ES2886642T3 - Factor antisecretor 17 - Google Patents

Abstract

Péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética, o sal farmacéuticamente activa del mismo, en el que dicho péptido comprende al menos una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 2 (AF-6) y un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido (aa) n.º 1 de SEQ.ID.NO. 2, teniendo dicho péptido actividad antisecretora.

Description

DESCRIPCIÓN

Factor antisecretor 17

Campo de la invención

El factor antisecretor (AF) es un complejo proteico que inhibe la inflamación y regula el transporte de líquidos; el complejo AF reside en proteasomas modificados. Se han caracterizado previamente péptidos sintéticos que comprenden la secuencia antidiarreica AF-16, situada entre las posiciones de aminoácido 35 y 50 de la secuencia de proteína de factor antisecretor (AF) (documento WO 97/08202; documento WO 05/030246). Se sabe que el AF16 se degrada rápidamente en el plasma. La presente invención da a conocer el principal destino metabólico del AF-16 en el plasma, que es una rápida formación de disulfuro de AF16, lo que da como resultado que el AF-16 comprenda un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido 2 (C2) (a continuación en el presente documento denominado AF-17). Esta acción, al ser reversible, protege claramente al AF16 de la degradación rápida de la peptidasa. Basándose en este sorprendente conocimiento, la presente invención da a conocer por primera vez péptidos sintéticos, que comprenden AF-17 que, cuando se administran a un paciente que los necesita, proporcionan una semivida sustancialmente prolongada de AF16.

Antecedentes de la invención

Factor antisecretor (AF)

El factor antisecretor (AF) es una proteína de 41 kDa que originalmente se describió que proporcionaba protección contra las enfermedades diarreicas y la inflamación intestinal (para una revisión, véase: The antisecretory factor: Synthesis, anatomical and cellular distribution, and biological action in experimental and clinical studies. Int Rev Cytol, 2001. 210: págs. 39-75). Se ha secuenciado la proteína de factor antisecretor (AF) y se ha clonado su ADNc. La actividad antisecretora parece ser ejercida principalmente por un péptido situado entre las posiciones de aminoácido 35 y 50 en la secuencia de proteína de factor antisecretor (AF) (es decir, la ^{secuencia antidiarreica/secuencia de consenso) que comprende al menos 4-16, tal como en particular 4,} 6^{, 7,} 8 ^o 16 aminoácidos de la secuencia antidiarreica. Las investigaciones inmunoquímicas e inmunohistoquímicas han revelado que la proteína de factor antisecretor (AF) está presente y también puede ser sintetizada por la mayoría de los tejidos y órganos en un organismo. Se han caracterizado previamente péptidos sintéticos que comprenden la secuencia antidiarreica/de consenso o fragmentos de la misma (documento WO 97/08202; documento WO 05/030246). Se han dado a conocer previamente que las proteínas y péptidos de factor antisecretor (AF) normalizan el transporte de líquido patológico y/o las reacciones inflamatorias, tal como en el intestino y el plexo coroideo en el sistema nervioso central después de la exposición a la toxina del cólera (documento WO 97/08202). Por tanto, se ha sugerido que los alimentos y los piensos con capacidad para o bien inducir la síntesis endógena de AF o bien la captación de AF añadidos son útiles para el tratamiento del edema, la diarrea, la deshidratación y la inflamación, por ejemplo, en el documento WO 97/08202. El documento WO 98/21978 da a conocer el uso de productos con actividad enzimática para la producción de un alimento que induce la formación de proteínas de factor antisecretor (AF). El documento W^o 00/038535 da a conocer además productos alimenticios enriquecidos en proteínas nativas de factor antisecretor (AF) como tal (NASP).

También se ha demostrado que las proteínas de factor antisecretor (AF) y fragmentos de las mismas mejoran la reparación del tejido nervioso y la proliferación, apoptosis, diferenciación y/o migración de células madre y progenitoras y de células derivadas de las mismas en el tratamiento de estados asociados a la pérdida y/o ganancia de células (documento WO 05/030246) y que son igualmente eficaces en el tratamiento y/o la prevención de la hipertensión intraocular (documento WO 07/126364), como para el tratamiento y/o la prevención del síndrome compartimental (documento WO 07/126363).

Los presentes inventores han demostrado además que el AF es capaz de monitorizar y/o afectar beneficiosamente a la estructura, distribución y múltiples funciones de las balsas lipídicas, los receptores y/o las caveolas en las membranas y, por tanto, es útil para el tratamiento y/o la prevención de la desorganización estructural y la disfunción de las balsas lipídicas y/o las caveolas en las membranas celulares (documento WO 07/126365).

Los presentes inventores han podido demostrar además que la misma proteína de factor antisecretor (AF), así como péptidos y fragmentos de la misma, pueden intervenir en la activación biológica de las proteínas transmembrana, por ejemplo, NKCC1 a través de FAK y CAP, y que pueden así regular directamente la actividad patológica del canal iónico en células patológicas y/o perturbadas, normalizando efectivamente la presión intracelular y la función de la proteína transmembrana en dicha célula, y permitiendo así una mejor captación de los fármacos usados en, por ejemplo, la terapia contra el cáncer (documento WO 2010/093324).

Los presentes inventores aislaron una proteína denominada AF1 (factor antisecretor 1) de la sangre, y secuenciaron su gen codificador. Posteriormente, se demostró que el AF1 era un constituyente de la subunidad del proteasoma 19S, y como tal se denominó PSMD4, RPN10 o S5a. Se demostró además que las enterotoxinas bacterianas y los cereales procesados eran capaces de inducir una forma alterada del factor antisecretor (AF), que inhibía la inflamación y la secreción de líquidos en el intestino. Se descubrió que esta forma modificada de AF se unía al polisacárido agarosa. Después de la elución con a-metilglucósido, pudo determinarse su concentración mediante ELISA.

Sorprendentemente, se ha demostrado recientemente que los proteasomas reaccionan con los factores del complemento C3 después de la ingesta de cereales procesados (SPC). Esta reacción da lugar a la exposición de epítopos antisecretorios previamente ocultos, y la formación del complejo proteasoma/complemento da lugar a la división de C3 en su forma inactiva C3c.

En consecuencia, hay muchos estados médicos que se beneficiarían de la administración de AF-16. Por desgracia, se ha demostrado que tiene una semivida muy corta en el organismo de los pacientes una vez administrado.

Se sabe que los enlaces disulfuro de cisteína proporcionan resistencia a las proteasas, tal como se muestra en los documentos KING GLENN F ET AL: “Spider-venom peptides: structure, pharmacology, and potential for control of insect pests”, ANNUAL REVIEW OF ENTOMOLOGY 2013, vol. 58, 2013, páginas 475-496, KING GLENN F: “Venoms as a platform for human drugs: translating toxins into therapeutics.”, EXPERT OPINION ON BIOLOGICAL THERAPY NOV 2011, vol. 11, n.° 11, noviembre de 2011 (11-2011), páginas 1469-1484, que describen ambos péptidos extremadamente ricos en S-S y que muestran disposiciones únicas de enlaces disulfuro que les dan forma de nudos y hélices que, a su vez, les proporcionan una resistencia extrema a las proteasas.

LAUER-FIELDS JANELLE L ET AL: “Application of topologically constrained mini-proteins as ligands, substrates, and inhibitors”, METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (CLIFTON, N.J.) 2007, vol. 386, 2007, páginas 125-166, afirma que “Una de las limitaciones en la creación de péptidos con diseños topológicos definidos es la inestabilidad termodinámica inherente a las moléculas más pequeñas. Este problema puede superarse mediante el uso de enlaces disulfuro, que sirven para desplazar el equilibrio de especies no plegadas a plegadas.” La presente invención presenta por primera vez un metabolito de AF16 aislado, recombinante o producido de manera sintética, y protegido (a continuación en el presente documento denominado AF-17), con una semivida sustancialmente prolongada en el organismo de los pacientes una vez administrado.

Sumario de la presente invención

En una realización, la presente invención se refiere a un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética, a continuación en el presente documento denominado AF-17 (tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 7), o una sal farmacéuticamente activa del mismo, que tiene una actividad funcional equivalente, que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 3 (AF-16) y un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido n.° 2 de SEQ.ID.NO. 3, teniendo dicho péptido actividad antisecretora.

En la figura 12 se muestra la estabilidad relativa de AF16 en diferentes especies. Tal como se documenta en el presente documento por primera vez, independientemente de la especie, el AF16 desaparece rápidamente, con ^{una semivida (ti/}2^{) in vitro inferior o igual a 10 minutos. Los presentes inventores fueron además capaces por} primera vez de determinar el destino molecular del péptido de AF-16 después de su administración, lo que condujo a una comprensión profunda de la base farmacocinética de cualquier acción farmacológica del AF y al ^{desarrollo de un nuevo péptido de AF (AF-17) con una semivida (ti/}2^{) in vitro mejorada, permitiendo medios} mejorados para controlar el destino de la sustancia activa de AF después de su administración a un paciente que lo necesita y, en consecuencia, conduciendo a medios mejorados para optimizar la pauta de administración del AF activo y/o del péptido de AF.

La presente invención identifica por primera vez que el principal metabolito de AF es un disulfuro de cisteína del AF16 (AF-17). La rápida formación de disulfuro de AF16, al ser reversible, protege claramente a AF16 de la rápida degradación de la peptidasa y es una función protectora que permite a AF16 alcanzar su diana intacto en un grado mucho mayor, y/o que mejora los medios para monitorizar el destino de la sustancia activa de AF después de su administración a un paciente que lo necesita y, en consecuencia, conduce a una pauta de administración optimizada del AF activo y/o del péptido de AF.

Tal como se revela en el presente documento, los presentes inventores sintetizan y estudian por primera vez las propiedades farmacocinéticas in vitro del AF-17, demostrando que el AF-17 puede administrarse directamente a un paciente que lo necesita y que el AF-17 es al menos tan eficaz como el AF-16 para normalizar el transporte de líquido patológico y/o las reacciones inflamatorias, tal como en el intestino, después de la exposición a la toxina del cólera, tal como se muestra, por ejemplo, en el experimento 3. Dado que el AF-16 ha demostrado ser eficaz en una gran variedad de enfermedades y estados diferentes seleccionados de, pero no limitados a, normalizar el transporte de líquido patológico y/o las reacciones inflamatorias, tratar y/o prevenir la TBI, los tumores y/o las complicaciones relacionadas con los tumores, para tratar el cáncer, el síndrome compartimental, el glioblastoma, la diabetes y la diarrea, para optimizar la captación celular de un fármaco dado, tal como un fármaco molecular pequeño, para la neuroprotección, así como para la normalización de la caveola, y que el AF-17 es el metabolito de AF-16 que se produce de manera natural, puede asumirse que el AF-17 dado a conocer en el presente documento es al menos tan eficaz como el AF-16 para tratar las mismas enfermedades y/o estados para los que se sabe que el AF-16 es eficaz.

Por tanto, la presente invención da a conocer un nuevo y mejorado péptido activo aislado recombinante o sintético que consiste en, comprende, se deriva de y/o se basa en la proteína (AF-17) de factor antisecretor (AF) y su(s) uso(s) en medicina. En particular, la presente invención se refiere al uso del AF-17 descrito en el presente documento para el tratamiento de lesión cerebral traumática (TBI).

Además, tal como se conoce ampliamente a partir de extensos estudios de la proteína antisecretora (AF) a lo largo de muchos años, la proteína endógena es procesada de manera postranscripcional para dar una plétora de péptidos más pequeños, todos con un efecto antisecretor similar probado, siempre que la secuencia activa ^{central de la proteína (AF-}6^{, mostrada en el SEQ.ID.NO. 2) esté intacta. Por tanto, resulta lógico que, en el} entorno natural, la proteína antisecretora (AF) sea degradada y/o procesada de manera postranscripcional para ^{dar péptidos más pequeños que comprenden AF-}6^{, y que el metabolito de esos péptidos más pequeños, en} analogía con el destino observado de AF-16, también esté protegido al menos por un disulfuro en la única ^{cisteína de AF-}6^{, es decir, en la posición de aminoácido 1 de AF-}6^{, tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 2.}

Por tanto, la presente invención se refiere además a un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética, o a una sal farmacéuticamente activa del mismo, que tiene una actividad funcional equivalente, en el que dicho péptido comprende al menos una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 2 ^(AF-6^{) y un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido n.° 1 de SEQ.ID.NO. 2, teniendo dicho péptido actividad antisecretora y una semivida (ti/}2^{) in vitro mejorada en comparación con un péptido que consiste en un} fragmento idéntico de la proteína de factor antisecretor (AF) mostrado en SEQ.ID.NO. 1 (AF) y/o un homólogo ^{del mismo, en el que dicho péptido no comprende un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido n.°} 1 ^de SEQ.ID.NO. 2.

En una realización actualmente preferida, el péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 3 (AF-16) y un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido n.° 2 de SEQ.ID.NO. 3.

Un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención tiene una ^{longitud de} 6 ^{a 25 aminoácidos, preferiblemente 7-17, 6-16, 7-20, 7-17, 16-25, 16-20, 17-20, 17-25, como por ejemplo} 6^{, 7,} 8^{, 9, 16 o 17 aminoácidos. En determinadas realizaciones, tiene una longitud de al menos} 6^{, 7, 16 o 17 aminoácidos y/o como máximo 7,} 8^{, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25} aminoácidos.

Un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención comprende normalmente la secuencia de aminoácidos (VC(C)HSKTRSNPENNVGL), tal como se muestra en SEQ.ID.NO.7, ^{o la secuencia de aminoácidos (C(C)HSKTR) tal como se muestra en SEQ.ID.NO.}8^{, o la secuencia de} aminoácidos (VC(C)HSKTR) tal como se muestra en SEQ.ID.NO.9.

Un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención consiste normalmente en los aminoácidos (VC(C)HSKTRSNPENNVGL) tal como se muestra en SEQ.ID.NO.7, o la ^{secuencia de aminoácidos (C(C)HSKTR) tal como se muestra en SEQ.ID.NO.}8^{, o la secuencia de aminoácidos} (VC(C)HSKTR) tal como se muestra en SEQ.ID.NO.9.

Un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención tiene normalmente una t1/2 de al menos 0,2 h, preferiblemente de al menos 0,25 h, 0,3 h, 0,4 h, 0,5 h, 1 h o 1,5 h, 1,9 h, 2,0 h, 2,5 h, tal como una t1/2 de al menos 1,8 h.

La presente invención se refiere además a un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención para su uso en medicina, tal como para su uso en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades y estados seleccionados de la lista que consiste en transporte de líquido patológico, infecciones, inflamaciones, reacciones inflamatorias, TBI, estados relacionados con TBI, tumores, complicaciones relacionadas con tumores, cáncer, síndrome compartimental, glioblastoma, diabetes y diarrea. La presente invención se refiere además a un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención para optimizar la captación celular de una sustancia activa, para la neuroprotección y/o para la normalización de la caveola.

En una realización, se prevé una composición farmacéutica y/o cosmética que comprende un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención y un portador farmacéutico adecuado.

Una composición farmacéutica y/o cosmética según la presente invención está destinada para su uso en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades y estados seleccionados de la lista que consiste en el transporte de líquido patológico, infecciones, inflamaciones, reacciones inflamatorias, TBI, estados relacionados con TBI, tumores, complicaciones relacionadas con tumores, cáncer, síndrome compartimental, glioblastoma, diabetes y diarrea. La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica y/o cosmética según la presente invención para optimizar la captación celular de una sustancia activa, para la neuroprotección y/o para la normalización de la caveola.

También se refiere a un método para normalizar el transporte de líquido patológico y/o la reacción inflamatoria en el paciente que lo necesita, y/o un método para optimizar la captación celular de una sustancia activa para la neuroprotección y/o para la normalización de la caveola y/o para tratar y/o prevenir enfermedades y estados seleccionados de la lista que consiste en transporte de líquido patológico, infecciones, inflamaciones, reacciones inflamatorias, TBI, estados relacionados con TBI, tumores, complicaciones relacionadas con tumores, cáncer, síndrome compartimental, glioblastoma, diabetes y diarrea, que comprende administrar a un animal o a un ser humano que lo necesita una cantidad eficaz de un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención o una composición farmacéutica que comprende dicho péptido.

Leyendas de las figuras

Figura 1

Oxidación de la cisteína. A: ácido sulfénico, B: ácido sulfínico, C: ácido sulfónico

Figura 2

Análogo de la N-etilmaleimida de AF16 (AF16-NEM)

Figura 3

Estabilidad en plasma humano y en tampón de AF16 (A) y AF16-NEM (B)

Figura 4

Productos de degradación de AF16 en el plasma humano detectados mediante CL-EM

Figura 5

Degradación de AF16 en presencia de células Caco-2. PI indica el cóctel de inhibidores de la proteasa ^Figura 6

Cinética de formación de metabolitos de la degradación de AF16 en presencia de células Caco-2. Rombo azul AF16. Cuadrado rojo AF16 cóctel de inhibidores

Figura 7

Cinética de formación de metabolitos de la degradación de AF16 en presencia de células Caco-2. Rombo azul AF16. Cuadrado rojo AF16 cóctel de inhibidores

^Figura 8

Cinética de formación de metabolitos de la degradación de AF16 en presencia de células Caco-2. Rombo azul AF16. Cuadrado rojo AF16 cóctel de inhibidores

Figura 9

Degradación de AF16 en presencia de células Caco-2. Rutas sugeridas de estructuras determinadas Figura 10

Estabilidad relativa de AF16 con diferentes métodos de precipitación a lo largo de 20 h a 10°C. La figura 10 muestra los resultados de la inyección repetida de la misma muestra tres veces a lo largo de 20 h. Resulta evidente que TCA y MeCN muestran una buena estabilidad aparente a lo largo del tiempo. Se observa una ligera ^{desaparición con ZnSO}4 ^{a las 20 h. Con MeOH se observa una pérdida significativa a lo largo del tiempo. Es} probable que el AF16 sea estable con MeOH, pero la pérdida se debe a la precipitación del péptido, ya que se sabe que los péptidos pueden tener una solubilidad limitada en mezclas alcohólicas.

Figura 11

Estabilidad relativa de AF16 con diferentes métodos de precipitación a lo largo de 20 h a 10°C. La figura 11 muestra un diagrama de los datos adquiridos anteriormente en comparación con los demás en cuanto a intensidad de EM (recuento de iones). La precipitación con TCA mostró la señal más fuerte y se estableció como referencia. Resulta evidente que los métodos no orgánicos se quedan atrás, muy probablemente debido a los iones supresores coeluyentes. Los dos métodos con mejor estabilidad (TCA y MeCN) muestran una diferencia de más de 500 veces en la sensibilidad, por lo que, para continuar con los estudios, se eligió el TCA para usarlo durante todo el estudio.

Figura 12

Estabilidad relativa de AF16 con diferentes métodos de precipitación a lo largo de 20 h a 10°C

Figura 13

Cinética de AF16 y de los metabolitos identificados en el plasma humano (arriba) y de rata (abajo)

Figura 14

Exploración de resolución potenciada del metabolito 592.3/594.4

Figura 15

^{Cinética de AF16 y de los metabolitos identificados usando ZnSO}4 ^{como precipitante plasmático y /- DTT. A:} humano DTT, B: humano - DTT, C: rata DTT y D: rata - DTT. AF16 se muestra en el círculo completo Figura 16

Formación relativa de los principales productos identificados en el plasma humano

Figura 17

Formación relativa de los principales productos identificados en el plasma de rata

Figura 18

Lista de secuencias

Definiciones y abreviaturas

Abreviaturas

IFP: presión del líquido intersticial;

PBS: solución salina tamponada con fosfato;

AF: factor antisecretor, proteína de AF de longitud completa (tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 1)

^AF-6^{: un hexapéptido CHSKTR (tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 2);}

^{AF-7: un péptido que se compone de los aminoácidos C(C)HSKTR (tal como se muestra en SEQ.ID.NO.} 8^); AF-16: un péptido que se compone de los aminoácidos VCHSKTRSNPENNVGL (tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 3);

AF-17: un péptido que se compone de los aminoácidos VC(C)HSKTRSNPENNVGL (tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 7);

^AF-8^{: un septapéptido VCHSKTR (tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 4);}

AF-9: un péptido que se compone de los aminoácidos VC(C)HSKTR (tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 9); Octapéptido IVCHSKTR (tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 5);

^{Pentapéptido HSKTR (tal como se muestra en SEQ.ID.NO.} 6^);

SPC: cereales especialmente procesados;

RTT: método para medir una respuesta de secreción estandarizada en el intestino delgado de rata, tal como se publicó en el documento SE 9000028-2 (número de publicación 466331) para medir el contenido de AF (ASP); AF: factor antisecretor;

ELISA: ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas;

PBS: solución salina tamponada con fosfato;

AP: fosfatasa alcalina;

BSA: albúmina sérica bovina;

AcM: anticuerpo monoclonal;

CL-EM/EM: cromatografía de líquidos de nanoflujo-espectrometría de masas en tándem;

PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida.

VHS1: virus del herpes simple 1

TBI: lesión cerebral traumática

Definiciones

Las proteínas son macromoléculas biológicas constituidas por residuos de aminoácidos unidos juntos por enlaces peptídicos. Las proteínas, como polímeros lineales de aminoácidos, también se denominan polipéptidos. Normalmente, las proteínas tienen de entre 50 y 800 residuos de aminoácidos y, por tanto, tienen pesos moleculares que oscilan entre aproximadamente 6.000 y varios cientos de miles de Dalton o más. Las proteínas pequeñas se denominan péptidos, polipéptidos u oligopéptidos. Los términos “proteína”, “polipéptido”, “oligopéptido” y “péptido” pueden usarse de manera intercambiable en el presente contexto. Los péptidos pueden tener muy pocos residuos de aminoácidos, por ejemplo de entre 2 y 50 residuos de aminoácidos (aa).

El término “antisecretor” se refiere, en el presente contexto, a la inhibición o disminución de la secreción y/o la transferencia de líquidos. En el presente contexto, los términos “proteína de factor antisecretor”, “proteína de factor antisecretor (AF)”, “proteína de AF”, AF, o un homólogo, derivado o fragmento de los mismos, pueden usarse de manera intercambiable con el término “factores antisecretores” o “proteínas de factor antisecretor” tal como se definen en el documento WO 97/08202, y se refieren a una proteína de factor antisecretor (AF) o a un péptido o a un homólogo, derivado y/o fragmento de la misma que tenga una actividad antisecretora y/o funcional equivalente y/o análoga, o a una modificación de la misma que no altere la función del polipéptido. Por tanto, debe entenderse que un “factor antisecretor”, “proteína de factor antisecretor”, “péptido antisecretor”, “fragmento antisecretor”, o una “proteína de factor antisecretor (AF)” en el presente contexto, también puede referirse a un derivado, homólogo o fragmento de los mismos. Estos términos pueden usarse de manera intercambiable en el contexto de la presente invención. Además, en el presente contexto, el término “factor antisecretor” puede abreviarse como “AF”. La proteína de factor antisecretor (AF) en el presente contexto también se refiere a una proteína con propiedades antisecretoras tal como se definió previamente en los documentos WO97/08202 y WO 00/38535. Los factores antisecretores también se han dado a conocer, por ejemplo, en el documento WO 05/030246.

SPC© es un alimento médico que comprende cereales especialmente procesados (SPC).

Un “alimento médico”, en el presente contexto, se refiere a un alimento, un pienso o complemento alimenticio, o un alimento para uso dietético especial, que se ha preparado con una proteína de factor antisecretor (AF), o alternativamente, tiene la capacidad de inducir la síntesis y/o activación del AF endógeno. Dicho alimento puede ser cualquier alimento adecuado, en forma fluida o sólida, tal como un líquido o un polvo, o cualquier otro alimento adecuado. Pueden encontrarse ejemplos de esta materia en el documento WO 0038535 o el documento WO 91/09536.

Salovum©, también entendido por el término factor antisecretor, son factores antisecretorios nativos (NASP) que pueden proporcionarse en la yema de huevo con un alto contenido de factores antisecretorios (NASP), tal como por ejemplo, se da a conocer en los documentos SE 900028-2 y WO 00/38535, y tal como se describe más adelante.

Descripción detallada de la invención

La presente invención identifica por primera vez que el principal metabolito de AF es un disulfuro de cisteína del AF16 (AF-17). La rápida formación de disulfuro de AF16, al ser reversible, protege claramente al AF16 de la degradación rápida de la peptidasa y es una función protectora que permite a AF16 alcanzar su diana intacto en un grado mucho mayor, y mejora los medios para monitorizar el destino de la sustancia activa de AF después de su administración a un paciente que lo necesita y, en consecuencia, conduce a una pauta de administración optimizada de la sustancia activa de AF, AF de longitud completa, un fragmento de ^a F y/o péptido de AF. Tal como se documenta por primera vez en el presente documento, se da a conocer un nuevo péptido de AF ^{recombinante (AF-17) producido sintéticamente o aislado con una semivida (t}1^/2^{) in vitro mejorada, que permite} medios mejorados para monitorizar el destino de la sustancia activa de AF después de la administración a un paciente que lo necesita y, en consecuencia, conduce a medios mejorados para optimizar la pauta de administración del AF activo y/o del péptido de AF.

En una realización, la presente invención se refiere a un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética denominado a continuación en el presente documento AF-17 (tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 7), o una sal farmacéuticamente activa del mismo, que tiene una actividad funcional equivalente, que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 3 (AF-16) y un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido n.° 2 de SEQ.ID.NO. 3, teniendo dicho péptido actividad antisecretora.

En otra realización, la presente invención se refiere a un péptido aislado recombinante y/o producido de manera ^{sintética, a continuación en el presente documento denominado AF-7 (tal como se muestra en SEQ.ID.NO.} 8^{), o} una sal farmacéuticamente activa del mismo, que tiene una actividad funcional equivalente, que comprende una ^{secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 2 (AF-}6^{) y un disulfuro de cisteína en la posición} de aminoácido n.° 1 de SEQ.ID.NO. 3, teniendo dicho péptido actividad antisecretora.

En aún otra realización, la presente invención se refiere a un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética, a continuación en el presente documento denominado AF-9 (tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 9), o una sal farmacéuticamente activa del mismo, que tiene una actividad funcional equivalente, ^{que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 4 (AF-}8^{) y un disulfuro de} cisteína en la posición de aminoácido n.° 2 de SEQ.ID.NO. 4, teniendo dicho péptido actividad antisecretora. Tal como se reveló en el presente documento, los presentes inventores dan a conocer por primera vez un péptido según la presente invención que es al menos tan eficaz como el AF-16 para normalizar el transporte de líquido patológico y/o las reacciones inflamatorias, tal como en el intestino, después de la exposición a la toxina del cólera, tal como se muestra, por ejemplo, en el experimento 3. Un péptido según la presente invención es eficaz en una gran variedad de enfermedades y estados diferentes seleccionados de, pero no limitados a, normalizar el transporte de líquido patológico y/o las reacciones inflamatorias, tratar y/o prevenir la TBI, los tumores y/o las complicaciones relacionadas con los tumores, para tratar el cáncer, el síndrome compartimental, el glioblastoma, la diabetes y la diarrea, para optimizar la captación celular de un fármaco dado, para la neuroprotección, así como para la normalización de la caveola.

Por tanto, la presente invención da a conocer un nuevo y mejorado péptido activo aislado recombinante o sintético que consiste en, comprende, se deriva de y/o se basa en la proteína (AF-17) de factor antisecretor (AF) y su(s) uso(s) en medicina. En particular, la presente invención se refiere al uso de uno o una combinación de los AF-17, AF-7 y/o AF-9 descritos en el presente documento para tratar y/o prevenir enfermedades y estados seleccionados de la lista que consiste en transporte de líquido patológico, infecciones, inflamaciones, reacciones inflamatorias, TBI, estados relacionados con TBI, tumores, complicaciones relacionadas con tumores, cáncer, síndrome compartimental, glioblastoma, diabetes y diarrea, o para optimizar la captación celular de una sustancia activa, para la neuroprotección y/o para la normalización de la caveola.

La presente invención da a conocer un nuevo y mejorado péptido activo aislado recombinante o sintético que consiste en, comprende, se deriva de y/o se basa en la proteína (AF-17) de factor antisecretor (AF) y en particular un nuevo péptido denominado factor antisecretor (AF) 17. El péptido se usa, por ejemplo, para normalizar el transporte de líquido patológico y/o las reacciones inflamatorias en animales, incluyendo los seres humanos. El AF-17 puede usarse además para la inmunodetección, como aditivo para piensos de animales en crecimiento y como antidiarreico y fármaco contra enfermedades que implican edema, deshidratación y/o inflamación.

El factor antisecretor

El factor antisecretor es una clase de proteínas que se produce de manera natural en el organismo. La proteína de factor antisecretor AF humana es una proteína de 41 kDa, que comprende 382-288 aminoácidos cuando se aísla de la glándula pituitaria. El sitio activo según la presente invención puede localizarse en la proteína en una región cercana al extremo N-terminal de la proteína, en particular en los aminoácidos 1-163 de SEQ ID NO 1, más específicamente en las posiciones de aminoácido 35 - 50 en la secuencia de la proteína de factor antisecretor (AF). El efecto biológico del AF es ejercido por cualquier péptido o polipéptido que comprenda al ^menos 6 ^{aminoácidos, tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 2 (AF-}6^{), de dicha secuencia consenso, o que} comprenda una modificación de la misma que no altere la función biológica del polipéptido y/o péptido.

Los presentes inventores han demostrado que el factor antisecretor es, hasta cierto punto, homólogo con la proteína S5a, y Rpn10, que constituye una subunidad de un constituyente que prevalece en todas las células, el proteasoma 26 S, más específicamente en la caperuza 19 S/PA 700. En la presente invención, las proteínas de factor antisecretor (AF) se definen como una clase de proteínas homólogas que tienen las mismas propiedades funcionales. El factor antisecretor también es muy similar a la angiocidina, otra isoforma proteica que se sabe ^{que se une a la trombospondina}-1 ^{y que está asociada a la progresión del cáncer.}

Los homólogos, derivados y fragmentos de las proteínas y/o péptidos de factor antisecretor (AF) según la presente invención tienen todos una actividad biológica análoga. Los homólogos, derivados y fragmentos, en el ^{presente contexto, comprenden al menos} 6 ^{aminoácidos (tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 2)} correspondientes a los de una proteína de factor antisecretor (AF) que se produce de manera natural, que pueden modificarse adicionalmente cambiando uno o más aminoácidos para optimizar la actividad biológica del factor antisecretor, sin alterar la función biológica esencial del polipéptido y/o péptido.

Por derivado se entiende en el presente contexto una proteína que tiene una actividad equivalente y/o una actividad funcional equivalente a la de un factor antisecretor tal como se define en el presente documento, que se deriva de otra sustancia, o bien directamente o bien mediante modificación o sustitución parcial, en la que uno o más aminoácidos se han sustituido por otro aminoácido, aminoácido que puede ser un aminoácido modificado o no natural. Por ejemplo, los derivados de factor antisecretor según la invención pueden comprender un grupo protector de extremo N-terminal y/o C-terminal. Un ejemplo de un grupo protector de extremo N-terminal incluye acetilo. Un ejemplo de un grupo protector de extremo C-terminal incluye amida.

Además, cualquier secuencia de aminoácidos que sea al menos el 70% idéntica, tal como que sea al menos el 72%, el 75%, el 77%, el 80%, el 82%, el 85%, el 87%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de una proteína, péptido, homólogo, derivado y/o fragmento de factor antisecretor (AF) según la invención, también se considera dentro del alcance de la presente invención.

Por proteínas, homólogos, derivados, péptidos y/o fragmentos de los mismos que tienen una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, un 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, se entiende que la secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, el péptido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia de aminoácidos puede incluir hasta 5 mutaciones puntuales por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos al menos un 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta un 5% de los aminoácidos de la secuencia de referencia puede delecionarse o sustituirse con otro aminoácido, o puede insertarse en la secuencia de referencia un número de aminoácidos de hasta un 5% del total de aminoácidos de la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

En la presente invención, un programa de algoritmo local es el más adecuado para determinar la identidad. Los programas de algoritmos locales, (tales como Smith Waterman) comparan una subsecuencia en una secuencia con una subsecuencia en una segunda secuencia, y encuentran la combinación de subsecuencias y el alineamiento de esas subsecuencias, que produce la mayor puntuación de similitud global. Los huecos internos, si se permiten, se penalizan. Los algoritmos locales funcionan bien para comparar dos proteínas multidominio, que tienen en común un solo dominio o sólo un sitio de unión.

Los métodos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas disponibles públicamente. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG (Devereux, J et al (1994)) BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul, S.F. et al (1990)). El programa BLASTX está disponible públicamente en el NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S.F. et al, Altschul, S.F. et al (1990)). Cada programa de análisis de secuencias tiene una matriz de puntuación por defecto y unas penalizaciones por defecto para los huecos. En general, se espera que un biólogo molecular use la configuración por defecto establecida por el programa de software usado.

Las proteínas de factor antisecretor (AF) o un péptido o un homólogo, derivado y/o fragmento de las mismas que ^{tenga una actividad equivalente como se define en el presente documento, pueden comprender} 6 ^{aminoácidos o más, tales como 6-16 aminoácidos, tales como} 6^{, 7,} 8^{, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos} o más. En otras realizaciones preferidas, el factor antisecretor consiste en 7, 9 o 17 aminoácidos. En determinadas realizaciones, la proteína de factor antisecretor (AF), un homólogo, derivado, péptido y/o fragmento ^{de la misma, según la presente invención, consiste en} 6^{, 7,} 8^{, 9, 15, 16 o 17 aminoácidos.}

En una realización actualmente preferida, un péptido aislado recombinante y/o sintético AF-17 (tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 7), o una sal farmacéuticamente activa del mismo, que tiene una actividad funcional equivalente, comprende una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 3 (AF-16) y un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido n.° 2 de SEQ.ID.NO. 3, teniendo dicho péptido actividad antisecretora.

En otra realización preferida, un péptido aislado recombinante y/o sintético, o una sal farmacéuticamente activa del mismo, que tiene una actividad funcional equivalente, comprende al menos una secuencia de aminoácidos tal ^{como se muestra en SEQ.ID.NO. 2 (AF-}6^{) y un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido n.° 1 de} SEQ.ID.NO. 2, teniendo dicho péptido actividad antisecretora.

En aún otra realización preferida, un péptido aislado recombinante y/o sintético, o una sal farmacéuticamente activa del mismo, que tiene una actividad funcional equivalente, comprende al menos una secuencia de ^{aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 4 (AF-}8^{) y un disulfuro de cisteína en la posición de} aminoácido n.° 2 de SEQ.ID.NO. 4, teniendo dicho péptido actividad antisecretora.

La proteína de factor antisecretor (AF), un homólogo, un derivado, un péptido y/o un fragmento de la misma, según la presente invención, puede producirse in vivo o in vitro, por ejemplo, de manera recombinante, sintetizarse de manera sintética y/o química, y/o aislarse a partir de una fuente que se produce de manera natural de factores antisecretores, tales como, de glándulas pituitarias de cerdo o huevos de ave. Después de la producción, la proteína de factor antisecretor (AF), el homólogo, el derivado, el péptido y/o el fragmento de la misma, según la presente invención, puede procesarse adicionalmente, tal como por escisión química o enzimática para dar fragmentos activos antisecretorios más pequeños y/o por modificación de aminoácidos y/o por adición de una cisteína en la posición de aminoácido n.° 1 de SEQ.ID.NO. 2, alternativamente en la posición de aminoácido n.° 2 de SEQ.ID.NO.3, a través de un enlace disulfuro en la cisteína del péptido.

Actualmente no es posible obtener la proteína de factor antisecretor (AF) en forma pura por purificación. Sin embargo, es posible producir una proteína de factor antisecretor biológicamente activa de manera recombinante o sintética, tal como se ha dado a conocer previamente en los documentos WO 97/08202 y WO 05/030246. El documento WO 97/08202 también da a conocer la producción de fragmentos biológicamente activos de esta proteína de 7-80 aminoácidos.

En el presente contexto, la proteína de factor antisecretor (AF), un homólogo, un derivado, un péptido y/o un fragmento de la misma, según la presente invención, es un metabolito natural de la proteína de factor antisecretor (AF) producido en un mamífero (excluyendo los seres humanos), o producido de manera recombinante y opcionalmente modificado químicamente, o un péptido producido sintéticamente.

La proteína de factor antisecretor (AF), un homólogo, un derivado, un péptido y/o un fragmento de la misma, según la presente invención, puede comprender además un grupo protector de extremo N-terminal y/o C-terminal. Un ejemplo de un grupo protector de extremo N-terminal incluye acetilo. Un ejemplo de grupo protector de extremo C-terminal incluye la amida.

En una realización preferida de la presente invención, la proteína de factor antisecretor (AF), un homólogo, un derivado, un péptido y/o un fragmento de la misma, según la presente invención, se selecciona de las SEQ ID NO 7-9, es decir, VC(C)HSKTRSNPENNVGL (SEQ ID NO 7, en este contexto también llamada AF-17), ^{C(C)HSKTR (SEQ ID NO} 8^{, en este contexto también llamada AF-7), VC(C)HSKTR (SEQ ID NO 9 en este} contexto también llamada AF-9), usando las abreviaturas comunes de una letra para los aminoácidos. Tal como se especifica en la lista de secuencias adjunta, algunos de los aminoácidos de las secuencias especificadas anteriormente pueden reemplazarse por otros aminoácidos.

La presente invención también contempla la combinación de dos o más de cualquiera de los péptidos según SEQ ID NO 7-9.

En aún otra realización, la invención se refiere al uso de una composición farmacéutica tal como se da a conocer en el presente documento, que comprende dos o más proteínas de factor antisecretor (AF), un homólogo, derivado, péptido y/o fragmento de las mismas, según la presente invención.

Disulfuro

En el presente contexto, un disulfuro se refiere a un grupo funcional con la estructura general R-S-S-R. El enlace también se denomina enlace SS o puente disulfuro y suele derivarse del acoplamiento de dos grupos tiol. En términos formales, la conexión es un persulfuro, por analogía con su congénere, el peróxido (R-O-O-R).

La cisteína (abreviada como Cys o C) es un aminoácido proteinogénico semiesencial con la fórmula HO2CCH(NH2)CH2SH>. Está codificada por los codones UGU y UGC. La cadena lateral de tiol de la Cys participa a menudo en las reacciones enzimáticas, como nucleófilo. El tiol es susceptible a oxidación para dar el derivado de disulfuro cisteína, que desempeña un importante papel estructural en muchas proteínas.

Los residuos de cisteína se encuentran entre los aminoácidos más implicados químicamente, participando normalmente en las reacciones químicas redox, pero también como nucleófilos frente a los electrófilos reactivos, tales como las especies reactivas de oxígeno o los xenobióticos/fármacos modificados metabólicamente. AF16 contiene un residuo de cisteína en la posición 2 de SEQ.ID.NO.2. El AF-17, o cualquier otro péptido que contenga disulfuro según la presente solicitud, tal como, pero sin limitarse a AF-7 y AF-9, está protegido de ese modo contra la oxidación del azufre, contra la reacción con otras cisteínas (formación de disulfuro), contra la reacción con electrófilos y, por tanto, es más resistente contra la actividad proteolítica.

Síntesis

Los enlaces disulfuro se forman habitualmente a partir de la oxidación de los grupos sulfhidrilo (-SH). Una variedad de oxidantes promueve esta reacción, incluyendo aire y peróxido de hidrógeno. Se cree que estas reacciones avanzan a través de productos intermediarios de ácido sulfénico. En el laboratorio, el yodo en presencia de una base se emplea habitualmente para oxidar los tioles a disulfuros. Alternativamente, los enlaces disulfuro en las proteínas se forman a menudo por intercambio tiol-disulfuro. Estas reacciones están mediadas por enzimas en algunos casos y en otros están bajo control de equilibrio, especialmente en presencia de una cantidad catalítica de base.

Se han desarrollado muchos métodos especializados para la formación de disulfuros, para aplicaciones en síntesis orgánica y pueden emplearse para producir los péptidos de AF-disulfuro sintéticos AF-17 o AF-7 o AF-9 o basados en AF-7 según la presente invención.

El AF16 muestra un alto grado de sensibilidad al plasma tal como se muestra en la figura 3A. La cinética de ^{degradación indica una semivida (ti/}2^{) in vitro de 0,4 h. Se prevé que el AF-17 tenga una estabilidad casi 5 veces mayor, ti}/2 ^{= 1,8 h. El AF16 es muy sensible a la degradación enzimática y química en la circulación sistémica. El} AF-17 es más resistente a las reacciones enzimáticas o químicas, ya que el resto cisteína está modificada. Los experimentos piloto cuantitativos de AF16 durante los experimentos de permeabilidad de las células Caco-2 mostraron claramente una rápida desaparición del péptido (no se muestra). Es bien sabido que en el intestino, y como tal en el lado apical de las células Caco-2, existen peptidasas de borde en cepillo. La cinética de ^{degradación de AF16 es muy rápida, tal como se describió, con una t}1/2 ^de 8 ^minutos.

El AF16 y el péptido marcado isotópicamente en cantidad similar se incubaron en plasma de rata y humano tal como se describe en el experimento 1. Para el análisis de los datos de EM de barrido completo, se usó un software de identificación de metabolitos de Sciex, Lightsight, que compara la respuesta de EM incubada con la muestra de control de calidad (QC) y asigna picos aparentes como metabolitos con valores específicos de masa sobre carga (m/z). Las áreas de los picos de metabolitos más grandes se ordenaron por rango y, en algunos casos, se verificaron mediante la fragmentación EM/EM. La metodología Skyline se usó para predecir la fragmentación de los péptidos identificados, pero también ayudó a crear métodos MRM sensibles para poder monitorizar cantidades bajas.

^{La tabla} 6 ^{enumera los productos identificados y su cantidad relativa a una incubación de 30 minutos. La} sensibilidad de EM puede diferir y, por tanto, los porcentajes individuales pueden cambiar. Al revisar los resultados, quedó claro que, basándose en el área relativa de los picos identificados, un metabolito era mucho ^{mayor que el otro, designado M1 en la tabla} 6^{. Sin embargo, el par de masas identificado (m/z 625/630) no} correspondía a ningún producto catabólico (escisión de enlaces peptídicos proteolíticos prevista). Este par se identifica ahora como el disulfuro de cisteína de AF-16 (AF-17).

Tratamientos médicos

TBI

La lesión cerebral traumática (TBI) es una lesión compleja con un amplio espectro de síntomas y discapacidades. La lesión cerebral traumática (TBI), también conocida como lesión intracraneal, se produce cuando una fuerza externa lesiona traumáticamente el cerebro. La TBI puede clasificarse en función de la gravedad, el mecanismo (lesión craneal cerrada o penetrante) u otras características (por ejemplo, que se produzca en un lugar específico o en una zona extensa). En el presente contexto, se entiende que la TBI también incluye lesión craneal, es decir, puede implicar daños en estructuras distintas del cerebro, tales como el cuero cabelludo y el cráneo.

La TBI es una causa principal de muerte y discapacidad en todo el mundo, especialmente en niños y adultos jóvenes. Las causas incluyen caídas, accidentes de tráfico y violencia. Los traumatismos cerebrales pueden producirse como consecuencia de un impacto focal sobre la cabeza, por una aceleración/desaceleración repentina dentro del cráneo o por una compleja combinación de ambos, movimiento e impacto repentino. Además del daño provocado en el momento de la lesión, el traumatismo cerebral provoca lesiones secundarias, una serie de acontecimientos que tienen lugar en los minutos y días siguientes a la lesión. Estos procesos, que incluyen alteraciones del flujo sanguíneo cerebral y de la presión dentro del cráneo, contribuyen sustancialmente al daño de la lesión inicial.

La TBI puede provocar una serie de efectos físicos, cognitivos, sociales, emocionales y conductuales, y el resultado puede variar desde la recuperación completa hasta la discapacidad permanente o la muerte.

En el presente contexto, los siguientes términos y definiciones se refieren a las diferentes lesiones relacionadas con/de TBI, todas las cuales pueden tratarse mediante la administración de un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética, o una sal farmacéuticamente activa del mismo, que tiene una actividad funcional equivalente, en la que dicho péptido comprende al menos una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en ^{s Eq .ID.NO. 2 (AF-}6^{) y un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido n.° 1 de SEQ.ID.NO. 2, tal como} una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 3 (AF-16) y un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido n.° 2 de la SEQ.ID.NO. 3., a un paciente que lo necesita: lesión craneal cerrada, lesión craneal abierta, lesión axonal difusa, contusión, traumatismo penetrante y lesión secundaria.

El péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética dado a conocer actualmente, o una sal farmacéuticamente activa del mismo, que tiene una actividad funcional equivalente, en el que dicho péptido ^{comprende al menos una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 2 (AF-}6^{) y un disulfuro} de cisteína en la posición de aminoácido n.° 1 de SEQ.ID.NO. 2, tal como una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 3 (AF-16) y un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido n.° 2 de SEQ.ID.NO. 3, es particularmente útil para tratar y/o prevenir la TBI secundaria, tal como hinchazón y liberación de sustancias químicas que promueven la inflamación y la lesión o muerte celular. Esto provoca una hinchazón en el cerebro que puede aumentar la presión intracraneal e impedir que el líquido cefalorraquídeo drene fuera del cráneo. Esto provoca un mayor aumento de la presión y el daño cerebral. Si esto no se controla o se previene, el cerebro puede herniarse a través de (atravesar) la base del cráneo y provocar una insuficiencia respiratoria y la muerte. La prevención de esta lesión secundaria es el objetivo de la atención médica aguda después de la lesión.

Por tanto, la presente invención en una realización actualmente preferida se refiere al uso de un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir la lesión secundaria de TBI. La presente invención se refiere igualmente al uso de un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención para tratar y/o prevenir una lesión secundaria de TBI, a un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una lesión secundaria de TBI, así como a un método de tratamiento y/o prevención de una lesión secundaria de TBI mediante la administración a un paciente que lo necesita de un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención en una cantidad suficiente para tratar y/o curar a dicho paciente y/o prevenir los síntomas de la lesión de TBI.

La lesión secundaria de TBI incluye:

• Hemorragia intracraneal (sangrado dentro del cráneo)

• Hinchazón del cerebro

• Presión intracraneal aumentada (presión dentro del cráneo)

• Daños cerebrales asociados a la falta de oxígeno

• Infección dentro del cráneo, frecuente en los traumatismos penetrantes

• Cambios químicos que conducen a la muerte celular

• Aumento del líquido dentro del cráneo (hidrocefalia)

Lesión cerebral adquirida.

Las lesiones cerebrales adquiridas son lesiones distintas de las congénitas, hereditarias, degenerativas o los traumatismos de nacimiento. Esto incluye lesión cerebral traumática. En los tipos no traumáticos de lesión cerebral adquirida, el cerebro presenta habitualmente lesiones difusas. Estas lesiones no suelen incluirse en la lesión cerebral traumática, pero los síntomas abarcan el mismo espectro.

Las causas comunes son la anoxia y la hipoxia. Estas son la falta de oxígeno en el cerebro y la insuficiencia de oxígeno en el cerebro. Estas pueden producirse por problemas mecánicos con la respiración, con parada cardíaca o sangrado. Las drogas y las intoxicaciones también pueden provocar lesión cerebral traumática adquirida. La intoxicación por monóxido de carbono es un ejemplo de intoxicación que puede provocar una lesión cerebral.

El péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética dado a conocer actualmente, o una sal farmacéuticamente activa del mismo, que tiene una actividad funcional equivalente, en el que dicho péptido ^{comprende al menos una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 2 (AF-}6^{) y un disulfuro} de cisteína en la posición de aminoácido n.° 1 de SEQ.ID.NO. 2, tal como una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 3 (AF-16) y un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido n.° 2 de SEQ.ID.NO. 3, es igualmente útil para tratar y/o prevenir la lesión cerebral adquirida.

Por tanto, la presente invención en una realización preferida actualmente se refiere al uso de un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir la lesión cerebral adquirida. La presente invención se refiere igualmente al uso de un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención para tratar y/o prevenir la lesión cerebral adquirida, a un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la lesión cerebral adquirida, así como a un método de tratamiento y/o prevención de la lesión cerebral adquirida mediante la administración de un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención en una cantidad suficiente a un paciente que lo necesita.

Cáncer

En una realización, la presente invención se refiere a un método para tratar el cáncer, tal como, pero sin limitarse a, el glioblastoma, caracterizado por administrar un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética, o una sal farmacéuticamente activa del mismo, que tiene una actividad funcional equivalente, en el que ^{dicho péptido comprende al menos una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 2 (AF-}6⁾ y un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido n.° 1 de SEQ.ID.NO. 2, tal como una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 3 (AF-16) y un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido n.° 2 de SEQ.ID.NO. 3., a un paciente que lo necesita. En una realización de la presente invención, dicho método puede usarse para facilitar una captación de fármacos optimizada y la administración de una sustancia farmacéutica adicional.

En una realización preferida en la actualidad, dicho método para tratar a un mamífero que padece cáncer, tal como, pero sin limitarse a, el glioblastoma, puede comprender la alimentación de dicho paciente con un alimento, un producto alimenticio y/o un complemento alimenticio y, de este modo, inducir la producción endógena de AF para facilitar una captación de fármacos optimizada y la administración de una sustancia farmacéutica adicional. En el presente contexto, dicha sustancia y/o formulación farmacéuticas se selecciona del grupo que consiste en fármaco antineoplásico, fármaco antitumoral, radioterapia, sustancias y/o células inmunológicas y una sustancia antibiótica, un fármaco que selecciona como diana lesiones postraumáticas, un fármaco que selecciona como diana la neurodegeneración y un fármaco contra estados inflamatorios. Dicha sustancia farmacéutica adicional puede estar en forma de nanopartículas y/o formulaciones de las mismas para el tratamiento del cáncer, tal como, pero sin limitarse a, el glioblastoma (un tumor GBM).

A continuación en el presente documento, se describirán con detalle las realizaciones de la presente invención. Cabe señalar que las realizaciones dadas a conocer individualmente a continuación son ejemplos del péptido aislado o sintético y del uso previsto del péptido. La presente invención no se limita a estos ejemplos.

Síndrome compartimental

Además, en una realización, la presente invención se refiere al uso de un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir el síndrome compartimental. La presente invención se refiere igualmente al uso de un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención para tratar y/o prevenir el síndrome compartimental, a un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención para su uso en el tratamiento y/o la prevención del síndrome compartimental, así como a un método de tratamiento y/o prevención de la lesión cerebral adquirida mediante la administración de un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la presente invención en una cantidad suficiente a un paciente que lo necesita.

En una realización, la presente invención se refiere a un método para tratar y/o prevenir el síndrome compartimental o los síntomas del mismo, caracterizado por la administración de un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética, o una sal farmacéuticamente activa del mismo, que tiene una actividad funcional equivalente, en el que dicho péptido comprende al menos una secuencia de aminoácidos tal ^{como se muestra en SEQ.ID.NO. 2 (AF-}6^{) y un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido n.° 1 de} SEQ.ID.NO. 2, tal como una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 3 (AF-16) y un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido n.° 2 de SEQ.ID.NO. 3., a un paciente que lo necesita. En una realización de la presente invención, dicho método puede usarse para facilitar una captación de fármacos optimizada y la administración de una sustancia farmacéutica adicional.

Sección experimental

Ejemplo 1

El efecto del fragmento peptídico de la proteína de factor antisecretor (AF16) está bastante bien estudiado en diversas configuraciones farmacológicas por varios grupos. La mayoría de los estudios se han centrado en el efecto farmacológico/fisiológico de la proteína o el péptido. Sin embargo, hay menos informes que traten el punto de vista farmacocinético de AF16. Por tanto, todas las pruebas en diversas matrices han asumido que el AF, o presumiblemente el fragmento de péptido añadido del mismo, es la especie molecular que está provocando el efecto. Estudios anteriores en otros laboratorios han indicado, de hecho, que el AF o el AF16 es sensible a la degradación en, por ejemplo, el plasma humano o de roedores, pero no se ha realizado ninguna investigación detallada.

Este experimento resume los esfuerzos realizados para comprender la farmacocinética in vitro y el destino molecular del péptido de AF16 tanto en plasma humano agrupado como en presencia de células Caco-2, que se usa habitualmente en los estudios farmacológicos del AF16.

Materiales y métodos

Materiales

El material sólido de AF16 y el AF16 IS estable marcado isotópicamente (SIL) fueron proporcionados por Jan Bruhn en Lantmannen. Según la información proporcionada por Ewa Johansson de1Hospital Sahlgrenska, el péptido tiene una pureza de aproximadamente el 70%, siendo los otros componentes 4 x ácido trifluoroacético ^{(TFA) y x H}2^{O desconocido. Sin embargo, para simplificar, todas las concentraciones relativas al péptido se} consideran del 100%. Esta suposición no influye en los resultados presentados en el presente documento, ya que son relativos. Todos los demás productos químicos y consumibles procedían de fuentes comerciales comunes.

Alquilación y oxidación de AF16

^{Para someter a prueba la oxidación del AF16 se usó una disolución de peróxido de hidrógeno (H}2^O2^{) al 50%. Se añadieron 2 |il de H}2^O2 ^{(35 mM de concentración final) a una disolución de 1 ml de AF16 15 |iM en bicarbonato} de amonio 0,1 M. Inmediatamente después del mezclado, se inyectó la disolución (infusión directa) en el espectrómetro de masas (EM) para buscar productos de oxidación. Sólo se detectó el producto final oxidativo, el ácido sulfónico, del que se creó un método de reacciones múltiples (MRM) sensible (tabla 1). En un experimento simultáneo, la adición de un excedente de ditiotreitol (DTT) mostró que el DTT protegía contra la oxidación. La variante alquilada de N-etilmaleimida (NEM) de AF16 (AF16-NEM) se produjo mezclando 10 |il de NEM 0,1 M con 250 |il de AF16 2 mg/ml en PBS en un vial de vidrio para HPLC, obteniendo aproximadamente una disolución de 1 mM. La muestra se dejó reposar, sellada, a temperatura ambiente durante 30 minutos antes del análisis por EM. Después de 30 minutos quedaba menos del 5% de AF16 y se creó un método MRM sensible de AF16-NEM (tabla 1).

Estabilidad de AF16 en el plasma humano y en células Caco-2

La prueba de estabilidad de AF16 y AF16-NEM en plasma se realizó usando plasma humano agrupado (4 donantes, dos mujeres dos hombres) en viales de vidrio para HPLC a 37°C (conc. de incubación de 20 |iM). Se sometieron a prueba cuatro matrices diferentes: Plasma: fosfato de potasio isotónico 67 mM pH 7,4 (KP) (1:1), plasma: KP DTT 0,1 mM, KP y KP DTT 0,1 mM. Los tiempos de incubación fueron de 0, 1,5 y 3 h. A los tiempos indicados se extrajo una alícuota de 50 |il y se extinguió/precipitó en 150 |il de metanol helado y se congeló hasta el análisis. La cuantificación relativa se realizó por UPLC-EM/EM.

La investigación del destino de AF16 en presencia de células Caco-2 se realizó en tres ocasiones distintas. En primer lugar, se realizó una medición cuantitativa usando la metodología MRM (tabla 1) a lo largo de 0, 15, 30 y 60 minutos. En este caso, el AF16 o su posible metabolito de ácido sulfónico se monitorizó tanto en el compartimento apical como en el basolateral (no mostrado). El segundo experimento fue una determinación cualitativa del destino del AF16 durante una incubación de 60 minutos. Se incubó AF1650 |iM en tampón HBSS en el lado apical de la monocapa de células Caco-2 y se extrajeron alícuotas de 100 |il a los 5, 10, 20, 30 y ^{60 minutos. La muestra se colocó en una placa de 96 pocillos que contenía 100 |il de MeCN/H}2^{O. La placa se} selló y se congeló hasta el análisis por UPCL-EM de barrido completo (véase más abajo y la tabla 2). El tercer experimento fue una copia del segundo y la única diferencia fue que se usó una disolución HBSS de AF16:AF16 IS (1:1), para ayudar a la elucidación de la estructura.

Procedimientos analíticos

Todas las muestras de los diferentes ensayos se analizaron por UPCL-EM/EM. Se usó el siguiente sistema, un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Waters XEVO TQ (ionización por electropulverización, ESI) acoplado a un UPLC Waters Acquity (Waters Corp.). Para la separación cromatográfica se usó un gradiente ^{general (del} 1^{% de la fase móvil B al 50% a lo largo de una ejecución total de 3 minutos) en una columna C18} BEH de 1,7|im 2x100 mm (Waters Corp.). La fase móvil A consistió en TFA al 0,05% y la fase móvil B en acetonitrilo al 100%. La velocidad de flujo fue de 0,5 ml/min. Se inyectaron 5 |il de la muestra y se ejecutaron con los ajustes de espectrometría de masas indicados en la tabla 1. En el análisis de EM de barrido completo se usaron los mismos ajustes cromatográficos, excepto que se inyectaron 10 |il (bucle completo). La EM se ^{configuró para buscar iones en la ventana de 100-400 o 400-700 m/z usando el voltaje del cono en la tabla} 1^. Para el análisis de barrido de derivados de los iones originales seleccionados en la tabla 2, la energía de colisión se escalonó entre 10, 20 y 40 V. El ion original, la carga sugerida y el tiempo de retención de AF16 y los ^{metabolitos encontrados se enumeran en la tabla} 2^.

Tabla 1. Ajustes específicos de EM MRM usados para la detección. Iones producto en negrita usados para el análisis cuantitativo.

Tabla 2. Valores de iones moleculares m/z y tiempo de retención cromatográfica encontrados en incubaciones de AF16 con células Caco-2.

Resultados

Alquilación y oxidación de AF16

Los residuos de cisteína están entre los aminoácidos más implicados químicamente, participando normalmente en las reacciones químicas redox, pero también como nucleófilos frente a los electrófilos reactivos, tales como las especies reactivas de oxígeno o los xenobióticos/fármacos modificados metabólicamente. El AF16 contiene un residuo de cisteína, por lo que era importante comprobar si la sensibilidad a la oxidación u otra modificación se produce in vitro. En un primer momento, se realizó la oxidación de AF16 con peróxido de hidrógeno para ver si era posible crear métodos analíticos de EM de los posibles derivados de ácido sulfénico, sulfínico y sulfónico (figura 1). Se comprobó que el peróxido de hidrógeno era un reactivo oxidante demasiado fuerte para permitir la detección de las especies de orden inferior, por lo que sólo se creó un método para el análogo del ácido sulfónico.

Para explorar adicionalmente el papel de la cisteína en experimentos posteriores se creó una variante alquilada usando el reactivo S-alquilante N-etilmaleimida (NEM) (figura 2). El AF16 modificado con NEM está protegido de ese modo contra la oxidación del azufre, contra la reacción con otras cisteínas (formación de disulfuro), contra la reacción con electrófilos y presumiblemente es más resistente contra la actividad proteolítica, al ser un aminoácido no natural.

Estabilidad del AF16 en el plasma humano.

AF16, el AF16 estable marcado con isótopos (SIL) y el análogo alquilado AF16-NEM se incubaron a 1|iM en plasma humano: fosfato de potasio 0,1 M pH 7,4 (KP) (1:1), plasma humano:KP (1:1) DTT 1 mM, KP o KP DTT 1 mM a lo largo de 3 h a 37°C para investigar la estabilidad. Se incluyó KP para proporcionar capacidad tampón al plasma y no confundir los resultados con los efectos relacionados con el pH. Los resultados se muestran en la figura 3.

AF16 muestra un alto grado de sensibilidad al plasma tal como se muestra en la figura 3A. La cinética de ^{degradación indica una semivida (ti}/2^{) in vitro de 0,4 h. La inclusión de DTT parece tener un efecto protector que aumenta la t}1/2 ^{hasta 1,1 h. De manera interesante, el análogo no natural de AF16 (figura 3B) tiene una estabilidad casi 5 veces mayor, t}1/2 ^{= 1,8 h. En este caso, DTT también impone un efecto protector, ti}/2 ^{= 4,2h.} Estos resultados indican que el AF16 es muy sensible a la degradación enzimática y química en la circulación sistémica. También muestran que el AF16 es más resistente a las reacciones enzimáticas o químicas si se modifica el resto cisteína. El efecto de DTT con ambos compuestos es más difícil de entender, pero lo más probable es que esto refleje que el DTT protege contra las reacciones generales de oxidación, tales como la formación de productos de carbonilo, por ejemplo, la treonina, la lisina, la arginina y la prolina, todas ellas presentes en el AF16. El análisis de CL-EM de barrido completo de las incubaciones de 3 horas de AF16, SIL-AF16 y AF16-NEM reveló algunos resultados interesantes, véase la figura 4. Se encontraron dos productos de degradación distintos, la escisión en el 5° enlace peptídico (lisina y treonina) y en el 10° enlace (prolina y glutamato) dando lugar a los fragmentos teóricos VCHSK-TRs Np , TrSn P-ENnVGl y ENNVGL. Los fragmentos TRSNP-ENNVGL y ENNVGL fueron detectados por CL-EM pero no VCHSK-TRSNP. Presumiblemente, el fragmento no detectado sufrió una mayor degradación durante la incubación. De manera interesante, en la incubación con AF16-NEM, no se produjo ninguna proteólisis aparente en la posición cinco, lo que indica que se excluyen las proteasas que actúan hacia el extremo N-terminal, por ejemplo, las aminopeptidasas.

Estabilidad de AF16 con células Caco-2

Los experimentos piloto cuantitativos de AF16 durante los experimentos de permeabilidad de las células Caco-2 mostraron claramente una rápida desaparición del péptido (no mostrado). Es bien sabido que en el intestino, y como tal en el lado apical de las células Caco-2, existen peptidasas de borde en cepillo. Para investigar adicionalmente esto, se diseñó un experimento separado. Las células Caco-2 se expusieron en el lado apical a AF16 50 |iM, con o sin un cóctel de inhibidores de proteasas, y se tomaron muestras a lo largo de 1 hora. Los resultados de la degradación de AF16 se muestran en la figura 5.

^{La cinética de degradación de AF16 es muy rápida tal como se describió con una t}1/2 ^de 8 ^{minutos. El cóctel de inhibidores ralentiza significativamente la degradación (t}1/2 ^{= 57 min) pero no completamente, lo que indica una} cinética complicada. Se realizó un análisis de CL-EM para comprender el destino molecular de AF16. En las incubaciones con o sin inhibidores se detectaron varios metabolitos nuevos en comparación con el experimento de estabilidad en plasma. Sin embargo, esto puede depender de la mayor concentración de incubación usada. ^{Las figuras} 6-8 ^{muestran la cinética de formación de los metabolitos M1-M9 a lo largo del tiempo experimental y} la figura 9 muestra las estructuras preliminarmente determinadas para estos productos.

La tabla 3 muestra las cantidades relativas de las especies moleculares individuales, ± cóctel de inhibidores, después de 30 y 60 minutos, respectivamente. Los metabolitos aparentemente principales (>10 %) se indican por números en negrita. Sin embargo, es importante mencionar que cuando se hacen comparaciones como las de la tabla 3, se asume que todos los iones individuales tienen una sensibilidad de EM similar. Todos los productos identificados se refieren a escisiones en enlaces peptídicos específicos. Las composiciones de aminoácido sugeridas se muestran en la tabla 4.

En ausencia del cóctel de inhibidores, después de 30 minutos de incubación dominan tres metabolitos claros, ^{M1, M3 y M}6^{. Después de 60 minutos de incubación, tanto M3 como M}6 ^{disminuyen, mientras que M1 sigue aumentando linealmente (figuras} 6^{A/C y 7C). Si se observan las rutas sugeridas en la figura 9, es razonable suponer que la escisión del péptido N-terminal de M3 da lugar a M1. Sin conocer la estructura de M}6 ^{y su disminución relativamente rápida después de 20 minutos, esto también puede indicar que M}6 ^{contribuye a la} formación de M1. Se sugiere que los otros metabolitos son productos de degradación adicionales de M1 pero, por supuesto, podrían formarse también de una manera más directa, por una ruta más lenta.

Tabla 3. Cantidades preliminares (%) de las especies moleculares respectivas a 30 o 60 minutos de incubación con células Caco-2. (+/- cóctel de inhibidores de peptidasas)

El cóctel de inhibidores consistía en tres inhibidores de enzimas protelíticas, bestatinas (aminopeptidasa), diprotina A (dipeptidilpeptidasa IV) y captopril (enzima convertidora de angiotensina, una carboxipeptidasa). Es ^{interesante ver que debido a la inhibición de estas enzimas, la formación de M1, M3 y m}6 ^{se minimiza} efectivamente. Además, el producto teórico M7, mostrado en la figuras 4, 9 y la tabla 4, se forma de manera relativamente lineal y parece estar estabilizado por los inhibidores. Esto está de acuerdo con la inhibición de las ^{proteasas que actúan en el extremo N-terminal. La figura} 8^{A sugiere que el M7 se forma muy rápidamente al} principio sin inhibidores, pero es probable que se metabolice eficientemente después. Aunque son relativamente ^{pequeños, los principales metabolitos M}8 ^{y M9 no se han identificado todavía. Es muy posible que estos dos} metabolitos se deriven de una química más complicada que la escisión del enlace peptídico, tal como se ^{mencionó anteriormente. Sin embargo, para tratar de entender la estructura de los metabolitos desconocidos M}6^{, M}8 ^{y M9 y para verificar los ya asignados estructuralmente, se realizó un experimento adicional usando el AF16} marcado SIL. Sin embargo, de este experimento no se pudo extraer más información, aparte del hecho de que ^M6 ^{contiene un aminoácido SIL y M}8 ^{y M9 no. Sin embargo, esto debe explorarse más a fondo.}

Tabla 4. Composición de aminoácidos sugerida para los péptidos identificados preliminarmente.

La permeabilidad de o bien AF16 o bien cualquiera de los metabolitos detectados también se monitorizó en el lado basolateral después de 60 minutos de tiempo de incubación con las células Caco-2. Sin embargo, no se ^{encontró ningún metabolito en este experimento, excepto el M}8^{, que dio un pico distintivo en la incubación} inhibida.

Conclusiones y estudios futuros

Se han realizado varios experimentos in vitro importantes para comprender mejor la farmacocinética in vitro de AF16.

Es muy probable que el AF16 se adsorba, por ejemplo, a las superficies de poliestireno. Sin embargo, las contramedidas descritas no mostraron un efecto y es difícil interpretar su gravedad. A una concentración mayor, ^> 1 ^{|iM, el efecto no es evidente y, por tanto, en las incubaciones de la presente invención el efecto es} probablemente menor.

Los estudios actuales han demostrado que el péptido de AF16 se degrada a varios productos peptídicos en presencia tanto del plasma humano como de las células Caco-2.

La degradación es muy rápida en ambas matrices e indica una ruta metabólica similar, dando lugar a M1 como producto principal, formado linealmente y aparentemente estable (escisión en el 5° enlace peptídico (lisina y treonina)).

La implicación de peptidasas de borde en cepillo queda demostrada por el fuerte efecto del cóctel de inhibidores, ^{que aumenta la ti}/2 ^{in vitro de desde} 8 ^{hasta 55 minutos. El cambio en el patrón metabólico en presencia de} inhibidores de la proteasa es interesante, pero es muy probable que los metabolitos actualmente desconocidos ^(M8^{, M9) no se formen en un grado significativo en ausencia de inhibidores.}

La protección de la cisteína en la posición 2 con N-etilmaleimida estabiliza en gran medida el péptido en el plasma humano. Probablemente debido a la eliminación de la actividad de las aminopeptidasas.

Estos resultados, cuando se toman en conjunto, sugieren fuertemente que la farmacocinética in vitro de AF16 es compleja y necesita ser cuidadosamente equilibrada e interpretada con respecto al efecto farmacológico que se ha observado en diversos estados. Es evidente que el AF16 desaparece rápidamente in vitro después de un breve tiempo de incubación con células Caco-2. Además, unos pocos metabolitos se forman muy rápidamente a una tasa paralela a la desaparición de AF16. Es muy posible que el AF16 y los metabolitos actúen contra la misma diana con una eficacia similar, lo que se comprobará en un ensayo funcional.

Ejemplo 2

AF16: estabilidad in vitro en plasma y destino metabólico

Introducción

Este experimento resume los últimos descubrimientos sobre la cinética plasmática entre especies (humano, ratón, rata y perro) y el catabolismo/metabolismo cualitativo de AF16 en el plasma humano y de rata.

Materiales y métodos

Materiales

El material sólido de AF16 y el AF16 IS estable marcado isotópicamente (SIL) fueron proporcionados por Lantmannen AB. Según la información proporcionada por Ewa Johansson en el Hospital Sahlgrenska, el péptido tiene una pureza de aproximadamente el 70%, siendo los otros componentes 4 x ácido trifluoroacético (TFA) y x ^H2^{O desconocido. Sin embargo, para simplificar, todas las concentraciones relativas al péptido se consideran del} 100%. Esta suposición no influye en los resultados presentados en el presente documento, ya que se comparan de manera relativa. El plasma humano agrupado (4 donantes, 2 hombres y 2 mujeres, no fumadores) se obtuvo del hospital académico. El plasma animal era de Novakemi AB. Todos los demás productos químicos y consumibles procedían de fuentes comerciales comunes.

Prueba del precipitado plasmático

Para optimizar la sensibilidad de EM de AF16, se sometieron a prueba los agentes de precipitación de proteínas más comunes con una eficacia aparentemente similar. La matriz de plasma consistió en 1:2 (plasma:tampón de fosfato de potasio isotónico) (pH 7,4) y se precipitó en viales de vidrio para HPLC con o bien: 1:3 (acetonitrilo en ^{plasma (MeCN)), 1:4 (plasma:metanol (MeOH)), 1:3 (plasma:sulfato de zinc (ZnSO}4^{: NaOH 5 M) (10% p/v)) y 1:3} (plasma:ácido tricloroacético (TCA) (10% p/v)) (Polson et al, 2003). Se añadieron a la muestra adiciones conocidas de una mezcla 1:2 de 10 |iM (concentración final) de AF16 y de AF16 marcado isotópicamente (AFIS). Las muestras se sellaron y se centrifugaron a 3500 rpm. Después de la centrifugación, los sobrenadantes se analizaron por UHPCL-EM/EM (véase a continuación). Las muestras idénticas se inyectaron tres veces en diferentes puntos de tiempo para estudiar mediante sonda la estabilidad del péptido con un precipitante determinado en el inyector automático a 10°C.

Estabilidad, cinética e identificación de metabolitos de AF16 en plasma humano y de rata

Todas las incubaciones de las muestras de plasma usaron una mezcla 1:2 de AF16 (disolución madre 1 mM en ^MeCN:H2^{O) y AFIS (disolución madre 0,9 mM en MeCN:H}2^{O), esto para ayudar a la interpretación estructural de} los productos metabólicos o catabólicos. La mezcla de compuestos se pipeteó siempre hasta el fondo del vial antes de añadir cualquier otro disolvente. La estabilidad en plasma se realizó usando plasma humano, plasma de rata Wistar, plasma de ratón CD-1 y plasma de perro Beagle agrupados, en viales de vidrio sellados para HPLC a 37°C (conc. de incubación de 10 |iM). Los tiempos de incubación fueron en general entre 0 (muestra QC) y 2 h. En cada punto de tiempo se tomó una alícuota y se detuvo la reacción con el precipitante seleccionado, incluyendo ditiotreitol (DTT) (conc. final 1 mM). La cuantificación relativa (en comparación con el QC) se realizó mediante UHPCL-EM/EM (véase a continuación). La identificación de los metabolitos se realizó mediante la monitorización de reacciones múltiples (MRM, Skyline predicted MRM)), el software Lightsight (Sciex), el barrido de EM potenciado (EMS), el barrido de iones producto potenciado (EPI) y el barrido de resolución potenciado (ERS).

Procedimientos analíticos

Todas las muestras de los diferentes ensayos se analizaron por UHPCL-EM/EM con el uso de la trampa de iones lineal para el barrido EMS, ERS y EPI. Se usó el siguiente sistema: espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Sciex QTRAP 6500 (ionización por electropulverización, ESI) con una trampa de iones lineal acoplada a un UHPLC Agilent 1290. Para la separación cromatográfica se usó un gradiente general (del 0% de la fase móvil B al 90% en una ejecución total de 5-15 minutos) en una columna C18 HSS T3 de 1,8 |im 2x50 mm (Waters Corp.). La fase móvil A consistió en TFA al 0,05%/ácido fórmico al 0,05% y la fase móvil B en acetonitrilo al 100%, TFA al 0,05%/ácido fórmico al 0,05%. La velocidad de flujo fue de 0,5 ml/min. Se inyectaron 10 |il de la muestra y se ejecutaron con los ajustes de espectrometría de masas indicados en la tabla 5.

Tabla 5. Ajustes específicos de EM MRM usados para la detección de AF16 y metabolitos.

Resultados y discusión

Impacto del precipitado de proteínas plasmáticas en la sensibilidad de EM de AF16 y en la cromatografía UHPLC Debido a la complejidad de la matriz plasmática, era importante comprobar cómo responde la sensibilidad de espectrometría de masas (EM) o cromatografía de AF16 a diferentes métodos de precipitación de proteínas. Los precipitantes elegidos se aplican habitualmente y han demostrado tener una eficacia similar. Los resultados se ^{muestran en las figuras} 10 ^y 11^.

La figura 10 muestra los resultados de la inyección repetida de la misma muestra tres veces a lo largo de 20 horas. Está claro que el TCA y el MeCN muestran una buena estabilidad aparente a lo largo del tiempo. Se ^{observa una ligera desaparición con ZnSO}4 ^{a lo largo de 20 h. Con el MeOH se observa una pérdida significativa} a lo largo del tiempo. Es probable que el AF16 sea estable con MeOH, pero la pérdida se debe a la precipitación del péptido, ya que se sabe que los péptidos pueden tener una solubilidad limitada en mezclas alcohólicas. Van a realizarse pruebas adicionales.

La figura 11 muestra un diagrama de los datos adquiridos anteriormente en comparación con los demás en cuanto a intensidad de EM (recuento de iones). La precipitación con TCA mostró la señal más fuerte y se estableció como referencia. Resulta evidente que los métodos no orgánicos se quedan atrás, muy probablemente debido a los iones supresores coeluyentes. Los dos métodos con mejor estabilidad (TCA y MeCN) muestran una diferencia de más de 500 veces en la sensibilidad, por lo que, para continuar con los estudios, se eligió el TCA para usarlo durante todo el estudio.

Estabilidad en plasma de AF16

En la figura 12 se muestra la estabilidad relativa de AF16 en diferentes especies. Independientemente de la ^{especie, el AF16 desaparece rápidamente con una semivida (t}1^/2^{) in vitro inferior o igual a 10 minutos. Por tanto,} es de suma importancia determinar el destino molecular del péptido para entender la base farmacocinética de cualquier acción farmacológica.

Destino molecular de AF16 en plasma humano y de rata

El AF16 y el péptido marcado isotópicamente en cantidad similar se incubaron en plasma de rata y humano tal como se describió anteriormente. Para el análisis de los datos de EM de barrido completo, se usó el software de identificación de metabolitos de Sciex, Lightsight, que compara la respuesta de EM incubada con la muestra de control de calidad (QC) y asigna picos aparentes como metabolitos con valores específicos de masa sobre carga (m/z). Actualmente, el software no es óptimo para su uso con compuestos de carga múltiple, tales como los péptidos, por lo que la tasa de aciertos en la detección de metabolitos es bastante alta y hubo que realizar una evaluación manual de cada pico encontrado. Las áreas de los picos de metabolitos más grandes se ordenaron por rango y, en algunos casos, se verificaron mediante la fragmentación EM/EM. La metodología Skyline se usó para predecir la fragmentación de los péptidos identificados, pero también ayudó a crear métodos de MRM sensibles para poder monitorizar cantidades bajas.

^{La tabla} 6 ^{enumera los productos identificados y su cantidad relativa a una incubación de 30 minutos. Sin} embargo, hay que destacar que esta comparación supone que cada producto tiene la misma sensibilidad de EM, que puede ser diferente y, por tanto, los porcentajes individuales pueden cambiar. Al revisar los resultados, quedó bastante claro que, basándose en el área relativa de los picos identificados, un metabolito era mucho ^{mayor que los demás, designado M1 en la tabla} 6^{. Sin embargo, el par de masas identificado (m/z 625/630) no} correspondía a ningún producto catabólico (escisión de enlaces peptídicos proteolíticos prevista). Este par se identifica ahora como el disulfuro de cisteína de AF16.

^Tabla 6^{. % de área relativa de los metabolitos identificados en plasma humano y de rata.}

La figura 13 muestra la cinética relativa de los metabolitos identificados y es evidente que el disulfuro de cisteína M1 se forma de manera similar, tanto en cuanto a velocidad como en cuanto a cantidad, en plasma humano y de rata, lo que indica que la rata puede ser un buen modelo para los estudios farmacológicos. La mayor disparidad entre el ser humano y la rata es la formación de M9, que se forma de manera lineal a lo largo del tiempo en el ser humano, pero en un grado muy bajo en la rata. Una explicación a esto podría ser que la actividad proteolítica de los fragmentos más pequeños en plasma humano es mayor que en el de la rata. Un metabolito (M10) con un par ^{m/z de 592,3/594,4 (no mostrado en la tabla} 6^{/figura 13) seguía siendo desconcertante y se comprendió por} primera vez tras los estudios de EM/EM y el escaneo en modo ERS (figura 14). ERS mostró que tenía una carga triple en el patrón isotópico de 13C (paso de 0,3 Da entre los picos isotópicos) y coincidía con un producto disulfuro M2. M2 se forma en cantidades aparentemente bajas, pero esta formación podría estar oculta por una oxidación eficiente de la cisteína, formando el disulfuro. Alternativamente, M10 se forma a partir de M1, pero esto es menos probable. La escisión simple la valina N-terminal es bastante sorprendente (formando M2) ya que la mayoría de las peptidasas que actúan en el extremo N-terminal cortan dos aminoácidos a la vez y es, hasta donde se sabe, raro que una peptidasa actúe tan cerca del disulfuro y forme M10.

Para verificar adicionalmente que estos productos, M1 y M10, eran efectivamente disulfuros, se incubó una mezcla de reacción con el agente alquilante selectivo de cisteína N-etilmaleimida, que confirmó que no había reacción con estos metabolitos (no mostrado).

La cinética mostrada en la figura 13 fue sorprendente dado el hecho de que se usó DTT en la disolución de extinción con TCA, aunque es probable que la capacidad reductora del DTT disminuya en condiciones ácidas. ^{Por tanto, se sometió a prueba si se producía el mismo patrón al usar un precipitante neutro ZnSO}4 ^{(sin NaOH).} Este método de precipitación no es tan eficaz, pero se espera que proporcione más información sobre la formación de los principales productos de disulfuro. Los resultados se muestran en la figura 15.

A partir de la figura 15 y en comparación con la figura 13, resulta evidente que no se indican grandes diferencias y también es muy sorprendente la resistencia del disulfuro M1/M10 frente a la reducción del DTT.

Conclusiones y estudios futuros

Se han realizado una serie de importantes experimentos in vitro para comprender mejor la farmacocinética in vitro del AF16 y cómo puede trasladarse a la situación in vivo.

1. El ácido tricloroacético se ha identificado como la opción óptima para retirar las proteínas plasmáticas en la mezcla de incubación y mantener una buena sensibilidad de e M y cromatografía.

2. Se sabe que el AF16 se degrada rápidamente en el plasma gracias a estudios anteriores. Esta investigación lo valida aún más, pero también muestra que la tasa es similar entre las diferentes especies.

3. Se muestra que el principal destino metabólico aparente en el plasma, tanto de la rata como del ser humano, es la rápida formación de disulfuro del AF16. Esta acción, al ser reversible, protege claramente al AF16 de la rápida degradación de la peptidasa, lo que se ha demostrado anteriormente con la estabilización por N-etilmaleimida, que es menos reversible. Esto puede verse como una función protectora que permite al AF16 alcanzar su diana intacto en un grado mucho mayor.

4. El disulfuro M1/M10 es sorprendentemente resistente a la reducción del DTT.

Ejemplo 3

M1 (AF-17) se sintetiza para poder realizar una cuantificación precisa in vitro/in vivo, pero también para estudiar las propiedades farmacocinéticas in vitro en general y para usarse en estudios farmacológicos.

La actividad biológica de AF-17 - Se midió la actividad antisecretora en un modelo de asa intestinal de rata previamente descrito (Lange, S. (1982) FEMS Microbiol. Lett. 15, 239-242). Un asa yeyunal se expuso a 3 pg de toxina del cólera. Se inyectaron por vía intravenosa o intramuscular diferentes dosis de AF-17, AF-16 producidos de manera sintética o de control (= sin péptido, sólo tampón (XY)), antes de la exposición a la toxina del cólera. Se registró el peso del líquido acumulado en el asa intestinal (mg/cm (mg/ml)) después de cinco horas. Cada preparación de AF se sometió a prueba en al menos seis ratas. Se usó el PLSD de Fisher para el análisis estadístico de los datos.

La actividad biológica de AF-17 - Se sometió a prueba la actividad biológica del AF-17 en un modelo de rata. En la tabla 7 se muestra la capacidad del AF-17 para inhibir la secreción de líquido intestinal cuando se inyecta por vía intravenosa o intramuscular 20-30 segundos antes de la exposición intestinal a toxina del cólera. En los animales de control inyectados sólo con tampón, la toxina del cólera provocó una secreción pronunciada, 390 mg de líquido por cm de intestino.

El AF-17 provocó una inhibición dependiente de la dosis de la secreción de cólera que fue significativamente ^{diferente de la respuesta al tampón (p <} 0^,001^{, n=}6^).

Tabla 7

^Tabla 8

Bibliografía

1. Documento WO 97/08202;

2. Documento WO 05/030246

3. Documento WO 97/08202

4. Documento WO 97/08202

5. Documento WO 98/21978

6^{. Documento WO 00/038535.}

7. Documento WO 05/030246

8^{. Documento WO 07/126364}

9. Documento WO 07/126363

10. Documento WO 07/126365

11. Documento WO 2010/093324

12. Lange et al., 2003; Food-induced antisecretory factor activity is correlated with small bowel length in patients with intestinal resections. APMIS. Octubre de 2003; 111(10):985-8.

13. Laurenius et al., 2003; Antisecretory factor counteracts secretory diarrhoea of endocrine origin. Clin Nutr. Diciembre de 2003; 22(6):549-52.

14. Jennische et al., 2006; Immunohistochemical staining patterns using epitope-specific antibodies indicate conformation variants of antisecretory factor/S5a in the CNS. Ap MIS. Julio-agosto de 2006; 114(7-8):529-38.

15. Tomko, R.J., Jr. and M. Hochstrasser, Molecular architecture and assembly of the eukaryotic proteasome. Annu Rev Biochem, 2013. 82: págs. 415-45.

16. Sixt, S.U. and B. Dahlmann, Extracellular, circulating proteasomes and ubiquitin - incidence and relevance. Biochim Biophys Acta, 2008. 1782(12): págs. 817-23.

17. Johansson, E., I. Lonnroth, S. Lange, I. Jonson, E. Jennische, and C. Lonnroth, Molecular cloning and expression of a pituitary gland protein modulating intestinal fluid secretion. J Biol Chem, 1995. 270(35): págs.

20615-20.

18. Bjorck, S., I. Bosaeus, E. Ek, E. Jennische, I. Lonnroth, E. Johansson, and S. Lange, Food induced stimulation of the antisecretory factor can improve symptoms in human inflammatory bowel disease: a study of a concept. Gut, 2000. 46(6): págs. 824-9.

19. Lange, S. and I. Lonnroth, The antisecretory factor: synthesis, anatomical and cellular distribution, and biological action in experimental and clinical studies. Int Rev Cytol, 2001. 210: págs. 39-75.

20. Johansson, E., I. Lonnroth, I. Jonson, S. Lange, and E. Jennische, Development of monoclonal antibodies for detection of Antisecretory Factor activity in human plasma. J Immunol Methods, 2009. 342(1-2): págs. 64-70. 21. Johansson, E., M. Al-Olama, H.A. Hansson, S. Lange, and E. Jennische, Diet-induced antisecretory factor prevents intracranial hypertension in a dosage-dependent manner. Br J Nutr, 2013. 109(12): págs. 2247-52. 22. Nilsson, S.C., R.B. Sim, S.M. Lea, V. Fremeaux-Bacchi, and A.M. Blom, Complement factor I in health and disease. Mol Immunol, 2011.48(14): págs. 1611-20.

23. Nicolas, V. and V. Lievin-Le Moal, Antisecretory peptide AF-16 inhibits the Sat toxin-stimulated transcellular and paracellular passages of fluid in cultured human enterocyte-like cells. Infect Immun, 2014.

24. Matson Dzebo, M., A. Reymer, K. Fant, P. Lincoln, B. Norden, and S. Rocha, Enhanced cellular uptake of antisecretory peptide AF-16 through proteoglycan binding. Biochemistry, 2014. 53(41): págs. 6566-73.

25. DeMartino, G.N., Purification of PA700, the 19S regulatory complex of the 26S proteasome. Methods Enzymol, 2005. 398: págs. 295-306.

26. Cara Polson, Pratibha Sarkar, Bev Incledon, Vanaja Raguvaran, Russell Grant. Optimization of protein precipitation based upon effectiveness of protein removal and ionization effect in liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B (2003). 785, págs. 263-275.

27. Lange, S. (1982) FEMS Microbiol. Lett. 15, 239-242

28. KING GLENN F ET AL: “Spider-venom peptides: structure, pharmacology, and potential for control of insect pests.”, ANNUAL REVIEW OF ENTOMOLOGY 2013, vol. 58, 2013, páginas 475-496.

29. KING GLENN F: “Venoms as a platform for human drugs: translating toxins into therapeutics.”, EXPERT OPINION ON BIOLOGICAL THERAPY NOV 2011, vol. 11, n.° 11, noviembre de 2011 (11-2011), páginas 1469­ 1484.

30. LAUER-FIELDS JANELLE L ET AL: “Application of topologically constrained mini-proteins as ligands, substrates, and inhibitors ”, METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (CLIFTON, N.J.) 2007, vol. 386, 2007, páginas 125-166.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética, o sal farmacéuticamente activa del mismo, en el que dicho péptido comprende al menos una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO.

^{2 (AF-}6^{) y un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido (aa) n.° 1 de SEQ.ID.NO. 2, teniendo dicho} péptido actividad antisecretora.

2. Péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la reivindicación 1, en el que dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 3 (AF-16) y un disulfuro de cisteína en la posición de aminoácido n.° 2 de SEQ.ID.NO. 3.

3. Péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según la reivindicación 1, en el que dicho ^{péptido comprende una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 4 (AF-}8^{) y un disulfuro} de cisteína en la posición de aminoácido n.° 2 de SEQ.ID.NO. 4.

4. Péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que tiene una longitud de 6-25 aminoácidos, preferiblemente de 7-17, 7-16, 7-2o, 8-17, 8-20, 17-25, 17-20, ^{tal como 7,} 8^{, 16 o 17 aminoácidos, o que tiene una longitud de al menos} 6^{, 7,} 8^{, 16 o 17 aminoácidos y como máximo 7,} 8^{, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 aminoácidos.}

5. Péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende los aminoácidos (VC(C)HSKTRSNPENNVGL) tal como se muestran en SEQ.ID.NO.

^{7, o la secuencia de aminoácidos (C(C)HSKTR) tal como se muestra en SEQ.ID.NO.} 8^{, o la secuencia de} aminoácidos (VC(C)HSKTR) tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 9.

6^{. Péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según cualquiera de las reivindicaciones} anteriores, que consiste en los aminoácidos (VC(C)HSKTRSNPENNVGL) tal como se muestran en ^{SEQ.ID.NO.7, o la secuencia de aminoácidos (C(C)HSKTR) tal como se muestra en SEQ.ID.NO.} 8^{, o la} secuencia de aminoácidos (VC(C)HSKTR) tal como se muestra en SEQ.ID.NO. 9.

7. Péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene una t1/2 de al menos 0,2 h, preferiblemente de al menos 0,5 h, 1 h o 1,5 h.

8^{. Péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene una t}1/2 ^{de al menos} 1,8 ^h.

9. Péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en medicina.

10. Péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades y estados seleccionados de la lista que consiste en transporte de líquido patológico, infecciones, inflamaciones, reacciones inflamatorias, TBI, estados y síntomas relacionados con TBI, tumores, complicaciones relacionadas con tumores, cáncer, síndrome compartimental, glioblastoma, diabetes y diarrea, o para su uso en la optimización de la captación celular de una sustancia activa, para la neuroprotección y/o para la normalización de la calveola.

11. Péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en el tratamiento y o la prevención de TBI y/o estados o síntomas relacionados con TBI, seleccionados de lesiones cerebrales secundarias.

12. Péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en el tratamiento y o la prevención de lesiones cerebrales adquiridas.

13. Composición farmacéutica que comprende un péptido aislado recombinante y/o producido de manera sintética según cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un portador farmacéutico adecuado.

14. Composición farmacéutica según la reivindicación 14, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades y estados seleccionados de la lista que consiste en transporte de líquido patológico, infecciones, inflamaciones, reacciones inflamatorias, TBI, estados relacionados con TBI, tumores, complicaciones relacionadas con tumores, cáncer, síndrome compartimental, glioblastoma, diabetes y diarrea, o para su uso en la optimización de la captación celular de una sustancia activa, para la neuroprotección y/o para la normalización de la calveola.

15. Composición farmacéutica según la reivindicación 14, para su uso en el tratamiento y o la prevención de TBI, tal como lesiones cerebrales secundarias asociadas a TBI, o para su uso en el tratamiento y o la prevención de lesiones cerebrales adquiridas.