WO2017117701A1 - 预防听力退化的活性物质、含其的组合物、及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种预防听力退化的活性物质、其制备方法、含其的医药组合物、及该医药组合物的制备方法。该活性物质的制备方法是通过平板培养、烧瓶培养、发酵槽培养的方式制备，而得到粉末形态的猴头菇菌丝体活性物质。该猴头菇菌丝体粉末经动物实验证实具有预防听力退化的功效。

Description

预防听力退化的活性物质、含其的组合物、及其制备方法 技术领域
本发明关于一种预防听力退化的活性物质、其制备方法、含其的医药组合物、及该医药组合物的制备方法，尤指一种包含猴头菇菌丝体活性物质的医药组合物及其制备方法。
背景技术
老年性失聪
随着人口的老化，各种退化性疾病的发生比率亦随之攀升。常见的退化性疾病有骨骼及感官机能的退化，其中听觉功能退化为老年人最常见的感觉退化性疾病之一。
老年性失聪又称为老化相关的听力损失(age related hearing loss,ARHL)，是指随着患者的年龄增长，其两侧耳朵的听力退化现象也逐渐恶化。大致上又分为神经性听力受损与感觉性听力受损，其中神经性听力受损的起因为听神经退化，感觉性听力受损则是由耳蜗退化所造成，但在临床上两者不易区分，统称为感觉神经性听力受损。该听力受损的主要致病原因被认为是老化、氧化伤害、粒腺体损害、或环境压力所造成。此种听力受损通常好发于50岁后的中老年者，最早的症状为高频率的听觉丧失，意即相较于语言中的元音，对于子音较难听取(语言中高频率的部分)。若在噪音的环境下，上述症状尤其明显，患者的中枢神经系统处理听觉信息的速度会减慢，使得该患者需要花费更长的时间以解读其接收到的听觉信息。在临床上，该疾病的病理特征为听力阀值(threshold shifts)增加及言语理解下降，这些症状使得患者的声音接收与语言识别的能力受到影响，造成患者在沟通、社会功能及情绪上有明显的障碍产生，严重会影响到长者生活质量。
根据老年性失聪的病理位置，Schuknecht(1993)于老年性听力退化者耳蜗病理研究报告中，将老年性失聪分为四种型态：
1.感觉性老年失聪(sensory presbycusis)：耳蜗(corti)中的感觉细胞、支持细胞等细胞数量逐渐变少或是功能退化。
2.神经性老年失聪(neural presbycusis)：螺旋神经节细胞数目减少或神经元退化导致的，而影响到听觉信息传递。
3.代谢性老年失聪(metabolic/strial presbycusis)：血管纹的退化及萎缩，导致血流量不足无法运送养分。
4.机械性老年失聪(mechanical/cochlear presbycusis)：基底膜的退化造成，包含宽度变厚、弹性变少或因钙化而变硬皆属之。
猴头菇
根据“中国药用真菌”的记载：“猴头菇味甘、性平、能利五脏、助消化、滋补、对消化不良、神经衰退与十二指肠溃疡及胃溃疡有良好的功效。”，由此可知在古代医学上已知猴头菇具有预防疾病的效果，为药膳两用菌。猴头菇学名Hericium erinaceus，其分类于真菌界(Fungi)、真菌门(Eumycota)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、担子菌纲(Basidiomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、齿菌科(Hydnaceae)、猴头菌亚科(Hericioideae)中的猴头菌属(Hericium)。猴头菇在外型上，其子实体外形由长条粗糙的突起组成，而成软圆形状，新鲜时成白色，干燥过后则变为黄褐色。猴头菇子实体或菌丝体中提取物中含有糖类(Wang et al.,2001；Yang et al.,2003)、猴头素(Erinacines)(Saito et al.,1998；Kenmoku et al.,2002；Kenmoku et al.,2004；Watanabe et al.,2007；Watanabe and Nakada,2008；Lee et al.,2014；Li et al.,2014)、双亚麻油酸磷酯乙烯胺(dilinoleoyl-phosphatidylethanolamine；DLPE)(Nagai et al.,2006)、氨基酸、蛋白质及微量元素(Jia et al.,2004)。在过去文献记载中，不乏是猴头菇多糖体具有免疫调解、降血脂、降血糖或是抑制胃部发炎及胃癌的产生的效果，但并未证实具有可预防听力老化的效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猴头菇活性物质的制备方法，其可用于制成预防听力退化的活性物质。
为达到前述目的，本发明提供的猴头菇活性物质的制备方法包含以下的步骤：
(a)取猴头菇菌丝体接种于平板上，于温度15-32℃下培养8-16天；
(b)将步骤(a)培养的猴头菇菌丝体接种于烧瓶培养基，并于温度20-30℃及pH值4.5-6.5下，培养3-5天；
(c)将步骤(b)培养的猴头菇菌丝体接种于发酵槽培养基，并于温度24-32℃及pH值4.5-5.5下，培养8-16天，取得猴头菇菌丝体发酵液；
(d)将步骤(c)的该猴头菇菌丝体发酵液进行干燥，获得猴头菇菌丝体粉末。
较佳地，前述制备方法中的步骤(b)的培养为震荡培养，其震荡速率为100-250rpm。
较佳地，前述制备方法中的步骤(c)中发酵槽的槽压为0.8-1.2kg/cm2，搅拌速率为10-150rpm，且以通气速率为0.5-1vvm通入气体至发酵槽。
较佳地，前述制备方法中的所述气体为空气、氧气、二氧化碳、氮气、或其组合。
较佳地，前述制备方法中的步骤(b)与步骤(c)中使用相同的培养基。
较佳地，前述制备方法中的该培养基包含综合性碳氮源、动植物来源蛋白或其水解物、 无机盐类、糖类、酵母、麦芽抽出物、消泡剂或其组合。
较佳地，前述制备方法中的所述综合性碳氮源为谷类或豆类；所述无机盐类为硫酸盐类或磷酸盐类。
本发明又提供一种预防听力退化的猴头菇菌丝体活性物质，其以如前述所述的方法制备而成。
较佳地，前述活性物质是以如部分前述方法制备时，其中所述猴头菇活性物质为粉末形态。
本发明另外提供一种预防听力退化的医药组合物，其包含如前所述的猴头菇菌丝体活性物质；以及生物可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或辅剂。
本发明再提供一种制备用于预防听力退化的医药组合物的方法，其包含将有效量的猴头菇菌丝体活性物质；以及生物可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或辅剂混合。
较佳地，该猴头菇菌丝体活性物质包含如前述的活性物质。
本发明再提供一种应用，其在制备预防听力退化的医药组合物中包含如前所述的猴头菇菌丝体活性物质。即如前所述的猴头菇菌丝体活性物质在制备预防听力退化的医药组合物中的应用。
附图说明
图1显示实施例5中，以听性脑干反应测定实验小鼠于喂食含猴头菇活性物质饲料的实验前后的听力阈值，藉此求得喂食实验前后的听力阈值的差值。
具体实施方式
本发明的目的在于提供一种医药组合物及其制备方法，通过该制备方法得到的医药组合物含有粉末形态的猴头菇菌丝体活性物质，且该医药组合物可达到预防听力退化的目的。
实验方法
菌种来源：
本发明的实施例所用的猴头菇(Hericium erinaceus)菌种，购自于食品工业研究(BCRC35669)，但本发明所述的猴头菇活性物质不限于由此菌种所得。
液体培养：
猴头菇菌丝体的液体培养方式如下，其包括将菌丝体接种于平板上，于适当温度如15-32℃下培养约14天。接着，刮取菌丝并接种于烧瓶内，且使用下列培养基，在20-30°C、pH 4.5-6.5、振荡速率100-250rpm之下振荡培养到log期初期，3-5天。最后，将烧瓶 培养物接种于发酵槽培养基(同烧瓶培养基)内，在24-32℃，槽压0.8-1.2Kg/cm2，及pH约4.5-5.5，以0.5-1vvm通气速率通入空气，或空气与氧气，二氧化碳或氮气的混合物，较佳者为空气，在10-150rpm搅拌速率下培养8-16天，即得猴头菇菌丝体发酵液，其包括菌丝体与澄清液。
培养基配方如下：
成分 含量(重量％)
综合性碳氮源 0.01-10
动植物来源蛋白及其水解物 0.01-5
酵母或麦芽抽出物(粉、膏) 0.001-2
无机盐类 0.0001-2
糖类 0.01-20
消泡剂 0.01-0.5
水 加至100重量％
其中该综合性碳氮源可为谷类(如：麦粉、麸皮类)或豆类(如：黄豆粉、绿豆粉、大豆粉等)；其中该无机盐类可为硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铁、或硫酸锌等；其中该糖类可为葡萄糖、果糖、麦芽糖、或蔗糖等；其中，除上述成分外其余为水。
于发酵槽培养基中可额外添加消泡剂以抑制于培养过程中大量泡沫的生成，其中该消泡剂可为市售的常用消泡剂，如0.01％消泡剂如含硅油、硅树脂的水性消泡剂。具体实施例的培养方法详述如后。
活性物质的制备
将上述所得的发酵液进行干燥，即可得到粉末状的猴头菇菌丝体活性物质，干燥的方式可例举如喷雾干燥、热风干燥、滚筒干燥、冷冻干燥、或其他可适用于本发明的干燥方法。较佳地实行冷冻干操法，故所得的粉末状的猴头菇菌丝体活性物质即为菌丝体冻干粉。
活性物质对实验动物的体重及器官发育的影响
利用特定模式的实验小鼠仿真生理环境的老化，且该特定小鼠于饲养特定期间后，经实验证实呈现听力老化的生理特征。将该特定模式的实验小鼠随机分组，分别喂食含有猴头菇菌丝体活性物质的饲料、以及不含有猴头菇菌丝体活性物质的饲料，并持续进行该喂食实验于一特定实验期间。
于该实验期间纪录实验小鼠的体重及摄食量，并在实验后得出各组别实验小鼠的体重变化量和摄食量，以确认摄食含有猴头菇菌丝体活性物质的饲料对于实验小鼠的体重或摄食量是否有影响。最后，将该实验小鼠牺牲，测量小鼠不同器官的重量，并比较不同组别 间的差异，以确认喂食含有猴头菇菌丝体活性物质的饲料对于小鼠脏器的影响。
活性物质预防听力退化的效果
在喂食实验开始前与完成后，皆以听性脑干反应(Auditory brainstem response,ABR)测定实验小鼠在声音刺激下的反应，并据以得出其听力阈值，而喂食实验前后的听力阈值的差值即为听力退化的程度，并比较各组别间听力退化的程度差异，以研究喂食含有猴头菇菌丝体活性物质的饲料对于预防听力退化的效果。
听性脑干反应(Auditory brainstem response,ABR)的测定原理为通过ABR诱发电位，即电流刺激周边感觉神经时，该电流会沿着神经传导，可以通过贴附于头皮上的电极(electrodes)记录到大脑的电位变化，并从所得的波形图中分析测试个体的听力状况，据此判别听神经或脑干的病变。由于此听力检测的方法操作简易，再现性高，且不易受意识状态影响以及年龄的限制，因此该方法为近二十年来最广泛使用的客观性生理听力检查(参考文献：Starr and Achor,1957)。
实施例1：猴头菇菌丝体的培养与其活性物质的制备
平板培养：
将菌丝体接种于平板培养基上，使用马铃薯糊精培养基(Potato Dextrose Agar,PDA)，于25℃下培养约7天。
烧瓶培养：
刮取平板上的菌丝接种于烧瓶内，用下列培养基，在约26℃、pH 5.0、于转速120rpm震荡机上，震荡培养5天；
培养基配方：
成分 含量(重量％)
葡萄糖 2.0
酵母抽出物 0.1
动植物来源蛋白及其水解物 0.1
硫酸镁 0.001
黄豆粉 0.1
水 加至100重量％
发酵槽培养：
发酵槽培养所使用的培养基成分同烧瓶培养步骤，将烧瓶培养物接种于发酵槽培养基内，在26℃、槽压0.5-1.0Kg/cm2、pH 5.0、10-150rpm搅拌速度或不搅拌(air lift)的情况下，以0.5-1.0vvm通气速率通入空气，培养12天。12天后，便取得发酵液，该发酵液 中包括菌丝体与澄清液，并含有具预防听力退化效果的猴头菇活性物质。
实施例2：猴头菇菌丝体冻干粉的制备
该发酵液进行冷冻干燥后，即可得猴头菇菌丝体冻干粉，20吨的发酵液在经冷冻干燥处理后，可得约80Kg的冻干粉。
实施例3：实验动物模式与猴头菇菌丝体活性物质的喂食
本发明所使用的动物模式为老化促进小鼠(SAMP8)，该小鼠属于SAMP品系之一，被认为是研究与年龄相关退化情形，如学习记忆及免疫缺损的有利动物模型，亦是探讨基因与蛋白质量表现的良好模型(Butterfield and Poon,2005)。该小鼠在早期即出现老化促进的现象，可能的原因为体内自由基生成增加、抗氧化酶活性及免疫能力降低、及过氧化物产生过多，引发氧化压力所导致，这些因素也可能是导致生理功能急速退化的原因。
在进行后续实验之前，利用听性脑干反应测量SAMP8听力退化情形，发现SAMP8于9月龄开始退化，11月龄以后听力有更快速退化的现象。因此本研究计划以9月龄的SAMP8品系小鼠为试验模式，探讨其与听力退化症状的相关性。
将离乳后雄性老化促进小鼠，以福寿牌固形饲料饲养至9月龄后，以随机方式进行分组。分组后的小鼠饲养于30(W)×20(D)×10(H)cm的透明塑料笼中，并将该饲养笼置于动物室中。该动物室的温度为22±2℃、相对湿度为65±5％，且为一无尘自动控制室。该动物房的光暗周期以自动定时器控制，光照期(light period)为19:00～07:00，黑暗期(dark period)则为07:00～19:00。实验饲料基本组成有20％酪蛋白(casein)、5％黄豆油(soybean oil)、1％维生素混合物(vitamin mixture)(AIN93-VX)、5％矿物质混合物(mineral mixture)(AIN93-G)、2％纤维素粉末(cellulose powder)、2.5％胆素(Choline)，其剩余部分为淀粉及蔗糖以2：1的比例组合。
小鼠共分为三组，分别为喂食未添加猴头菇菌丝体冻干粉饲料的控制组A组，以及喂食猴头菇菌丝体冻干粉不同重量的B、C组。B组的小鼠每天每公斤小鼠体重喂食215.25毫克(215.25mg/kg BW/day)，C组的小鼠则是每天每公斤小鼠体重喂食430.5毫克(430.5mg/kg BW/day)，喂食实验连续进行12周。
实施例4：喂食猴头菇菌丝体活性物质对小鼠的影响
本实验于喂食期间纪录老化促进小鼠的体重及摄食量变化，并分析各组别间体重及每日平均摄食量的差异。实验结果表示为平均值±S.E.M，并且以单向ANOVA进行统计。这些实验结果显示于表1，由表1可得知在喂食不同饲料12周后，各组别体重增加量以及每日平均的摄食量并无显着差异，说明摄食含有猴头菇活性物质的猴头菇冻干粉不会影响 小鼠的摄食量，同时也不会造成小鼠生长发育障碍。
表1：实验小鼠喂食12周后的体重及摄食量的变化
Figure PCTCN2016070019-appb-000001
除体重及摄食量的实验以外，另比较各组的老化促进小鼠在喂食实验12周后，各组别间器官重量的比较。实验结果表示为平均值±S.E.M，并且以单向ANOVA进行统计。这些实验结果显示于表2，由表2可得知在喂食不同饲料12周后，各组别间小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、及全脑的平均相对重量并无显着差异，肉眼亦未见异常现象，说明摄食含有猴头菇活性物质的猴头菇冻干粉对脏器并无不良影响。
表2：实验小鼠喂食12周后的相对器官重量的比较
Figure PCTCN2016070019-appb-000002
实施例5：以听性脑干反应分析猴头菇菌丝体活性物质预防听力退化的效果
听性脑干反应的测定分别在喂食实验的前后进行。在进行听性脑干反应测试期间，通过注射巴比妥盐至实验小鼠的腹膜内以麻醉实验小鼠，并适时追加注射巴比妥盐以使实验小鼠维持在适当的麻醉状态。听性脑干反应测试使用的仪器为双频式听性诱发测试仪(Intelligent Hearing System,Ronamac International Corp.,USA)，受测部位为左耳，故将一条软管置于左耳处，给予单耳滴答声(click)声音刺激，每次刺激约8～10秒。刺激频率的测定范围有低频、中频、高频，以比较不同频率下实验小鼠的听力阈值变化。在此实验中，该低频、中频、高频的刺激音的频率分别为滴答声(click)(频率约为2千赫兹至4千赫兹)、8千赫兹、16千赫兹。该刺激音所诱发出来的反应通过多功能诱发电位记录器 smart EP软件记录，而得到不同组别在不同频率的声音刺激下所产生的电位反应波形图。每一次刺激经由向上或向下调整声压(decibel sound pressure level，dB SPL)，根据该电位反应波形图，用以确定可听到声音大小的最低强度，而求得喂食实验前后的听力阈值。滴答声(click)、8K及16K的测量值分别代表低频、中频、高频的听力阈值。再以小鼠在12月龄测定所得的听力阈值，与9月龄测定的听力阈值相减所得的数值，即为听力阈值的变化量(threshold shift)。听力阈值的变化量的结果显示于下表3中，其表示为平均值±S.E.M，并且以单向ANOVA进行统计，以a与b的上标表示当p＜0.05时该组别的实验数据在特定频率下与其他实验组别的数据具有显着差异。再以表3的听力阈值差值绘制图1，由图1可得知喂食不含猴头菇菌丝体冻干粉饲料的控制组A组的实验小鼠，其听力阈值差值不论在滴答声(click)、8千赫兹、16千赫兹的刺激音下，皆高于喂食不同重量的猴头菇菌丝体冻干粉冻干粉的实验组B、与C组的实验小鼠的听力阈值差值，表示喂食猴头素冻干粉的实验小鼠，其听力阈值的差值小，亦即其听力退化的幅度小，证实猴头菇冻干粉中的猴头菇活性物质具有预防听力退化的效果。
表3：实验动物于喂食实验前后不同频率的听力阈值差值
Figure PCTCN2016070019-appb-000003

Claims (13)

  1. 一种预防听力退化的猴头菇菌丝体活性物质的制备方法，其包含下列步骤：
    (a)取猴头菇菌丝体接种于平板上，于温度15-32℃下培养8-16天；
    (b)将步骤(a)培养的猴头菇菌丝体接种于烧瓶培养基，并于温度20-30℃及pH值4.5-6.5下，培养3-5天；
    (c)将步骤(b)培养的猴头菇菌丝体接种于发酵槽培养基，并于温度24-32℃及pH值4.5-5.5下，培养8-16天，取得猴头菇菌丝体发酵液；
    (d)将步骤(c)的所述猴头菇菌丝体发酵液进行干燥，获得猴头菇菌丝体粉末。
  2. 根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤(b)的培养为震荡培养，其震荡速率为100-250rpm。
  3. 根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤(c)中发酵槽的槽压为0.8-1.2kg/cm2，搅拌速率为10-150rpm，且以通气速率为0.5-1vvm通入气体至发酵槽。
  4. 根据权利要求3所述的制备方法，其中所述气体为空气、氧气、二氧化碳、氮气、或其组合。
  5. 根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤(b)与步骤(c)中使用相同的培养基。
  6. 根据权利要求5所述的制备方法，其中所述培养基包含综合性碳氮源、动植物来源蛋白或其水解物、无机盐类、糖类、酵母、麦芽抽出物、消泡剂或其组合。
  7. 根据权利要求6所述的制备方法，其中所述综合性碳氮源为谷类或豆类；所述无机盐类为硫酸盐类或磷酸盐类。
  8. 一种预防听力退化的猴头菇菌丝体活性物质，其以权利要求1-7中任一项的方法制备而成。
  9. 根据权利要求8所述的活性物质，其中所述猴头菇菌丝体活性物质为粉末形态。
  10. 一种预防听力退化的医药组合物，其包含权利要求8或9的猴头菇菌丝体活性物质；以及生物可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或辅剂。
  11. 一种制备用于预防听力退化的医药组合物的方法，其包含将有效量的猴头菇菌丝体活性物质；以及生物可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或辅剂混合。
  12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述猴头菇菌丝体活性物质包含权利要求8或9中任一项的活性物质。
  13. 权利要求8或9所述的猴头菇菌丝体活性物质在制备预防听力退化的医药组合物中的应用。
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