JP2001231545A - アントロディアカンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の分離株、その培養物の生産方法、及びそれにより得られる産生物 - Google Patents
アントロディアカンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の分離株、その培養物の生産方法、及びそれにより得られる産生物Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 好適な人工培地で生育でき、かつ所望の薬理
的活性、特に抗腫瘍活性を示し得るアントロディア カ
ンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔ
ａ）の新規な分離株を提供し、医学及び食物の分野で有
用な産生物を提供する。 【解決手段】 ポテトデキストロース培養基及び主要炭
素源としてフルクトースを含有する合成培地を利用する
ことにより、Ａ．カンフォラータの培養物の薬理的活性
が有意に増加する。
的活性、特に抗腫瘍活性を示し得るアントロディア カ
ンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔ
ａ）の新規な分離株を提供し、医学及び食物の分野で有
用な産生物を提供する。 【解決手段】 ポテトデキストロース培養基及び主要炭
素源としてフルクトースを含有する合成培地を利用する
ことにより、Ａ．カンフォラータの培養物の薬理的活性
が有意に増加する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、医学及び食物分野
において有用な産生物を提供するための、アントロディ
ア カンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏ
ｒａｔａ）の分離株を培養する方法に関する。本発明
は、また、好適な培地で培養した時に、その培養物が薬
理的活性を示す、新規なアントロディア カンフォラー
タの分離株に関する。
において有用な産生物を提供するための、アントロディ
ア カンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏ
ｒａｔａ）の分離株を培養する方法に関する。本発明
は、また、好適な培地で培養した時に、その培養物が薬
理的活性を示す、新規なアントロディア カンフォラー
タの分離株に関する。
【０００２】
【従来の技術】アントロディア カンフォラータ（Ａｎ
ｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）［（Ｚａｎｇ
＆ Ｓｕ）Ｓ．−Ｈ．Ｗｕ，Ｒｙｖａｒｄｅｎ ＆
Ｔ．Ｔ．Ｃｈａｎｇ］は、また台湾で「ニシャンチ」あ
るいは「ニシャンク」として知られているが、純粋培養
した時、子実体に現れる担子胞子の筒状形態、ややアミ
ロイド状の骨格菌糸、苦味と軽いシナモン味、仰向け状
から傘状の担子器果、そしてまた厚膜胞子と花冠状分生
胞子などで特徴付けられる新種の菌として最近報告され
た。この新種の菌の生育は極めて遅く、かつ、固有の樹
木種であるＣｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｋａｎｅｈｉｒａｉ
Ｈａｙ（クスノキ科）のみを唯一の宿主として生育す
る。アントロディア カンフォラータの詳細な特徴付け
と分類上の位置付けは、Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｔ．ら、「台
湾におけるＣｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｋａｎｅｈｉｒａｉ
に生育する新種のアントロディア シンナモメア（Ａｎ
ｔｒｏｄｉａ ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ）」、Ｍｙｃｏ
ｌ．Ｒｅｓ．，９９（６）：７５６−７５８（１９９
５）及びＷｕ，Ｓ．−Ｈ．ら、「アントロディア シン
ナモメア［Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ
（ニシャンチ）］、台湾における薬用カビの新規な組合
わせ」，Ｂｏｔ．Ｂｕｌｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｎ．３８：
２７３−２７５（１９９７）に記載されており、その全
面的開示は、参照することにより本明細書に取り入れら
れている。
ｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）［（Ｚａｎｇ
＆ Ｓｕ）Ｓ．−Ｈ．Ｗｕ，Ｒｙｖａｒｄｅｎ ＆
Ｔ．Ｔ．Ｃｈａｎｇ］は、また台湾で「ニシャンチ」あ
るいは「ニシャンク」として知られているが、純粋培養
した時、子実体に現れる担子胞子の筒状形態、ややアミ
ロイド状の骨格菌糸、苦味と軽いシナモン味、仰向け状
から傘状の担子器果、そしてまた厚膜胞子と花冠状分生
胞子などで特徴付けられる新種の菌として最近報告され
た。この新種の菌の生育は極めて遅く、かつ、固有の樹
木種であるＣｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｋａｎｅｈｉｒａｉ
Ｈａｙ（クスノキ科）のみを唯一の宿主として生育す
る。アントロディア カンフォラータの詳細な特徴付け
と分類上の位置付けは、Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｔ．ら、「台
湾におけるＣｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｋａｎｅｈｉｒａｉ
に生育する新種のアントロディア シンナモメア（Ａｎ
ｔｒｏｄｉａ ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ）」、Ｍｙｃｏ
ｌ．Ｒｅｓ．，９９（６）：７５６−７５８（１９９
５）及びＷｕ，Ｓ．−Ｈ．ら、「アントロディア シン
ナモメア［Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ
（ニシャンチ）］、台湾における薬用カビの新規な組合
わせ」，Ｂｏｔ．Ｂｕｌｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｎ．３８：
２７３−２７５（１９９７）に記載されており、その全
面的開示は、参照することにより本明細書に取り入れら
れている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】台湾民間薬の中で、
Ａ．カンフォラータの子実体はある種の薬用効果を有す
ると信じられている。伝統的方法に従い、子実体は乾燥
末に粉砕されたり他の薬草類と煎じられ、飲み薬として
中毒、下痢、腹痛、高血圧、皮癬、肝ガンなどにより引
き起こされた症状の治療に使われる。しかしながら、前
述の諸点についての薬理学的又は臨床的研究は、これま
で文献に出てきていない。厳格な宿主特異性と天然での
希少性、ならびに、人工培養の不成功の理由により、ニ
シャンチは台湾で極めて高価である。近年、高品質の本
カビの子実体は１ｋｇ当り約１５，０００ＵＳドルとい
う極めて高い価格で販売されている。
Ａ．カンフォラータの子実体はある種の薬用効果を有す
ると信じられている。伝統的方法に従い、子実体は乾燥
末に粉砕されたり他の薬草類と煎じられ、飲み薬として
中毒、下痢、腹痛、高血圧、皮癬、肝ガンなどにより引
き起こされた症状の治療に使われる。しかしながら、前
述の諸点についての薬理学的又は臨床的研究は、これま
で文献に出てきていない。厳格な宿主特異性と天然での
希少性、ならびに、人工培養の不成功の理由により、ニ
シャンチは台湾で極めて高価である。近年、高品質の本
カビの子実体は１ｋｇ当り約１５，０００ＵＳドルとい
う極めて高い価格で販売されている。
【０００４】従って、本菌、Ａ．カンフォラータが持つ
薬理的活性を保持しながら、好適な人工環境のもとで、
本菌を大量に培養する方法の確立が求めらている。ま
た、好適な人工環境のもとで培養された時、薬理学的に
有用な活性を示すＡ．カンフォラータの分離株を得るこ
とが求めらている。
薬理的活性を保持しながら、好適な人工環境のもとで、
本菌を大量に培養する方法の確立が求めらている。ま
た、好適な人工環境のもとで培養された時、薬理学的に
有用な活性を示すＡ．カンフォラータの分離株を得るこ
とが求めらている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】従って、本発明の目的
は、Ａ．カンフォラータの分離株の培養に好適な方法で
あって、水面下培養時に菌糸状態で良好に生育し得る方
法を提供することである。この目的のために、本発明者
らは食品工業研究所（ＦＩＲＤＩ）、中華民国、台湾、
新竹で収集されたＡ．カンフォラータの５種の分離株を
検討した。加えて、驚くべきことにその内の１株が所望
の薬理的活性、特に抗腫瘍活性を示すことを見出した。
本発明の好ましい実施態様によれば、通常は炭水化物で
ある培地の炭素源が、Ａ．カンフォラータを培養するた
めの最適環境を得るために、極めて重要と思われる。
は、Ａ．カンフォラータの分離株の培養に好適な方法で
あって、水面下培養時に菌糸状態で良好に生育し得る方
法を提供することである。この目的のために、本発明者
らは食品工業研究所（ＦＩＲＤＩ）、中華民国、台湾、
新竹で収集されたＡ．カンフォラータの５種の分離株を
検討した。加えて、驚くべきことにその内の１株が所望
の薬理的活性、特に抗腫瘍活性を示すことを見出した。
本発明の好ましい実施態様によれば、通常は炭水化物で
ある培地の炭素源が、Ａ．カンフォラータを培養するた
めの最適環境を得るために、極めて重要と思われる。
【０００６】本発明のもう１つの目的は、好適な人工環
境のもとで生育した時に、所望の薬理的活性、特に抗腫
瘍活性を保持している、新規なアントロディア カンフ
ォラータの分離株を提供することである。この目的のた
めに本発明者らは、水面下培養時に菌糸状態で良好に生
育することができ、かつ、その培養物が優れた薬理的活
性を示す、Ａ．カンフォラータの分離株を分離し同定し
た。
境のもとで生育した時に、所望の薬理的活性、特に抗腫
瘍活性を保持している、新規なアントロディア カンフ
ォラータの分離株を提供することである。この目的のた
めに本発明者らは、水面下培養時に菌糸状態で良好に生
育することができ、かつ、その培養物が優れた薬理的活
性を示す、Ａ．カンフォラータの分離株を分離し同定し
た。
【０００７】従って本発明は、薬理的活性を有するＡ．
カンフォラータの分離株の培養物を生産する方法であっ
て： （ａ）Ａ．カンフォラータの分離株の菌糸を、該分離株
の生育に好適な培地に植菌し； （ｂ）工程（ａ）から得られる培養物を培養し；そして （ｃ）ハンター座標系（Ｈｕｎｔｅｒ‘ｓ ｃｏｏｒｄ
ｉｎａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して測定される培養
物の赤色指標ａが、ａ≧３である時に該培養物を収穫す
る；工程を含む方法を提供する。
カンフォラータの分離株の培養物を生産する方法であっ
て： （ａ）Ａ．カンフォラータの分離株の菌糸を、該分離株
の生育に好適な培地に植菌し； （ｂ）工程（ａ）から得られる培養物を培養し；そして （ｃ）ハンター座標系（Ｈｕｎｔｅｒ‘ｓ ｃｏｏｒｄ
ｉｎａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して測定される培養
物の赤色指標ａが、ａ≧３である時に該培養物を収穫す
る；工程を含む方法を提供する。
【０００８】本発明の他の目的は、上記の方法で得られ
る産生物を提供することである。
る産生物を提供することである。
【０００９】本発明の更なる目的は、上記の方法で得ら
れる産生物を含有する、薬剤組成物あるいは栄養補助剤
を提供することである。
れる産生物を含有する、薬剤組成物あるいは栄養補助剤
を提供することである。
【００１０】本発明の上記の及び他の目的及び特徴は、
添付の図面と共に以下の発明の実施の形態の記述を参照
することにより明白になるであろう。
添付の図面と共に以下の発明の実施の形態の記述を参照
することにより明白になるであろう。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明に従い、Ａ．カンフォラー
タの１分離株が中華民国、台湾、台東郡で分離され、そ
して、これと他の４株の分離株が天然素材培地もしくは
合成培地で成功裏に培養された。これら５種の分離株
は、食品工業研究所（ＦＩＲＤＩ）、中華民国、台湾、
新竹に所属する培養菌収集・研究センター（Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｃｅｎｔｅｒ、ＣＣＲＣ）に寄託され、それぞれ受
託番号はＣＣＲＣ３５３９６（１９９４年１２月１日
付）、３５３９８（１９９４年、１２月１日付）、３６
４０１、３６７９５及び９３００３２（２０００年、１
月２７日付）である。
タの１分離株が中華民国、台湾、台東郡で分離され、そ
して、これと他の４株の分離株が天然素材培地もしくは
合成培地で成功裏に培養された。これら５種の分離株
は、食品工業研究所（ＦＩＲＤＩ）、中華民国、台湾、
新竹に所属する培養菌収集・研究センター（Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｃｅｎｔｅｒ、ＣＣＲＣ）に寄託され、それぞれ受
託番号はＣＣＲＣ３５３９６（１９９４年１２月１日
付）、３５３９８（１９９４年、１２月１日付）、３６
４０１、３６７９５及び９３００３２（２０００年、１
月２７日付）である。
【００１２】本明細書で使用される天然培地又は天然素
材培地という用語は、当業者にとって通常の意味を持つ
もので、主に天然にある素材から成る培地を示す。本発
明によれば、商業的に入手可能なＧＩＢＣＯ社製のポテ
ト−デキストロース培養基が好ましい。
材培地という用語は、当業者にとって通常の意味を持つ
もので、主に天然にある素材から成る培地を示す。本発
明によれば、商業的に入手可能なＧＩＢＣＯ社製のポテ
ト−デキストロース培養基が好ましい。
【００１３】本明細書で使用される合成培地という用語
は、明確な化学構造を持つ種々の成分と、所望により１
つ以上の天然素材由来の未精製成分との人工混合物を意
味する。一般に、合成培地は、炭素源、窒素源、無機塩
などの微量元素、及び必要によりビタミン類又は他の成
長因子を含んでいる。
は、明確な化学構造を持つ種々の成分と、所望により１
つ以上の天然素材由来の未精製成分との人工混合物を意
味する。一般に、合成培地は、炭素源、窒素源、無機塩
などの微量元素、及び必要によりビタミン類又は他の成
長因子を含んでいる。
【００１４】炭素源は、グルコース、ショ糖、ガラクト
ース、フルクトース、コーンスターチ、麦芽抽出物及び
それらの組み合わせを包含するが、これらに限定されな
い。所期の効果の観点から、合成培地は、主要炭素源と
してフルクトースを含むのが好ましく、必要により麦芽
抽出物又はグルコースが追加される。好ましくは、炭素
源は、合成培地の総体積を基準にして１．５−２．５ｗ
／ｖ％の範囲で、より好ましくは２．５ｗ／ｖ％の量で
含まれる。
ース、フルクトース、コーンスターチ、麦芽抽出物及び
それらの組み合わせを包含するが、これらに限定されな
い。所期の効果の観点から、合成培地は、主要炭素源と
してフルクトースを含むのが好ましく、必要により麦芽
抽出物又はグルコースが追加される。好ましくは、炭素
源は、合成培地の総体積を基準にして１．５−２．５ｗ
／ｖ％の範囲で、より好ましくは２．５ｗ／ｖ％の量で
含まれる。
【００１５】窒素源は、硫酸アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム、硝酸ナトリウム、カザミノ酸、酵母抽出物、ペ
プトン、トリプトン及びそれらの組み合わせを包含する
が、これらに限定されない。本発明によれば、好ましく
は、合成培地は窒素源として酵母抽出物を含む。窒素源
は、合成培地の総体積を基準にして０．２−２．５ｗ／
ｖ％の範囲が好ましく、より好ましくは０．５ｗ／ｖ％
の量で含まれる。
ニウム、硝酸ナトリウム、カザミノ酸、酵母抽出物、ペ
プトン、トリプトン及びそれらの組み合わせを包含する
が、これらに限定されない。本発明によれば、好ましく
は、合成培地は窒素源として酵母抽出物を含む。窒素源
は、合成培地の総体積を基準にして０．２−２．５ｗ／
ｖ％の範囲が好ましく、より好ましくは０．５ｗ／ｖ％
の量で含まれる。
【００１６】本発明の方法は、菌の子実体自体を粉砕し
たり煎じるようなニシャンチの取り扱いの伝統的方法に
比較して、製薬工業において所望する菌を簡便に操作
し、その大量生産に迅速に対応できるという明白な利便
性を持つ。
たり煎じるようなニシャンチの取り扱いの伝統的方法に
比較して、製薬工業において所望する菌を簡便に操作
し、その大量生産に迅速に対応できるという明白な利便
性を持つ。
【００１７】５種のＡ．カンフォラータの分離株が、医
薬分野での可能性、特に腫瘍又はガン細胞の増殖阻害能
について検討された。これら分離株の腫瘍細胞に対する
増殖阻害能を評価するため、天然培地と合成培地での
Ａ．カンフォラータ培養物の水相をＭＴＴ比色定量試験
に供した。
薬分野での可能性、特に腫瘍又はガン細胞の増殖阻害能
について検討された。これら分離株の腫瘍細胞に対する
増殖阻害能を評価するため、天然培地と合成培地での
Ａ．カンフォラータ培養物の水相をＭＴＴ比色定量試験
に供した。
【００１８】本明細書で使用されるＭＴＴ比色定量試
験、又はＭＴＴテトラゾリウム定量試験という用語は、
米国国立ガン研究所の医療開発プログラム、ガン治療部
門により１９８０年代に確立された、抗ガン剤スクリー
ニングスキームを意味する（例えば以下を参照。Ａｌｌ
ｅｙ、Ｍ．Ｃ．ら、「微量培養テトラゾリウム定量法を
使用したヒト腫瘍細胞系パネルによる薬剤スクリーニン
グ法の可能性」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：５８９
−６０１，１９８８；Ｓｃｕｄｉｅｒｏ，Ｄ．Ａ．ら、
「ヒト及び他の腫瘍細胞系を使用した培養における細胞
増殖と薬剤感受性に対する可溶性テトラゾリウム・フォ
ルマザン定量法の評価」、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４８：
４８２７−４８３３，１９８８；Ｖｉｓｔｃａ，Ｄ．
Ｔ．ら、「テトラゾリウムをベースにした細胞生存性の
定量法：フォルマザンに影響する選ばれたパラメターの
厳密な検討」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：２５１５
−２５２０，１９９１；並びに、Ｍｏｎｋｓ，Ａ．ら、
「培養されたヒト腫瘍細胞系の多様なパネルを使用し
た、高能率抗ガン剤スクリーニング法の可能性」、Ｊ．
Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８３：７５７−７６
６，１９９１）。
験、又はＭＴＴテトラゾリウム定量試験という用語は、
米国国立ガン研究所の医療開発プログラム、ガン治療部
門により１９８０年代に確立された、抗ガン剤スクリー
ニングスキームを意味する（例えば以下を参照。Ａｌｌ
ｅｙ、Ｍ．Ｃ．ら、「微量培養テトラゾリウム定量法を
使用したヒト腫瘍細胞系パネルによる薬剤スクリーニン
グ法の可能性」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：５８９
−６０１，１９８８；Ｓｃｕｄｉｅｒｏ，Ｄ．Ａ．ら、
「ヒト及び他の腫瘍細胞系を使用した培養における細胞
増殖と薬剤感受性に対する可溶性テトラゾリウム・フォ
ルマザン定量法の評価」、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４８：
４８２７−４８３３，１９８８；Ｖｉｓｔｃａ，Ｄ．
Ｔ．ら、「テトラゾリウムをベースにした細胞生存性の
定量法：フォルマザンに影響する選ばれたパラメターの
厳密な検討」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：２５１５
−２５２０，１９９１；並びに、Ｍｏｎｋｓ，Ａ．ら、
「培養されたヒト腫瘍細胞系の多様なパネルを使用し
た、高能率抗ガン剤スクリーニング法の可能性」、Ｊ．
Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８３：７５７−７６
６，１９９１）。
【００１９】この定量試験で、植物又は微生物（本明細
書では、Ａ．カンフォラータからの５種の分離株）由来
の潜在的抗ガン剤や天然物の薬効が、ヒト悪性腫瘍の主
要な臨床上のカテゴリーをそれぞれ代表する細胞系パネ
ル群に対して検討された。ウエル当りの生存細胞数は、
フォルマザン形成に正比例し、可溶化により分光測光法
で測定できる。原則として、生物活性物質又はそれらを
含む天然物は細胞増殖を阻害するか、さらには停止させ
ることができ、その結果、フォルマザンがほとんど形成
されない。
書では、Ａ．カンフォラータからの５種の分離株）由来
の潜在的抗ガン剤や天然物の薬効が、ヒト悪性腫瘍の主
要な臨床上のカテゴリーをそれぞれ代表する細胞系パネ
ル群に対して検討された。ウエル当りの生存細胞数は、
フォルマザン形成に正比例し、可溶化により分光測光法
で測定できる。原則として、生物活性物質又はそれらを
含む天然物は細胞増殖を阻害するか、さらには停止させ
ることができ、その結果、フォルマザンがほとんど形成
されない。
【００２０】５種の分離株の中で、Ａ．カンフォラータ
ＣＣＲＣ ９３００３２が優れた薬理的活性を持つこ
とが見出された。この菌株は、また、特許手続きのため
の微生物寄託に関する国際的承認についてのブタペスト
条約に基づき、２０００年１月２７日付けでアメリカタ
イプカルチャーセンター（ＡＴＣＣ）に寄託され（寄託
者による参照ＩＤ番号：Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈ
ｏｒａｔａ ＣＣＲＣ３６７９９）、受託番号ＰＴＡ−
１２３３を有している。とりわけＭＴＴ比色定量試験の
結果は、Ａ．カンフォラータ ＣＣＲＣ ９３００３２
が、設計された培養条件（ポテト−デキストロース培養
基、又は主要炭素源としてフルクトースを含む合成培
地）で培養した時に優れた抗腫瘍活性を有していること
を示す。
ＣＣＲＣ ９３００３２が優れた薬理的活性を持つこ
とが見出された。この菌株は、また、特許手続きのため
の微生物寄託に関する国際的承認についてのブタペスト
条約に基づき、２０００年１月２７日付けでアメリカタ
イプカルチャーセンター（ＡＴＣＣ）に寄託され（寄託
者による参照ＩＤ番号：Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍｐｈ
ｏｒａｔａ ＣＣＲＣ３６７９９）、受託番号ＰＴＡ−
１２３３を有している。とりわけＭＴＴ比色定量試験の
結果は、Ａ．カンフォラータ ＣＣＲＣ ９３００３２
が、設計された培養条件（ポテト−デキストロース培養
基、又は主要炭素源としてフルクトースを含む合成培
地）で培養した時に優れた抗腫瘍活性を有していること
を示す。
【００２１】選択された培地を用いて、Ａ．カンフォラ
ータ ＣＣＲＣ ９３００３２の培養に成功したことに
鑑みて、上述した本発明の方法を用いて、Ａ．カンフォ
ラータ ＣＣＲＣ ９３００３２の薬理的活性特性と実
質的に同一な薬理的活性特性を有する、新規なＡ．カン
フォラータの分離株を分離し培養することが可能である
ことが、当業者により理解されるであろう。
ータ ＣＣＲＣ ９３００３２の培養に成功したことに
鑑みて、上述した本発明の方法を用いて、Ａ．カンフォ
ラータ ＣＣＲＣ ９３００３２の薬理的活性特性と実
質的に同一な薬理的活性特性を有する、新規なＡ．カン
フォラータの分離株を分離し培養することが可能である
ことが、当業者により理解されるであろう。
【００２２】おそらく、目標とする腫瘍細胞に働く未知
の活性物質（類）は、例えば、培地中の特定の組成など
好適な環境が与えられれば、菌糸から培養物の液相中に
産生され、分泌される。従って、本発明者らの予期せぬ
発見は、最適化された大規模醗酵によるＡ．カンフォラ
ータの大量生産のための実施可能な方法と、それから由
来する培養物の健康食品のような有用素材の製造への利
用を示唆するものである。
の活性物質（類）は、例えば、培地中の特定の組成など
好適な環境が与えられれば、菌糸から培養物の液相中に
産生され、分泌される。従って、本発明者らの予期せぬ
発見は、最適化された大規模醗酵によるＡ．カンフォラ
ータの大量生産のための実施可能な方法と、それから由
来する培養物の健康食品のような有用素材の製造への利
用を示唆するものである。
【００２３】従って本発明は、Ａ．カンフォラータの薬
草医薬品用途への適用性に対して有益である。本発明
は、また、得られたＡ．カンフォラータ培養物を、その
ような治療を必要とする患者における、ガン又は腫瘍疾
患の治療に利用することに対して、門戸を開くものであ
る。
草医薬品用途への適用性に対して有益である。本発明
は、また、得られたＡ．カンフォラータ培養物を、その
ような治療を必要とする患者における、ガン又は腫瘍疾
患の治療に利用することに対して、門戸を開くものであ
る。
【００２４】
【実施例】以下の実施例は、説明の目的だけのためのも
のであり、本発明の範囲を限定することを意図するもの
ではない。
のであり、本発明の範囲を限定することを意図するもの
ではない。
【００２５】例１：Ａ．カンフォラータ ＣＣＲＣ ９
３００３２の天然培地での液体培養物の調製 培養株の保持 培養菌収集・研究センター（ＣＣＲＣ）に寄託したＡ．
カンフォラータ ＣＣＲＣ ９３００３２分離株の保存
株は、ポテト−デキストロース寒天（ＰＤＡ、Ｄｉｆｃ
ｏ社から購入）のスラントチューブを用い、２５℃で保
持し、２ヶ月ごとに植え継いだ。ＰＤＰプレート上の作
業用株は，ＰＤＡスラントから植菌し、２８℃で１５−
２０日間培養した。
３００３２の天然培地での液体培養物の調製 培養株の保持 培養菌収集・研究センター（ＣＣＲＣ）に寄託したＡ．
カンフォラータ ＣＣＲＣ ９３００３２分離株の保存
株は、ポテト−デキストロース寒天（ＰＤＡ、Ｄｉｆｃ
ｏ社から購入）のスラントチューブを用い、２５℃で保
持し、２ヶ月ごとに植え継いだ。ＰＤＰプレート上の作
業用株は，ＰＤＡスラントから植菌し、２８℃で１５−
２０日間培養した。
【００２６】植菌用菌糸の調製 １５−２０日間の培養後、雑菌の混入がないことを確認
するため、アントロディア カンフォラータ ＣＣＲＣ
９３００３２の菌糸の特徴を光学顕微鏡で調べた。全
菌糸を細かい断片に裁断した後、５０ｍｌの滅菌水中
で、ホモジナイザー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ）により３０
秒間、無菌的に均質にした。その菌糸懸濁液１０ｍｌ分
をその後の試験のために、植菌用に使用した。
するため、アントロディア カンフォラータ ＣＣＲＣ
９３００３２の菌糸の特徴を光学顕微鏡で調べた。全
菌糸を細かい断片に裁断した後、５０ｍｌの滅菌水中
で、ホモジナイザー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ）により３０
秒間、無菌的に均質にした。その菌糸懸濁液１０ｍｌ分
をその後の試験のために、植菌用に使用した。
【００２７】水面下の振盪培養 ポテト−デキストロース培養基（ＰＤＢ、Ｄｉｆｃｏ社
から購入）を製造者の使用説明書に従い調製した。５０
０ｍｌエーレンマイヤーフラスコ中にある１００ｍｌの
天然素材培地に対し、１０ｍｌのＡ．カンフォラータ
ＣＣＲＣ ９３００３２の植菌液を加えた。水面下の培
養は、３０℃で１４日間、定常振盪（５０ｒｐｍ、Ｈｏ
ｔｅｃｈ社から購入の軌道回転振盪機）で培養した。培
養終了時に菌培養物を、吸引濾過ロート、フラスコ及び
真空装置から成る簡単な濾過装置を通過させた。濾液を
その後のＭＴＴ比色定量試験に使用した。ロート上に収
穫されたペレットは６０℃で７日間乾燥し、全菌体量の
乾燥重量を計測した。本試験は３回繰り返した。
から購入）を製造者の使用説明書に従い調製した。５０
０ｍｌエーレンマイヤーフラスコ中にある１００ｍｌの
天然素材培地に対し、１０ｍｌのＡ．カンフォラータ
ＣＣＲＣ ９３００３２の植菌液を加えた。水面下の培
養は、３０℃で１４日間、定常振盪（５０ｒｐｍ、Ｈｏ
ｔｅｃｈ社から購入の軌道回転振盪機）で培養した。培
養終了時に菌培養物を、吸引濾過ロート、フラスコ及び
真空装置から成る簡単な濾過装置を通過させた。濾液を
その後のＭＴＴ比色定量試験に使用した。ロート上に収
穫されたペレットは６０℃で７日間乾燥し、全菌体量の
乾燥重量を計測した。本試験は３回繰り返した。
【００２８】例２：Ａ．カンフォラータ ＣＣＲＣ ９
３００３２の合成培地での液体培養物の調製 天然培地を合成培地に置き換えた以外は何も変更しない
で、例１を繰り返した。各合成培地は、０．５％（ｗ／
ｖ）の酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．１％（ｗ／
ｖ）のＫ2ＨＰＯ4（Ｍｅｒｋ社製）、０．０５％（ｗ／
ｖ）のＭｇＳＯ 4・７Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｋ社製）、及び、主
要炭素源として、フルクトース、グルコース、ショ糖、
麦芽抽出物又はコーンスターチから選択された１種の炭
水化物２．５％を含む。本試験は３回繰り返した。
３００３２の合成培地での液体培養物の調製 天然培地を合成培地に置き換えた以外は何も変更しない
で、例１を繰り返した。各合成培地は、０．５％（ｗ／
ｖ）の酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．１％（ｗ／
ｖ）のＫ2ＨＰＯ4（Ｍｅｒｋ社製）、０．０５％（ｗ／
ｖ）のＭｇＳＯ 4・７Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｋ社製）、及び、主
要炭素源として、フルクトース、グルコース、ショ糖、
麦芽抽出物又はコーンスターチから選択された１種の炭
水化物２．５％を含む。本試験は３回繰り返した。
【００２９】例１及び例２の結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】表１に示すように、菌糸の最大乾燥重量
は、炭素源としてコーンスターチ又は麦芽抽出物を使用
した合成培地で得られた。菌糸ペレットの平均サイズは
かなり小さく、通常直径約１−３ｍｍであった。得られ
た培養物の色調は各々異なり、それらに含まれる組成に
依存しているように思われる。例えば、ポテト−デキス
トロース培養基で得られた培養物は暗赤色であり、類似
の色調が主要な炭素源としてフルクトースを加えた合成
培地で得られた培養物で観察された。他方、他の培養物
の色調は極めて異なっていた。炭素源としてグルコース
又はコーンスターチを使用した合成培地から得られた培
養物は培養の終わりには黄色となり、一方、麦芽抽出物
を使用した合成培地から得られた培養物の色調は茶色で
あった。
は、炭素源としてコーンスターチ又は麦芽抽出物を使用
した合成培地で得られた。菌糸ペレットの平均サイズは
かなり小さく、通常直径約１−３ｍｍであった。得られ
た培養物の色調は各々異なり、それらに含まれる組成に
依存しているように思われる。例えば、ポテト−デキス
トロース培養基で得られた培養物は暗赤色であり、類似
の色調が主要な炭素源としてフルクトースを加えた合成
培地で得られた培養物で観察された。他方、他の培養物
の色調は極めて異なっていた。炭素源としてグルコース
又はコーンスターチを使用した合成培地から得られた培
養物は培養の終わりには黄色となり、一方、麦芽抽出物
を使用した合成培地から得られた培養物の色調は茶色で
あった。
【００３２】例３：ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチ
アゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリ
ウムブロミド］比色定量試験 ＭＴＴ定量試験用サンプルの調製 例１及び例２から集められたＡ．カンフォラータの培養
濾液（試験サンプル）と非植菌培地（対照サンプル）を
ＭＴＴ定量試験に使用した。培養濾液及び培地をアンモ
ニア水（ＮＨ4ＯＨ）でｐＨ７に調整し、オートクレー
ブで滅菌した。そのサンプルは分析までの間、４℃で保
存した。
アゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリ
ウムブロミド］比色定量試験 ＭＴＴ定量試験用サンプルの調製 例１及び例２から集められたＡ．カンフォラータの培養
濾液（試験サンプル）と非植菌培地（対照サンプル）を
ＭＴＴ定量試験に使用した。培養濾液及び培地をアンモ
ニア水（ＮＨ4ＯＨ）でｐＨ７に調整し、オートクレー
ブで滅菌した。そのサンプルは分析までの間、４℃で保
存した。
【００３３】細胞系と培養 ＭＣＦ−７、Ｈｅｌａ、ＡＧＳ、ＣＯＬＯ ３２０ＨＳ
Ｒ及びＨｅｐ Ｇ２細胞などを含む腫瘍細胞系をＭＴＴ
比色定量試験用に選択した。これらを、１０％胎児ウシ
血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）と２ｍＭのＬ−グルタミン
酸塩（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を添加したＲＰＭＩ
１６４０（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）培地で保存用に保
持した。これらの細胞系の培養物を、トリプシン−ＥＤ
ＴＡ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて週１、２回継
代培養し、培養フラスコから細胞を剥離した。
Ｒ及びＨｅｐ Ｇ２細胞などを含む腫瘍細胞系をＭＴＴ
比色定量試験用に選択した。これらを、１０％胎児ウシ
血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）と２ｍＭのＬ−グルタミン
酸塩（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を添加したＲＰＭＩ
１６４０（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）培地で保存用に保
持した。これらの細胞系の培養物を、トリプシン−ＥＤ
ＴＡ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて週１、２回継
代培養し、培養フラスコから細胞を剥離した。
【００３４】ＭＴＴ−微量培養テトラゾリウム定量試験 腫瘍細胞株を収穫し、計数し、適切な濃度で９６ウエル
−マイクロタイタープレートに植えつけた。例えば、Ｈ
ｅｌａ細胞の初期濃度は、１ウエル当り１０００細胞数
であり、Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７、ＨｅｐＧ２、ＡＧＳ，
ＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ及びＭＣＦ−７細胞では１ウエ
ル当り３０００細胞数であった。１ウエル当りの細胞培
養培地の総量は１８０μｌとし、５％ＣＯ2濃度のイン
キュベーターで３７℃で一晩培養した。
−マイクロタイタープレートに植えつけた。例えば、Ｈ
ｅｌａ細胞の初期濃度は、１ウエル当り１０００細胞数
であり、Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７、ＨｅｐＧ２、ＡＧＳ，
ＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ及びＭＣＦ−７細胞では１ウエ
ル当り３０００細胞数であった。１ウエル当りの細胞培
養培地の総量は１８０μｌとし、５％ＣＯ2濃度のイン
キュベーターで３７℃で一晩培養した。
【００３５】２０μｌ分のサンプル液を３つ培養ウエル
に入れ、上述の培養条件で３日間培養した。その後、あ
らかじめＰＢＳ液（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）中、５ｍ
ｇ／ｍｌ濃度で調製し、４℃で保存してある２０μｌの
ＭＴＴ（Ｍｅｒｋ社製）を各々のウエルに加えた。
に入れ、上述の培養条件で３日間培養した。その後、あ
らかじめＰＢＳ液（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）中、５ｍ
ｇ／ｍｌ濃度で調製し、４℃で保存してある２０μｌの
ＭＴＴ（Ｍｅｒｋ社製）を各々のウエルに加えた。
【００３６】３７℃で４時間追加インキュベートした
後，各々のウエルから上清液を取り除き、ＭＴＴ−フォ
ルマゾン生成物を溶解するため、１００μｌの１００％
ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド、Ｓｉｇｍａ社から
入手可能）を加えた。機械的プレートミキサーで完全に
混合した後、５４０ｎｍでの吸光度をマイクロプレート
リーダー（ＭＲＸ、Ｄｙｎｅｘ社製）で測定した。試験
されたＡ．カンフォラータの培養濾液の腫瘍細胞増殖阻
害率は、各試験サンプルの吸光度を対応する対照サンプ
ルの吸光度で割って計算した。結果を図１及び図２に示
す。
後，各々のウエルから上清液を取り除き、ＭＴＴ−フォ
ルマゾン生成物を溶解するため、１００μｌの１００％
ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド、Ｓｉｇｍａ社から
入手可能）を加えた。機械的プレートミキサーで完全に
混合した後、５４０ｎｍでの吸光度をマイクロプレート
リーダー（ＭＲＸ、Ｄｙｎｅｘ社製）で測定した。試験
されたＡ．カンフォラータの培養濾液の腫瘍細胞増殖阻
害率は、各試験サンプルの吸光度を対応する対照サンプ
ルの吸光度で割って計算した。結果を図１及び図２に示
す。
【００３７】図１では、選択された培養基はポテト−デ
キストロース培養基で、Ａ．カンフォラータ ＣＣＲＣ
９３００３２分離株は、３０℃、５０ｒｐｍ、１０％
の植菌量で１４日間培養した（例１）。培養物から培養
濾液を収穫し、Ｈｅｌａ、ＥＳ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＭＣＦ
−７、ＡＧＳ、ＣＯＬＯ ２０５、ＣＯＬＯ ３２０Ｈ
ＳＲ及びＣａｃｏ−２細胞を含む数種の典型的な腫瘍細
胞系に対して、インキュベートし、ＭＴＴ−テトラゾリ
ウム定量法で試験した。
キストロース培養基で、Ａ．カンフォラータ ＣＣＲＣ
９３００３２分離株は、３０℃、５０ｒｐｍ、１０％
の植菌量で１４日間培養した（例１）。培養物から培養
濾液を収穫し、Ｈｅｌａ、ＥＳ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＭＣＦ
−７、ＡＧＳ、ＣＯＬＯ ２０５、ＣＯＬＯ ３２０Ｈ
ＳＲ及びＣａｃｏ−２細胞を含む数種の典型的な腫瘍細
胞系に対して、インキュベートし、ＭＴＴ−テトラゾリ
ウム定量法で試験した。
【００３８】図１は、ポテト−デキストロース培養基で
培養されたＡ．カンフォラータ ＣＣＲＣ ９３００３
２分離株からの培養濾液の添加により、腫瘍細胞系の増
殖率は対照サンプルからの結果に比べ顕著に減少するこ
とを示している。例示すると、例１の培養濾液で処理さ
れたＭＣＦ−７細胞の増殖率は、対応する対照の増殖率
を基準にして８％であり、一方同様に処理されたＣＯＬ
Ｏ ３２０ＨＳＲ及びＡＧＳ細胞では増殖率はわずかに
４％である。
培養されたＡ．カンフォラータ ＣＣＲＣ ９３００３
２分離株からの培養濾液の添加により、腫瘍細胞系の増
殖率は対照サンプルからの結果に比べ顕著に減少するこ
とを示している。例示すると、例１の培養濾液で処理さ
れたＭＣＦ−７細胞の増殖率は、対応する対照の増殖率
を基準にして８％であり、一方同様に処理されたＣＯＬ
Ｏ ３２０ＨＳＲ及びＡＧＳ細胞では増殖率はわずかに
４％である。
【００３９】図２では、表１に掲げた合成培地の組成を
使用し、３０℃、５０ｒｐｍ、１０％の植菌量で１４日
間培養した。Ｈｅｌａ、ＡＧＳ、ＣＯＬＯ ３２０ＨＳ
Ｒ、Ｈｅｐ Ｇ２及びＭＣＦ−７細胞の５種類の腫瘍細
胞系をＭＴＴ−テトラゾリウム定量試験に使用した。図
２に示すように、腫瘍細胞の増殖に対する有意な阻害効
果を、フルクトースを主要炭素源とした合成培地からの
培養濾液で処理した細胞において観察した。加えて、Ｃ
ＯＬＯ ３２０ＨＳＲ及びＭＣＦ−７細胞系では増殖率
が２０％未満に減少した。驚いたことには、グルコー
ス、麦芽抽出物、コーンスターチのそれぞれを主要炭素
源とした同一の合成培地で培養した時には、Ａ．カンフ
ォラータ ＣＣＲＣ ９３００３２分離株は、腫瘍細胞
系の増殖を有意には阻害しなかった。さらにその上、何
らかの理由で、時折培養基が暗赤色にならなかった時、
Ａ．カンフォラータ ＣＣＲＣ ９３００３２分離株の
阻害能は極端に減少し、かつ、ＡＧＳとＭＣＦ−７腫瘍
細胞系のみに限定されていた。
使用し、３０℃、５０ｒｐｍ、１０％の植菌量で１４日
間培養した。Ｈｅｌａ、ＡＧＳ、ＣＯＬＯ ３２０ＨＳ
Ｒ、Ｈｅｐ Ｇ２及びＭＣＦ−７細胞の５種類の腫瘍細
胞系をＭＴＴ−テトラゾリウム定量試験に使用した。図
２に示すように、腫瘍細胞の増殖に対する有意な阻害効
果を、フルクトースを主要炭素源とした合成培地からの
培養濾液で処理した細胞において観察した。加えて、Ｃ
ＯＬＯ ３２０ＨＳＲ及びＭＣＦ−７細胞系では増殖率
が２０％未満に減少した。驚いたことには、グルコー
ス、麦芽抽出物、コーンスターチのそれぞれを主要炭素
源とした同一の合成培地で培養した時には、Ａ．カンフ
ォラータ ＣＣＲＣ ９３００３２分離株は、腫瘍細胞
系の増殖を有意には阻害しなかった。さらにその上、何
らかの理由で、時折培養基が暗赤色にならなかった時、
Ａ．カンフォラータ ＣＣＲＣ ９３００３２分離株の
阻害能は極端に減少し、かつ、ＡＧＳとＭＣＦ−７腫瘍
細胞系のみに限定されていた。
【００４０】従って、ポテト−デキストロース培養基及
びフルクトースを含む合成培地からの培養濾液が暗赤色
を帯びることは、試験した菌培養物の腫瘍細胞に対する
阻害効果が、培養物の色調とおそらく相関していること
を示唆する。この推定を例４でさらに検討する。
びフルクトースを含む合成培地からの培養濾液が暗赤色
を帯びることは、試験した菌培養物の腫瘍細胞に対する
阻害効果が、培養物の色調とおそらく相関していること
を示唆する。この推定を例４でさらに検討する。
【００４１】例４：Ａ．カンフォラータ培養濾液の阻害
活性と色調外観の一致 本例では、ＣＣＲＣ ９３００３２分離株を５リッター
ファーメンターで培養した。各サンプルを植菌後、１４
３、１６７、２１６、２３９、２６３、２８７及び３１
１時間目に培養物から抜き取り、ＭＴＴ−テトラゾリウ
ム定量試験に使用した。収集した各培養物サンプルをＬ
ｏｖｉｂｏｎｄ ＴｉｎｔｏｍｅｔｅｒＰＦＸ９９０で
検出した。サンプルの色調外観はハンター座標系のＬ、
ａ及びｂ座標で表現される。このシステムでは、Ｌ値が
大きいほどより高いレベルの輝度を表し、ａ値が正で大
きいほどより高いレベルの赤色を表し、そして、ｂ値が
正で大きいほどより高いレベルの黄色を表す。初期培地
をブランク標準に使用した。これらの結果を図３と以下
の表２に示す。
活性と色調外観の一致 本例では、ＣＣＲＣ ９３００３２分離株を５リッター
ファーメンターで培養した。各サンプルを植菌後、１４
３、１６７、２１６、２３９、２６３、２８７及び３１
１時間目に培養物から抜き取り、ＭＴＴ−テトラゾリウ
ム定量試験に使用した。収集した各培養物サンプルをＬ
ｏｖｉｂｏｎｄ ＴｉｎｔｏｍｅｔｅｒＰＦＸ９９０で
検出した。サンプルの色調外観はハンター座標系のＬ、
ａ及びｂ座標で表現される。このシステムでは、Ｌ値が
大きいほどより高いレベルの輝度を表し、ａ値が正で大
きいほどより高いレベルの赤色を表し、そして、ｂ値が
正で大きいほどより高いレベルの黄色を表す。初期培地
をブランク標準に使用した。これらの結果を図３と以下
の表２に示す。
【００４２】
【表２】
【００４３】濾液のａ値（すなわち、赤色）が急に増す
につれて、腫瘍細胞の増殖率が有意に減少することを見
ることができる。濾液のａ値が３より大きい時、被験腫
瘍細胞に対し２０％の阻害が示される一方、所望の濾
液、すなわち、腫瘍細胞に対しより高い阻害効果がある
濾液は、７より大きいａ値を持ち、裸眼で赤色を観察で
きることが内挿法により推定される。
につれて、腫瘍細胞の増殖率が有意に減少することを見
ることができる。濾液のａ値が３より大きい時、被験腫
瘍細胞に対し２０％の阻害が示される一方、所望の濾
液、すなわち、腫瘍細胞に対しより高い阻害効果がある
濾液は、７より大きいａ値を持ち、裸眼で赤色を観察で
きることが内挿法により推定される。
【００４４】理論に限定されることを望まないが、ＣＣ
ＲＣ ９３００３２分離株は有利な遺伝的背景を持つで
あろうこと、それ故、例えば、特定の培養基中で活性物
質（類）を産生及び／又は分泌するのを促進する１組の
酵素群を含むであろうことが推定される。代謝物は培地
の環境と共に、培養物の色調の黄色から暗赤色への変化
をもたらす。おそらく、活性物質自体がテルペノイドの
ような共役二重結合を持ち、それらが分泌される液体培
養物に暗赤色を与えるのであろう。従って、培養物の色
調外観は、培養物の阻害活性を評価する有用な指標とな
るものと思われる。
ＲＣ ９３００３２分離株は有利な遺伝的背景を持つで
あろうこと、それ故、例えば、特定の培養基中で活性物
質（類）を産生及び／又は分泌するのを促進する１組の
酵素群を含むであろうことが推定される。代謝物は培地
の環境と共に、培養物の色調の黄色から暗赤色への変化
をもたらす。おそらく、活性物質自体がテルペノイドの
ような共役二重結合を持ち、それらが分泌される液体培
養物に暗赤色を与えるのであろう。従って、培養物の色
調外観は、培養物の阻害活性を評価する有用な指標とな
るものと思われる。
【００４５】例５：稀釈した培養濾液による腫瘍細胞の
増殖に対する阻害効果 Ａ．カンフォラータ ＣＣＲＣ ９３００３２分離株の
阻害強度を同定するために、ポテト−デキストロース培
養基中の微生物の培養物から得られた培養濾液を５、１
０及び５０倍に稀釈し，ＭＴＴ−テトラゾリウム定量試
験に供した。図４に図示した結果は、稀釈倍率が増加す
るに従い、培養濾液の腫瘍細胞に対する阻害効果は用量
依存的に次第に減少することを示している。それでも、
５倍稀釈の濾液を用いることにより、Ｈｅｐ ３Ｂ、Ａ
ＧＳ、ＥＳ−２及びＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ細胞系の増
殖の有意な阻害が観察された。５０倍稀釈の濾液で処理
されたＥＳ−２及びＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ細胞の増殖
率は、非処理細胞からの結果に比べなお４０％より低く
阻害された。
増殖に対する阻害効果 Ａ．カンフォラータ ＣＣＲＣ ９３００３２分離株の
阻害強度を同定するために、ポテト−デキストロース培
養基中の微生物の培養物から得られた培養濾液を５、１
０及び５０倍に稀釈し，ＭＴＴ−テトラゾリウム定量試
験に供した。図４に図示した結果は、稀釈倍率が増加す
るに従い、培養濾液の腫瘍細胞に対する阻害効果は用量
依存的に次第に減少することを示している。それでも、
５倍稀釈の濾液を用いることにより、Ｈｅｐ ３Ｂ、Ａ
ＧＳ、ＥＳ−２及びＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ細胞系の増
殖の有意な阻害が観察された。５０倍稀釈の濾液で処理
されたＥＳ−２及びＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ細胞の増殖
率は、非処理細胞からの結果に比べなお４０％より低く
阻害された。
【００４６】例６：異なるＡ．カンフォラータ分離株の
培養物の腫瘍細胞に対する阻害効果 Ａ．カンフォラータ ＣＣＲＣ ９３００３２分離株を
４種の他の分離株、それぞれＣＣＲＣ ３５３９６、３
５３９８、３６４０１及び３６７９５に置き換えた以外
は何も変更しないで、例１及び例３を繰り返した。培養
終了時に、４種の分離株由来の濾液はすべて黄色を呈し
た。図５に図示したように、その結果は、被験腫瘍細胞
の増殖阻害活性に関して、ＣＣＲＣ ９３００３２分離
株が他４種の分離株より優れていることを示している。
このように、Ａ．カンフォラータ ＣＣＲＣ ９３０
０３２分離株は、薬剤組成物又は栄養補給剤の製造にと
って期待される候補品と思われる。
培養物の腫瘍細胞に対する阻害効果 Ａ．カンフォラータ ＣＣＲＣ ９３００３２分離株を
４種の他の分離株、それぞれＣＣＲＣ ３５３９６、３
５３９８、３６４０１及び３６７９５に置き換えた以外
は何も変更しないで、例１及び例３を繰り返した。培養
終了時に、４種の分離株由来の濾液はすべて黄色を呈し
た。図５に図示したように、その結果は、被験腫瘍細胞
の増殖阻害活性に関して、ＣＣＲＣ ９３００３２分離
株が他４種の分離株より優れていることを示している。
このように、Ａ．カンフォラータ ＣＣＲＣ ９３０
０３２分離株は、薬剤組成物又は栄養補給剤の製造にと
って期待される候補品と思われる。
【００４７】本発明は、上述の特定した実施様態に関し
て記述されているが、本発明の精神と範囲を逸脱しない
範囲で、関連の当業者には明らかな種々の修正や変更が
なされてもよいことは認められるべきである。
て記述されているが、本発明の精神と範囲を逸脱しない
範囲で、関連の当業者には明らかな種々の修正や変更が
なされてもよいことは認められるべきである。
【００４８】
【発明の効果】Ａ．カンフォラータ ＣＣＲＣ ９３０
０３２分離株又はそれと同一の薬理的活性特性を有する
Ａ．カンフォラータの分離株は、優れた抗腫瘍活性を有
している。
０３２分離株又はそれと同一の薬理的活性特性を有する
Ａ．カンフォラータの分離株は、優れた抗腫瘍活性を有
している。
【図１】図１は、腫瘍細胞の増殖が、ポテト−デキスト
ロース培養基中で振盪培養したＡ．カンフォラータ Ｃ
ＣＲＣ ９３００３２由来の培養濾液によって影響され
ることを示す図であり、被験細胞系として、Ｈｅｌａ、
ＥＳ−２、Ｈｅｐ ３Ｂ、ＭＣＦ−７、ＡＧＳ、ＣＯＬ
Ｏ ２０５、ＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ、及びＣａｃｏ−
２細胞株を含む。
ロース培養基中で振盪培養したＡ．カンフォラータ Ｃ
ＣＲＣ ９３００３２由来の培養濾液によって影響され
ることを示す図であり、被験細胞系として、Ｈｅｌａ、
ＥＳ−２、Ｈｅｐ ３Ｂ、ＭＣＦ−７、ＡＧＳ、ＣＯＬ
Ｏ ２０５、ＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ、及びＣａｃｏ−
２細胞株を含む。
【図２】図２は、腫瘍細胞の増殖が、合成培地中で振盪
培養したＡ．カンフォラータＣＣＲＣ ９３００３２由
来の培養濾液によって影響されることを示す図であり、
被験細胞系として、Ｈｅｌａ、ＡＧＳ、ＣＯＬＯ ３２
０ＨＳＲ、Ｈｅｐ Ｇ２及びＭＣＦ−７細胞を含む。
培養したＡ．カンフォラータＣＣＲＣ ９３００３２由
来の培養濾液によって影響されることを示す図であり、
被験細胞系として、Ｈｅｌａ、ＡＧＳ、ＣＯＬＯ ３２
０ＨＳＲ、Ｈｅｐ Ｇ２及びＭＣＦ−７細胞を含む。
【図３】図３は、Ａ．カンフォラータ ＣＣＲＣ ９３
００３２を振盪培養し、異なるサンプリング時間で収穫
した培養濾液の、腫瘍細胞増殖に対する阻害効果を示す
図であり、被験細胞系として、Ｈｅｌａ、ＡＧＳ、Ｈｅ
ｐ ３Ｂ２．１−７、及びＭＣＦ−７細胞を含む。
００３２を振盪培養し、異なるサンプリング時間で収穫
した培養濾液の、腫瘍細胞増殖に対する阻害効果を示す
図であり、被験細胞系として、Ｈｅｌａ、ＡＧＳ、Ｈｅ
ｐ ３Ｂ２．１−７、及びＭＣＦ−７細胞を含む。
【図４】図４は、腫瘍細胞の増殖が、５、１０及び５０
倍に稀釈したＡ．カンフォラータ ＣＣＲＣ ９３００
３２の培養濾液によって影響されることを示す図であ
り、被験細胞系として、Ｈｅｌａ、ＥＳ−２、Ｈｅｐ
３Ｂ、ＭＣＦ−７、ＡＧＳ、ＣＯＬＯ ２０５、ＣＯＬ
Ｏ ３２０ＨＳＲ、及びＣａｃｏ−２細胞を含む。
倍に稀釈したＡ．カンフォラータ ＣＣＲＣ ９３００
３２の培養濾液によって影響されることを示す図であ
り、被験細胞系として、Ｈｅｌａ、ＥＳ−２、Ｈｅｐ
３Ｂ、ＭＣＦ−７、ＡＧＳ、ＣＯＬＯ ２０５、ＣＯＬ
Ｏ ３２０ＨＳＲ、及びＣａｃｏ−２細胞を含む。
【図５】図５は、腫瘍細胞の増殖が、Ａ．カンフォラー
タの５種類の分離株、すなわち、ＣＣＲＣ ３５３９
６、３５３９８、３６４０１、３６７９５及びＣＣＲＣ
９３００３２由来の振盪培養濾液によって影響されるこ
とを示す図であり、被験細胞系として、ＥＳ−２、ＡＧ
Ｓ、Ｈｅｐ ３Ｂ２．１−７、及びＭＣＦ−７細胞を含
む。
タの５種類の分離株、すなわち、ＣＣＲＣ ３５３９
６、３５３９８、３６４０１、３６７９５及びＣＣＲＣ
９３００３２由来の振盪培養濾液によって影響されるこ
とを示す図であり、被験細胞系として、ＥＳ−２、ＡＧ
Ｓ、Ｈｅｐ ３Ｂ２．１−７、及びＭＣＦ−７細胞を含
む。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 1/02 (Ｃ１２Ｐ 1/02 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 ジアン − チイ チェン 台湾 ミアオリ シエン、トウ − フェ ン チェン、チュン − シャン ロー ド、レーン 286、アレイ ２、 ナンバ ー ６ (72)発明者 ボル − チェー ワン 台湾 シンチュ シティ、パン − シー ロード、 ナンバー 29、４エフ Ｆターム(参考） 4B064 AH19 CA07 CC03 CD09 CD22 CD30 DA05 4B065 AA71X BA22 BB15 BB26 BB29 CA44 4C087 BC03 NA14 ZB26
Claims (26)
- 【請求項１】 食品工業研究所（Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＦＩＲＤＩ）に寄託され
て受託番号ＣＣＲＣ９３００３２を有し、そしてアメリ
カンタイプカルチャーセンター（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ、ＡＴＣＣ）に
寄託されて受託番号ＰＴＡ−１２３３を有する、アント
ロディア カンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃａｍ
ｐｈｏｒａｔａ）の分離株。 - 【請求項２】 請求項１記載の分離株の薬理的活性特性
と同一の薬理的活性特性を有する、Ａ．カンフォラータ
（Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の分離株。 - 【請求項３】 薬理的活性を有するＡ．カンフォラータ
（Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の培養物を生産する方法
であって、 （ａ）Ａ．カンフォラータ（Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔ
ａ）の分離株の植菌用菌糸を、該分離株の培養に好適な
培地中に植菌し； （ｂ）工程（ａ）から得られる培養物を培養し；そして （ｃ）ハンター座標系（Ｈｕｎｔｅｒ‘ｓ ｃｏｏｒｄ
ｉｎａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して測定される培養
物の赤色指標ａが、ａ≧３である時に該培養物を収穫す
る；ことを含む方法。 - 【請求項４】 請求項１記載の分離株を植菌工程（ａ）
に使用する、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 請求項２記載の分離株を植菌工程（ａ）
に使用する、請求項３記載の方法。 - 【請求項６】 培地が、主要な炭素源として、ポテト−
デキストロース培養基又はフルクトースを含有する合成
培地から選択される、請求項３記載の方法。 - 【請求項７】 合成培地が、窒素源として酵母抽出物を
含有する、請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 合成培地が、所望により麦芽抽出物又は
グルコースを含有する、請求項６記載の方法。 - 【請求項９】 薬理的活性が、腫瘍又はガン細胞に対す
る阻害活性である、請求項３記載の方法。 - 【請求項１０】 ハンター座標系（Ｈｕｎｔｅｒ‘ｓ
ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して測定
される培養物の赤色指標ａがａ≧７である、請求項３記
載の方法。 - 【請求項１１】 薬理的活性を有する菌類培養物を生産
する方法であって、Ａ．カンフォラータ（Ａ．ｃａｍｐ
ｈｏｒａｔａ）の分離株由来の植菌用菌糸をポテト−デ
キストロース培養基又はそれと同等な培地中で培養し、
ハンター座標系（Ｈｕｎｔｅｒ‘ｓ ｃｏｏｒｄｉｎａ
ｔｅ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して測定される培養物の赤
色指標ａが、ａ≧３である時に該培養物を収穫すること
を含む方法。 - 【請求項１２】 分離株が、食品工業研究所（Ｆｏｏｄ
ＩｎｄｕｓｔｒｙＲｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＦＩＲＤＩ）
に寄託されて受託番号ＣＣＲＣ９３００３２を有し、そ
してアメリカンタイプカルチャーセンター（Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｅｎｔｅｒ，ＡＴ
ＣＣ）に寄託されて受託番号ＰＴＡ−１２３３を有す
る、アントロディア カンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉ
ａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の分離株である、請求項１
１記載の方法。 - 【請求項１３】 分離株が、請求項１記載の分離株の薬
理的活性特性と同一の薬理的活性特性を有する、請求項
１１記載の方法。 - 【請求項１４】 薬理的活性が、腫瘍又はガン細胞に対
する阻害活性である、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１５】 ハンター座標系（Ｈｕｎｔｅｒ‘ｓ
ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して測定
される培養物の赤色指標ａがａ≧７である、請求項１１
記載の方法。 - 【請求項１６】 薬理的活性を有する菌類培養物を生産
する方法であって、Ａ．カンフォラータ（Ａ．ｃａｍｐ
ｈｏｒａｔａ）の分離株由来の植菌用菌糸を、主要炭素
源としてフルクトースを含有する合成培地中で培養し、
ハンター座標系（Ｈｕｎｔｅｒ‘ｓ ｃｏｏｒｄｉｎａ
ｔｅ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して測定される培養物の赤
色指標ａが、ａ≧３である時に該培養物を収穫すること
を含む方法。 - 【請求項１７】 分離株が、食品工業研究所（Ｆｏｏｄ
ＩｎｄｕｓｔｒｙＲｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＦＩＲＤＩ）
に寄託されて受託番号ＣＣＲＣ９３００３２を有し、そ
してアメリカンタイプカルチャーセンター（Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｅｎｔｅｒ，ＡＴ
ＣＣ）に寄託されて受託番号ＰＴＡ−１２３３を有す
る、アントロディア カンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉ
ａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の分離株である、請求項１
６記載の方法。 - 【請求項１８】 分離株が、請求項１記載の分離株の薬
理的活性特性と同一の薬理的活性特性を有する、請求項
１６記載の方法。 - 【請求項１９】 薬理的活性が、腫瘍又はガン細胞に対
する阻害活性である、請求項１６記載の方法。 - 【請求項２０】 合成培地が、窒素源として酵母抽出物
を含有する、請求項１６記載の方法。 - 【請求項２１】 合成培地が、所望により麦芽抽出物又
はグルコースを含有する、請求項１６記載の方法。 - 【請求項２２】 ハンター座標系（Ｈｕｎｔｅｒ‘ｓ
ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して測定
される培養物の赤色指標ａがａ≧７である、請求項１６
記載の方法。 - 【請求項２３】 請求項３乃至２２のいずれか１つに記
載の方法から得られる産生物。 - 【請求項２４】 請求項３乃至２２のいずれか１つに記
載の方法から得られる産生物を含有する薬剤組成物。 - 【請求項２５】 ガン又は腫瘍疾患の治療に使用するた
めの、請求項２４記載の薬剤組成物。 - 【請求項２６】 ガン又は腫瘍疾患の治療を必要とする
患者における、ガン又は腫瘍疾患の治療方法であって、
請求項３乃至２２のいずれか１つに記載の方法から得ら
れる産生物を含有する組成物を患者に投与することを含
む方法。
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001231545A true JP2001231545A (ja) | 2001-08-28 |
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|---|---|
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