TWI595880B - Active substance for preventing hearing loss, preparation method thereof, pharmaceutical composition containing the same, and preparation method of the pharmaceutical composition - Google Patents

Description

預防聽力退化之活性物質、其製備方法、含其之醫藥組合物、及該醫藥組合物的製備方法

本發明關於一種預防聽力退化的活性物質、其製備方法、含其之醫藥組合物、及該醫藥組合物的製備方法，尤指一種包含猴頭菇菌絲體活性物質的醫藥組合物及其製備方法。

老年性失聰

隨著人口的老化，各種退化性疾病的發生比率亦隨之攀升。常見的退化性疾病有骨骼及感官機能的退化，其中聽覺功能退化為老年人最常見的感覺退化性疾病之一。

老年性失聰又稱為老化相關之聽力損失(age related hearing loss,ARHL)，是指隨著患者的年齡增長，其兩側耳朵的聽力退化現象也逐漸惡化。大致上又分為神經性聽力受損與感覺性聽力受損，其中神經性聽力受損的起因為聽神經退化，感覺性聽力受損則是由耳蝸退化所造成，但在臨床上兩者不易區隔，統稱為感覺神經性聽力受損。該聽力受損的主要致病原因認為是老化、氧化傷害、粒腺體損害、或環境壓力所造成。此種聽力受損通常好發於50歲後的中老年者，最早的症狀為高頻率之聽覺喪失，意即相較於語言中的母音，對於子音較難聽取(語言中高頻率的部分)。若在噪音的環境下，上述症狀尤其明顯，患者的中樞神經系統處理聽覺訊息的速度會減慢，使得該患者需要花費更長的時間以解 讀其接收到的聽覺訊息。在臨床上，該疾病的病理特徵為聽力閥值(threshold shifts)增加及言語理解下降，該等症狀使得患者的聲音接收與語言識別的能力受到影響，造成患者在溝通、社會功能及情緒上有明顯的障礙產生，嚴重會影響到長者生活品質。

根據老年性失聰的病理位置，Schuknecht(1993)於老年性聽力退化者耳蝸病理研究報告中，將老年性失聰分為四種型態：

1.感覺性老年失聰(sensory presbycusis)：耳蝸(corti)中的感覺細胞、支持細胞等細胞數量逐漸變少或是功能退化。

2.神經性老年失聰(neural presbycusis)：螺旋神經節細胞數目減少或神經元退化導致的，而影響到聽覺訊息傳遞。

3.代謝性老年失聰(metabolic/strial presbycusis)：血管紋的退化及萎縮，導致血流量不足無法運送養分。

4.機械性老年失聰(mechanical/cochlear presbycusis)：基底膜的退化造成，包含寬度變厚、彈性變少或因鈣化而變硬皆屬之。

猴頭菇

根據『中國藥用真菌』的記載：「猴頭菇味甘、性平、能利五臟、助消化、滋補、對消化不良、神經衰退與十二指腸潰瘍及胃潰瘍有良好的功效。」，由此可知在古代醫學上已知猴頭菇具有預防疾病的效果，為藥膳兩用菌。猴頭菇學名Hericium erinaceus，其分類於真菌界(Fungi)、真菌門(Eumycota)、擔子菌亞門(Basidiomycotina)、擔子菌綱(Basidiomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、齒菌科(Hydnaceae)、猴頭菌亞科(Hericioideae)中之猴頭菌屬(Hericium)。猴頭菇在外型上，其子實體外形由長條粗糙之突起組成，而成軟圓形狀，新鮮時成白色，乾燥過後則變為黃褐色。猴頭菇子實體或菌絲體中抽出物中 含有醣類(Wang et al.,2001；Yang et al.,2003)、猴頭素(Erinacines)(Saito et al.,1998；Kenmoku et al.,2002；Kenmoku et al.,2004；Watanabe et al.,2007；Watanabe and Nakada,2008；Lee et al.,2014；Li et al.,2014)、雙亞麻油酸磷酯乙烯胺(dilinoleoyl-phosphatidylethanolamine；DLPE)(Nagai et al.,2006)、胺基酸、蛋白質及微量元素(Jia et al.,2004)。在過去文獻記載中，不乏是猴頭菇多醣體具有免疫調解、降血脂、降血糖或是抑制胃部發炎及胃癌的產生的效果，但並未證實具有可預防聽力老化的效果。

本發明的目的在於提供一種猴頭菇活性物質的製備方法，其可用於製成預防聽力退化的活性物質。

為達到前述目的，本發明提供之猴頭菇活性物質的製備方法包含以下的步驟：(a)取一猴頭菇菌絲體接種於一平板上，於溫度15-32℃下培養8-16天；(b)將步驟(a)培養的猴頭菇菌絲體接種於一燒瓶培養基，並於溫度20-30℃及pH值4.5-6.5下，培養3-5天；(c)將步驟(b)培養的猴頭菇菌絲體接種於一醱酵槽培養基，並於溫度24-32℃及pH值4.5-5.5下，培養8-16天，取得一猴頭菇菌絲體醱酵液；(d)將步驟(c)之該猴頭菇菌絲體醱酵液進行乾燥，獲得一猴頭菇菌絲體粉末。

較佳地，前述製備方法中的步驟(b)的培養為震盪培養，其震盪速率為100-250rpm。

較佳地，前述製備方法中的步驟(c)中醱酵槽的槽壓為0.8-1.2 kg/cm2，攪拌速率為10-150rpm，且以通氣速率為0.5-1vvm通入一氣體至醱酵槽。

較佳地，前述製備方法中的該氣體為空氣、氧氣、二氧化碳、氮氣、或其組合。

較佳地，前述製備方法中的步驟(b)與步驟(c)中使用相同的培養基。

較佳地，前述製備方法中的該培養基包含綜合性碳氮源、動植物來源蛋白或其水解物、無機鹽類、醣類、酵母、麥芽抽出物、消泡劑或其組合。

較佳地，前述製備方法中的該綜合性碳氮源為穀類或豆類；該無機鹽類為硫酸鹽類或磷酸鹽類。

本發明又提供一種預防聽力退化的猴頭菇菌絲體活性物質，係以如前述所述之方法製備而成。

較佳地，前述活性物質係以如部分前述方法製備時，其中該猴頭菇活性物質為粉末之型態。

本發明另外提供一種預防聽力退化的醫藥組合物，其包含如前所述的猴頭菇菌絲體活性物質；以及生物可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑或輔劑。

本發明再提供一種製備用於預防聽力退化的醫藥組合物之方法，其包含有效量之猴頭菇菌絲體活性物質；以及生物可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑或輔劑。

較佳地，該猴頭菇菌絲體活性物質係包含如前述的活性物質。

第一圖顯示實施例五中，以聽性腦幹反應測定實驗小鼠於餵 食含猴頭菇活性物質飼料的實驗前後的聽力閾值，藉此求得餵食實驗前後的聽力閾值的差值。

本發明的目的在於提供一種醫藥組合物及其製備方法，透過該製備方法得到的醫藥組合物係含有粉末型態之猴頭菇菌絲體活性物質，且該醫藥組合物可達到預防聽力退化的目的。

實驗方法

菌種來源：

本發明之實施例所用之猴頭菇(Hericium erinaceus)菌種，購自於食品工業研究(BCRC 35669)，但本發明所述之猴頭菇活性物質不限於由此菌種所得。

液體培養：

猴頭菇菌絲體的液體培養方式如下，其包括將菌絲體接種於平板上，於適當溫度如15-32℃，下培養約14天。接著，刮取菌絲並接種於燒瓶內，且使用下列培養基，在20-30℃、pH 4.5-6.5、振盪速率100-250rpm之下振盪培養到log期初期，3-5天。最後，將燒瓶培養物接種於醱酵槽培養基(同燒瓶培養基)內，在24-32℃，槽壓0.8-1.2公斤/平方公分，及pH約4.5-5.5，以0.5-1vvm通氣速率通入空氣，或空氣與氧氣，二氧化碳或氮氣的混合物，較佳者為空氣，在10-150rpm攪拌速率下培養8-16天，即得猴頭菇菌絲體醱酵液，其包括菌絲體與澄清液。

培養基配方如下：

其中該綜合性碳氮源可為穀類(如：麥粉、麩皮類)或豆類(如：黃豆粉、綠豆粉、大豆粉等)；其中該無機鹽類可為硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鐵、或硫酸鋅等；其中該醣類可為葡萄糖、果糖、麥芽糖、或蔗糖等；其中，除上述成分外其餘為水。

於醱酵槽培養基中可額外添加消泡劑以抑制於培養過程中大量泡沫之生成，其中該消泡劑可為市售之習用消泡劑，如0.01%消泡劑如含矽油、矽樹脂之水性消泡劑。具體實施例的培養方法詳述如後。

活性物質的製備

將上述所得的醱酵液進行乾燥，即可得到粉末狀的猴頭菇菌絲體活性物質，乾燥的方式可例舉如噴霧乾燥、熱風乾燥、滾筒乾燥、冷凍乾燥、或其他可適用於本發明之乾燥方法。較佳係採行冷凍乾操法，故所得之粉末狀的猴頭菇菌絲體活性物質即為菌絲體凍乾粉。

活性物質對實驗動物的體重及器官發育的影響

利用特定模式的實驗小鼠模擬生理環境的老化，且該特定小鼠於飼養特定期間後，經實驗證實呈現聽力老化的生理特徵。將該特定模式的實驗小鼠隨機分組，分別餵食含有猴頭菇菌絲體活性物質的飼料、以及不含有猴頭菇菌絲體活性物質的飼料，並持續進行該餵食實驗於一特定實驗期間。

於該實驗期間紀錄實驗小鼠的體重及攝食量，並在實驗後得出各組別實驗小鼠的體重變化量和攝食量，以確認攝食含有猴頭 菇菌絲體活性物質的飼料對於實驗小鼠的體重或攝食量是否有影響。最後，將該實驗小鼠犧牲，測量小鼠不同器官的重量，並比較不同組別間的差異，以確認餵食含有猴頭菇菌絲體活性物質的飼料對於小鼠臟器的影響。

活性物質預防聽力退化的效果

在餵食實驗開始前與完成後，皆以聽性腦幹反應(Auditory brainstem response,ABR)測定實驗小鼠在聲音刺激下的反應，並據以得出其聽力閾值，而餵食實驗前後的聽力閾值的差值即為聽力退化的程度，並比較各組別間聽力退化的程度差異，以研究餵食含有猴頭菇菌絲體活性物質的飼料對於預防聽力退化的效果。

聽性腦幹反應(Auditory brainstem response,ABR)的測定原理為藉由ABR誘發電位，即電流刺激周邊感覺神經時，該電流會沿著神經傳導，而可以透過貼附於頭皮上的電極(electrodes)記錄到大腦的電位變化，並從所得的波形圖中分析測試個體的聽力狀況，據此判別聽神經或腦幹的病變。由於此聽力檢測的方法操作簡易，再現性高，且不易受意識狀態影響以及年齡的限制，因此該方法為近二十年來最廣泛使用的客觀性生理聽力檢查(參考文獻：Starr and Achor,1957)。

實施例一：猴頭菇菌絲體的培養與其活性物質的製備

平板培養：

將菌絲體接種於平板培養基上，使用馬鈴薯糊精培養基(Potato Dextrose Agar,PDA)，於25℃下培養約7天。

燒瓶培養：

刮取平板上之菌絲接種於燒瓶內，用下列培養基，在約26℃、pH 5.0、於轉速120rpm震盪機上，震盪培養5天；

培養基配方：

醱酵槽培養：

醱酵槽培養所使用的培養基成分同燒瓶培養步驟，將燒瓶培養物接種於醱酵槽培養基內，在26℃、槽壓0.5-1.0公斤/平方公分、pH 5.0、10-150rpm攪拌速度或不攪拌(air lift)的情況下，以0.5-1.0vvm通氣速率通入空氣，培養12天。12天後，便取得醱酵液，該醱酵液中包括菌絲體與澄清液，並含有具預防聽力退化效果之猴頭菇活性物質。

實施例二：猴頭菇菌絲體凍乾粉的製備

該醱酵液進行冷凍乾燥後，即可得猴頭菇菌絲體凍乾粉，而20公噸之醱酵液在經冷凍乾燥處理後，可得約80公斤的凍乾粉。

實施例三：實驗動物模式與猴頭菇菌絲體活性物質的餵食

本發明所使用的動物模式為老化促進小鼠(SAMP8)，該小鼠屬於SAMP品系之一，被認為是研究與年齡相關退化情形，如學習記憶及免疫缺損之有利動物模型，亦是探討基因與蛋白質量表現的良好模型(Butterfield and Poon,2005)。該小鼠在早期即出現老化促進的現象，可能的原因為體內自由基生成增加、抗氧化酵素活性及免疫能力降低、及過氧化物產生過多，引發氧化壓力所導致，該等因素也可能是導致生理功能急速退化的原因。

在進行後續實驗之前，利用聽性腦幹反應測量SAMP8聽力退 化情形，發現SAMP8於9月齡開始退化，11月齡以後聽力有更快速退化的現象。因此本研究計劃以9月齡的SAMP8品系小鼠為試驗模式，探討其與聽力退化症狀之相關性。

將離乳後雄性老化促進小鼠，以福壽牌固形飼料飼養至9月齡後，以隨機方式進行分組。分組後的小鼠飼養於30(W)×20(D)×10(H)cm之透明塑膠籠中，並將該飼養籠置於動物室中。該動物室的溫度為22±2℃、相對濕度為65±5%，且為一無塵自動控制室。該動物房的光暗週期以自動定時器控制，光照期(light period)為19：00~07：00，黑暗期(dark period)則為07：00~19：00。實驗飼料基本組成有20%酪蛋白(casein)、5%黃豆油(soybean oil)、1%維生素混合物(vitamin mixture)(AIN93-VX)、5%礦物質混合物(mineral mixture)(AIN93-G)、2%纖維素粉末(cellulose powder)、2.5%膽素(Choline)，其剩餘部分為澱粉及蔗糖以2：1之比例組合。

小鼠共分為三組，分別為餵食未添加猴頭菇菌絲體凍乾粉飼料的控制組A組，以及餵食猴頭菇菌絲體凍乾粉不同重量的B、C組。B組的小鼠每天每公斤小鼠體重餵食215.25毫克(215.25mg/kg BW/day)，C組的小鼠則是每天每公斤小鼠體重餵食430.5毫克(430.5mg/kg BW/day)，餵食實驗連續進行12週。

實施例四：餵食猴頭菇菌絲體活性物質對小鼠之影響

本實驗於餵食期間紀錄老化促進小鼠的體重及攝食量變化，並分析各組別間體重及每日平均攝食量之差異。實驗結果表示為平均值±S.E.M，並且以單向ANOVA進行統計。該等實驗結果顯示於表1，由表1可得知在餵食不同飼料12週後，各組別體重增加量以及每日平均的攝食量並無顯著差異，說明攝食含有猴頭菇活性物質的猴頭菇凍乾粉不會影響小鼠的攝食量，同時也不會造成小鼠生長發育障礙。

除體重及攝食量的實驗以外，另比較各組的老化促進小鼠在餵食實驗12週後，各組別間器官重量的比較。實驗結果表示為平均值±S.E.M，並且以單向ANOVA進行統計。該等實驗結果顯示於表2，由表2可得知在餵食不同飼料12週後，各組別間小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、及全腦的平均相對重量並無顯著差異，肉眼亦未見異常現象，說明攝食含有猴頭菇活性物質的猴頭菇凍乾粉對臟器並無不良影響。

實施例五：以聽性腦幹反應分析猴頭菇菌絲體活性物質預防聽力退化的效果

聽性腦幹反應的測定分別在餵食實驗的前後進行。在進行聽性腦幹反應測試期間，透過注射巴比妥鹽至實驗小鼠的腹膜內以麻醉實驗小鼠，並適時追加注射巴比妥鹽以使實驗小鼠維持在適當的麻醉狀態。聽性腦幹反應測試使用的儀器為雙頻式聽性誘發測試儀(Intelligent Hearing System,Ronamac International Corp.,USA)，受測部位為左耳，故將一條軟管置於左耳處，給予單耳滴答聲(click)聲音刺激，每次刺激約8~10秒。刺激頻率的測定範圍有低頻、中頻、高頻，以比較不同頻率下實驗小鼠的聽力閾值變化。在此實驗中，該低頻、中頻、高頻的刺激音的頻率分別為滴答聲(click)(頻率約為2千赫茲至4千赫茲)、8千赫茲、16千赫茲。該刺激音所誘發出來的反應藉由多功能誘發電位記錄器smart EP軟體記錄，而得到不同組別在不同頻率的聲音刺激下所產生的電位反應波形圖。每一次刺激經由向上或向下調整聲壓(decibel sound pressure level，dB SPL)，根據該電位反應波形圖，用以確定可聽到聲音大小之最低強度，而求得餵食實驗前後的聽力閾值。滴答聲(click)、8K及16K之測量值分別代表低頻、中頻、高頻之聽力閾值。再以小鼠在12月齡測定所得之聽力閾值，與9月齡測定的聽力閾值相減所得的數值，即為聽力閾值之變化量(threshold shift)。聽力閾值之變化量的結果顯示於下表3中，其表示為平均值±S.E.M，並且以單向ANOVA進行統計，以a與b的上標表示當p<0.05時該組別的實驗數據在特定頻率下與其他實驗組別的數據具有顯著差異。再以表3的聽力閾值差值繪製第一圖，由第一圖可得知餵食不含猴頭素活性物質飼料的控制組A組的實驗小鼠，其聽力閾值差值不論在滴答聲(click)、8千赫茲、 16千赫茲的刺激音下，皆高於餵食不同重量的猴頭素凍乾粉的實驗組B、與C組的實驗小鼠的聽力閾值差值，表示餵食猴頭素凍乾粉的實驗小鼠，其聽力閾值的差值小，意即其聽力退化的幅度小，證實猴頭菇凍乾粉中的猴頭菇活性物質具有預防聽力退化的效果。

Claims (7)

1. 一種猴頭菇菌絲體活性物質在製備預防聽力退化之醫藥組合物的用途，其中該猴頭菇菌絲體活性物質的製備方法包含下列步驟：(a)取一猴頭菇菌絲體接種於一平板上，於溫度15-32℃下培養8-16天；(b)將步驟(a)培養的猴頭菇菌絲體接種於一燒瓶培養基，並於溫度20-30℃及pH值4.5-6.5下，培養3-5天；(c)將步驟(b)培養的猴頭菇菌絲體接種於一醱酵槽培養基，並於溫度24-32℃及pH值4.5-5.5下，培養8-16天，取得一猴頭菇菌絲體醱酵液；(d)將步驟(c)之該猴頭菇菌絲體醱酵液進行乾燥，獲得一猴頭菇菌絲體粉末。
2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中步驟(b)的培養為震盪培養，其震盪速率為100-250rpm。
3. 如申請專利範圍第1項之用途，其中步驟(c)中醱酵槽的槽壓為0.8-1.2kg/cm²，攪拌速率為10-150rpm，且以通氣速率為0.5-1vvm通入一氣體至醱酵槽。
4. 如申請專利範圍第3項之用途，其中該氣體為空氣、氧氣、二氧化碳、氮氣、或其組合。
5. 如申請專利範圍第1項之用途，其中步驟(b)與步驟(c)中使用相同的培養基。
6. 如申請專利範圍第5項之用途，其中該培養基包含綜合性碳氮源、動植物來源蛋白或其水解物、無機鹽類、醣類、酵母、麥芽抽出物、消泡劑或其組合。
7. 如申請專利範圍第6項之用途，其中該綜合性碳氮源為穀類或豆類；該無機鹽類為硫酸鹽類或磷酸鹽類。