CN105025916B - 抗分泌因子(af)在胶质母细胞瘤治疗中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗分泌因子(AF)蛋白、具有等效功能活性的其肽、其衍生物、其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐在胶质母细胞瘤治疗中的用途。在一个实施方式中，AF蛋白用于优化药物物质和/或制剂的递送和细胞摄取或基因递送。通常，所述药物物质和/或制剂包括抗癌药、放射治疗、抗生素物质、免疫活性化合物或靶向创伤后损伤、神经变性或炎性疾患的药物。

Description

抗分泌因子(AF)在胶质母细胞瘤治疗中的用途

技术领域

本发明涉及抗分泌因子(AF)蛋白，具有等效的功能活性的其肽、其衍生物、其同系物和/或其片段，和/或其药学活性盐作为佐剂用于胶质母细胞瘤治疗和/或用于优化至胶质母细胞瘤肿瘤细胞的药物物质和/或制剂诸如抗癌药的递送和细胞摄取、免疫治疗、放射治疗或者基因递送的用途。

在另一方面，本发明涉及监测和/或验证和/或增强患有胶质母细胞瘤的患者中的胶质母细胞瘤的治疗控制的新型且可靠的诊断和/或预后工具的设计。

背景技术

多形性胶质母细胞瘤(GBM)是最常见的和最有攻击性的人类原发性脑肿瘤，其涉及神经胶质细胞并占据全部颅内肿瘤的大部分。多形性胶质母细胞瘤是原发性脑肿瘤的约120种不同类型中最流行的瘤形式。在欧洲和北美，GBM年发病率是每100000人2-3例病例。根据WHO的中枢神经系统的肿瘤分类，该脑肿瘤的标准名称是"胶质母细胞瘤"，并且其以若干种变型存在。

多形性胶质母细胞瘤(GBM)被认为是最常见和致死形式的中枢神经系统癌。当前使用的手术方法、化疗剂、免疫疗法和放疗策略在延长被诊断患有GBM的患者的预期寿命方面几乎没有作为。治疗该恶性疾病的难度在于其内在复杂性和其复杂的耐药性机制。

胶质母细胞瘤具有任何中枢神经系统(CNS)恶性肿瘤的最差预后，尽管多模式治疗由手术切除尽可能多的肿瘤，及同时或依序化疗、放疗、抗血管生成疗法、免疫疗法、伽玛刀放射手术及使用皮质类固醇的症状治疗组成。预后极差，其中中位存活时间为大约一年，并且所述疾病几乎总是致命的，因为仅约3％存活超过3年。

多形性胶质母细胞瘤肿瘤，也被称为IV级，特征在于存在由具有多次有丝分裂和内皮增殖的间变性细胞围绕的坏死性组织区域。该特征以及存在增生性异常血管使肿瘤与不具有这些特征的III级星形细胞瘤区分开来。

存在数种胶质母细胞瘤亚型。在'典型'亚型中97％的肿瘤携带表皮生长因子受体(EGFR)基因的额外拷贝，并且大部分具有比正常EGFR表达更高的表达，而经常在胶质母细胞瘤中突变的基因TP53很少在该亚型中突变。相反，原神经亚型通常具有高的TP53和PDGFRα(编码α型血小板源性生长因子受体的基因)及IDHI(编码异柠檬酸脱氢酶-1的基因)的变化率。间充质亚型的特征在于NF1(编码1型神经纤维瘤病的基因)的高突变率或其它变化，EGFR基因的较少变化及EGFR而非其它类型的较少表达。

GBM肿瘤通常在脑白质中存在，生长快速并可在引起症状之前变得非常大。在低级星形细胞瘤或间变性星形细胞瘤的去分化之后，少于10％更慢地形成。这些被称为继发性GBM肿瘤并且在更年轻的患者(平均年龄45对比62岁)中更常见。肿瘤可延伸至脑膜或心室壁内，从而在脑脊髓液(CSF)中产生高蛋白含量(>100mg/dL)，以及10至100个细胞的偶尔脑脊液细胞增多，大多数是淋巴细胞。CSF中载有的恶性细胞可扩散(很少地)至脊髓或引起脑膜胶质瘤病。然而，GBM转移超出中枢神经系统是极其不寻常的。约50％的GBM肿瘤占据半球的多于一个叶或是双侧的。该类型的肿瘤通常源于大脑并且可能很少呈现在胼胝体上的典型浸润，从而产生蝴蝶状(双侧)神经胶质瘤。

所述肿瘤可呈现多种外观，这取决于出血的量、坏死和/或其年龄。CT扫描通常将显示具有低密度中心和由水肿围绕的强化的可变环的不均匀肿块。肿瘤和水肿的占位效应可压缩双室并引起如脑积水以及机械形变和疝形成。

异常的、功能失调性的肿瘤维管结构和胶质母细胞瘤干细胞样细胞(GSC)的形成据信是不能有效治疗GBM肿瘤的主要因素。此外，将肿瘤细胞紧紧包在保护性糖萼包衣中，从而预防如药物的接近以达到肿瘤细胞并在其上发挥作用。

原发性脑肿瘤和脑转移的治疗由根治性、症状性和姑息性疗法组成。

用于症状疗法的原发性支持剂是抗惊厥药和皮质类固醇。

根治性和姑息性治疗包括手术、放射治疗、免疫治疗和化疗。最大限度可行的切除术通常连同放射和化疗进行。肿瘤的全切除(Gross total resection)与更佳的预后相关。

遗憾地是，GBM肿瘤已知含有表现出缺氧的组织的区域，所述区域对放疗高度耐受。肿瘤干细胞已被证实占优势并对可用的疗法耐受。迄今为止，成功寻求到化疗、免疫治疗和放射致敏剂的各种方法是有限的。

此外，在其它治疗中，当前还测试了基因转移和蛋白治疗性治疗。

在无任何治疗的情况下，从诊断时间起的中位存活时间是3个月，而在完全自理的情况下，如今天所用，约1年。在现代、大量的治疗之后的2年，仅五分之一存活。年龄增长(>60岁)带有更差的预后风险。死亡通常由于脑水肿和/或增加的颅内压所致，并且另外由于损伤血液循环和引起脑疝形成的占位效应所致。

因此存在对改进的和/或优化的GBM肿瘤治疗的长久需要。

抗分泌因子(AF)是起初被描述为提供抗腹泻病和肠炎保护的41kDa蛋白(关于综述，参见Lange和

2001)。抗分泌因子(AF)蛋白已被测序并且其cDNA被克隆。抗分泌活性似乎主要由位于抗分泌因子(AF)蛋白序列上的氨基酸位置35与50之间且包含共有序列的至少4-16个诸如4、6、7、8或16个氨基酸的肽施加。免疫化学和免疫组织化学调查已揭示抗分泌因子(AF)蛋白存在并且还可由体内的大部分组织和器官合成。包含止泻序列的合成肽先前已被描述(WO 97/08202；WO 05/030246)。抗分泌因子(AF)蛋白和肽之前已被公开可在用霍乱毒素激发之后使病理性流体运输和/或炎症反应正常化，诸如在肠中和中枢神经系统中的脉络丛中(WO 97/08202)。能够诱导AF的内源性合成或添加的AF的摄取的食物和饲料因此已表明可用于治疗WO 97/08202中的水肿、腹泻、脱水和炎症。WO 98/21978公开了使用具有酶活性的产物以生产具有诱导抗分泌因子(AF)蛋白形成的食物。WO 00/038535另外公开了富含天然的像这样的抗分泌因子(AF)蛋白的食品。

抗分泌因子(AF)蛋白及其片段还显示出在与细胞损失和/或增加相关的疾患的治疗中可改善神经组织的修复及干细胞和祖细胞及其衍生的细胞的增殖、凋亡、分化和/或迁移(WO 05/030246)，并且在治疗和/或预防眼内高血压(WO07/126364)与治疗和/或预防间室综合征(WO 07/126363)同样有效。

此外，本发明人最近指出AF能够监测和/或有利地影响膜中的脂筏、受体和/或胞膜窖的结构、分布和多种功能，并因此可用于治疗和/或预防细胞膜中的脂筏和/或胞膜窖的结构混乱和功能障碍(WO 07/126365)。

本发明人此外能够证明相同的抗分泌因子(AF)蛋白、其肽及其片段可干预跨膜蛋白的生物活化，如NKCC1通过FAK和CAP，并且它们因此可直接调控病理细胞和/或扰动细胞中的离子通道的病理活性，从而有效地使所述细胞中的胞内压和跨膜蛋白功能正常化，并因此使得如癌症疗法所用的药物摄取改善(WO 2010/093324)。

本申请首次公开抗分泌因子(AF)蛋白、其肽、其同系物和/或其片段可另外用于胶质母细胞瘤的症状性、根治性和姑息性疗法中。特别地，它们可在胶质母细胞瘤的治疗中用作佐剂和/或用于优化药物和基因递送以及化疗、免疫治疗和放疗。

发明内容

本申请首次公开对治疗GBM肿瘤的有效方法的长期探索。其令人惊讶地公开了抗分泌因子AF可用于胶质母细胞瘤的症状性、根治性和姑息性疗法中。特别地，其可在胶质母细胞瘤的治疗中用作佐剂和/或用于优化药物和基因递送、以及化疗、免疫治疗和放疗。

如在实验章节中所示，本申请首次公开了具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白的片段，其用于降低由胶质母细胞瘤肿瘤所引起的升高的颅内压至约20mm Hg或更低的可接受的水平以及用于促进和/或改善化疗物质进入胶质母细胞瘤肿瘤细胞中。

本发明因此涉及用于治疗胶质母细胞瘤(GBM肿瘤)的如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白，和/或具有等效活性并至少包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段，和/或其药学活性盐。在一个实施方式中，其涉及用于治疗胶质母细胞瘤(GBM肿瘤)的富含所述抗分泌因子(AF)蛋白和/或其同系物和/或其片段的食物和/或食物补充剂。

如本文所定义的抗分泌因子(AF)蛋白和/或其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐，和/或富含所述抗分泌因子(AF)蛋白和/或其同系物和/或其片段的食物和/或食物补充剂，可用于制造用于胶质母细胞瘤的症状性、根治性和/或姑息性疗法的组合物和/或用在症状性、根治性和/或姑息性治疗胶质母细胞瘤的方法中。

特别地，抗分泌因子(AF)蛋白和/或其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐，和/或富含所述抗分泌因子(AF)蛋白和/或其同系物和/或其片段的食物和/或食物补充剂可用于优化治疗胶质母细胞瘤(GBM肿瘤)所用的另外的药物物质和/或制剂的递送和/或细胞摄取和/或基因递送。另一方面，抗分泌因子(AF)蛋白和/或其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐，和/或富含所述抗分泌因子(AF)蛋白和/或其同系物和/或其片段的食物和/或食物补充剂本身可用作胶质母细胞瘤(GBM肿瘤)治疗中的药物。

附图说明

图1：

在中心具有RG2-N32胶质母细胞瘤(深色染色；第22天)的大鼠脑的横截面，由水肿脑组织(浅橙色)界定。注意图片中心的右半球是放大的，导致中线偏移以及位错及中线和侧脑室的变形。

图2：

图1的更高放大倍数。高度细胞肿瘤通过指样伸展侵入脑组织，使得肿瘤难于界定。

图3：

RG2-N32胶质母细胞瘤的荧光显微图片经处理用于说明糖萼，其对每个肿瘤细胞界定。每个肿瘤细胞由富含α-N-乙酰半乳糖胺(绿色/由白色箭头标记)的糖萼以及在较小程度上由α-N-乙酰葡糖胺(红色)包围。注意红细胞的红色染色。将两个大血管用黑色箭头标记。

图4：

经麻醉的大鼠倚靠在其腹部。暴露头骨，且用于两个Samba压力传感器的光导件通过颅中的孔洞进入脑中。将所述两个光导件(箭头)在进行实验时通过支撑仪器固定，但在这张照片中不含所述支撑仪器以便于说明。

图5：

在具有胶质母细胞瘤的大鼠(第22天)的半小时记录期间，升高的颅内压显现为大约30mm Hg。正常大鼠中相应的压力为5.3±2.1mm Hg。扩展的肿瘤团块和脑水肿均造成压力升高。

图6：

具有胶质母细胞瘤的大鼠中的颅内压将随着时间增加，并最终引起扩大的脑变形和位错以及疝形成和循环衰竭。当前几乎没有任何选择可用于能够将动物从肿瘤扩大和脑水肿引起的有害效应中拯救出来。将所述动物在由箭头指示的时间处死。

图7：

具有胶质母细胞瘤的大鼠中的颅内压从经鼻施用AF-16(4mg/kg bw)后约12分钟开始降低。红线和蓝线显示压力降低同时在任一个脑半球中进行，在半个小时内实现压力为约20mm Hg，其被认为是可接受的水平。

图8：

具有胶质母细胞瘤的大鼠中的颅内压从经鼻滴注AF-6(1mg/kg bw)之后约15分钟开始降低。在几乎半个小时后获得17.7mm Hg。

图9和图10：

向在它们的右脑半球具有胶质母细胞瘤的大鼠在静脉内注射示踪剂多柔比星(10mg/kg bw)之前1小时经鼻滴注媒介物、水(图9)或AF-16(4mg/kg bw)。30分钟后从经麻醉的动物移除脑，并对其进行处理用于荧光显微术。与在用媒介物预处理之后获得的结果相比(图9)，用AF-16预处理增加了染色的强度和经染色的肿瘤细胞核的频率(示例性细胞用白色箭头指出)(图10)。该结果记录了AF-16促进标记物至胞内肿瘤细胞结构即治疗靶标的摄取和结合。

具体实施方式

定义和缩写

缩写

IFP：组织液压；

PBS：磷酸盐缓冲液；

AF：抗分泌因子，全长AF蛋白(如SEQ ID NO:1所示)；

AF-6：六肽CHSKTR(如SEQ ID NO:2所示)；

AF-16：由氨基酸VCHSKTRSNPENNVGL组成的肽(如SEQ ID NO:3所示)；

AF-8：七肽(speta peptide)VCHSKTR(如SEQ ID NO:4所示)；

八肽IVCHSKTR(如SEQ ID NO:5所示)；

五肽HSKTR(如SEQ ID NO:6所示)。

SPC：特殊处理的谷物

RTT：测量大鼠小肠中的标准化的分泌响应的方法，如SE 9000028-2(公开号466331)中所公开用于测量AF(ASP)的含量。

定义

蛋白质是由通过肽键连接在一起的氨基酸残基构成的生物大分子。蛋白质，作为氨基酸线性聚合物，也被称为多肽。通常，蛋白具有50-800个氨基酸残基，并因此具有在约6,000至约几十万道尔顿或更多范围内的分子量。小蛋白被称为肽、多肽或寡肽。术语"蛋白质"、"多肽"、"寡肽"和"肽"可在本文的上下文中互换使用。肽可具有非常少的氨基酸残基，诸如2-50个氨基酸残基(aa)。

"药物组合物"，在本文的上下文中，是指包含可选地与药学活性赋形剂诸如载体或媒介物组合的治疗有效量的抗分泌因子(AF)蛋白的组合物。所述药物组合物被配制用于适当的施用途径，所述施用途径可根据患者的情况以及其它因素诸如年龄或偏好选择而变化。包含抗分泌因子(AF)蛋白的药物组合物可用作药物递送系统。药物组合物在施用后向人或动物的身体呈递活性物质。所述药物组合物可呈片剂、丸剂、锭剂、胶囊、粪便丸剂(stool pills)、凝胶剂、溶液等的形式，但不限于此。

术语"药学活性盐"是指抗分泌因子(AF)蛋白、其肽或其多肽，或其同系物和/或其片段的盐，所述盐基于所谓的霍夫迈斯特系列(Hofmeiser's series)可以为任何源自于其的盐。药学活性盐的其它实例包括三氟乙酸盐、乙酸盐和赖氨酸氯化物，本发明不限于此。

术语"抗分泌性"在本文的上下文中是指抑制或减少分泌和/或流体转移。因此，术语"抗分泌因子(AF)蛋白"是指一类能够抑制或减少或另外调控体内流体转移以及分泌的蛋白。

在本文的上下文中，"等效活性"涉及抗分泌因子(AF)蛋白、其肽或其多肽，或其同系物、其衍生物和/或其片段的生物效应，即其改善疗法和/或用于治疗胶质母细胞瘤的能力。用于测试和/或测量此类能力的标准化实例是本技术领域所熟知的。在本申请的实验章节诸如实施例1-4中给出实例。

在本文的上下文中，术语"抗分泌因子蛋白"、"抗分泌因子(AF)蛋白"、"AF-蛋白"、AF或其同系物、衍生物或片段可与如WO 97/08202所定义的术语"抗分泌因子"或"抗分泌因子蛋白"互换使用，并且是指具有抗分泌性和/或等效功能性和/或类似物活性或者其修饰不改变多肽功能的抗分泌因子(AF)蛋白或其肽或其同系物、其衍生物和/或其片段。因此，应该理解"抗分泌因子"、"抗分泌因子蛋白"、"抗分泌肽"、"抗分泌片段"或"抗分泌因子(AF)蛋白"在本文的上下文中也可指其衍生物、同系物或片段。这些术语全都可在本发明的上下文中互换使用。此外，在本文的上下文中术语"抗分泌因子"可缩写为"AF"。在本文的上下文中的抗分泌因子(AF)蛋白也指如之前WO97/08202和WO 00/38535所定义的具有抗分泌性的蛋白。抗分泌因子还在如WO 05/030246中公开。术语抗分泌因子还意指如SE 900028-2和WO 00/38535所公开的富含抗分泌因子的蛋黄中的天然抗分泌因子，如下文进一步描述。

"医疗食物"在本文的上下文中是指食物、食物补充剂或用于特殊膳食用途的食物，其用抗分泌因子(AF)蛋白制备或可替选地具有诱导内源AF的合成和/或活化的能力。所述食物可为呈流体或固体形式(诸如液体或粉末)的任何适合的食物，或任何其它适当的食料。此类物质的实例可见于WO 0038535或WO 91/09536。

"雾化器"在本文的上下文中是指以雾的形式递送液体药物至呼吸道的医疗装置。

术语"气雾剂"在本文的上下文中是指微细固体或液体颗粒的气体悬浮液。

在本文的上下文中，使用术语"细胞抑制剂(cytostaticum)"，以及"细胞抑制药物"、"细胞抑制剂(cytostatica)"、"细胞抑制试剂"或"细胞抑制化合物"，术语可互换并涉及用于癌症疗法且通常向进行化疗的患者施用的药物(细胞抑制试剂是所谓的抗癌药)。细胞抑制试剂是抑制(check)病理细胞和正常细胞的生长的物质。此类物质因此可用于肿瘤的化疗治疗中，但也用于去除肿瘤后的术后和/或放射后治疗中。细胞抑制试剂可呈现液体、粉末或颗粒形式，还可选地深度冷冻。本领域技术人员将从过多的可商购获得的细胞抑制试剂中调整细胞抑制剂的选择和剂量。

在本文的上下文中，使用术语"细胞毒素"以及"细胞毒性药物"、"细胞毒性剂(cytotoxica)"、"细胞毒性试剂"或"细胞毒性化合物"，术语可互换并涉及可用于癌症疗法且通常向进行化疗的患者施用的药物(细胞毒性试剂是所谓的抗癌药)。细胞毒性试剂是对细胞有毒性并因而可抑制病理细胞和正常细胞的生长的物质。此类物质因此可用于肿瘤的化疗治疗中，但也用于去除肿瘤后的术后治疗或放射后疗法中。细胞毒性试剂可呈现液体、粉末或颗粒形式，还可选地深度冷冻。本领域技术人员将从过多的可商购获得的细胞毒性剂中调整细胞毒性剂的选择和剂量。

在本文的上下文中，术语"佐剂"可用于描述改变其它药剂作用的药理学试剂和/或免疫试剂。本申请中的佐剂增强或优化了接受者对施用的活性物质的使用，因此使所述物质的必需量最小化。

多形性胶质母细胞瘤肿瘤可在本文的上下文中为巨细胞胶质母细胞瘤或神经胶质肉瘤。

发明详述

本发明涉及抗分泌因子(AF)蛋白，具有等效的功能活性的其肽、其衍生物、其同系物和/或其片段，和/或其药学活性盐，在治疗胶质母细胞瘤(GBM肿瘤)和/或优化至胶质母细胞瘤肿瘤细胞的药物物质和/或制剂诸如抗癌药、放射治疗、依赖于免疫机制的治疗的递送和/或细胞摄取或者基因递送的用途。

本申请首次公开对治疗GBM肿瘤的有效方式和/或途径的长期探索。其令人惊讶地公开了抗分泌因子AF可用于胶质母细胞瘤的症状性、根治性和姑息性疗法中。特别地，它们可在胶质母细胞瘤的治疗中用作佐剂和/或用于优化药物和基因递送以及化疗、免疫治疗和放疗。

特别地，抗分泌因子(AF)蛋白和/或其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐，和/或富含所述AF蛋白和/或其同系物和/或其片段的食物和/或食物补充剂在本文中用于优化GBM肿瘤中的血液循环和/或氧张力，从而促进放射治疗以及免疫治疗和/或化疗的影响。

本发明因此涉及如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白，和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段，和/或其药学活性盐，其用于治疗胶质母细胞瘤(GBM肿瘤)。在一个实施方式中，其涉及富含所述抗分泌因子(AF)蛋白和/或其同系物和/或其片段的食物和/或食物补充剂用于治疗胶质母细胞瘤(GBM肿瘤)。

在另一方面，本发明涉及用于监测和/或验证和/或增强患有胶质母细胞瘤的患者中的胶质母细胞瘤(GBM肿瘤)的治疗控制的新型且可靠的诊断和/或预后工具的设计。如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白，和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段，和/或其药学活性盐在本文中用于优化药物物质和/或制剂至GBM肿瘤细胞的递送和/或细胞摄取。所述药物物质和/或制剂在本文的上下文中选自由抗癌药、抗肿瘤药、放射治疗、免疫物质和/或细胞和抗生素物质、靶向创伤后损伤的药物、靶向神经变性的药物及针对炎性疾患的药物组成的组。

本领域熟知的实施例选自但不限于包括诸如替莫唑胺和

(其为可植入的烷基化卡莫司汀晶片)的烷化剂的组。此外，涵盖了血管内皮生长因子抗体。

胶质母细胞瘤疗法的最佳长期结果至今已经通过使用替莫唑胺和放射的组合而实现。应该强调的是放射的功效被高的组织氧张力改善，其促进了自由基的产生。因此，本发明涉及如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白，和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段，和/或其药学活性盐，用于可替选地与至GBM肿瘤细胞的放射组合来优化替莫唑胺的递送和/或细胞摄取。

本发明同样涉及了制造包含如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐及替莫唑胺的药物制剂，其可选地与放射组合用于治疗胶质母细胞瘤。

化疗和放射的一个障碍是各个GBM肿瘤细胞被包衣包围，所述包衣最明显地由糖萼衬里细胞胞外表面组成。从而，疗法的功效通常被妨碍到一定程度，使得存在有限的短期和长期效果。胶质母细胞瘤肿瘤具有极为丰富和复杂的血管网络，但包围肿瘤细胞极大的减少了化疗剂以及例如氧至肿瘤细胞中的递送。

本发明涉及如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白，和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段，和/或其药学活性盐，用于克服化疗剂和氧到达它们的靶标(各个GBM肿瘤细胞)的障碍。

本发明同样涉及了包含抗分泌因子(AF)蛋白，具有等效的功能活性或其修饰不改变多肽功能的其肽、其衍生物、其同系物和/或其片段，和/或其药学活性盐的药物制剂的制造，用于克服化疗剂和氧到达它们的靶标(各个GBM肿瘤细胞)的障碍。

脑水肿是胶质母细胞瘤生长中的早期事件，并且随着时间的增加在一定程度上通常不限于肿瘤区域但发展到整个脑中。这意味着在坚硬的颅内的内含物不仅通过肿瘤生长和出血发生而扩展，而且还由于水肿形成而扩展。随着坚硬的颅抵抗扩展，颅内压升高，限制血液循环以及变形并扭曲脑组织。升高的颅内压将引起患者日益严重的神经学症状和精神病学症状。因此，胶质母细胞瘤治疗中的重要目标是减少脑水肿并从而降低颅内压，进而促进如血液循环、暂时改善化疗剂和如氧及从而自由基接近肿瘤细胞。另外的有益作用是通过减少脑水肿和降低颅内压改善患有胶质母细胞瘤的患者的健康状况。

抗分泌因子(AF)有效调控和/或使经扰动的细胞和病理细胞中的特定离子和/或流体通道的异常活性正常化，从而有效使细胞的尺寸和胞内压正常化，这继而还可导致使经扰动的组织中的孔隙压力正常化，并因此潜在地使胶质母细胞瘤治疗中所用的药物物质诸如药物的细胞摄取得以改善。

如实验章节所示，如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白的片段AF-16，其具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列，可被证明可降低普遍在具有实验性诱导的胶质母细胞瘤的动物的头部中升高的颅内压。这种极其有益的作用通过施用AF-16可重复地诱导。应该强调的是，AF-16不仅降低了具有肿瘤的半球的颅内压，而且还降低了尽管不含有任何肿瘤但水肿的对侧半球的颅内压。此外，施用AF-16h的关键作用(critical effect)有效地改善了肿瘤细胞核对标记物物质多柔比星的摄取。这两种有益作用也可被证明用物质AF-6，即具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白的片段获得。另外的实验表明AF-16既降低了具有实验性诱导的胶质母细胞瘤的小鼠中的高颅内压，也促进了肿瘤细胞核摄取多柔比星和多柔比星与肿瘤细胞核的结合。

本发明因此首次公开如SEQ ID NO:1(AF)所示的AF蛋白、和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段、和/或其药学活性盐在制造用于治疗胶质母细胞瘤(GBM肿瘤)、用于胶质母细胞瘤的症状性、根治性和/或姑息性治疗的任一者的药物组合物和/或医疗食物中的用途。

本发明涉及包含如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐的药物组合物，在制造用于优化治疗胶质母细胞瘤所用的第二或另外的药物物质和/或制剂的递送和/或细胞摄取的药物组合物中的用途。通常，所述第二或另外的药物物质和/或制剂包括抗癌药、放射治疗、抗微生物物质、抗生素物质和/或靶向创伤后损伤、神经变性和/或炎性疾患的药物。

在又一方面，本发明涉及用于治疗胶质母细胞瘤的包含与第二或另外的药物物质和/或制剂组合的如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐的药物组合物，其中所述第二或另外的药物物质和/或制剂选自抗癌药、放射治疗、抗生素物质和靶向创伤后损伤、神经变性或炎性疾患的药物，并因此涉及其在医学中的用途，特别是其在胶质母细胞瘤治疗中的用途。

此外，所述药物组合物当然可包含两种或更多种抗分泌因子(AF)蛋白、其片段、其衍生物或其组合，以及另外包含药学上可接受的赋形剂。

特别地，AF蛋白和/或其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐和/或富含所述AF蛋白和/或其同系物和/或其片段的食物和/或食物补充剂用于优化在胶质母细胞瘤(GBM肿瘤)治疗中，纳米颗粒形式的另外的药物物质和/或其制剂的递送和/或细胞摄取。

例如，所述第二或另外的药物物质和/或制剂可选自抗癌药、细胞抑制剂、遗传材料、放射治疗、抗微生物物质、抗生素物质、抗病毒物质、免疫活性化合物及靶向创伤后损伤、神经变性或炎性疾患的药物。

此外，所述药物组合物可包含两种或更多种抗分泌因子(AF)蛋白和/或其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐，以及药学上可接受的赋形剂。

在目前优选的实施方式中，如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐显示能够克服胶质母细胞瘤中的恶性细胞和/或病理细胞的细胞屏障，诸如保护性糖萼包衣，并因此可用作降低所需药物剂量的佐剂，可替选地用于将所述药物物质和/或制剂的剂量效应最大化。结果，所述上述如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐和/或包含它的药物组合物可用于将胶质母细胞瘤治疗中的所述药物物质和/或制剂的毒性或不需要的副作用最小化。

此外，如本文所述的富含抗分泌因子(AF)蛋白和/或其同系物和/或其片段的食物和/或食物补充剂优选地作为富含天然存在的抗分泌因子的蛋黄提供。

因此，本发明还涉及包含与抗癌药诸如替莫唑胺组合的富含如本文所述的抗分泌因子(AF)-蛋白质和/或其同系物和/或其片段的食物和/或食物补充剂(诸如富含天然存在的抗分泌因子的蛋黄)的药物组合物，以及其在医学中的一般用途和特别地其在胶质母细胞瘤(GBM肿瘤)的治疗中的用途。

在另一个同样优选的实施方式中，如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白，和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段，和/或其药学活性盐可由患者在摄入诱导抗分泌因子(AF)蛋白的摄取、形成和/或释放的食物和/或用于特殊膳食用途的食物之后自发地产生。

本发明涉及包含如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐的药物组合物，在制造用于优化治疗胶质母细胞瘤的第二或另外的药物物质和/或制剂的递送和/或细胞摄取的药物组合物中的用途。AF和第二或另外的药物物质和/或制剂可一起或交替相继地施用。它们可被共同配制或者以单独的制剂施用。

本发明目前优选的实施方式另外是包含根据本发明的抗分泌因子(AF)蛋白、其同系物、其衍生物、其肽和/或其片段的药物组合物在制造用于优化胶质母细胞瘤治疗中的放射治疗的药物组合物中的用途。

此外，基于细胞IFP降低的瞬时和可逆性质，临床医生可容易地预想到其中根据本分明的抗分泌因子(AF)蛋白、其同系物、其衍生物、其肽和/或其片段以最佳的定时间隔施用的施用途径，所述最佳的定时间隔被调整成使得在胶质母细胞瘤患者的治疗方案期间靶细胞中的IFP在施用第二或另外的药物物质和/或制剂的时间恰好降低。

因此，另一个同样优选的实施方式涉及用于第二或另外的药物物质和/或制剂的优化的递送和/或细胞摄取的方法或施用剂量方案，其中所述第二或另外的药物物质和/或制剂包括适于治疗胶质母细胞瘤的抗癌药、放射治疗、抗生素物质和/或靶向创伤后损伤、神经变性或炎性疾患的药物。

根据本发明的抗分泌因子(AF)蛋白、其同系物、其衍生物、其肽和/或其片段及第二或另外的药物物质和/或制剂可一起或交替相继地施用。它们可被共同配制或者以单独的制剂施用。

根据本发明的药物组合物可被配制用于眼内、鼻内、经口、局部、皮下和/或全身施用，并可意在作为喷雾剂、气雾剂和/或通过吸入器或雾化器施用。根据本发明的药物组合物可在一种情况下通过施加局部施用、原位局部施用、经口施用、鼻内施用、皮下施用和/或经由血管或经由呼吸道全身施用。

当药物组合物和/或医疗食物被配制用于全身施用至血液时，剂量方案选择为剂量：如每次施加且每kg体重和每天0.1μg至10mg的AF-16(SEQ ID NO:3)、优选每次施加且每kg体重和每天1-1000μg的AF-16(SEQ ID NO:3)，并且所述施用以单剂量或作为多次每日施加进行。

因此，本发明还涉及包含与抗癌药诸如替莫唑胺组合的如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段(诸如SEQ ID NO:1(AF)、SEQ ID NO:2(AF-6)、SEQ ID NO:3(AF-16))和/或其药学活性盐的药物组合物，以及其在医学中的一般用途，并且特别地，其在胶质母细胞瘤(GBM肿瘤)治疗中的用途。

在另一方面，本发明涉及包含根据本发明的抗分泌因子(AF)蛋白、其同系物、其衍生物、其肽和/或其片段或其药学活性盐的药物组合物，在制造用于优化治疗和/或预防胶质母细胞瘤的第二或另外的药物物质和/或制剂的递送和/或细胞摄取的药物组合物中的用途。

此外，设想了适于治疗的预期目的以及患者的年龄、性别、条件等的多种施用剂量和途径。

使用的有效剂量方案的极为宽的范围表明副作用和意想不到的并发症的风险是最小的。因此本发明将使得能够治疗细胞和组织上的过量负荷以及用与疾病和/或不适的个体响应和严重性相符合的宽范围的剂量治疗患者。

在一个目前优选的实施方式中的本发明还涉及用于改进的药物设计的方法，其特征在于测试经历胶质母细胞瘤治疗的细胞或组织对于本申请提及的物质或药物制剂的响应和评估根据本发明的抗分泌因子(AF)蛋白、其同系物、其衍生物、其肽和/或其片段或其组合对所述物质或制剂的细胞摄取的影响(如通过测量磷酸化FAK的量)。

任一种上述方法通常可以可选地在细胞系统或测试生物体中进行。上述方法也同样适用于体内、原位和计算机(in silico)系统。

标准方法：

-用于改善的药物设计，

-用于筛选和/或评估潜在的AF抑制性物质和/或增强物质，

-用于评估新型或已知的抗分泌因子(AF)蛋白、具有等效的功能活性的其肽、其衍生物、其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐的功效和/或验证它们的功能活性，

是本领域中所熟知的。

抗分泌因子

抗分泌因子是一类体内天然存在的蛋白。人抗分泌因子AF蛋白是当从脑垂体分离时包含382-288个氨基酸的41kDa蛋白。至于对根据本发明的胶质母细胞瘤治疗的有益作用的活性位点可定位于接近蛋白的N末端的区域中的蛋白，特别定位于SEQ ID NO：1的氨基酸1-163，更具体地定位于抗分泌因子(AF)蛋白序列上的氨基酸位置35-50。AF的生物效应由任何包含所述共有序列的至少6个氨基酸(SEQ ID NO:2(AF-6))或其修饰不改变多肽和/或肽的功能的肽或多肽施加。

本发明人已经说明抗分泌因子在一定程度上与蛋白质S5a和Rpn10同源，所述蛋白质S5a和Rpn10构成所有细胞、更具体在19S/PA 700帽中主要成分26S蛋白酶体的亚基。在本发明中，抗分泌因子(AF)蛋白被定义为一类具有相同功能性质的同系物蛋白。抗分泌因子还与安吉西丁高度相似，安吉西丁是已知结合至血小板反应蛋白-1并与癌症进展相关的另一种蛋白同工型。

根据本发明的抗分泌因子(AF)蛋白和/或肽的同系物、衍生物和片段都具有类似的生物活性。在本文的上下文中，同系物、衍生物和片段包含至少6个对应于天然存在的抗分泌因子(AF)蛋白的那些氨基酸的氨基酸(如SEQ ID NO:2所示)，其可通过改变一个或多个氨基酸进一步地被修饰以优化抗分泌因子的生物活性而不改变多肽和/或肽的基本功能。

在本文的上下文中，所述衍生物意为直接或通过修饰或部分取代来源于另一种物质的，与如本文所定义的抗分泌因子具有等效活性和/或功能等效活性的蛋白，其中一种或多种氨基酸已被另一种氨基酸所取代，所述另一种氨基酸可被修饰或为非天然氨基酸。例如，根据本发明的抗分泌因子衍生物可包含N末端保护基团和/或C末端保护基团。N末端保护基团的一个实例包括乙酰基。C末端保护基团的一个实例包括酰胺。

此外，任何与根据本发明的抗分泌因子(AF)蛋白、肽、同系物、衍生物和/或片段的氨基酸序列至少70％同源性，诸如至少72％、75％、77％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列也被认为在本发明的范围内。

所述具有与参考氨基酸序列至少例如95％同源性的氨基酸序列的蛋白、其同系物、其衍生物、其肽和/或其片段意指如所述肽的氨基酸序列与参考序列同源，除了所述氨基酸序列可包括参考氨基酸序列的每100个氨基酸多达5个点突变之外。换言之，为了获得具有与参考氨基酸序列至少95％同源性的氨基酸序列的多肽，参考序列中多达5％的氨基酸可缺失或用另一种氨基酸取代，或者参考序列中多达5％总氨基酸的多个氨基酸可插入到参考序列中。参考序列的这些突变可在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置处发生，或可在这些末端位置之间的任何单独散布在参考序列的氨基酸之间或者在参考序列内的一个或多个连续组中的位置处发生。

在本发明中，局部算法程序最适合测定同源性(identity)。局部算法程序(诸如Smith Waterman)比较了一条序列中的亚序列与第二序列中的亚序列，并且发现亚序列的组合以及这些亚序列的比对，这产生了最高整体相似性得分。如果允许，则对内部空位罚分。局部算法在比较两个具有共有的单个结构域或仅仅具有结合位点的多结构域蛋白方面行得通。

用公开可用的计算机程序整理测定同源性和相似性的方法。优选的测定两条序列之间的同源性和相似性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J等(1994))BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等(1990))。BLASTX程序是从NCBI和其它来源公开可用的(BLAST手册，Altschul,S.F.等，Altschul，S.F.等(1990))。每个序列分析程序具有默认的得分矩阵和默认的空位罚分。通常，分子生物学家将预期使用由使用的软件程序确立的默认设置。

如本文所定义的抗分泌因子(AF)蛋白或具有等效活性的其肽或其同系物、其衍生物和/或其片段可包含6个氨基酸或更多个氨基酸，诸如6-16个氨基酸，诸如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸或更多个氨基酸。在其它优选的实施方式中，抗分泌因子由42、43、45、46、51、80、128、129或163个氨基酸组成。在优选的实施方式中，根据本发明的抗分泌因子(AF)蛋白、其同系物、其衍生物、其肽和/或其片段由6、7、8或16个氨基酸组成。

在另一个优选的实施方式中，根据本发明的抗分泌因子(AF)蛋白、其同系物、其衍生物、其肽和/或其片段由根据下式的氨基酸序列组成：X1-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5，其中X1是1，SEQ ID NO 6的氨基酸或者不存在，X2是H、R或K，X3是S或L，X4是T或A，X5是SEQ ID NO6的氨基酸43-46、43-51、43-80或43-163或不存在。

根据本发明的抗分泌因子(AF)蛋白、其同系物、其衍生物、其肽和/或其片段可在体内或体外产生，如重组地、合成地和/或化学合成，和/或从抗分泌因子的天然存在的来源诸如从猪脑垂体或鸟蛋分离。在产生后，根据本发明的抗分泌因子(AF)蛋白、其同系物、其衍生物、其肽和/或其片段可例如通过化学裂解或酶促裂解至较小的抗分泌性活性片段或者通过氨基酸的修饰进一步处理。当前不可能通过纯化获得纯形式的抗分泌因子(AF)-蛋白质。然而如WO97/08202和WO 05/030246所公开的那样，可能重组地或合成地产生生物活性抗分泌因子蛋白。WO 97/08202还公开了7-80个氨基酸的该蛋白的生物活性片段的产生。

根据本发明的抗分泌因子(AF)蛋白、其同系物、其衍生物、其肽和/或其片段可另外包含N末端保护基团和/或C末端保护基团。N末端保护基团的一个实例包括乙酰基。C末端保护基团的一个实例包括酰胺。

在本发明的优选实施方式中，根据本发明的抗分泌因子(AF)蛋白、其同系物、其衍生物、其肽和/或其片段选自SEQ ID NO 1-6，即VCHSKTRSNPENNVGL(SEQ ID NO 3，在该上下文中也称为AF-16)、IVCHSKTR(SEQ ID NO 5)、VCHSKTR(SEQ ID NO 4)、CHSKTR(SEQ ID NO2)、HSKTR(SEQ ID NO 6)或根据SEQ ID NO 1的抗分泌因子(AF)蛋白的氨基酸序列(使用常见的一个字母缩写氨基酸)。它们之前已被公开在如WO05/030246中。如所列出的随附序列中所指出，上文指出的序列中的一些氨基酸可被其它氨基酸替代。在该段落的下文中，特定氨基酸序列中的特定氨基酸的位置从左计算，表示大部分N-末端氨基酸是在此特定序列中的位置1中。如下文所指出的任何氨基酸取代可独立于此序列中的任何其它氨基酸取代进行。在SEQ ID NO 3中，位置2中的C可被S所替代，位置3中的H可被R或K所替代，位置4中的S可被L所替代，和/或位置6中的T可被A所替代。在SEQ ID NO 5中，位置3中的C可被S所替代，位置4中的H可被R或K所替代，位置5中的S可被L所替代，和/或位置7中的T可被A所替代。在SEQ ID NO 4中，位置2中的C可被S所替代，位置3中的H可被R或K所替代，位置4中的S可被L所替代，和/或位置6中的T可被A所替代。在SEQ ID NO 2中，位置1中的C可被S所替代，位置2中的H可被R或K所替代，位置3中的S可被L所替代，和/或位置5中的T可被A所替代。在SEQ IDNO 6中，位置1中的H可被R或K所替代，位置2中的S可被L所替代，和/或位置4中的T可被A所替代。

本发明还意在根据SEQ ID NO 1-6的两条或更多条任何片段的组合。

根据本发明待被使用的和/或由本发明所包括的特异性抗分泌因子(AF)蛋白或肽选自由包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的抗分泌因子(AF)蛋白、包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的抗分泌因子(AF)蛋白、包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的抗分泌因子(AF)蛋白、包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的抗分泌因子(AF)蛋白和包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的抗分泌因子(AF)蛋白组成的组。

此外，在另一个实施方式中，本发明涉及抗分泌因子(AF)蛋白的用途，其是具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白或者包含SEQ ID NO:1的氨基酸37-42的其同系物、其衍生物和/或其片段。

在另一个实施方式中，本发明涉及如本文所公开的药物组合物的用途，所述药物组合物包含选自如SEQ ID NO:1-6所公开的蛋白，和SEQ ID NO:1所公开的蛋白或包含SEQID NO:1的氨基酸37-42的其同系物、其衍生物和/或其片段或如本文所述的通式公开的序列中的两种或更多种抗分泌因子(AF)蛋白。所述序列全部同样优选用于本发明中。

WO 00/038535公开了本身富含抗分泌因子(AF)蛋白的食品，其是本文的上下文所用的适合的食物、食料和/或食物补充剂的实例。

药物组合物

在本发明的一个实施方式中，根据本发明的药物组合物另外包含药学上可接受的赋形剂。根据本发明的药学上可接受的赋形剂及其使用的最佳浓度的选择可由技术人员通过实验容易地确定。根据本发明的使用的药学上可接受的赋形剂包括溶剂、缓冲剂、防腐剂、螯合剂、抗氧化剂和稳定剂、乳化剂、助悬剂和/或稀释剂。本发明的药物组合物可根据常规的药物实践来配制，如根据"Remington:The science and practice of pharmacy"，第21版，ISBN 0-7817-4673-6或"Encyclopedia of pharmaceutical technology"，第2版，Swarbrick J.编辑，ISBN:0-8247-2152-7。药学上可接受的赋形剂是基本上对待施用所述组合物的个体无害的物质。此类赋形剂通常满足国家卫生当局给定的需求。官方药典诸如英国药典(British Pharmacopoeia)、美国药典(the United States of AmericaPharmacopoeia)及欧洲药典(The European Pharmacopoeia)设定了药学上可接受的赋形剂的标准。

以下是根据本发明的药物组合物中任意使用的相关化合物的评论。所述评论基于特定施用途径。然而，应理解在可以不同的剂型或组成使用药学上可接受的赋形剂的那些情况下，特定药学上可接受的赋形剂的施加不限于特定剂型或具有赋形剂的特定功能。应当强调的是本发明不限于以下提到的组合物的使用。

胃肠外组合物：

对于全身施加来说，根据本发明的组合物可含有常规的无毒性的药学上可接受的载体和赋形剂，包括微球和脂质体。

根据本发明的使用的组合物可包括所有种类的固体、半固体和流体组合物。

药学上可接受的赋形剂可包括溶剂、缓冲剂、防腐剂、螯合剂、抗氧化剂和稳定剂、乳化剂、助悬剂和/或稀释剂。不同试剂的实例在以下给出。

各种试剂的实例：

溶剂的实例包括但不限于水、醇、血液、血浆、脊髓液、腹水和淋巴液。

缓冲剂的实例包括但不限于柠檬酸、乙酸、酒石酸、乳酸、氢磷酸(hydrogenphosphoric acid)、碳酸氢盐、磷酸盐、二乙酰胺等。

螯合剂的实例包括但不限于EDTA和柠檬酸。

抗氧化剂的实例包括但不限于叔丁基羟基茴香醚(BHA)、抗坏血酸及其衍生物、生育酚及其衍生物、半胱氨酸、及其混合物。

稀释剂和崩解剂的实例包括但不限于乳糖、蔗糖、emdex、磷酸钙、碳酸钙、硫酸钙、甘露醇、淀粉和微晶纤维素。

粘合剂的实例包括但不限于蔗糖、山梨糖醇、阿拉伯树胶、藻酸钠、白明胶、壳聚糖、淀粉、纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮和聚乙二醇。

根据本发明的药物组合物可在一种情况下局部施用或者经由静脉内远端输注或者经由肌内或皮下注射施用给患者，或者经由经颊、经肺、经鼻、经皮或经口途径施用。此外，还可能通过手术插入至患者脑室中的分流器施用药物组合物。

在一个实施方式中，根据本发明使用的药物组合物被配制用于眼内、局部、鼻内、经口、皮下和/或全身施用。所选择的施用途径将根据待治疗的患者的情况和患者的年龄和性别等而变化。

在优选的实施方式中，本发明的组合物通过施加作为混悬液或甚至更优选的作为用喷雾剂、气雾剂、吸入剂或雾化器经鼻和/或至呼吸道的吸入所用的粉末来施用。

包含抗分泌因子的粉末的施用就稳定性和剂量而言具有额外的优势。根据本发明的药物组合物还可局部施加、经眼、经鼻、经口、皮下和/或经由血管全身施用。在优选的实施方式中，药物组合物被配制用于静脉内、肌内、局部、经口或经鼻施用。通常，当用于局部施加至眼睛时，本发明的组合物的施加的浓度为以每日单剂量或每日重复若干次(多剂量)的形式每次施加1μg至1mg，优选50μg-500μg，但不限于此。

全身施用至血液，剂量在每次施加和每kg体重0.1μg至10mg，诸如每次施加和每kg体重0.1μg至1mg，优选1-500、诸如1-1000μg/体重kg的范围内。当根据本发明使用富含抗分泌因子的蛋黄时，该制剂优选经口施用。

在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物另外包含药学上可接受的赋形剂。此类赋形剂可为经选择适于特定用途的任何优选的赋形剂。赋形剂的实例在本文中公开。

治疗胶质母细胞瘤的方法

在一个实施方式中，本发明涉及治疗胶质母细胞瘤的方法，所述方法的特征在于向有需要的患者施用如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐。所述方法可在本发明的一个实施方式中用于促进另外药物物质的优化的药物摄取和递送。

在本发明优选的实施方式中，所述治疗患有胶质母细胞瘤的哺乳动物的方法可包括向所述患者喂食食物、食料和/或食物补充剂、从而诱导AF的内源性产生以促进另外的药物物质的优化的药物摄取和递送。

在本文的上下文中，所述药物物质和/或制剂选自由抗癌药、抗肿瘤药、放射治疗、免疫物质和/或细胞和抗生素物质、靶向创伤后损伤的药物、靶向神经变性的药物及针对炎性疾患的药物组成的组。所述另外的药物物质在胶质母细胞瘤(GBM肿瘤)的治疗中可呈纳米颗粒和/或其制剂的形式。

本领域熟知的实例选自但不限于包括烷化剂诸如替莫唑胺(Maity等，2008；Kaye和Laws，2012)和

(其为可植入的烷基化卡莫司汀晶片)的组。此外，将抗体掺入到血管内皮生长因子中。

在另一个同样优选的实施方式中，所述的治疗患有胶质母细胞瘤的哺乳动物的方法可包括向所述患者喂食富含抗分泌因子的蛋黄并从而优化另外的药物物质的药物摄取和递送。

本发明涉及治疗胶质母细胞瘤(GBM肿瘤)和/或用于优化至胶质母细胞瘤肿瘤细胞的药物物质和/或制剂诸如抗癌药、放射治疗、依赖于免疫机制的治疗的递送和/或细胞摄取或者基因递送中的用途，其特征在于向有需要的患者施用如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白，和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐。

本申请首次公开对治疗GBM肿瘤的有效手段和/或方法的长期探索。其令人惊讶地公开了用于胶质母细胞瘤的症状性、根治性和姑息性疗法，特征在于向有需要的患者施用如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐。特别地，它们可在胶质母细胞瘤的治疗中用于优化药物和基因递送以及化疗、免疫治疗和放疗。

特别地，公开了用于优化GBM肿瘤中的血液循环和/或氧张力的方法，从而促进了放射治疗以及免疫治疗的效果，并且公开了任选与GBM肿瘤细胞放射组合的用于促进经优化替莫唑胺的药物摄取和递送的方法。

公开了用于降低所需的药物剂量、可替选的最大化所述药物物质和/或制剂的剂量效应的方法，所述方法的特征在于向有需要的患者施用如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐，其用于将胶质母细胞瘤治疗中的所述药物物质和/或制剂的毒性或不需要的副作用最小化。

如本文所述的富含抗分泌因子(AF)-蛋白质和/或其同系物和/或其片段的食物和/或食物补充剂被优选作为富含天然存在的抗分泌因子的蛋黄提供。

AF和第二或另外的药物物质和/或制剂可一起或或交替相继地施用。它们可被共同配制或者以单独的制剂施用。

设想了优化在胶质母细胞瘤治疗中的放射治疗的方法，所述方法特征在于向有需要的患者施用如SEQ ID NO:1(AF)所示的抗分泌因子(AF)蛋白，和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2(AF-6)所示的氨基酸序列的其同系物和/或其片段和/或其药学活性盐。

实验章节

实施例1

AF-16(SEQ ID NO:3)

该实验的目的是研究肽AF-16的施用是否降低具有胶质母细胞瘤的脑中显著的高颅内压。如果这样，则肿瘤诱导的脑水肿和高颅内压的有害作用可被消减，其是一种高度有益且需要的效果。

成年雄性Fisher 344大鼠购自Charles River，德国。实验时的体重为230-250g。所述动物可随意饮水和食用颗粒饲料。实验许可由区域动物实验伦理委员会(RegionalAnimal Experiments Ethical Committee)授予并遵循国家和EU规则。

将建立的神经胶质瘤细胞系RG2的培养细胞，克隆N32，立体定向沉积在成年Fisher 344大鼠的脑右侧纹状体中(A.T.Aas,A Brun,C.Blennow,S.

和L.G.Salford(1995).The RG2glioma model.J.Neuro-Oncology 23,175-183；R.F.Barth和B.Kauer(299).Rat brain tumor models in experimental neuro-oncology:the C6,9L,T9,RG2,F98,BT4C,RT-2and CNS-1gliomas.(J Neuro-Oncology 94,299-312)。在18-22天后，满足胶质母细胞瘤既定标准的肿瘤可证明在右半球中，侵入相邻脑实质(图1和图2)。如在图3中所揭示，公开了广泛血管化的肿瘤中的细胞被糖萼划界，即多糖和蛋白聚糖的薄层。扩展的肿瘤扩大了脑组织，因为骨颅不允许任何体积扩大从而导致颅内压增加。图4显示压力传感器的植入(Samba 3200；Samba Sensors AB，V.

瑞典)，每个半球一个。颅内压被测量为在25-50mm Hg的范围内(图4)，这意味着与正常的5.3±2.1mm Hg相比显著升高(H.-A.Hansson,M.Al-Olama,E.Jennische,K.Gatzinsky和S.Lange(2012)。Thepeptide AF-16and the AF protein counteract intracranial hypertension.ActaNeurochir.增刊114,377-382)。最终，颅内压超过50-60mm Hg，从而导致脑疝形成、位错和受损的血液循环及死亡(图5)。

单次经鼻滴注10μl肽AF-16(1-4mg/kg体重)于水中的溶液在15-30分钟内导致高颅内压降低至可接受的水平(约20mm Hg或更低)(图6)。颅内压在肿瘤感染的右侧和对侧左侧中升高，并且压力以相同的程度在任一脑半球中降低。同时，任何可证明的神经学损伤消退。

我们断定肽AF-16在15-30分钟内消减具有实验性诱导的胶质母细胞瘤肿瘤的成年大鼠中另外可证明的颅内压升高。有益作用持续至少4-6h。

实施例2

AF-6(SEQ ID NO:2)

该实验的目的是研究肽AF-16的施用是否降低具有胶质母细胞瘤的脑中显著的高颅内压。如果这样，则肿瘤诱导的脑水肿和高颅内压的有害作用可被消减，其是一种高度有益且需要的效果。

成年雄性Fisher 344大鼠购自Charles River，德国。实验时的体重为230-250g。所述动物可随意饮水和食用颗粒饲料。实验许可由区域动物实验伦理委员会授予并遵循国家和EU规则。

如实施例1所述，将建立的神经胶质瘤细胞系RG2的培养细胞，克隆N32，立体定向沉积在成年Fisher 344大鼠的脑右侧纹状体中。在18-22天后，满足胶质母细胞瘤既定标准的肿瘤可证明在右半球中，侵入相邻脑实质。

将单剂量的肽AF-6(1-2mg/kg体重，溶解于水中)在植入后第21天，滴注在具有RG2-N32来源的实验性胶质母细胞瘤肿瘤的Fisher大鼠的鼻中。约15分钟后，颅内压开始从25-27mm Hg降低至17.7mm Hg(图7)。

我们断定肽AF-6使由植入的胶质母细胞瘤肿瘤引起的升高的颅内压降低至可接受的水平，约20mm Hg或更低。没有副作用可被公开。

实施例3

AF-6(SEQ ID NO:2)

该实验的目的是研究肽AF-16的施用是否降低具有胶质母细胞瘤的小鼠脑中显著的高颅内压。如果这样，则肿瘤诱导的脑水肿和高颅内压的有害作用可被消减，其是一种高度有益且需要的效果。

成年C57/BI/6小鼠购自B&K,Sollentuna,，瑞典。体重为23g并且所述动物可随意饮水和食用颗粒饲料。实验许可由区域动物实验伦理委员会授予并遵循国家和EU规则。

GL261小鼠神经胶质瘤细胞系是C57BI/6来源的，并且根据已制定的方案在Rausing实验室，BMC,Lund University中培养(K.Enell Smith,S.Fritzell,W.Badn,S.

S.Janelidze,E.Visse,A.Darabi和P.

(2008).Cure of establishedGL261gliomas after combined immunotherapy with GM-CSF and IFNγis mediated byboth CD8+and CD4+T-cells.Int.J.Cancer 124,630-637)。

C57/BI/6小鼠的于5μl组织培养基中的每5.000GL261神经胶质瘤细胞立体定向沉积在右脑半球中的深脑结构中。扩展的肿瘤形成并在22天后具有3-5mm的直径。所述动物当被选择用于实验用途时，没有显示出显著的疾病或运动障碍的体征。

选择六AA肽AF-6(SEQ ID N0:2)(由KJ Ross-Petersen ApS,Copenhagen通过固相合成制造，纯度>95％且TFA作为平衡离子)以研究其减小在肿瘤发展的这一阶段不可避免形成增加的颅内压(ICP)的能力。

将在右脑半球中具有GL261肿瘤的小鼠用异氟醚麻醉并置于立体定向固定架中。将颅盖上的皮肤切开并移除软组织。在右顶骨和左顶骨中钻两个孔，每一个孔直径为1mm。将微型光纤压力传感器插入通过脑组织内头盖骨中的每个孔中，其连接至Samba 3200压力测量设备(Samba Samba Sensors AB，V.Frolunda，瑞典)和计算机。将传感器在每次测量阶段之前和之后校准。

向经麻醉的小鼠的每个鼻孔中滴注5μl溶解于蒸馏水中的6氨基酸肽(AF-6)，同时使所述动物背部向下。剂量是5mg/kg体重。此后开始持续记录每一个半球中的压力。右肿瘤半球中的初始组织液压(IFP)为23mm Hg，并且左半球中的ICP为19mm Hg，这与正常对照小鼠中的ICP(约6mm Hg)相反。IFP和ICP两者均在约15分钟之后开始减少。在经鼻滴注AF-6后45分钟，右肿瘤半球中的IFP为7mm Hg而左半脑中的IFP为4-5mm Hg。未注意到副作用。

结论是，经鼻滴注肽AF-6不仅降低了具有肿瘤的半球中而且还降低了对侧半球中的单侧实验脑肿瘤处形成的升高的颅内压。这意味着AF-6可有效消减具有扩展的肿瘤的脑中形成的升高的复杂压力模式。

实施例4

AF-16(SEQ ID NO:3)

该实验的目的是研究用AF-16进行的治疗是否增加标记物渗透通过肿瘤细胞膜和随后进入并分布于其核中。多柔比星被选作示踪剂，原因是其是分子量为543.52g/mol的确定的细胞毒性药物，即被认为是相当低分子量的物质。此外，多柔比星的颜色为红色并当暴露于光时发射红色荧光。多柔比星强力嵌入到细胞核中的DNA中。这意味着如果在细胞核中观察到红色荧光，则标记物已到达其靶标(肿瘤细胞)。已知如在动物中，人中的胶质母细胞瘤细胞防止化疗物质进入到肿瘤细胞中，并因此未获得有益作用。药物最重要的屏障主要是在肿瘤细胞的表面。

成年雄性Fisher 344大鼠购自Charles River，德国。实验时的体重为230-250g。所述动物可随意饮水和食用颗粒饲料。实验许可由区域动物实验伦理委员会授予并遵循国家和EU规则。

如实施例1所述，将建立的神经胶质瘤细胞系RG2的培养的细胞，克隆N32，定向沉积在成年Fisher 344大鼠的脑右侧纹状体中。在20天后，满足胶质母细胞瘤的既定标准的肿瘤存在于任一只大鼠的右脑半球。

将溶解于水中并以10μl体积单剂量施用的AF-16，1mg/kg体重滴注在麻醉的Fisher大鼠的鼻孔中。一小时后，向每只动物以10mg/kg体重的剂量静脉内注射示踪剂多柔比星(Sigma)，并将其在30分钟后最终处死。利用冷冻切片机制备脑的切片，并借助于荧光显微镜检查。

在注射示踪剂多柔比星之前，具有胶质母细胞瘤并通过经鼻施用媒介物、水处理的大鼠脑切片的荧光显微术显示仅少数分散的红色核(图8)。这意味着极少的多柔比星分子进入了肿瘤细胞。

相反，在施用多柔比星之前用AF-16预处理具有胶质母细胞瘤的大鼠导致肿瘤细胞核的强烈红色染色，并且另外导致大比例的这些细胞被标记(图9)。

结论是，施用AF肽显著改善了细胞毒性药物对标记物的摄取，促进其在细胞中分布和所述化合物嵌入DNA或所述化合物结合DNA。因此，AF肽改善了化疗剂接近其靶标(肿瘤细胞)。

参考文献

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3.K.Enell Smith,S.Fritzell,W.Badn,S.

S.Janelidze,E.Visse,A.Darabi和P.

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15.WO 07/126363

16.WO 07/126365

17.WO 2010/093324

Claims (25)

1.一种如SEQ ID NO:1所示的抗分泌因子蛋白和/或对于治疗胶质母细胞瘤具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的其片段和/或其药学活性盐在制备用于治疗胶质母细胞瘤的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述抗分泌因子蛋白的片段是如SEQ ID NO:3所示的AF-16或如SEQ ID NO:2所示的AF-6。

3.根据权利要求1所述的用途，其中，使用的抗分泌因子蛋白和/或其片段和/或其药学活性盐以富含所述抗分泌因子蛋白和/或其片段的食物和/或食物补充剂提供。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述治疗是胶质母细胞瘤的根治性疗法、症状性疗法和/或姑息性疗法。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其中，使用的抗分泌因子蛋白和/或其片段和/或其药学活性盐用于优化在胶质母细胞瘤治疗中另外的药物物质和/或制剂的递送和/或细胞摄取和/或基因递送。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述另外的药物物质和/或制剂选自抗癌药、细胞抑制剂、遗传材料、放射治疗剂、抗微生物物质、免疫活性化合物及靶向创伤后损伤、神经变性或炎性疾患的药物。

7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述抗微生物物质为抗生素物质或抗病毒物质。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其中，使用的抗分泌因子蛋白和/或其片段和/或其药学活性盐用于优化多形性胶质母细胞瘤GBM肿瘤中的血液循环和/或氧张力。

9.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其中，使用的抗分泌因子蛋白和/或其片段和/或其药学活性盐被配制为包含两种或更多种抗分泌因子蛋白和/或其片段和/或其药学活性盐的药物组合物。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述药物组合物另外包含药学上可接受的赋形剂。

11.根据权利要求9所述的用途，其中所述药物组合物被配制用于眼内、鼻内、经口、局部、皮下和/或全身施用。

12.根据权利要求9所述的用途，其中所述药物组合物被配制用于作为喷雾剂、气雾剂、吸入剂和/或通过雾化器施用。

13.根据权利要求9所述的用途，其中所述药物组合物被配制用于以每天每kg体重每次施加0.1μg至10mg的剂量全身施用至血液。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述药物组合物被配制用于以每天每kg体重每次施加1μg至1000μg的剂量全身施用至血液。

15.根据权利要求9所述的用途，其中，使用的抗分泌因子蛋白和/或其片段和/或其药学活性盐的施用作为单剂量或作为每日多次施加进行。

16.根据权利要求3所述的用途，其中富含所述抗分泌因子蛋白和/或其片段的食物和/或食物补充剂作为富含抗分泌因子的蛋黄提供。

17.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗分泌因子蛋白和/或其片段和/或其药学活性盐由患者在摄入诱导抗分泌因子蛋白的摄取、形成和/或释放的食物之后自发产生。

18.一种药物组合物，包含与抗胶质母细胞瘤药物组合的如SEQ ID NO:1所示的抗分泌因子蛋白和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的其片段和/或其药学活性盐。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述抗分泌因子蛋白的片段是如SEQ IDNO:3所示的AF-16或如SEQ ID NO:2所示的AF-6。

20.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述抗胶质母细胞瘤药物是替莫唑胺。

21.一种药物组合物，包含与抗胶质母细胞瘤药物组合的富含如SEQ ID NO:1所示的抗分泌因子蛋白和/或具有等效活性并包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的其片段和/或其药学活性盐的食物和/或食物补充剂。

22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述食物和/或食物补充剂是富含天然存在的抗分泌因子的蛋黄。

23.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述抗胶质母细胞瘤药物是替莫唑胺。

24.根据权利要求18至23中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物用于医学。

25.根据权利要求18至23中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗胶质母细胞瘤。

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