에서 AF16 또는 검출된 임의의 대사 산물의 투과성을 모니터하였다. 그러나 이 실험에서 억제된 인큐베이션에서 분명한 피크를 나타낸 M8을 제외하고는 어떤 대사 산물도 발견되지 않았다.

결론 및 향후의 연구

AF16의 시험관 내 약물 동태학을 더 이해하기 위해 많은 중요한 시험관 내 실험을 수행하였다.

AF16은 예를 들어, 폴리스티렌 표면에 가장 잘 흡착한다. 그러나 설명된 대책은 효과를 나타내지 않았으며 이것이 엄밀한 정도를 해석하기 어렵다. 농도가 1 μM보다 높을 경우, 효과는 분명하지 않으므로 인큐베이션에서 효과가 아마도 미미할 것이다.

본 연구에 의하면 AF16 펩티드는 인간 혈장과 Caco-2 세포의 존재하에서 모두 몇몇 펩티드 생성물로 분해된다.

분해는 두 기질 모두에서 매우 빠르며 유사한 대사 경로를 나타내며, M1을 주요한, 선형으로 형성되는 명백하고 안정한 생성물(5번째 펩티드 결합(리신과 트레오닌)에서의 절단)을 생성한다.

솔 가장자리 펩티다아제가 관여됨은 시험관 내 t_1/2가 8분에서 55분으로 증가시키는 억제제 칵테일의 강력한 효과에 의해 입증되었다. 프로테아제 억제제의 존재하에서 대사 패턴의 변화는 흥미롭지만, 현재 미지의 대사 산물(M8, M9)은 아마도 억제제가 없을 때 유의한 정도로 형성되지 않을 것이다.

N-에틸 말레이미드로 위치 2의 시스테인을 보호하면 인간의 혈장에서 펩티드가 크게 안정화된다. 아마도 아미노펩티다아제의 활성 제거 때문일 것이다.

이러한 결과를 종합해 볼 때, AF16의 시험관 내 약물 동태학은 복잡하며 여러 조건하에서 관찰된 약리학적 효과와 균형을 이루고 해석될 필요가 있음을 시사한다. AF16이 Caco-2 세포와의 짧은 인큐베이션 후에 시험관 내에서 빠르게 소실되는 것은 분명하다. 또한, 약간의 대사 산물은 AF16 소실과 유사한 속도로 매우 빠르게 생성된다. AF16과 대사 산물이 동일한 표적에 대해 유사한 효율로 작용할 가능성이 매우 크며, 이는 기능 분석에서 입증될 것이다.

실시예 2

AF16 : 혈장 시험관 내 안정성 및 대사 과정

도입

이 실험은 인간과 래트의 혈장에서 AF16의 종간(인간, 마우스, 래트 및 개) 혈장 동역학 및 정성적인 이화/대사에 대한 최신 연구 결과를 요약한다.

재료 및 방법

재료

고형 물질의 AF16과 안정한 동위원소로 표지된 AF16 IS는 랜트만넨 아베에서 제공하였다. 살그렌스카 병원의 에와 요한센이 제공한 정보에 따르면 펩티드는 약 70%의 순도를 가지며 다른 성분은 4 x 트리플루오로아세트산(TFA)과 미지 배수의 H₂O이다. 그러나 간단히 하기 위해 펩티드에 관한 모든 농도는 100%로 간주한다. 이 가정은 상대적인 기준으로 비교되기 때문에 본원에 제시된 결과에는 영향을 미치지 않는다. 인간 혼주 혈장(4명의 기증자, 2명의 남성과 2명의 여성, 비흡연자)은 대학 병원으로부터 입수하였다. 동물 혈장은 노바케미 아베(Novakemi AB)로부터 입수하였다. 다른 모든 화학 물질 및 소모품은 일반적인 공급업체로부터 구입하였다.

혈장 침전제의 시험

AF16의 MS 민감도를 최적화하기 위해, 명백하고 비슷한 효율을 보이는 가장 일반적인 단백질 침전제를 시험하였다. 혈장 기질은 1:2(혈장:등장성 인산칼륨 완충액)(pH 7.4)로 이루어졌으며 1:3(혈장 아세토니트릴(MeCN)), 1:4(혈장:메탄올(MeOH)), 1:3(혈장:황산아연(ZnSO₄:5M NaOH)(10% w/v)) 및 1:3(혈장:트리클로로 아세트산(TCA)(10% w/v)) 중 하나로 HPLC 유리 바이알에서 침전시켰다(Polson et al, 2003). AF16과 동위원소로 표지된 AF16(AFIS)의 1:2 혼합물 10 μM(최종 농도)과 샘플을 혼합하였다. 샘플을 밀봉하고 3500 rpm으로 원심분리하였다. 원심 분리 후, 상등액을 UHPLC-MS/MS로 분석하였다(하기 참조). 동일한 샘플을 다른 시점에서 3회 주입하여 10℃에서 자동 시료 채취기에서 주어진 침전제와의 펩티드 안정성을 조사하였다.

인간과 래트의 혈장 내 AF16 안정성, 동역학 및 대사 산물 확인

혈장 샘플의 모든 인큐베이션은 AF16(MeCN:H₂O 중의 원액 1mM)과 AFIS(MeCN:H₂O 중의 원액 0.9mM)의 1:2 혼합물을 이용하였으며, 이는 대사 산물 또는 이화 산물의 구조적 해석을 돕기 위한 것이다. 화합물 혼합물을 항상 바이알의 바닥에 피펫팅한 후 임의의 다른 용매를 첨가하였다. 혈장에서의 안정성은 밀폐된 HPLC 유리 바이알에서 인간 혼주 혈장, 위스터(Wistar) 래트 혈장, CD-1 마우스 혈장 및 비글 개 혈장을 사용하여 37℃(10 μM 인큐베이션 농도)에서 수행하였다. 인큐베이션 시간은 일반적으로 0(QC 샘플)에서 2시간 사이였다. 각 시점에서 분액을 취하고 디티오트레이톨(DTT)(1mM 최종 농도)를 포함하는 선택된 침전제로 반응을 정지시켰다. UHPLC-MS/MS를 사용하여 상대적 정량(QC와 비교)을 수행하였다(아래 참조). 다중 반응 탐색법(MRM(multiple reaction monitoring), 스카이라인 예측 MRM), 라이트사이트 소프트웨어(Sciex) 증강 MS 스캔(EMS: enhanced MS scan), 증강 생성 이온 스캔(EPI: enhanced product ion scan) 및 증강 해상도 스캔(ERS: enhanced resolution scan)을 사용하여 대사 산물을 확인하였다.

분석 절차

상이한 분석으로부터의 모든 샘플을 EMS, ERS 및 EPI 스캔을 위한 선형 이온 트랩을 이용하는 UHPLC-MS/MS에 의해 분석하였다. 다음 시스템을 사용하였다; 애질런트(Agilent) 1290 UHPLC에 연결된 선형 이온 트랩을 갖춘 사이엑스 QTRAP 6500 3 중 사극자 질량 분석기(전기 분무 이온화, ESI). 크로마토그래피 분리를 위해 C18 HSS T3 1.8μm 칼럼 2 x 50mm(Waters Corp.)에서 일반적인 구배를 사용하였다(0% 이동상 B에서 90%까지 5-15분에 걸친 전체 실행). 이동상 A는 0.05% TFA/0.05% 포름산으로 이루어졌으며 이동상 B는 100% 아세토니트릴 0.05% TFA/0.05% 포름산으로 이루어졌다. 유속은 분당 0.5 ml였다. 10 ㎕의 샘플을 주입하고 표 5에 보고된 질량 분석기 설정으로 실행하였다.

결과 및 고찰

AF16 MS 민감도 및 UHPLC 크로마토그래피에 대한 혈장 단백질 침전의 영향

혈장 기질의 복잡성 때문에, AF16 크로마토그래피 및 질량 분석(MS) 민감도가 다른 단백질 침전 방법에 어떻게 반응하는지 시험하는 것이 중요하였다. 선택된 침전제를 일반적으로 적용하여 비슷하게 효율적임을 보였다. 결과는 [도 10] 및 [도 11]에 나타낸다.

[도 10]은 동일한 샘플을 20시간에 걸쳐 3회 반복 주입한 결과를 나타낸다. TCA와 MeCN은 시간 경과에 따라 양호하고 명백한 안정성을 나타낸다. 20시간에 ZnO₄ 으로 약간의 손실이 나타난다. 시간 경과에 따라 MeOH으로 상당한 손실이 나타난다. AF16은 MeOH와 안정하지만, 펩티드가 알콜성 혼합물에서 용해도가 제한될 수 있다고 알려져 있기 때문에 손실은 펩티드 침전에서 기인한 것으로 보인다. 추가 시험을 수행해야 한다.

[도 11]은 MS 강도(이온 카운트)의 관점에서 서로 비교된 상기에서 획득된 데이터의 다이어그램을 나타낸다. TCA 침전은 가장 강한 신호를 나타내었고 기준으로 설정되었다. 비유기적 방법이 뒤떨어짐이 명백하며, 이는 아마도 동시에 용출되는 억제 이온으로 인한 것이다. 최상의 안정성을 갖는 두 가지 방법(TCA 및 MeCN)은 민감도에서 500배 이상 차이를 나타내므로 계속적인 연구를 위해 TCA를 선택하여 연구 전체에 사용하였다.

AF16의 혈장 안정성

다양한 종에서 AF16의 상대적인 안정성을 [도 12]에 나타낸다. 종에 관계없이, AF16은 10분 이하의 시험관 내 반감기(t_1/2)로 급속히 사라지고 있다. 따라서, 약리학적 작용의 약물 동태학적 기초를 이해하기 위해 펩티드의 분자 운명을 결정하는 것이 가장 중요하다.

인간 및 래트 혈장에서 AF16의 분자 운명

AF16과 유사한 양의 동위원소로 표지된 펩티드를 전술한 바와 같이 래트 및 인간의 혈장에서 인큐베이션하였다. 전체 스캔 MS 데이터의 분석을 위해, 사이엑스의 대사 산물 확인 소프트웨어인 라이트사이트를 사용하여 인큐베이션된 MS 반응을 정성 대조군(QC) 샘플과 비교하고 명백한 피크를 비전하(m/z) 값을 갖는 대사 산물로서 할당한다. 이 소프트웨어는 현재 대사 산물 검출의 적중률이 상당히 높도록 펩티드와 같은 다중 하전된 화합물과 함께 사용하기에 최적이 아니며 각 피크의 수동 평가를 수행해야 했다. 가장 큰 대사 산물 피크 면적을 순위 매겼으며 어떤 경우에는 MS/MS 조각화로 확인하였다. 스카이라인 방법을 사용하여 확인된 펩티드의 조각화를 예측하였으나, 민감한 MRM 방법을 설계하는 것을 도움받아 적은 양을 모니터할 수 있었다.

표 6은 30분 인큐베이션 시 확인된 생성물 및 그의 상대량을 나열한다. 그러나 이 비교에서는, 달라질 수 있어서 개별 퍼센트가 변경될 수 있는 MS 민감도가 각 생성물에서 같다고 추정함을 강조해야 한다. 결과를 검토한 결과, 확인된 피크의 상대적인 면적에 따르면 표 6에서 M1로 표시된 하나의 대사 산물이 다른 것보다 훨씬 컸음이 명백하였다. 그러나 확인된 질량 쌍(m/z 625/630)은 이화 생성물과 전혀 일치하지 않았다(단백질 분해성 펩티드 결합 절단으로 예상됨). 이 쌍은 이제 AF16의 시스테인 디술피드로서 확인되었다.

도 13은 확인된 대사 산물의 상대적인 동역학을 나타내며, 시스테인 디술피드 M1이 인간 및 래트 혈장에서 속도 및 양에 있어 모두 유사하게 형성됨이 명백하며, 이는 래트가 약리학적 연구에 알맞은 모델일 수 있음을 나타낸다. 인간과 래트 사이의 가장 큰 불균형은 인간에서 시간 경과에 따라 선형적으로 형성되지만 래트에서는 매우 낮은 정도로 형성되는 M9의 형성이다. 이것에 대한 한 가지 설명은 더 작은 단편의 인간 혈장 단백질 분해 활성이 래트의 혈장보다 높다는 것일 수 있다. 592.3/594.4의 m/z 쌍(표 6/도 13에 나타내지 않음)을 가진 한 대사 산물(M10)이 여전히 이해되지 않았으며 MS/MS 연구와 ERS 방식 스캔(도 14) 후에 처음으로 이해되었다. ERS는 ¹³C 동위원소 패턴(동위원소 피크 사이의 0.3Da 단계)에 대해 3중으로 하전되었으며 M2 디술피드 생성물과 일치함을 나타냈다. M2는 명백하게 적은 양으로 형성되지만 이 형성은 디술피드를 형성하는 효율적인 시스테인 산화에 의해 가려졌을 수 있다. 대안적으로, 가능성은 더 적지만 M10이 M1으로 형성된다. 대부분의 N-말단 작용 펩티다아제가 한 번에 2개의 아미노산을 절단하기 때문에 N-말단 발린의 단순 절단은 매우 놀라우며(M2를 형성함), 펩티다아제가 디술피드에 매우 가깝게 작용하고 M1을 형성한다는 것은 우리가 알기에는 드문 일이다.

이들 생성물 M1 및 M10이 실제로 디술피드임을 추가로 확인하기 위해, 반응 혼합물을 시스테인 선택성 알킬화제 N-에틸 말레이미드와 함께 인큐베이션하였으며 이들 대사 산물과의 반응이 없음을 확인하였다(미제시).

산성 조건에서 DTT의 환원 능력이 감소할 것 같지만, DTT를 TCA와 함께 켄칭 용액에 사용하였다는 사실을 고려하면 [도 13]에 나타난 동역학은 놀라웠다. 따라서 중성 침전제인 ZnSO₄(NaOH 없이)를 사용할 때 동일한 패턴이 발생했는지 시험하였다. 이 침전 방법은 그만큼 효율적이지는 않지만 주요 디술피드 생성물에 대한 정보를 더 많이 제공할 것으로 기대된다. 결과는 [도 15]에 나타낸다

[도 15]로부터, 그리고 [도 13]과 비교하여, 분명히 큰 차이가 나타나지 않으며, M1/M10 디술피드가 DTT 환원에 대해 탄력적인 정도는 또한 매우 놀랍다.

결론 및 향후의 연구

AF16의 시험관 내 약물 동태학과 이것이 생체 내 상황에서 어떻게 해석되는 지를 더 이해하기 위해 많은 중요한 시험관 내 실험을 수행하였다.

1. 인큐베이션 혼합물에서 혈장 단백질을 제거하고 양호한 MS 민감도와 크로마토그래피를 유지하기 위한 최적의 선택으로 트리클로로아세트산이 확인되었다.

2. AF16은 초기 연구에서 혈장에서 신속하게 분해되는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 이를 추가로 검증하지만 동시에 상이한 종들 사이에서 속도가 유사하다는 것을 보여준다.

3. 래트와 인간 모두의 혈장에서 명백한 주요 대사 운명은 AF16의 디술피드의 신속한 형성으로 나타났다. 가역적인 이 작용은 분명히, AF16을 신속한 펩티다아제 분해로부터 보호하며, 이는 덜 가역적인 N-에틸 말레이미드 안정화를 이용하여 이전에 밝혀졌다. 이는 AF16이 훨씬 높은 정도로 완전하게 그의 표적에 도달하도록 할 수 있는 보호 기능으로서 생각할 수 있다.

4. M1/M10 디술피드는 DTT 환원에 대해 대단히 탄력적이다.

실시예 3

M1(AF-17)을 합성하여 시험관 내/생체 내에서 정확하게 정량할 수 있을 뿐만 아니라 시험관 내 약물 동태학 특성을 일반적으로 연구하고 약리학 연구에 사용할 수 있다.

AF-17의 생물학적 활성 - 항분비 활성은 이전에 기술된 래트 장 루프(intestinal loop) 모델(Lange, S. (1982) FEMS Microbiol. Lett. 15, 239-242)에서 측정하였다. 3 pg의 콜레라 독소를 공장 루프에 투여하였다. 콜레라 독소 투여 전에 정맥 내 또는 근육 내로 합성 제조된 AF-17, AF-16 또는 대조군(펩티드가 없이 완충액만(XY))을 상이한 용량으로 주사하였다. 5시간 후에 장 루프에서 축적된 체액의 중량(mg/cm(mg/ml))을 기록하였다. 각각의 AF 제제를 적어도 6마리의 래트에서 시험하였다. 데이터의 통계 분석에 피셔(Fisher)의 PLSD를 사용하였다.

AF-17의 생물학적 활성 - AF-17의 생물학적 활성을 래트 모델에서 시험하였다. 콜레라 독소의 장내 투여 20∼30초 전에 정맥 내 또는 근육 내로 주사하였을 때 AF-17의 장액 분비를 억제하는 능력을 표 7에 나타낸다. 완충액만을 주사한 대조 동물에서 콜레라 독소는 장 cm당 체액 390 mg으로 현저한 분비를 일으켰다.

AF-17은 콜레라 분비의 용량 의존적인 억제를 일으켰으며 이는 완충액에 대한 반응과 유의한 차이가 있었다(p <0.001, n = 6).

참고 문헌

SEQUENCE LISTING <110> Lantmannen AS-Faktor AB <120> Antisecretory Factor 17 <130> PS54055SE00 <140> SE1651074-5 <141> 2016-07-18 <160> 20 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 382 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> FULL-LENGTH <400> 1 Met Val Leu Glu Ser Thr Met Val Cys Val Asp Asn Ser Glu Tyr Met 1 5 10 15 Arg Asn Gly Asp Phe Leu Pro Thr Arg Leu Gln Ala Gln Gln Asp Ala 20 25 30 Val Asn Ile Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn 35 40 45 Val Gly Leu Ile Thr Leu Ala Asn Asp Cys Glu Val Leu Thr Thr Leu 50 55 60 Thr Pro Asp Thr Gly Arg Ile Leu Ser Lys Leu His Thr Val Gln Pro 65 70 75 80 Lys Gly Lys Ile Thr Phe Cys Thr Gly Ile Arg Val Ala His Leu Ala 85 90 95 Leu Lys His Arg Gln Gly Lys Asn His Lys Met Arg Ile Ile Ala Phe 100 105 110 Val Gly Ser Pro Val Glu Asp Asn Glu Lys Asp Leu Val Lys Leu Ala 115 120 125 Lys Arg Leu Lys Lys Glu Lys Val Asn Val Asp Ile Ile Asn Phe Gly 130 135 140 Glu Glu Glu Val Asn Thr Glu Lys Leu Thr Ala Phe Val Asn Thr Leu 145 150 155 160 Asn Gly Lys Asp Gly Thr Gly Ser His Leu Val Thr Val Pro Pro Gly 165 170 175 Pro Ser Leu Ala Asp Ala Leu Ile Ser Ser Pro Ile Leu Ala Gly Glu 180 185 190 Gly Gly Ala Met Leu Gly Leu Gly Ala Ser Asp Phe Glu Phe Gly Val 195 200 205 Asp Pro Ser Ala Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ala Leu Arg Val Ser Met 210 215 220 Glu Glu Gln Arg His Ala Gly Gly Gly Ala Arg Arg Ala Ala Arg Ala 225 230 235 240 Ser Ala Ala Glu Ala Gly Ile Ala Thr Thr Gly Thr Glu Asp Ser Asp 245 250 255 Asp Ala Leu Leu Lys Met Thr Ile Ser Gln Gln Glu Phe Gly Arg Thr 260 265 270 Gly Leu Pro Asp Leu Ser Ser Met Thr Glu Glu Glu Gln Ile Ala Tyr 275 280 285 Ala Met Gln Met Ser Leu Gln Gly Ala Glu Phe Gly Gln Ala Glu Ser 290 295 300 Ala Asp Ile Asp Ala Ser Ser Ala Met Asp Thr Ser Glu Pro Ala Lys 305 310 315 320 Glu Glu Asp Asp Tyr Asp Val Met Gln Asp Pro Glu Phe Leu Gln Ser 325 330 335 Val Leu Glu Asn Leu Pro Gly Val Asp Pro Asn Asn Glu Ala Ile Arg 340 345 350 Asn Ala Met Gly Ser Leu Pro Pro Arg Pro Pro Arg Thr Ala Arg Arg 355 360 365 Thr Arg Arg Arg Lys Thr Arg Ser Glu Thr Gly Gly Lys Gly 370 375 380 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> PEPTIDE <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> may be replaced by R or K <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> may be replaced by L <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> may be replaced by A <400> 2 Cys His Ser Lys Thr Arg 1 5 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> PEPTIDE <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> may be replaced with R or K <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> may be replaced with L <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> may be replaced with A <400> 3 Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn Val Gly Leu 1 5 10 15 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> PEPTIDE <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> may be replaced by R or K <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> may be replaced by L <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> may be replaced by A <400> 4 Val Cys His Ser Lys Thr Arg 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> PEPTIDE <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> may be replaced by R or K <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> may be replaced by L <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> may be replaced by A <400> 5 Ile Val Cys His Ser Lys Thr Arg 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> PEPTIDE <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> may be replaced by R or K <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> may be replaced by L <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> may be replaced by A <400> 6 His Ser Lys Thr Arg 1 5 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DISULFID at Cys in position 2 <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> may be replaced with R or K <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> may be replaced with L <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> may be replaced with A <400> 7 Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn Val Gly Leu 1 5 10 15 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DISULFID at Cys in position 1 <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> may be replaced by R or K <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> may be replaced by L <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> may be replaced by A <400> 8 Cys His Ser Lys Thr Arg 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DISULFIDE at Cys in position 2 <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> may be replaced by R or K <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> may be replaced by L <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> may be replaced by A <400> 9 Val Cys His Ser Lys Thr Arg 1 5 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 10 Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn Val Gly Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 11 Glu Asn Asn Val Gly Leu 1 5 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 12 His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn Val Gly Leu 1 5 10 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 13 Asn Val Gly Leu 1 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 14 Ser Asn Pro Glu Asn Asn Val Gly Leu 1 5 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 15 Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro 1 5 10 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 16 Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn Val Gly Leu 1 5 10 15 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 17 Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn Val Gly Leu 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 18 Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn Val Gly Leu 1 5 10 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 19 Asn Pro Glu Asn Asn Val Gly Leu 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 20 Glu Asn Asn Val Gly Leu 1 5

Claims

단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드, 또는 동등한 기능적 활성을 갖는 그의 약학적 활성 염으로서,
상기 펩티드는 서열 번호 1에 나타낸 항분비 인자(AF: Antisecretory Factor) 단백질(AF)의 단편에 상응하며,
상기 펩티드는 적어도, 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열(AF-6)을 포함하고 서열 번호 2의 아미노산(aa) 위치 1에 시스테인 디술피드를 포함하며,
상기 펩티드는 항분비 활성을 갖는 것인,
단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드, 또는 동등한 기능적 활성을 갖는 그의 약학적 활성 염.
제1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열 번호 3에 나타낸 아미노산 서열(AF-16)을 포함하고 서열 번호 3의 아미노산 위치 2에 시스테인 디술피드를 포함하는 것인 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드.
제1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열 번호 4에 나타낸 아미노산 서열(AF-8)을 포함하고 서열 번호 4의 아미노산 위치 2에 시스테인 디술피드를 포함하는 것인 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 6∼25 개의 아미노산 길이이거나, 또는 적어도 6, 7, 8, 16 또는 17 개의 아미노산 길이 및 많아야 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 개의 아미노산 길이인, 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 7에 나타낸 아미노산(VC(C)HSKTRSNPENNVGL), 또는 서열 번호 8에 나타낸 아미노산 서열(C(C)HSKTR), 또는 서열 번호 9에 나타낸 아미노산 서열(VC(C)HSKTR)을 포함하는 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 7에 나타낸 아미노산(VC(C)HSKTRSNPENNVGL), 또는 서열 번호 8에 나타낸 아미노산 서열(C(C)HSKTR), 또는 서열 번호 9에 나타낸 아미노산 서열(VC(C)HSKTR)로 이루어진 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 0.2시간의 t_1/2를 갖는 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1.8시간의 t_1/2를 갖는 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 약제에 사용하기 위한 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 병리학적 체액 수송(pathological fluid transport), 감염, 염증, 염증 반응, TBI, TBI 관련 병태 및 증상, 종양, 종양 관련 합병증, 암, 구획 증후군, 교모세포종, 당뇨병 및 설사로 이루어진 목록으로부터 선택된 질환 및 병태를 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한, 또는 활성 물질의 세포 흡수의 최적화, 신경 보호 및/또는 카베올라의 정상화를 위해 사용하기 위한 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, TBI 및/또는 2차 뇌 손상으로부터 선택된 TBI 관련 병태 또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 후천적 뇌 손상을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드 및 적합한 약학 담체를 포함하는, 감염, 염증, 염증 반응, TBI, TBI 관련 병태, 종양, 종양 관련 합병증, 암, 구획 증후군, 교모세포종, 당뇨병 및 설사로 이루어진 목록으로부터 선택된 질환 및 병태를 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 약학 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 단리된 재조합 및/또는 합성 제조 펩티드 및 적합한 약학 담체를 포함하는, TBI, TBI와 관련된 2차 뇌 손상, 또는 후천적 뇌 손상을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 약학 조성물.
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